JP5665021B2 - 融合mhc分子連結磁気微粒子、抗原ペプチドのスクリーニング方法、組換えベクター、及び磁性細菌の形質転換体 - Google Patents
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Description
現在、癌の治療方法として免疫療法の開発が進められている。免疫療法の代表的な例として、ペプチドワクチン療法が挙げられる。
免疫機構の開始点として重要な役割を担っているのが、MHC/抗原ペプチド複合体である。T細胞は細胞表面のT細胞受容体(TCR)を介して抗原提示細胞表面または腫瘍細胞表面のMHC/抗原ペプチド複合体を認識することで機能を発揮する。したがって、ペプチドワクチン療法の開発のためには、簡便にかつ高効率で癌抗原ペプチドを同定することが重要である。
したがって、MHCクラスI結合性抗原ペプチド、並びにMHCクラスII結合性抗原ペプチドを、新たに数多く同定することが求められている。
上記の問題を解決する一手法として、α鎖とβ鎖を別々のプラスミドに導入して発現させる方法が大腸菌において報告されている(非特許文献4参照)。しかしながら、その手順は煩雑であり多くの時間を要するという問題がある。
を含む抗原ペプチドのスクリーニング方法である。
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法は、前記融合MHC分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に融合MHC分子内にジスルフィド結合を形成させる処理をされたものであることが好ましい。また、前記融合MHC分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に洗浄されたものであることが好ましい。
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法は、癌抗原ペプチドのスクリーニングに好適である。
本発明の融合MHC分子連結磁気微粒子は、磁性細菌由来の磁気微粒子と、前記磁気微粒子上に存在する磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片に連結された、MHC分子のα鎖またはその断片および、β鎖またはその断片ならびに、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドを含む抗原ペプチド結合能を有する融合MHC分子と、を備えたものである。
かかる構成とすることにより、抗原ペプチドと可逆的に結合及び解離することが可能な融合MHC分子の特性と、磁気誘導可能な磁気微粒子の特性とを利用して、抗原ペプチドを高効率かつ高感度でスクリーニングし得る融合MHC分子連結磁気微粒子を提供することができる。
本発明の融合MHC分子連結磁気微粒子は、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合MHC分子とが、第二のリンカーペプチドを介して連結されたものが好ましい。
天然型のMHC分子はα鎖とβ鎖のヘテロダイマーであるが、本発明における融合MHC分子は、MHC分子のα鎖またはその断片とMHC分子のβ鎖またはその断片との間に、第一のリンカーペプチドが配置された融合タンパク質である。
なお、本明細書において「融合タンパク質」とは、2以上のタンパク質またはその断片が連結されている、天然には見出されないタンパク質をいう。融合タンパク質は、それぞれのタンパク質またはその断片をコードする遺伝子をインフレームで連結させて、組換え的に発現させることにより製造することができる。
ヒトMHCはヒト白血球抗原(human leukocyte antigen:HLA)と呼ばれ、MHCクラスIにはHLA−A、HLA−B、HLA−Cの3種類が存在し、MHCクラスIIにはHLA−DR、HLA−DP、HLA−DQの3種類が存在する。HLAは個人間、人種間で多型性に富み、日本人に多い遺伝子型としては、MHCクラスIとして、HLA−A24、HLA−A2等、MHCクラスIIとして、HLA−DR4、HLA−DR1等が知られており、本発明においてはこれらが好適に選択され得る。
第一のリンカーペプチドは、α鎖またはその断片とβ鎖またはその断片との間に配置されていればよく、第一のリンカーペプチドのN末端側に、α鎖またはその断片、β鎖またはその断片のいずれが配置されていてもよい。即ち、α鎖またはその断片のC末端とβ鎖またはその断片のN末端とが第一のリンカーペプチドを介して連結されていてもよく、β鎖またはその断片のC末端とα鎖またはその断片のN末端とが第一のリンカーペプチドを介して連結されていてもよい。この際、α鎖またはその断片とβ鎖またはその断片とは、抗原ペプチドとの結合性や磁性細菌内での発現効率の観点から、既述のように適宜設計され得る。
