JP5679255B2 - 酸素耐性が増強された微生物およびその利用 - Google Patents
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Description
まず、不均衡変異導入法を用いて、Lactobacillus gasseri OLL 2716株(寄託番号 FERM BP-6999)に変異を導入し、得られた変異株を酸素充満下低温保存することにより、酸素存在下での生残性が向上した(酸素耐性を保持した)変異株のスクリーニングを行った。その結果、OR1-9株、OR2-5株と命名した2株の生残性が、野生株OLL 2716よりも著しく高いことが明らかとなった(図2、図3)。
〔1〕リボフラビン・トランスポーター遺伝子が、全体的にまたは部分的に不活化されていることを特徴とする、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体。
〔2〕リボフラビン・トランスポーター遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、〔1〕に記載の乳酸菌変異体。
〔3〕前記乳酸菌が、Lactobacillus gasseri菌またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus菌であることを特徴とする〔1〕または〔2〕に記載の乳酸菌変異体。
〔4〕Lactobacillus gasseri OR_1141(NITE BP-840)またはLactobacillus gasseri d1141(NITE BP-839)である、〔1〕または〔2〕に記載の乳酸菌変異体。
〔5〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を含む、Helicobacter pyloriの除菌用および感染防御用の飲食品。
〔6〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を含む、Helicobacter pylori感染症の予防および/または治療用の医薬品。
〔7〕下記(1)〜(3)の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法。
(1)乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
(2)(1)で得られた乳酸菌変異体および乳酸菌野生株を酸素充満下低温保存する工程および
(3)乳酸菌野生株よりも生残性の高い乳酸菌変異株を単離する工程
〔8〕〔7〕(1)の工程において、不均衡変異導入法により乳酸菌に変異を導入することを特徴とする、〔7〕に記載のスクリーニング方法。
〔9〕下記(1)〜(3)の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法。
(1)乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
(2)(1)で得られた乳酸菌変異体のリボフラビン・トランスポーター遺伝子において、変異を検出する工程、および
(3)(2)において、乳酸菌野生株と比較し、変異が検出された乳酸菌変異株を単離する工程。
〔10〕〔9〕(2)において、フレームシフト変異を検出することを特徴とする、〔9〕に記載のスクリーニング方法。
〔11〕〔9〕(2)において、配列番号:1の184番目または176番目に、1塩基挿入または1塩基欠損を含む変異が存在するかを検出することを特徴とする、〔9〕に記載のスクリーニング方法。
(1)NITE BP-840
(イ)寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
(所在地:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 郵便番号292-0818)
(ロ)寄託日:2009年11月18日
(ハ)受託番号:Lactobacillus gasseri OR_1141株(受託番号NITE BP-840)
(2)NITE BP-839
(イ)寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
(所在地:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 郵便番号292-0818)
(ロ)寄託日:2009年11月18日
(ハ)受託番号:Lactobacillus gasseri d1141株(受託番号NITE BP-839)
(1)乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
(2)(1)で得られた乳酸菌変異体および乳酸菌野生株を酸素充満下低温保存する工程、および
(3)乳酸菌野生株よりも生残性の高い乳酸菌変異株を単離する工程
(1)乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
(2)(1)で得られた乳酸菌変異体のリボフラビン・トランスポーター遺伝子において、変異を検出する工程、および
(3)(2)において、乳酸菌野生株と比較し、変異が検出された乳酸菌変異株を単離する工程。
〔実施例1〕
プライマー1 ATGAAGATGAAAGATGAAAC (配列番号:3)
プライマー2 AAGACCTGTTGTGGCAACGGCAAAAATCACATA (配列番号:4)
プライマー3 TATGTGATTTTTGCCGTTGCCACAACAGGTCTT (配列番号:5)
プライマー4 CCGTAATAAAAAGAGTGAGC (配列番号:6)
〔実施例2〕
〔実施例3〕
〔実施例4〕
プライマー5 TAATTCAATTGCATCCGCTGCT (配列番号:7)
プライマー6 GGGCTGGGTTGATTATAGTTGC (配列番号:8)
次いで、OLL 2716株からリボフラビン・トランスポーター遺伝子全域を欠失させた遺伝子破壊株を作製した(概略を図7に示す)。表3に示したプライマー7、8、9、10を用いたsplice-overlap extension PCR法により、OLL 2716株染色体DNAからリボフラビン・トランスポーター遺伝子コーディング領域全体を欠失したDNA断片を増幅した。このDNA断片をベクターpTERM09に結合し、pDeltaRT1プラスミドを作製した。pDeltaRT1プラスミドをOLL 2716株に形質転換し、二重交叉による遺伝子交換を上記同様に行った(図7)。最終ステップの継代培養は15μg/mlリボフラビンを含むMRS培地にて行った。得られたリボフラビン・トランスポーター遺伝子欠失株をd1141株と命名した。d1141株のMRS培地中での生残性もOR2-5株とほぼ同等であった(図8)。
プライマー7 GGGCTGGGTTGATTATAGTTGC (配列番号:9)
プライマー8 CTTTTAGAAAATATTGATGATTCCTCCATA (配列番号:10)
プライマー9 TATGGAGGAATCATCAATATTTTCTAAAAG (配列番号:11)
プライマー10 TGCCGACTTCAACTCCCTGC (配列番号:12)
