JP2012507985A - 感染因子を含まないエンベロープウイルスベースvlpを単離するための改良法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、感染因子(infectious agent)を含まない、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子(VLP)を単離する分野に関する。好ましい例において、該分野は、エンベロープウイルスベースのVLPの免疫原性に有害な影響を及ぼさない、感染因子を不活化する方法を包含する。特定の実施形態では、エンベロープウイルスベースのVLPを、昆虫細胞ベースの発現系において作製する。
アセンブリーは、宿主細胞内で見出されるアクセサリー因子を必要とすることが多いため、エンベロープウイルスベースのVLPを作製するには、宿主細胞の発現系内におけるVLPの発現およびアセンブリーを必要とすることが典型的である。宿主細胞内における生物学的成分の発現には、感染因子による汚染の危険性が付きまとう。タンパク質および多糖など、比較的小さな生物学的成分については、そのような作用物質を除去するのに、フィルターによる滅菌が一般に用いられるが、UVによる不活化または化学的な不活化など、他の方法もまた用いられている(単独で、またはフィルターベースの方法と組み合わせて用いられる)。例えば、オーエスキー病ウイルスの糖タンパク質D遺伝子を発現させるのに用いるときのバキュロウイルスを不活化するには、光化学的不活性化が用いられており、該発現するタンパク質に対する抗体の結合の低下は何ら観察されていない(非特許文献1を参照されたい)。しかし、VLPなど、比較的大きな生物学的成分については、VLPはサイズが感染因子(例えば、ウイルス)に近接し、濾過によりそのような感染因子から分離することが不可能なことが多いので、フィルターによる滅菌は適用可能でないことが多い。したがって、VLPを調製するときの感染因子を不活化するには、他の方法を用いる必要がある。ブタパルボウイルス(PPV:非エンベロープまたはカプシドウイルス)VLPを生成させるのに用いるときのバキュロウイルスを不活化するには、そのような他の方法が試みられている。Ruedaらは、バキュロウイルスに対する低温殺菌、化学的不活化、および、洗浄剤による不活化を比較し、PPV VLPの免疫原性に対して影響を及ぼさないことを見出した(例えば、非特許文献2を参照されたい)。
本発明の好ましい実施形態は、エンベロープウイルスベースのVLPの免疫原性に有害な影響を及ぼさない、本明細書で開示される、感染因子を不活化するための各種の方法および組成物と、不活化を受けていないVLP調製物と実質的に同じ免疫原性を有する、感染因子を含まないエンベロープウイルスベースのVLP調製物を含む組成物とを提供することにより、この必要を満たす。このような好ましい実施形態は、試験された電磁放射ベースの不活化法(単独の不活化法、または該電磁放射に反応性の化学物質を伴う不活化法)が、他の純粋に化学物質ベースの不活化法と比較して、エンベロープウイルスベースのVLPの免疫原性を結果として低下させないという驚くべき観察に基づく。
本発明の好ましい実施形態には、感染因子を不活化する方法に供されたエンベロープウイルスベースのVLP調製物であって、そのような不活化法に供されていないVLPと実質的に同じ免疫原性をVLPが保持することを可能とする調製物と;エンベロープウイルスベースのVLP調製物における感染因子を不活化するこのような方法と;このような調製物をワクチン組成物へとさらに加工する方法と、このようなワクチン組成物を用いる方法とが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「エンベロープウイルスベースのVLP」とは、エンベロープウイルスに由来する1または複数の成分を用いて形成されるウイルス様粒子を指す。好ましい例には、gagポリペプチドを用いて作製したVLPと、インフルエンザM1ポリペプチドおよび/または赤血球凝集素ポリペプチド(また、場合によって、ノイラミニダーゼポリペプチド)を用いて作製したVLPと、レンチウイルスのgagポリペプチドおよびアルファレトロウイルスのgagポリペプチドからなる群ならびにRSウイルス(RSV)Fポリペプチド(および、場合によって、RSウイルスGポリペプチド)を用いて作製したVLPと、RSウイルス(RSV)Mおよび/またはFポリペプチド(および、場合によって、RSウイルスGポリペプチド)を用いて作製したVLPとが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の特定の態様は、エンベロープウイルスベースのVLP調製物と会合するさらなる抗原を包含する。このようなさらなる抗原は、同じ組成物中に組み込むことができ、さらにまた、VLPと共有結合させることもでき、非共有結合させることもできる。好ましい実施形態では、gagポリペプチド、インフルエンザM1ポリペプチド、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、および/または他の脂質ラフト会合ポリペプチドが、天然では脂質ラフトと会合しないであろう抗原を含有する、エンベロープウイルスベースのVLPを形成するのに容易に適合可能なプラットフォームである。本節では、開示されるVLPと共に用いるのに好ましい抗原について記載する。
天然では脂質ラフトと会合しない抗原、または天然では細胞膜と会合しない抗原を含有するVLPを形成する手段として、gagポリペプチド、インフルエンザM1ポリペプチド、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、および/または別の脂質ラフト会合ポリペプチドと、該抗原との連結を形成することができる。単一の抗原または複数の抗原に脂質ラフト会合ポリペプチドを連結することにより、VLPの免疫原性を増大させるか、各種の病原体に免疫原性を付与するか、または、特定の病原体の各種の株に免疫原性を付与することができる。
本明細書で用いられる抗原は、免疫反応を誘発することが可能であり、また、天然では脂質ラフトと会合しない任意の物質であり得る。抗原には、タンパク質、ポリペプチド(活性タンパク質、また、タンパク質内における個々のポリペプチドエピトープを含めた)、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド性および非ペプチド性模倣体、ならびに他の分子、低分子、脂質、糖脂質、ならびに炭水化物が含まれるが、これらに限定されない。天然において、抗原が脂質ラフトと直接的または間接的に会合しない場合、脂質ラフト会合ポリペプチドに連結しない限り、それをVLP内へと組み込むことは期待されない。抗原は、疾患または障害に関与する任意の抗原、例えば、微生物抗原(例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、蠕虫抗原、酵母抗原など)、腫瘍抗原、アレルゲンなどであり得る。
本明細書で記載される抗原は、化学的または酵素的に合成することもでき、組換えにより作製することもでき、天然の供給源から単離することもでき、前出の組合せでもあり得る。抗原は、精製することもでき、部分精製することもでき、粗抽出物でもあり得る。