具体的には、グリシンを4つ、次いで、セリンを1つ並べて配列した(G4S)を1ユニットとしたペプチドから構成されるリンカーペプチドが好ましいが、ここで、1ユニット内の5つのアミノ酸の配列は制限されるものでない。つまり、1ユニット内において、4つのグリシンと1つのセリンによる配列に関しては、任意に配されてよい。
本発明において「磁性細菌」とは、体内に、磁気微粒子(磁性細菌粒子、BacMPs:Bacterial Magnetic Particles、ともいう)を蓄積する能力を有する細菌である。例えば、Magnetospirillum magneticum AMB−1(FERM BP−5458,ATCC700264)、MS−1(IFO15272,ATCC31632,DSM3856)、MSR−1(IFO15272,DSM6361)、MGT−1(FERM P−16617)等のマグネトスピリラム種の磁性細菌、Desulfovibrio sp. RS−1(FERM BP−13283)等のデサルフォビブリオ種の磁性細菌を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
これらの磁性細菌は、粒径50〜100nm程度の磁気微粒子が10〜20個程度チェーン状に連なった構造をしており、厚さ約2〜4nmの有機膜で覆われている。また、磁性細菌によって合成されるBacMPsの形態としては、八面体形、六角柱、弾丸状などの形状があり、これらの形態は種特異的であることが観察されている。
AMB−1が合成するBacMPsは、マグネタイト(Fe3O4)からなる磁気微粒子であり、単磁区構造を持つ強磁性体であるため、弱い磁界に対しても強く反応することから、水溶液中で効率的に磁気による濃縮が行える。また、BacMPsは、脂質膜(脂質二重膜)を本来的に備える。この脂質二重膜を有するため、BacMPsは強磁性体でありながら水溶液中での分散性にも優れている。
前記脂質膜は、例えば界面活性剤を用いた処理等により、BacMPsから除去することができる。また、前記脂質膜を構成する脂質を、脂質以外の分子(ポリマー等)に交換することもできる。本発明においては、BacMPsは、前記脂質膜が除去されたものでもよく、前記脂質膜を構成する脂質が脂質以外の分子に交換されたものでもよい。脂質と交換可能なポリマーとしては、ブロック共重合体やリン脂質極性基を有するポリマー等が挙げられ、ブロック共重合体としては例えば、PMOXA−PDMS−PMOXAからなるブロック共重合体、リン脂質極性基を有するポリマーとしては例えば、MPCポリマーが挙げられる。
本発明において「磁気微粒子膜タンパク質」とは、前記脂質膜(磁気微粒子膜ともいう)に本来的に存在し得るタンパク質をいう。磁気微粒子膜タンパク質またはその断片は、前記脂質膜を除去しても、或いは前記脂質膜を構成する脂質を脂質以外の分子に交換しても、磁気微粒子上に存在し得る。本発明においては、磁気微粒子上に磁気微粒子膜タンパク質またはその断片が存在すれば、前記脂質膜はなくてもよい。磁気微粒子膜タンパク質またはその断片が磁気微粒子上に安定して存在し得、融合MHC分子が磁気微粒子上に安定して存在し得る観点からは、磁気微粒子は前記脂質膜を備えることが好ましい。
本発明においては、磁気微粒子上に磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片が存在し、当該磁気微粒子膜タンパク質の全部又は一部に、融合MHC分子が連結されている。磁気微粒子膜タンパク質の全部又は一部が融合MHC分子を磁気微粒子にアンカリングし、融合MHC分子を磁気微粒子表面に効率的に局在させることができる。
Mms13のアミノ酸配列は知られている(J Biol Chem 2003;278:8745-50)。Mms13は124アミノ酸からなる膜2回貫通型タンパク質であり、N末端およびC末端が磁性細菌の脂質膜表面にあると考えられている。Mms13の全領域を含む融合タンパク質は、磁気微粒子上に存在することが可能である。また、Mms13のC末端側の膜貫通ドメインでない領域はなくてもよく、当該領域を欠いたMms13を含む融合タンパク質も、磁気微粒子上に存在することが可能である。
本発明の融合MHC分子連結磁気微粒子は、前記融合MHC分子と前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片とが、第二のリンカーペプチドを介して連結されたものが好ましい。より具体的には、磁気微粒子膜タンパク質またはその断片のC末端と、融合MHC分子のN末端とが、第二のリンカーペプチドを介して連結されたものが好ましい。融合MHC分子が第二のリンカーペプチドを介して磁気微粒子膜タンパク質またはその断片に連結されていることで、磁気微粒子表面への各種分子や細胞の非特異的な吸着を低減することができ、抗原ペプチドのスクリーニング効率を向上させることができる。