他の乳酸菌種でも同様の効果が認められるかを確認するため、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusについて検討した。Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-11株染色体DNA上のリボフラビン・トランスポーター遺伝子の塩基配列を配列番号:2に示した。リボフラビン・トランスポーター遺伝子を欠失させるため、表4に示したプライマー11、12、13、14を用いたsplice-overlap extension PCR法により、T-11株染色体DNAからリボフラビン・トランスポーター遺伝子コーディング領域全体を欠失したDNA断片を増幅した。このDNA断片をベクターpSG+E2に結合し、pDeltaLBRT1プラスミドを作製した。pSG+E2は、pSYE2(非特許文献5)の複製タンパク質遺伝子repA中に、上記pTERM09と同じ温度感受性変異が導入されたプラスミドベクターである。Serrorらの方法(Serror, P., T. Sasaki, S. D. Ehrlich, and E. Maguin. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:46-52.)により、pDeltaLBRT1プラスミドをT-11株に形質転換した。プラスミドを含む形質転換株の選択は25μg/mlエリスロマイシンを含むMRS寒天培地プレートを用い、32℃、アネロパックによる嫌気条件下での培養にて行った。二重交叉による遺伝子交換は、上記OLL 2716株からのd1141株の作製(図7)と同様に行った。こうして得られたリボフラビン・トランスポーター遺伝子欠失株をT-11_d0726株と命名した。T-11_d0726株はT-11株に比較して、MRS培地中での酸素充満下での生残性が向上した(図9)。また、T-11_d0726株とT-11株をスキムミルク培地(10% (w/v)スキムミルク、0.1% (w/v)酵母エキス)で37℃終夜培養し、凝固した培地をそのまま酸素充満下で保存したところ、やはりT-11_d0726株はT-11株に比較して、生残性が向上していた(図10)。以上の結果から、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusにおいても、リボフラビン・トランスポーター遺伝子を欠失(失活)させることによって酸素充満下低温保存時の生残性を向上できることが示された。
プライマー11 TTGGCCGCTTGGACTACGAC (配列番号:13)
プライマー12 ATTTGTCTTTTCGCAATTAGCATACCTCCA (配列番号:14)
プライマー13 TGGAGGTATGCTAATTGCGAAAAGACAAAT (配列番号:15)
プライマー14 TGTCGATATAAACGAACGAC (配列番号:16)
Claims (9)
- 配列番号:1に記載の塩基配列において184番目にグアニンが挿入されおよび/または176番目のグアニンが欠損している塩基配列を有する遺伝子を有することを特徴とする、酸素耐性が増強されたLactobacillus gasseri乳酸菌変異体。
- 配列番号:1または2に記載の塩基配列を有する遺伝子が欠損していることを特徴とする酸素耐性が増強された乳酸菌変異体であって、当該乳酸菌変異体がLactobacillus gasseri乳酸菌変異体またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus乳酸菌変異体である、乳酸菌変異体。
- Lactobacillus gasseri OR_1141(NITE BP-840)またはLactobacillus gasseri d1141(NITE BP-839)である、請求項1または2に記載の乳酸菌変異体。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸菌変異体、該乳酸菌変異体含有物および/またはその処理物を含む、Helicobacter pyloriの除菌用および感染防御用の飲食品。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸菌変異体、該乳酸菌変異体含有物および/またはその処理物を含む、Helicobacter pylori感染症の予防および/または治療用の医薬品。
- 下記(1)〜(3)の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法であって、
変異が配列番号:1に記載の塩基配列を有する遺伝子の184番目におけるグアニンの挿入および/または176番目におけるグアニンの欠損であり、乳酸菌がLactobacillus gasseri菌であることを特徴とする、方法
(1)乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
(2)(1)で得られた乳酸菌変異体および乳酸菌野生株を酸素充満下低温保存する工程、および
(3)乳酸菌野生株よりも生残性の高い乳酸菌変異株を単離する工程。 - 下記(1)〜(3)の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法であって、
変異が配列番号:1または2に記載の塩基配列を有する遺伝子の欠損であり、乳酸菌がLactobacillus gasseri菌またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus菌であることを特徴とする、方法
(1)乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
(2)(1)で得られた乳酸菌変異体および乳酸菌野生株を酸素充満下低温保存する工程、および
(3)乳酸菌野生株よりも生残性の高い乳酸菌変異株を単離する工程。 - 下記(1)〜(3)の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法であって、
変異が配列番号:1に記載の塩基配列を有する遺伝子の184番目におけるグアニンの挿入および/または176番目におけるグアニンの欠損であり、乳酸菌がLactobacillus gasseri菌であることを特徴とする、方法
(1)乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
(2)(1)で得られた乳酸菌変異体の配列番号:1に記載の塩基配列を有する遺伝子において、変異を検出する工程、および
(3)(2)において、乳酸菌野生株と比較し、変異が検出された乳酸菌変異株を単離する工程。 - 下記(1)〜(3)の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法であって、
変異が配列番号:1または2に記載の塩基配列を有する遺伝子の欠損であり、乳酸菌がLactobacillus gasseri菌またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus菌であることを特徴とする、方法
(1)乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
(2)(1)で得られた乳酸菌変異体の配列番号:1または2に記載の塩基配列を有する遺伝子において、変異を検出する工程、および
(3)(2)において、乳酸菌野生株と比較し、変異が検出された乳酸菌変異株を単離する工程。
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