適切なウイルス抗原には、以下の群:Retroviridae科(例えば、HIV−1などのヒト免疫不全ウイルス(また、HTLV−III、LAV、もしくはHTLV−III/LAV、またはHIV−IIIとも称する));また、HIV−LPなど、他の単離物; Picomaviridae科(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス); Calciviridae科(例えば、ノーウォークウイルスおよび関連ウイルスを含めた、胃腸炎を引き起こすウイルス株); Togaviridae科(例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス); Flaviridae科(例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス); Coronoviridae科(例えば、コロナウイルス); Rhabdoviradae科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス); Coronaviridae科(例えば、コロナウイルス); Rhabdoviridae科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス); Filoviridae科(例えば、エボラウイルス); Paramyxoviridae科(例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス); Orthomyxoviridae科(例えば、インフルエンザウイルス); Bungaviridae科(例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス); Arena viridae科(出血熱ウイルス); Reoviridae科(例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス); Bimaviridae科; Hepadnaviridae科(B型肝炎ウイルス); Parvovirida科(パルボウイルス); Papovavirida(パピローマウイルス、ポリオーマウイルス); Adenoviridae科(大半のアデノウイルス); Herpesviridae科(1型および2型の単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス); Poxyiridae科(痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス);およびIridoviridae科(例えば、アフリカブタコレラウイルス);ならびに未分類のウイルス(例えば、海綿状脳症の病因因子、デルタ肝炎の因子(B型肝炎ウイルスの欠損サテライトウイルスと思われる)、非A型肝炎、非B型肝炎の因子(クラス1=内部感染による;クラス2=非経口感染による(すなわち、C型肝炎));およびアストロウイルス)のうちの1または複数のウイルスと関連する(例えば、これらにより合成される)抗原が含まれる。
本明細書で開示されるVLPには、ノロウイルス科に由来する各種の抗原が含まれ得ることが好ましい。「ノーウォーク様ウイルス」とも呼ばれるノロウイルスは、Caliciviridaeウイルス科内の4つの属のうちの1つを占める。ノロウイルス属内には、遺伝子群Iおよび遺伝子群IIと名付けられた、2つの主要な遺伝子群が存在する。遺伝子群Iのノロウイルス株には、ノーウォークウイルス、サウサンプトンウイルス、デザートシールドウイルス、およびチバウイルスが含まれる。遺伝子群IIのノロウイルス株には、ヒューストンウイルス、ハワイウイルス、ローズデールウイルス、グリムズビーウイルス、メキシコウイルス、およびスノーマウンテンエージェントが含まれる(Parker, T.D.ら、J. Virol.(2005年)、79巻(12号):7402〜9頁; Hale, A.D.ら、J Clin. Micro.(2000年)、38巻(4号):1656〜1660頁)。ノーウォークウイルス(NV)は、世界中における、大半の急性ウイルス性胃腸炎の流行的発生の一因となる、ヒトカリチウイルス群の原型株である。ノーウォークウイルスのカプシドタンパク質は、2つのドメイン:殻ドメイン(S)および突出部ドメイン(P)を有する。Pドメイン(アミノ酸226〜530;ノーウォーク株の番号付け)は、2つのサブドメインであるP1およびP2に分けられる。P2ドメインは、P1ドメイン内における127アミノ酸の挿入(アミノ酸279〜405)であり、フォールディングされた単量体の最遠位面に位置する。P2ドメインは、ノロウイルス株のうちで最も保存の程度が低いVP1領域であり、P2内の超可変領域は、受容体の結合および免疫反応性において重要な役割を果たすと考えられている。Pドメインが外部に位置することを踏まえるなら、それは、本明細書で開示されるVLPワクチンのための抗原として用いるのに好ましい抗原、またはポリペプチドエピトープの供給源である。P2ドメインは、遺伝子群Iまたは遺伝子群IIのノロウイルス株に好ましい抗原である。広範にわたるノロウイルス株を通じて保存されるP2ドメインのうちのある領域内に存在するエピトープとして近年になって同定されたmAb 61.21エピトープ、ならびにmAb 54.6エピトープ(Lochridge, V.P.ら、J Gen. Virol.(2005年)、86巻:2799〜2806頁)がさらにより好ましい。
本明細書で開示されるVLPは、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ以外に、またはこれらに加えて、インフルエンザに由来する各種の抗原を包含し得る。さらなる好ましいインフルエンザ抗原は、M2ポリペプチドである。インフルエンザウイルスのM2ポリペプチドは、スプライシングイベント後において、RNAセグメント7(マトリックスセグメント)によりコードされる、97アミノ酸の小型のクラスIII内在性膜タンパク質である(80、81)。ウイルス粒子上に存在するM2は極めてわずかであり、感染細胞上においてより豊富に見出すことができる。M2は、ウイルスの侵入に必要な、プロトン選択性イオンチャネルとして用いられる(82、83)。感染中または従来のワクチン接種中の免疫原性は最小限であることから、その保存が説明されるが、代替的なフォーマットで存在する場合は、より免疫原性であり防御性である(84〜86)。これは、インビボにおけるM2モノクローナル抗体の受動伝達により、ウイルスクリアランスが加速化され、結果として防御がもたらされるという観察(87)と符合する。M2の外部ドメインエピトープを、融合タンパク質として、HBVのコア粒子に連結すると、非経口接種および鼻腔内接種のいずれによっても、マウスにおいて防御性であり、3回の繰り返しコピーを該コアタンパク質のN末端へと融合させると、最も免疫原性となる(88〜90)。これは、エピトープ密度が増大すると免疫原性が増大することを示す他のキャリア−ハプテンデータ(91)と符合する。
適切な細菌性抗原には、例えば、病原性Pasteurella属種、Staphylococci属種、およびStreptococcus属種などの病原性グラム陽性菌;また、Neisseria属、Escherichia属、Bordetella属、Campylobacter属、Legionella属、Pseudomonas属、Shigella属、Vibrio属、Yersinia属、Salmonella属、Haemophilus属、Brucella属、Francisella属、およびBacterioides属のグラム陰性菌などのグラム陰性菌を含めた、各種の病原性細菌のうちのいずれかと関連する(例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である)抗原が含まれる。例えば、Schaechter, M、H. Medoff、D. Schlesinger、「Mechanisms of Microbial Disease」、ボルチモア、Williams and Wilkins社(1989年)を参照されたい。
公知の各種腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原(TAA)のうちのいずれかを、VLPに組み込むことができる。全TAAを用い得るが、その必要はない。代わりに、TAAの一部、例えば、エピトープを用いることができる。VLP内で用い得る腫瘍関連抗原(またはそれらのエピトープを含有する断片)には、MAGE−2、MAGE−3、MUC−1、MUC−2、HER−2、高分子量黒色腫関連抗原であるMAA、GD2、癌胎児性抗原(CEA)、TAG−72、卵巣関連抗原であるOV−TL3およびMOV18、TUAN、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、OFP、CA−125、CA−50、CA−19−9、腎腫瘍関連抗原であるG250、EGP−40(EpCAMとしても知られる)、S100(悪性黒色腫関連抗原)、p53、およびp21rasが含まれるがこれらに限定されない。前出のうちのいずれかを含めた、任意のTAA(またはそれらのエピトープ)の合成類似体を用いることができる。さらに、1または複数のTAA(またはそれらのエピトープ)の組合せを、組成物中に組み込むことができる。
一態様では、VLPワクチンの一部である抗原が、各種のアレルゲンのうちのいずれかであり得る。アレルゲンベースのワクチンを用い、被験体におけるアレルゲンに対する忍容性を誘導することができる。チロシンとの共沈殿(co−precipitation)を伴うアレルゲンワクチンの例は、米国特許第3,792,159号、同第4,070,455号、および同第6,440,426号において見出すことができる。