第二のリンカーペプチドは、複数のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を1ユニットとし、当該1ユニットのアミノ酸配列が繰り返して配列されるポリペプチドであることが好ましい。1ユニット内のペプチド配列は、5つのアミノ酸の配列で構成されることが好ましいが、これに制限されるものではない。
上記では例として、アスパラギンとセリンを選択した場合を説明したが、1ユニットの配列はアスパラギン、グルタミン、トレオニン、チロシン及びセリンから任意に選択した組合せからなるアミノ酸配列が可能である。
この場合、第二のリンカーペプチド内において、プロテアーゼによる消化部位となる配列を設ける位置としては、特に制限されない。例えば、融合MHC分子に比較的長めのNSリンカーが付いた融合タンパク質を単離しようとする場合には、第二のリンカーペプチドは、(N4S)ユニットを0回〜数回繰返した後にプロテアーゼの認識配列を有し、更に(N4S)ユニットを10回程度以上、好ましくは15回〜20回程度繰り返す態様が好ましい。
また、融合MHC分子にNSリンカーが付かない、若しくは比較的短いNSリンカーが付いた融合タンパク質を単離しようとする場合には、第二のリンカーペプチドは、(N4S)ユニットを10回程度以上、好ましくは15回〜20回程度繰り返した後にプロテアーゼの認識配列を有し、更に(N4S)ユニットを0回〜数回繰り返す態様が好ましい。
本発明の融合MHC分子連結磁気微粒子を製造する方法は、特に制限されないが、磁性細菌を用いて製造することができる。具体的には、少なくとも下記の工程を含む製造方法とし得る。即ち、磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質又はその断片と抗原ペプチド結合能を有する融合MHC分子とが連結された融合タンパク質を磁性細菌内で発現させる発現工程と、磁性細菌から磁気微粒子を単離する単離工程とを含む製造方法である。
より詳細には、これら融合タンパク質を磁性細菌内で合成するためのDNAを作製し、当該DNAを公知の遺伝子技術によってプラスミドなどのベクターに導入し、組換えベクターを得る。この得られた組換えベクターを、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等の公知の導入技術によって、前記融合タンパク質を発現することができる発現系を含んでなる磁性細菌に導入し、磁性細菌の形質転換体を得る。そして、当該磁性細菌を公知の培養技術により培養することによって、前記融合タンパク質を磁性細菌内で発現させることができる。
前記組換えベクターは、更に、(iii)前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合MHC分子とを連結する第二のリンカーペプチドをコードするDNAを含み、5’側から(i)(iii)(ii)の順で配置された態様が好ましい。
ここで、融合MHC分子、磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片、及び第二のリンカーペプチドの詳細及び好ましい態様は、既述のとおりである。
DNAの塩基配列は、磁性細菌内での発現をより容易にするため、磁性細菌で多用されるコドン使用頻度に基づいて作成されることが好ましい。例えば、磁性細菌としてMagnetospirllum magneticum AMB−1のコドン使用頻度データベースを参照する。
MHCクラスI由来の融合MHC分子をコードするDNAとしては、下記の(a)、(b)又は(c)が好ましいDNAの具体例として挙げられる。
(a)配列番号7の塩基配列、配列番号2の塩基配列、及び配列番号8の塩基配列がこの順に配置されてなるDNA、
(b)前記(a)のDNAがコードするアミノ酸配列の1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり抗原ペプチド結合能を有するタンパク質をコードするDNA、
(c)前記(a)又は(b)のDNAと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、抗原ペプチド結合能を有するタンパク質をコードするDNA。
MHCクラスII由来の融合MHC分子をコードするDNAとしては、下記の(d)、(e)又は(f)が好ましいDNAの具体例として挙げられる。
(d)配列番号9の塩基配列、配列番号3の塩基配列、及び配列番号10の塩基配列がこの順に配置されてなるDNA、
(e)前記(d)のDNAがコードするアミノ酸配列の1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり抗原ペプチド結合能を有するタンパク質をコードするDNA、
(f)前記(d)又は(e)のDNAと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、抗原ペプチド結合能を有するタンパク質をコードするDNA。
本明細書における「ストリンジェントな条件下」とは、相同性が高いDNA同士、例えば60%以上、好ましくは80%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜65℃、好ましくは65℃での条件をいう。
本明細書において「相同性」を具体的な数値として示す場合、例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(NCBI、又はAltschul, S. F. et al. J. Mol. Biol., 215:403-410(1990))を用いた配列比較で決定することができる。
前記ベクターは、磁気微粒子膜タンパク質をコードするDNAのプロモーター領域の配列(プロモーター配列)を搭載することが好ましい。このプロモーター配列は、例えば、特開2006−75103号公報、特開2006−314314号公報等に記載されている。これらの中でも、高転写活性を有するPmms16プロモーター、Pmsp1プロモーター、Pmsp3プロモーターを好適に用いることができる。
また、前記ベクターは、選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子(例えば、アンピシリン耐性遺伝子など)を含んでよい。
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法は、本発明の融合MHC分子連結磁気微粒子と抗原ペプチドを含む試料とを接触させること、前記接触後の融合MHC分子連結磁気微粒子から、前記接触により融合MHC分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出すること、を含む。
かかる構成とすることにより、抗原ペプチドを高効率かつ高感度でスクリーニングすることができる。
抽出した抗原ペプチドについては、公知の解析技術により、分子量、アミノ酸配列、立体構造等を同定することが可能である。
融合MHC分子連結磁気微粒子を磁気を利用して濃縮する方法としては、特に制限されず任意の方法でよい。具体的な方法としては、実施例に記載の方法が挙げられる。
前記酸化処理の方法としては、特に制限されず、融合MHC分子内にジスルフィド結合を形成させ得る公知のいかなる方法でもよい。例えば、適切な濃度の還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとを含むバッファー中で、融合MHC分子連結磁気微粒子をインキュベートする方法が好ましく挙げられる。当該方法においては、還元型グルタチオンの濃度としては、1〜5mMが好ましく、酸化型グルタチオンの濃度としては、0.01〜0.5mMが好ましい。より好ましくは、還元型グルタチオンの濃度を5mMとし、酸化型グルタチオンの濃度を0.5mMとする。インキュベートの温度及び時間は特に制限されないが、4℃又は室温(20〜26℃)にて30分〜10時間程度としてよい。
上記の還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとを含むバッファー中でインキュベートする方法は、例えば、Methods in Molecular Biology 2009;524:383-405に記載されており、具体的な方法としては、実施例に記載の方法が挙げられる。
洗浄方法としては、融合MHC分子連結磁気微粒子から融合MHC分子を失わせない限りにおいて特に制限されない。例えば、前記接触により融合MHC分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出する際に用い得る抽出用の緩衝液の中で、室温にて静置又は緩やかに撹拌することで洗浄する方法が挙げられる。
上記の緩衝液としては、例えば酸性の緩衝液、より具体的には、0.05〜0.2mol/L程度、好ましくは0.1〜0.15mol/L程度のクエン酸を含有するpH3程度のリン酸緩衝液を例示することができる。
試薬類は全て研究用の市販特級品またはそれに準じたものを用い、試薬等の調製は適宜、蒸留水または蒸留水をMilliQ Lab(日本ミリポア)で処理した純水を用いた。
画像解析は、画像解析ソフトウェアAqua cosmos(浜松ホトニクス)を用いて行った。