エンベロープウイルスベースのVLPは、当業者に適用可能な任意の方法により作製することができる。エンベロープウイルスベースのVLPは、VLPを形成する一因となる1または複数のポリペプチドを包含することが典型的である。加えて、エンベロープウイルスベースのVLPは、膜(脂質ラフトを含めた)会合ポリペプチドなど、1または複数のさらなるポリペプチドを包含することにより、(VLPを形成する一因となる1または複数のポリペプチドの一部として、天然において、または人工的に存在する抗原以外のさらなる)抗原をもたらすことができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドを、任意の適用可能なタンパク質発現系、好ましくは、哺乳動物細胞による発現系および昆虫細胞による発現系など、細胞膜内に脂質ラフトドメインを包含する細胞ベースの系において共発現させることができる。
当業者に適用可能な任意の方法により、VLPを容易にアッセンブルすることができ、この結果、gagポリペプチドと、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを包含するVLPがアッセンブルされることが好ましい。好ましい実施形態では、任意の適用可能なタンパク質発現系、好ましくは、哺乳動物細胞による発現系および昆虫細胞による発現系など、脂質内に脂質ラフトドメインを包含する細胞ベースの発現系内において、ポリペプチドを共発現させることができる。
電子放射は、エンベロープウイルスベースのVLPの免疫原性を実質的に低下させることなく、感染因子を不活化することが可能なので、不活化の好ましい方法は、電子放射を介する方法である。電磁放射で好ましい3つの方式のすべて(すなわち、光反応性化合物を伴うUV照射、UV照射単独、およびガンマ照射)には、血液、食品、ワクチンなど、多種多様な試料における病原体を不活化するのに用いられてきた長い歴史があるため、不活化用電磁放射を適用するための多種多様な装置が市販されており、これらは、本明細書で開示される方法を実施するのにほとんど〜まったく改変せずに用いることができる。さらに、当技術分野では、波長および線量の最適化がルーチン化しており、したがって、当業者の能力範囲内で容易に実施される。
電磁放射による例示的な不活化法は、光反応性化合物、好ましくは、感染因子中のポリヌクレオチドと反応する光反応性化合物の存在下における、UV−A照射などの紫外線照射の組合せである。
光反応性化合物の存在下におけるUV照射に加え、感染因子は、UV照射単独でも不活化することができる。好ましい実施形態では、放射は、波長が、約180〜320nm、または約225〜290nm、または約254nm(すなわち、ポリヌクレオチドの高い吸光度ピークを有し、タンパク質吸収は低いスペクトル領域)であるUV−C放射である。UV−C放射は、エンベロープを形成する脂質二重層、また、エンベロープ内のタンパク質など、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのVLPの成分に対して、安定性および免疫原性の両面で有害性が低い一方で、感染因子を不活化するのに十分なエネルギーを保持するので好ましい。しかし、例えば、UV−AおよびUV−Bなど、他の種類のUV放射もまた用いることができる。
本明細書で開示される方法を実施して組成物を作製するには、ガンマ照射(すなわち、イオン化放射)もまた用いることができる。この好ましい実施形態では、10〜60kGyのガンマ照射線量が、病原体の不活化に有効である。ガンマ照射は、感染因子のゲノムをコードするポリヌクレオチド内において鎖の切断を導入することにより、感染因子を直接的に不活化することもでき、または、該ポリヌクレオチドを攻撃するフリーラジカルを生成することにより、感染因子を間接的に不活化することもできる。ガンマ照射と共にフリーラジカルスカベンジャー(free radical scavenger)および低温を用い、ラジカルを介してエンベロープVLPの脂質成分およびタンパク質成分にもたらされる損傷を抑制することができる。
(処方物)
本明細書で記載されるエンベロープウイルスベースのVLPの好ましい使用は、ワクチン調製物としての使用である。典型的に、このようなワクチンは、液体溶液または懸濁物の注射剤として調製されるが、注射前に液体中に溶解させるか、または懸濁させるのに適する固体形態もまた調製することができる。このような調製物はまた、乳化させることもでき、乾燥粉末として作製することもできる。免疫原性の有効成分は、薬学的に許容され、また、有効成分に適合する、賦形剤と混合することが多い。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどであり、また、これらの組合せである。加えて、所望の場合、ワクチンは、保湿剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、または該ワクチンの有効性を増強するアジュバントなどの補助物質を含有し得る。
ワクチンに対するアジュバント効果を達成する各種の方法が公知であり、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのVLPと共に用いることができる。一般的な原理および方法は、「The Theory and Practical Application of Adjuvants」、1995年、Duncan E. S. Stewart−Tull(編)、John Wiley & Sons社、ISBN 0−471−95170−6において詳述されており、また、「Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants」、1995年、Gregoriadis Gら(編)、ニューヨーク、Plenum Press社、ISBN 0−306−45283−9においても詳述されている。
エンベロープウイルスベースのVLPのポリペプチド成分と混合または融合させることにより、該ワクチン内に容易に組み込み得るので、これらもまた好ましい。
HO(CH 2CH2O)n−A−R, (I)
[式中、nは1〜50であり、Aは結合または−−C(O)−−であり、RはC1〜50アルキル、またはフェニルC1〜50アルキルである]のアジュバント分子が含まれる。
MLV Gag遺伝子ならびに種々のインフルエンザAサブタイプのHAおよびNA遺伝子を、下に記載の通り個々にpFastBac1バキュロウイルス導入ベクターのポリヘドリンプロモーターの後ろにクローニングした。「三重遺伝子」発現ベクターを構築するために1つのHAおよび1つのNAベクターの転写単位全体をSnaB IおよびHpa Iでの切断によって切り出し、これらの平滑末端断片をGag遺伝子導入ベクター中のGag転写単位のいずれかの側の唯一のSnaB IおよびHpa Iクローニング部位にそれぞれ導入した。これは、ヘッドトゥーテール(head−to−tail)様式で配置された3種の別々の転写単位(HA、Gag、NA)を含有する単一のプラスミドを生じた。次いで種々のインフルエンザAサブタイプを示すpFB−HA−pGag−pNA3重導入ベクターをキット製造者(Invitrogen、Carlsbad、CA)によって記載された通りバキュロウイルスゲノムへの組み換えのためにDH10Bac細胞中に形質転換した。
マウス白血病ウイルスのGag遺伝子はプラスミドpAMS(ATCC、Manassas、VA)から以下のプライマー:5’CACCATGGGCCAGACTGTTACC3’(配列番号6)および5’CTACTAGTCATCTAGGGTCAGGAG3’(配列番号7)を使用するPCRによって得た。最初のプライマーの5’末端のCACC伸長は、Gateway cloning technology(Invitrogen)を用いるベクターpENTR D−TOPOへの一方向性の挿入を促進し、プラスミドpENTR−Gagを生じる。Gagコード配列をDNA配列決定によって確認し、次いでpFastbac1に以下の通り導入した:pENTR−GagをAsc Iで切断し、末端をKlenow DNAポリメラーゼでの処理によって平滑化し、その後DNAをNot Iで切断した。最初にpFastbac1をSph Iで切断し、末端を平滑化し、次いでNot Iで切断した後に、得られたGag断片をpFastbac1ベクターDNAにライゲーションした。