N末端ビオチン標識ペプチドは、株式会社ベックスに合成を依頼し、その他のペプチドは、Gl Biochem (Shanghai) Ltd.に合成を依頼した。これまでのMHCに関する研究で、ペプチドのN末端をビオチン化してもMHC−ペプチド間の結合を妨げないことが示されており(J Cell Biol 2004;119:531-42)、本実施例では、ペプチドのN末端に下記のビオチン化C6リンカーを連結したペプチドを使用した。
<融合MHCクラスI分子発現用プラスミドの構築と磁性細菌の形質転換>
Mms13と、NSリンカーと、HLA−A24(実際には、HLA−A24のβ鎖とα鎖とがGSリンカーを介して連結された融合タンパク質)とを、この順番に融合させた融合タンパク質(以下、「Mms13−NS linker−HLA−A24融合タンパク質」という)の発現用プラスミドpUM13LA24(図1参照)を、以下のようにして構築した。なお、HLA−A24遺伝子は、日本人に認められるMHCクラスI型遺伝子の中で、最も多く見られる遺伝子である。
pUMGP16M13は、SspI消化したpUMGにPmms16プロモーター、及びその下流にmms13遺伝子を含むPCR産物をライゲーションしたプラスミドである(Appl Environ Microbiol 2006;72:465-71, Methodのconstruction of expression vectorsを参照)。なお、pUMP16M13は、アンピシリン耐性遺伝子を含む。
遺伝子組換えの際に用いる大腸菌は、Top10 (インビトロジェン) を用いた。
<融合MHCクラスII分子発現用プラスミドの構築と磁性細菌の形質転換>
Mms13と、NSリンカーと、HLA−DR4(実際には、HLA−DR4のα鎖とβ鎖とがGSリンカーを介して連結された融合タンパク質)とを、この順番に融合させた融合タンパク質(以下、「Mms13−NS linker−HLA−DR4融合タンパク質」という)の発現用プラスミドpUM13LDR4(図2参照)を、以下のようにして構築した。なお、HLA−DR4遺伝子は、日本人に認められるMHCクラスII型遺伝子の中で、最も多く見られる遺伝子である。
次に、HLA−DR4のα鎖遺伝子(配列番号9)とβ鎖遺伝子(配列番号10)とが、GSリンカー(配列番号1)をコードする遺伝子(配列番号3)を介して連結され、更にその3’末端にFLAG−tag(配列番号11)をコードする遺伝子(配列番号13)が連結された融合遺伝子(末尾には更にストップコドンtgaが付加されている)(MBL社に遺伝子合成を発注)を、pUM13L(100)のNSリンカー遺伝子の下流に導入し、プラスミドpUM13LDR4を構築した。
遺伝子組換えの際に用いる大腸菌は、Top10 (インビトロジェン) を用いた。
<磁性細菌を用いた融合MHC分子連結磁気微粒子の作製>
実施例1及び2で得られた磁性細菌AMB−1の各形質転換体のプレカルチャーを、それぞれ10LのMSGM(magnetic spirillum growth medium)(J Bacteriol 1979;140:720-9)に植菌し(プレカルチャー/MSGM=1/1000(v/v))、室温(24〜26℃)にて約5〜7日間、静置培養した。植菌時には、MSGMをアルゴンガスでバブリング(pUM13LA24の場合は5〜10分間、pUM13LDR4の場合は30〜40分間)することにより微好気状態を形成した。なお、MSGMにはアンピシリンを添加した(5.0μg/ml)。
この菌体破砕液をガラス容器に移し、ガラス容器の外側にNd−Fe−B(ネオジウム−鉄−ボロン)磁石を設置することにより、融合MHC分子連結磁気微粒子を集積させ、菌体破砕液の上清を除去した(以下、磁石を用いた集積物と上清との分離を「磁気分離」という)。HEPES緩衝液を加え懸濁した後に磁気分離することを10回繰り返し、融合MHC分子連結磁気微粒子の洗浄を行った。洗浄した融合MHC分子連結磁気微粒子は、PBS緩衝液に懸濁し、4℃で保存した。
以上のようにして、Mms13−NS linker−HLA−A24融合タンパク質を連結した磁気微粒子(以下、単に「HLA−A24連結磁気微粒子」という)、及びMms13−NS linker−HLA−DR4融合タンパク質を連結した磁気微粒子(以下、単に「HLA−DR4連結磁気微粒子」という)を得た。
<磁気微粒子上のMHCの発現評価>
実施例3で得られたHLA−A24連結磁気微粒子1.0mg、HLA−DR4連結磁気微粒子8.0mgに、1%SDS溶液をそれぞれ30μl、25μl添加した。それぞれをVoltexミキサー及び超音波により撹拌しながら煮沸した(100℃、20〜30分)。次いで、磁気分離により上清を回収し各サンプルとした。各サンプルに3×SDSサンプルバッファーを加え(HLA−A24のサンプルには15μl、HLA−DR4のサンプルには12.5μl)、5分間煮沸後、SDS−PAGE(アクリルアミド濃度12.5%)を行った。続いて、泳動後のゲルをPVDF膜へセミドライ法で転写した。転写後のPVDF膜に対し、FLAG配列に対するアルカリホスファターゼ(ALP)標識マウス由来抗FLAGモノクローナル抗体(シグマ アルドリッチ ジャパン)(1μg/ml、PBS−T)(HLA−A24のサンプルには15ml、HLA−DR4のサンプルには10ml)を反応させた(室温、1時間)。PBS−Tによる10分間の洗浄を3回繰り返した後、基質としてNBT/BCIP-Blue Liquid Substrate(SIGMA,USA)を加え発色させた。
Mms13−NS linker−HLA−A24融合タンパク質は75kDaであり、当該サイズにバンドが確認された。Mms13−NS linker−HLA−DR4融合タンパク質は74kDaであり、当該サイズにバンドが確認された。本結果により、磁気微粒子上へのHLA−A24の発現、及びHLA−DR4の発現が確認された。
<ELISAによる磁気微粒子上のMHCクラスIの発現評価>
実施例3で得られたHLA−A24連結磁気微粒子100μgに、ALP標識マウス由来抗FLAGモノクローナル抗体100μl(10μg/ml)を添加し、30分室温で反応させた。反応後、PBSで洗浄し(200μl×3回)、磁気微粒子の懸濁液50μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移した。50μlのルミホス530(Lumigen PPD, 4-Methyoxy-4(3-phosphatephenyl) spiro[1, 2-dioxeteane-3, 2’adamantine]disodium salt、3.3 ×10−4M)(和光純薬)を加え2分間室温で反応させた後、発光プレートリーダー(Lucy2 luminescence reader、アロカ)を用いて発光強度(kcounts/sec)を測定した。結果を表1に示す。
<融合MHCクラスI分子連結磁気微粒子の機能評価>
[ビオチン標識癌抗原ペプチドを用いたHLA−A24連結磁気微粒子の結合能評価]
実施例3で得られたHLA−A24連結磁気微粒子100μgに、PBSで50μg/mlに調製したビオチン標識癌抗原ペプチドを1ml加え、4℃で3時間反応させた。癌抗原ペプチドとしては、MAGE1ペプチド(NYKHCFPEI)(配列番号14)、CDC27ペプチド(FSWAMDLDPKGA)(配列番号15)を用いた。
反応後、PBSで洗浄し(200μl×3回)、ALP標識ストレプトアビジン(Roche、PBSで1000倍希釈)1mlを加え、室温で30分間反応させた。次いで、PBSで洗浄し(200μl×3回)、50μlのPBSに懸濁したものをサンプルとした。96ウェルマイクロタイタープレートに移し、50μlのルミホス530を加え2分間室温で反応させた後、前記発光プレートリーダーを用いて発光強度(kcounts/sec)を測定した。結果を表2に示す。
<融合MHCクラスI分子連結磁気微粒子の機能評価>
[グルタチオン処理によるHLA−A24連結磁気微粒子の結合能の変化の評価]
実施例6において、ビオチン標識ペプチドの調製に用いたPBSを、5mM還元型グルタチオンと0.5mM酸化型グルタチオンを含むPBSに代え、癌抗原ペプチドとして、MAGE1ペプチド(配列番号14)、CDC27ペプチド(配列番号15)、及びCMVpp65ペプチド(QYDPVAALF)(配列番号16)を用いた以外は実施例6と同様にして、発光強度(kcounts/sec)を測定した。結果を表3に示す。
なお、CMVpp65ペプチドは、HLA−A24への結合が報告されている癌抗原ペプチドである(Immunol Lett 2004;95:199-205)。
また、HLA−A24連結磁気微粒子は、グルタチオンを含むPBSで処理した場合に発光強度が増大することから、酸化条件においてHLA−A24連結磁気微粒子と癌抗原ペプチドとの結合量が増大することが確認された。このことから、HLA−A24に存在するシステイン間のジスルフィド結合が酸化条件において強化され、癌抗原ペプチドとの結合能が向上したことが示唆された。
<融合MHCクラスI分子連結磁気微粒子の機能評価>
[ELISAによるペプチド結合時のHLA−A24の構造評価]
実施例3で得られたHLA−A24連結磁気微粒子100μgに、PBS又は5mM還元型グルタチオンと0.5mM酸化型グルタチオンを含むPBSで50μg/mlに調製した癌抗原ペプチドを1ml加え、4℃で3時間反応させた。癌抗原ペプチドとしては、MAGE1ペプチド(配列番号14)、CDC27ペプチド(配列番号15)、及びCLCA2ペプチド(LLGNCLPTV)(配列番号17)を用いた。