昆虫細胞Sf9をSF900−II培地で培養し、1mlあたり細胞5×105個で200mlスピナーフラスコに播種した。細胞を27℃で1mlあたり細胞2×106個の密度まで培養し、その時点でVLPコード組換えバキュロウイルスの第2継代接種材料をおよそ0.1から1.0の感染多重度で加えた。細胞生存率が20%またはそれより低くまで低下したときに培養液を回収した。培地を2,000rpm、15分間遠心分離することによって細胞細片を除去し、その後32ml一定分量をトリス緩衝生理食塩水(TBS)、pH7.4中の30%ショ糖のクッション4ml上に重層した。VLPをショ糖クッションによって25,000rpm、1時間、10℃でBeckman SW28ローター(100,000×g)で遠心分離した。培地200ml由来のVLPを合計6mlのTBSに再懸濁し、次いで単一の20〜60%不連続ショ糖勾配に重層し、25,000rpm、1時間、10℃で遠心分離した。ショ糖勾配を底から1.5ml画分へと分取し、赤血球凝集アッセイおよびノイラミニダーゼアッセイ(下を参照されたい)ならびにSDS−PAGEおよびウェスタンブロットによって分析した。ショ糖勾配精製したVLPをショ糖存在下、4℃で保存し、少なくとも6カ月間安定(HA活性に関して)であることを見出した。VLPを播種の前にショ糖溶液から遠心分離し、トリス緩衝生理食塩水に再懸濁した。本明細書において報告する動物実験に利用したVLPワクチンは凍結されていないが、しかしH1N1 VLPの少なくとも1回の凍結融解をHA活性の測定可能な損失を伴わずに実施できることが測定された。
赤血球凝集アッセイを0.5%ヒヨコ赤血球を使用して、動物インフルエンザ診断および調査についてのWHO手順書(WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance)に記載の通り実施した[41]。
ノイラミニダーゼ活性を蛍光基質2’−(4−メチルウンベリフェリル)−α−D−N−アセチルノイラミン酸(MUN)を使用してVLP調製物およびショ糖勾配画分中で検出した。PBS中のVLP含有試料の漸増希釈物(50μl)を黒色平底96ウエルプレートに入れ、PBS 50μlを各試料ウエルに添加した。NA活性を35mM MES pH6.5、4mM CaCl2、150mM NaCl、300μM MUNの50μlの添加によって検出した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、次いで83%エタノール中0.14N NaOHの1ウエルあたり100μlでの添加によって停止させた。プレートを励起波長および発光波長それぞれ365nmおよび455nmを使用して蛍光光度計で読み取った。すべての蛍光データは、基質を含有しているがVLPを含有していない対照ウエルから得たバックグラウンド値に対して補正した。補正した蛍光値を次いでアッセイの線形範囲にあるデータ点を決定するために希釈係数で割った。
実施例2は、H1N1 VLPでのマウスの免疫化を実証する。
6〜8週齢、雌性Balb/cマウスをHAおよそ0.7〜1.0μgを含有するトリス緩衝生理食塩水(TBS)中のVLP処方物で腹腔内接種(100μl)または筋肉内接種(30μl)を用いて免疫化した。初期実験において、モノホスホリルリピドA(解毒化脂質A、Avanti Polar Lipids、Alabaster、AL)20μgをアジュバントとして添加した。初回および追加免疫化は、4週間間隔を置いて離し、各免疫化に続いて2週間、側方顔面静脈から血液試料を採取した。免疫化マウスおよび対照マウスをPBS 50μl中の卵培養A/PR/8/34の10LD50で鼻腔内でチャレンジし、体重減少および病的状態について毎日モニターした。瀕死であるかまたは刺激に反応しないことが見出された動物は、CO2吸入で安楽死させた。動物を使用する研究を実施する際に研究者らは、National Research Councilの実験動物資源局(Institute of Laboratory Animal Resources)の実験動物の管理と使用に関する委員会(Committee on Care and Use of Laboratory Animals)によって作成された「実験動物の管理と使用のための指針」を遵守した[40]。
赤血球凝集抑制(HAI)アッセイは、0.5%ヒヨコ赤血球を使用して動物インフルエンザ診断および調査についてのWHO手順書に記載の通り実施した[41]。H5N1特異的HAIアッセイに関して、1.0%ウマ赤血球も使用し、沈降時間を1時間に延ばした。H5N1 HAIアッセイはまた、精製H5N1 VLPも感染性ウイルスの代替の凝集作用物質として使用した(実施例4を参照されたい)。
実施例3は、H3N2またはH5N1 VLPでのマウスの免疫化を実証する。マウスの免疫化およびチャレンジの方法ならびにHAIアッセイの方法は上の実施例2に記載の通り実施した。
卵培養インフルエンザウイルス(A/PR/8/34(H1N1)またはA/Aichi/68(H3N2))を尿膜腔液から、TBS中の30%ショ糖クッションによってMLS 50ローター、36,000RPM(100,000×g)、1時間、10℃での遠心分離で取り出した。ウイルスペレットをPBSに再懸濁し、タンパク質含有量をBCAアッセイ(Pierce Biotechnology、Rockford、IL)によって定量し、1mlあたり5μgに調整し、平底ELISAプレートを1ウエルあたり100μl、1晩、4℃でコートするために使用した。翌日プレートを0.05%Tween20を含むPBS(PBS−T)で洗浄し、StartingBlock(PBS)(Pierce Biotechnology)1ウエルあたり350μlで30分間ブロックした。血清試料をStartingBlock T20(PBS)(Pierce Biotechnology)で1:500に希釈して最上列に添加し、各カラムで下がる毎に連続的に3倍希釈し、室温で3時間または4℃で1晩インキュベートした。プレートをPBS−Tで3回洗浄し、StartingBlock T20(PBS)中に1:1000希釈したヤギ抗マウスIgG−HRP結合体(Southern Biotech、Birmingham、AL)100μlを各ウエルに添加した。プレートをさらに1.5時間室温でインキュベートし、PBS−Tで3回洗浄し、次いでABTS基質(Pierce Biotechnology)100μlを各ウエルに添加した。プレートを室温、45分後に405nmで読み取った。ELISA力価を、バックグラウンド吸光度値の1.75倍の吸光度値を生じた最も高い血清希釈の逆数を取ることによって算出した。このカットオフレベルは、すべての無処置血清試料対照からのすべての疑陽性を排除した。
A/Hong Kong/68(H3N2)を示すVLPを実施例1に記載の通り作製した。H3N2およびH5N1 VLP(PR/8 H1N1 VLPと共に)の免疫原性を表1に示す通りマウスの免疫化試験において評価した(MPLアジュバントの存在下で1用量あたりHAおよそ1μgを含有する筋肉内初回および追加免疫化がすべての動物において強いHAI活性を誘導した)。興味深いことに、相当な交差クレードHAI活性がIndonesia H5N1免疫化群とVietnam H5N1免疫化群との間でウマRBC HAIアッセイを使用して観察され[43]、H5N1チャレンジに対する顕著な交差クレード防御を誘導する可能性を示唆した。
表1に示すH5N1 HAIアッセイは、適切なH5N1ウイルス株を入手できないことから生きているウイルスの代替としてH5N1 IndonesiaおよびVietnam VLPを使用して実施した。HAIアッセイを実施例2に記載の通り実施した。インフルエンザ偽型Gag VLPが、H1N1およびH3N2サブタイプの両方について図4に示す通りHAIアッセイにおいて生きているウイルスの性能をかなりの程度まで模倣できることに注目することは重要である。この実験においてH1N1およびH3N2 VLP免疫化マウス由来の免疫血清を生きているウイルスおよび対応するVLPの両方を使用するHAIアッセイについて検査し、アッセイ方法間で顕著に類似する力価を明らかにした。これらの結果は、HAIアッセイにおける偽型VLPとウイルスとの間での同様の性能を実証するだけでなく、生きているインフルエンザウイルスをHA活性および密度(ワクチン性能に関して重要であると考えられる)に関して模倣する偽型VLPの能力についての追加的証拠を提供する。