反応後、PBSで洗浄し(200μl×3回)、一次抗体としてマウス由来抗HLA−ABCモノクローナル抗体(W6/32)50μl(10μg/ml、PBS)を加え、室温で30分反応させた。反応後、PBSで洗浄し(200μl×3回)、2次抗体としてALP標識ヤギ由来抗マウスIgG抗体(インビトロジェン)50μl(10μg/ml、PBS)を加え、室温で30分反応させた。その後PBSで洗浄し(200μl×3回)、50μlのPBSに懸濁しサンプルとした。96ウェルマイクロタイタープレートに移し、50μlのルミホス530を加え2分間室温で反応させた後、前記マイクロプレートリーダーを用いて発光強度(kcounts/sec)を測定した。結果を表4に示す。
マウス由来抗HLA−ABCモノクローナル抗体W6/32は、抗原ペプチドと複合体を形成し、立体構造が保たれたHLAにのみ特異的に結合することが報告されている(Cell 1978;14:9-20)。
<融合MHCクラスI分子連結磁気微粒子の機能評価>
[HLA−A24結合性抗原ペプチドのスクリーニング]
実施例3で得られたHLA−A24連結磁気微粒子1mgに、クエン酸バッファー(0.06mol/L Na2HPO4、0.13mol/L クエン酸、pH3.0)50μlを加え30分間室温でインキュベートすることで、HLA−A24連結磁気微粒子を洗浄した。その後、磁気分離により上清を取り除き、HLA−A24連結磁気微粒子を回収した。
洗浄したHLA−A24連結磁気微粒子に、PBSで50μg/mlに調製したMAGE1ペプチド(配列番号14)とCDC27ペプチド(配列番号15)とを1:1の割合又は1:10の割合で混合したペプチド溶液をそれぞれ1mlずつ加え、4℃で3時間反応させた。反応後、磁気分離により上清を取り除き、HLA−A24連結磁気微粒子を回収した。次いで、HLA−A24連結磁気微粒子に前記クエン酸バッファー50μlを加え、30分間室温でインキュベートした。磁気分離により上清を回収し、上清を下記のA溶液で10倍希釈し、上清中に含まれたペプチドをNano−LC/MSにより解析した。結果を図5に示す。
・温度:室温
・流速:300nL/min
・勾配:A溶液;100%;2.1分、B溶液;0−8% Linear Gradient;3分、B溶液;8−45%Linear Gradient;30分、B溶液;45−100% Linear Gradient;5分、B溶液;100%;10分、A溶液;100%;20分
・計測時間:70分
図5に示すとおり、ペプチド混合比を1:1にした場合には、MAGE1ペプチドに相当するm/z 1489.59に最も強いピークが検出された。また、ペプチド混合比を1:10にした場合には、MAGE1ペプチドに2つプロトンが付加された際の質量電荷比に相当するm/z 745.62に最も強いピークが検出された。
このことから、HLA−A24連結磁気微粒子を用いることで抗原ペプチドを濃縮して抽出することができ、Nano−LC/MS等により抗原ペプチドの同定が可能であることが示された。
<融合MHCクラスII分子連結磁気微粒子の機能評価>
[ビオチン標識ペプチドを用いた試料濃度およびアッセイ時間の評価]
使用するビオチン標識ペプチドはDMSO溶液で5mMに調節後、PBSで各濃度に調節して使用した。
実施例3で得られたHLA−DR4連結磁気微粒子100μgに、PBSで0〜60μM(0、12.5、25、50、及び60μM)に調製したビオチン標識癌抗原ペプチドを100μl加え、90分間室温で反応させた。ポジティブコントロールのペプチドとしては、CLIPペプチド(PKPPKPVSKMRMATPLLMQA)(配列番号18)、及びネガティブコントロールのペプチドとしては、HER2ペプチド(TYLPTNASL)(配列番号19)を用いた。
その後PBSで洗浄し(100μl×3回)、ALP標識ストレプトアビジン(PBSで1000倍希釈)100μlを加え、30分間室温で反応させた。次いで、Tris−HCl(pH7.4)で洗浄し(150μl×2回)、50μlのTris−HClに懸濁させてサンプルとした。96ウェルマイクロタイタープレートに移し、50μlのルミホス530を加え5分間室温で反応させた後、前記発光プレートリーダーを用いて発光強度(kcounts/sec)を測定した。結果を表5に示す。
表6に示すとおり、ペプチド反応時間を検討した結果、反応時間5時間で最大量のペプチドの結合が見られた。
<融合MHCクラスII分子連結磁気微粒子の機能評価>
[ビオチン標識癌抗原ペプチドを用いたHLA−DR4連結磁気微粒子の結合能評価]