マウスにおけるVLPの免疫原性に基づいて本発明者らは、H5N1およびH1N1 VLPワクチンを使用して、HPAI H5N1チャレンジに対して誘導され得る防御の程度を決定するためのフェレットの免疫化およびチャレンジ試験を実施した。
32匹の雄性フェレット、8〜16週齢(Triple、F Farms、Sayer、PA)(現在広まっているインフルエンザウイルスに関して赤血球凝集抑制により血清学的に陰性)を、下に記載のVLPワクチン処方物で0日目および28日目にワクチン接種した。フェレットVLPワクチンは、生理食塩水中にアジュバントを含まずに処方され、1用量あたりHAおよそ5μgを含有した。血液試料(前大静脈を用いて)を0日目、28日目および42日目に採取した。体重測定は、チャレンジの1週間前から研究終了(63日目)まで通して毎日行った。温度をIPTT−300埋め込み型トランスポンダーをDAS−7000携帯型プローブ(BioMedic Data Systems、Seafort、DE)と共に用いて測定した。各免疫化群の8匹のフェレットの内7匹をチャレンジのために無作為選択した。動物を筋肉内注射を用いてテラゾール(Telezol)(16mg/kg)で麻酔し、PBS 0.6ml中のA/Vietnam/1203/04ウイルスの106TCID50を鼻腔内に接種した。チャレンジウイルスは、Dr.Alexander Klimov(CDC、Atlanta、GA、USA)によって提供された。フェレットを体温および体重の変化についてモニターし、疾患の臨床徴候について観察した。神経学的機能障害を示したかまたは瀕死になったフェレットは、安楽死させた。動物実験は、実験動物の管理および使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)[40]に従って、国際実験動物管理評価公認協会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)公認動物機関のBattelle施設内動物管理使用委員会(Battelle’s Institutional Animal Care and Use Committee)の指導の下で実施した。
ウイルス流出(shedding)をチャレンジ後3日目および5日目に麻酔したフェレットから採取した鼻洗浄液中で測定した。合計1mlでの鼻洗浄用に軟性カテーテルを繋いだ1mLシリンジを使用してPBS 500μLで各鼻腔を素早く洗い流した。鼻洗浄液を滅菌標本カップに集め、クライオバイアル(cryovial)に移し、TCID50での計数まで−70℃保存した。鼻洗浄液中のウイルスをメイディン・ダービー・イヌ腎臓(MDCK)細胞での組織培養感染用量中央値(median tissue culture infectious dose)によって定量した。ウイルスの連続希釈物をEMEM(2mM グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび1%ペニシリン−ストレプトマイシンで増量)中、96ウエル形式の細胞単層に5連で入れた。単層を96時間、37℃、5%CO2でインキュベートした。細胞変性効果(CPE)を示したウエルを陽性と記録し、データをSpearman Karber法[42]を使用して分析し、TCID50/mLとして報告した。
血清中和抗体を標準的マイクロ中和アッセイを使用して測定した。熱不活化、連続希釈検査血清300μLを、ウイルス600TCID50を含有する等量のEMEM(2mM グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび1%ペニシリン−ストレプトマイシンで増量)と混合した。37℃、1時間のインキュベーションに続いて、各希釈物100μLを5連で96ウエル形式中のMDCK細胞に入れた。37℃、5%CO2での4日間のインキュベーションに続いて、CPEを含有するウエルを陰性と記録した。データをSpearman Karber法を使用して分析し、中和用量中央値(ND50)として報告した。
生きているバキュロウイルス粒子が顕著な先天免疫刺激およびアジュバント効果を示すこと[46〜48]、およびこれらの特性が、除去または不活化されなければVLPなどの昆虫細胞由来産物の免疫原性において役割を演じ得ることが実証されている。この現象を調査するために本発明者らは、ウイルス、A/Wisconsin/67/2005(H3N2)を示すVLPを精製するために使用したショ糖密度勾配においてバキュロウイルス粒子の力価を計り、同じ画分中の1mlあたり粒子およそ2×1012個のVLP濃度と比較して1mlあたりおよそ2×108pfuのバキュロウイルス力価を見出した。VLP粒子定量はVLPのタンパク質濃度を測定し、推定されるVLP分子量1.2×108ダルトン(ガンマレトロウイルス粒子1個あたりGagの複製物1500個およびGag対HAの比4:1に基づく)を使用することによって概算した。バキュロウイルスを超える大過剰量のVLPにも関わらず感染性バキュロウイルスがVLP調製物中に存在し、免疫原性へのその寄与は調査に重要であった。
Wisconsin/67(H3N2)VLP調製物中の感染性バキュロウイルスを、ソラーレン誘導体4’−アミノメチル−4,5’,8−トリメチルソラーレン塩酸塩(AMT)(Sigma−Aldrich、St.Lous、MO)存在下で長波長UV照射によって、またはベータ−プロピオラクトン(BPL)での処理によって不活化した。VLPを含有するプールしたショ糖勾配画分をUVまたはBPL処理のいずれかに供し、その後VLPを不活化溶液から100,000×g、トリス緩衝生理食塩水、pH7.4中の30%ショ糖クッションによる1時間、10℃での遠心分離によって回収した。UV不活化は1mlあたりAMT30μgの添加によって実施し、VLP懸濁物の1ml一定分量を6ウエル滅菌組織培養プレートの個々のウエルに添加した。培養プレート(蓋なし)を予め長波長照射用に再構成したCL−1000UV crosslinker(UVP、Upland、CA)に置き、365nm照射2.0〜2.5ジュールに、0.25ジュール毎に穏やかに撹拌しながら供した。BPL不活化についてはBPLを最終濃度0.2%で添加し、試料を室温で3時間インキュベートした。
本発明者らは、マウスおよびフェレットにおいて強い免疫原性および防御を示すキメラインフルエンザVLPの作製のためにMLV Gag遺伝子産物の堅調な粒子出芽特性を使用した。Gag媒介粒子出芽は、会合の膜部位へのこれらの分子の標的化を補助する翻訳後ミリスチル化に依存し[31、32]、Gag媒介粒子出芽がGagとカベオリンとの会合を介して脂質ラフトドメインを通って優先的に生じることの証拠が蓄積している[33]。この工程は、昆虫細胞および哺乳動物細胞の両方において効率的に生じ、Gagと組み込まれる抗原の細胞質側末端との間での特異的相互作用を必要することなく出芽粒子への脂質ラフト標的化内在性膜抗原の組み込みを可能にする。インフルエンザに加えて、このVLPプラットフォームは、パラミクソウイルス抗原の組み込みに同様に適用できるはずであり、このことは、複数の呼吸器感染疾患に対するキメラVLPワクチンファミリーの開発を可能にする。
以下の実施例において本発明者らは、UV−A/リボフラビン、UV−C照射単独および可視光/リボフラビンによるウイルス不活化の好ましい方法を記載する。ウイルス不活化は、バイオリアクター回収物(bioreactor offloads)、遠心分離または濾過によるバイオリアクター回収後の精製開始材料、中間精製画分(連続流式勾配遠心分離画分、クロマトグラフィー素通り画分またはクロマトグラフィー溶出画分)および/または最終精製産物を含むエンベロープVLPの作製において生成された任意の画分について実施され得る。
ガンマ照射を使用する病原体不活化のために、エンベロープVLP試料(液体試料および凍結試料の両方として)に、遊離ラジカルスカベンジャーの存在下または非存在下で照射する。代表的な試料を0から60kGyに増大させるエネルギー量に供し、ウイルス不活化(例えばバキュロウイルス不活化)を標準的感染性アッセイによって評価する。エンベロープVLPへの最小の損傷を実証するために、分析試験のパネルを処理後のエンベロープVLPの同一性、安定性および免疫原性を示すために実施する。適切なウイルス不活化条件が定められれば、移転可能な製造工程のより代表的である材料のレベルにおいて、選択されたウイルス不活化方法の効果を確実にするために、様々な深度の試料においてスケールアップ研究を実施する。
Claims (74)
- 感染因子を実質的に含まないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を単離する方法であって、
(a)前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を作製するのに用いられる宿主細胞、または前記宿主細胞の成分から、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を単離するステップと、
(b)前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物における実質的にすべての感染因子を不活化するのに十分な線量の電磁放射を、前記調製物へと適用するステップと
を含み、ステップ(b)の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物は、ステップ(b)の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と実質的に同じ免疫原性を有する、方法。 - 前記分離するステップ(a)が、少なくとも1つのクロマトグラフィーステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのクロマトグラフィーステップが、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー−クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合方式クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびサイズ除外クロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記分離するステップ(a)が、少なくとも1つの濾過ステップを含む、請求項1から3のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも1つの濾過ステップが、ノーマルフロー濾過、限外濾過、またはタンジェンシャルフロー濾過である、請求項4に記載の方法。
- 前記分離するステップ(a)が、少なくとも1つの遠心分離ステップを含む、請求項1から5のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記電磁放射が、可視光、x線放射、紫外線放射、およびガンマ放射からなる群より選択される、請求項1から6のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記紫外線放射が、UV−A、UV−B、およびUV−Cからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記紫外線放射の波長が、320nm〜400nmである、請求項7から8のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞が、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項1から9のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞が昆虫細胞であり、前記昆虫細胞は、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも1つの成分を発現するバキュロウイルス発現ベクターで感染させられる、請求項1から10のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞が、Bombyx mori宿主細胞、Spodoptera frugiperda宿主細胞、Choristoneura fumiferana宿主細胞、Heliothis virescens宿主細胞、Heliothis zea宿主細胞、Helicoverpa zea宿主細胞、Helicoverpa virescens宿主細胞、Orgyia pseudotsugata宿主細胞、Lymantria dispar宿主細胞、Plutella xylostella宿主細胞、Malacostoma disstria宿主細胞、Trichoplusia ni宿主細胞、Pieris rapae宿主細胞、Mamestra configurata宿主細胞、Mamestra brassica宿主細胞、およびHyalophora cecropia宿主細胞からなる群より選択される、請求項1から11のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記電磁放射線量が、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物におけるバキュロウイルスを不活化させるのに十分である、請求項11から12のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞であり、前記哺乳動物細胞は、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも1つの成分を発現する、アデノウイルス発現ベクター、アデノ関連ウイルス発現ベクター、アルファウイルス発現ベクター、ヘルペスウイルス発現ベクター、ポックスウイルス発現ベクター、またはレトロウイルス発現ベクターで感染させられる、請求項1から10のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記適用するステップ(b)の前に、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物にDNAインターカレート化合物を添加するステップをさらに含む、請求項1から14のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記DNAインターカレート化合物が、光反応性である、請求項15に記載の方法。
- 前記DNAインターカレート化合物が、ソラーレン、イソソラーレン、ならびにこれらの誘導体および類似体からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記電磁放射が、紫外線放射および可視光からなる群より選択される、請求項1から17のうちのいずれかに記載の方法。
- (c)前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物にアジュバントを添加するステップをさらに含む、請求項1から1718のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記分離するステップ(a)の前に、(i)gagポリペプチドと、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを併せて発現する、1または複数の発現ベクターを供給するステップと;(ii)前記1または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと;(iii)前記gagポリペプチドと、前記抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、請求項1から19のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記分離するステップ(a)の前に、(i)RSウイルスMポリペプチドと、RSウイルスFポリペプチドとを発現する、1または複数の発現ベクターを供給するステップと;(ii)前記1または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと;(iii)前記RSウイルスMポリペプチドと、前記RSウイルスFポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、請求項1から19のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記1または複数の発現ベクターが、RSウイルスGポリペプチドをさらに発現する、請求項21に記載の方法。
- 前記分離するステップ(a)の前に、(i)gagポリペプチドと、インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドとを併せて発現する、1または複数の発現ベクターを供給するステップと;(ii)前記1または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと;(iii)前記gagポリペプチドと、前記インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、請求項1から19のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記分離するステップ(a)の前に、(i)インフルエンザM1ポリペプチドと、赤血球凝集素ポリペプチドとを併せて発現する、1または複数の発現ベクターを供給するステップと;(ii)前記1または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと;(iii)前記インフルエンザM1ポリペプチドと、前記赤血球凝集素ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、請求項1から19のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記1または複数の発現ベクターが、ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに発現する、請求項23から24のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記1または複数の発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項20から25のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- ウイルスベクターを用いて、前記宿主細胞内において、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも1つの成分を発現させる、請求項1から27のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記感染因子が、前記ウイルスベクターを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記調製物が、1ミリリットル当たり20個未満の感染因子を含む、請求項1から29のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記調製物が、1ミリリットル当たり15個未満の感染因子を含む、請求項1から29のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記調製物が、1ミリリットル当たり10個未満の感染因子を含む、請求項1から29のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記調製物が、1ミリリットル当たり8個未満の感染因子を含む、請求項1から29のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記調製物が、1ミリリットル当たり6個未満の感染因子を含む、請求項1から29のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記調製物が、1ミリリットル当たり5個未満の感染因子を含む、請求項1から29のうちのいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ(b)の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも50パーセントの免疫原性を有する、請求項1から35のうちのいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ(b)の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも60パーセントの免疫原性を有する、請求項1から35のうちのいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ(b)の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも70パーセントの免疫原性を有する、請求項1から35のうちのいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ(b)の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも80パーセントの免疫原性を有する、請求項1から35のうちのいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ(b)の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも85パーセントの免疫原性を有する、請求項1から35のうちのいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ(b)の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも90パーセントの免疫原性を有する、請求項1から35のうちのいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ(b)の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも95パーセントの免疫原性を有する、請求項1から35のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、赤血球凝集素ポリペプチドを含み、前記免疫原性が、赤血球凝集抑制アッセイを用いて測定される、請求項1から42のうちのいずれかに記載の方法。
- 感染因子を実質的に含まないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を含む、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物であって、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、感染因子を実質的に含まないわけではないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と実質的に同じ免疫原性を有する、調製物。
- 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、昆虫または哺乳動物グリコシル化をさらに含む、請求項44に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記昆虫グリコシル化が、Autographa californica;Bombyx mori;Spodoptera frugiperda;Choristoneura fumiferana;Heliothis virescens;Heliothis zea;Helicoverpa zea;Helicoverpa virescens;Orgyia pseudotsugata;Lymantria dispar;Plutella xylostella;Malacostoma disstria;Trichoplusia ni;Pieris rapae;Mamestra configurata;Mamestra brassica;およびHyalophora cecropiaからなる群より選択される、請求項44または45に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、共有結合した光化学作用物質、タンパク質サブユニットの三次構造もしくは四次構造においてUV照射もしくはガンマ照射により誘導される変化、ガンマ照射により誘導される化学結合の開裂、またはUV照射もしくはガンマ照射により誘導される、脂質の酸化、タンパク質の架橋形成、アミノ酸の酸化、およびアミノ酸の修飾からなる群より選択される化学修飾から選択される1または複数の欠損をさらに示す、請求項44から46のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、以下の欠損:共有結合した光化学作用物質、タンパク質サブユニットの三次構造もしくは四次構造においてUV照射もしくはガンマ照射により誘導される変化、ガンマ照射により誘導される化学結合の開裂、またはUV照射もしくはガンマ照射により誘導される、脂質の酸化、タンパク質の架橋形成、アミノ酸の酸化、およびアミノ酸の修飾からなる群より選択される化学修飾のいずれもを含まない、請求項47に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、
(a)gagポリペプチドと、
(b)非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチド、または連結を形成するための抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドであって、前記抗原は天然では脂質ラフトと会合しない、ポリペプチドと
を含む、請求項44から48のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。 - 前記非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドが、GPIアンカーポリペプチド、ミリストイル化配列ポリペプチド、パルミトイル化配列ポリペプチド、二重アセチル化配列ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、および膜輸送ポリペプチドからなる群より選択される、請求項49に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドが、GPIアンカーポリペプチド、ミリストイル化配列ポリペプチド、パルミトイル化配列ポリペプチド、二重アセチル化配列ポリペプチド、カベオリンポリペプチド、フロチリンポリペプチド、シンタクシン−1ポリペプチド、シンタクシン−4ポリペプチド、シナプシンIポリペプチド、アデューシンポリペプチド、VAMP2ポリペプチド、VAMP/シナプトブレビンポリペプチド、シナプトブレビンIIポリペプチド、SNAREポリペプチド、SNAP−25ポリペプチド、SNAP−23ポリペプチド、シナプトタグミンIポリペプチド、およびシナプトタグミンIIポリペプチドからなる群より選択される、請求項49に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドが、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、融合タンパク質ポリペプチド、糖タンパク質ポリペプチド、およびエンベロープタンパク質ポリペプチドからなる群より選択される、請求項49に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記連結が、共有結合、イオン性相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属−配位子相互作用、および抗体−抗原相互作用からなる群より選択される、請求項49から52のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記連結が、共有結合である、請求項49から52のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記共有結合が、ペプチド結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、およびジスルフィド結合からなる群より選択される、請求項54に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記脂質ラフト会合ポリペプチドが、内在性膜タンパク質である、請求項49から55のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド性または非ペプチド性模倣体、低分子、脂質、糖脂質、および炭水化物からなる群より選択される、請求項49から56のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 赤血球凝集素ポリペプチドをさらに含む、請求項44から57のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- RSウイルスMポリペプチドをさらに含む、請求項44から58のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- RSウイルスGポリペプチドをさらに含む、請求項44から59のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- RSウイルスFポリペプチドをさらに含む、請求項44から60のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、
(a)gagポリペプチドと、
(b)赤血球凝集素ポリペプチドと
を含む、請求項44から47のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。 - 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、
(a)インフルエンザM1ポリペプチドと、
(b)赤血球凝集素ポリペプチドと
を含む、請求項44から47のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。 - ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに含む、請求項44から63に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記ウイルス様粒子と会合するアジュバントをさらに含む、請求項44から64に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記アジュバントが、前記ウイルス様粒子の内側に位置する、請求項65に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記アジュバントが、前記ウイルス様粒子の外側に位置する、請求項65に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記アジュバントを、前記gagポリペプチドと共有結合させて、共有結合を形成させる、請求項65から67のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記アジュバントを、前記脂質ラフト会合ポリペプチドと共有結合させて、共有結合を形成させる、請求項65から67のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 前記アジュバントが、フラジェリンのアジュバント活性断片を含む、請求項65から69のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
- 免疫系の疾患または症状を処置または予防する方法であって、免疫原性量の、請求項44から70のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または請求項1から43のうちのいずれかに記載の方法を用いて単離したエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を投与するステップを含む、方法。
- 前記投与するステップにより、被験体において、防御的免疫化反応が誘導される、請求項71に記載の方法。
- 前記投与するステップが、皮下送達、皮内送達、皮下送達、筋肉内送達、経口送達、経口送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群より選択される、請求項71から72のうちのいずれかに記載の方法。
- 免疫原性量の、請求項44から70のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または請求項1から43のうちのいずれかに記載の方法を用いて単離したエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、医薬組成物。
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