実施例3で得られたHLA−DR4連結磁気微粒子100μgに、PBSで50μMに調製したビオチン標識癌抗原ペプチドを100μl加え、90分間室温で反応させた。癌抗原ペプチドとしては、HER2ペプチド(配列番号19)、NY−ESO−1 119−143ペプチド(PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR)(配列番号20)、MAGE−A3 146−160ペプチド(FFPVIFSKASSSLQL)(配列番号21)を用いた。
その後PBSで洗浄し(100μl×3回)、ALP標識ストレプトアビジン(PBSで1000倍希釈)100μlを加え、30分間室温で反応させた。次いで、PBSで洗浄し(100μl×3回)、Tris−HClにバッファーに交換後、50μlのTris−HClに懸濁したものをサンプルとした。96ウェルマイクロタイタープレートに移し、50μlのルミホス530を加え5分間室温で反応させた後、前記発光プレートリーダーを用いて発光強度(kcounts/sec)を測定した。結果を表7に示す。
<融合MHCクラスII分子連結磁気微粒子の機能評価>
[ELISAによるペプチド結合時のHLA−DR4の構造評価]
実施例3で得られたHLA−DR4連結磁気微粒子100μgに、PBSで50μMに調製した癌抗原ペプチドを100μl加え、90分間室温で反応させた。癌抗原ペプチドとしては、HER2ペプチド(配列番号19)、NY−ESO−1 119−143ペプチド(配列番号20)、MAGE−A3 146−160ペプチド(配列番号21)を用いた。
その後、一次抗体としてPBSに懸濁したマウス由来抗HLA−DRモノクローナル抗体L243(Biodesign International)100μlを加え、室温で30分反応させた。反応後、PBSで洗浄し(100μl×3回)、2次抗体としてALP標識ヤギ由来抗マウスIgG抗体(インビトロジェン)100μlを加え、室温で30分反応させた。その後PBSで洗浄し(100μl×3回)、50μlのPBSに懸濁しサンプルとした。96ウェルマイクロタイタープレートに移し、50μlのルミホス530を加え5分間室温で反応させた後、前記マイクロプレートリーダーを用いて発光強度(kcounts/sec)を測定した。結果を表8に示す。
<融合MHCクラスII分子連結磁気微粒子の機能評価>
[ビオチン標識癌抗原ペプチドを用いたHLA−DR4連結磁気微粒子の抗原特異的結合能の評価]
実施例3で得られたHLA−DR4連結磁気微粒子200μgに、PBSで50μMに調製したビオチン標識癌抗原ペプチドを100μl加え、90分間室温で反応させた。癌抗原ペプチドとしては、MAGE−A3 146−160ペプチド(配列番号21)、MAGE−A3 146−158ペプチド(FFPVIFSKASSSL)(配列番号22)、及びMAGE−A3 146−156ペプチド(FFPVIFSKASS)(配列番号23)を用いた。
その後PBSで洗浄し(100μl×3回)、ALP標識ストレプトアビジン(PBSで1000倍希釈)100μlを加え、30分間室温で反応させた。その後PBSで洗浄し(100μl×3回)、Tris−HClにバッファーに交換後、50μlのTris−HClに懸濁したものをサンプルとした。96ウェルマイクロタイタープレートに移し、50μlのルミホス530を加え5分間室温で反応させた後、前記マイクロプレートリーダーを用いて発光強度(kcounts/sec)を測定した。結果を表9に示す。
<融合MHCクラスII分子連結磁気微粒子の機能評価>
[HLA−DR4結合性抗原ペプチドのスクリーニング]
実施例3で得られたHLA−DR4連結磁気微粒子1mgに、PBSで50μMに調製したMAGE−A3 146−160ペプチド(配列番号21)を100μl加え、90分間室温で反応させた。反応後、磁気分離により上清を取り除き、HLA−DR4連結磁気微粒子を回収した。次いで、HLA−DR4連結磁気微粒子にクエン酸バッファー(0.06mol/L Na2HPO4、0.13mol/L クエン酸、pH3.0)50μlを加え、30分間室温でインキュベートした。磁気分離により上清を回収し、上清中に含まれたペプチドを、実施例9と同様にしてNano−LC/MSにより解析した。結果を図6に示す。
よって、本発明の融合MHC分子連結磁気微粒子を用いることにより、高効率かつ高感度な抗原ペプチドのスクリーニング方法を提供することができる。
Claims (10)
- 磁性細菌由来の磁気微粒子と、
前記磁気微粒子上に存在する磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と、
前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片に連結された、第一のリンカーペプチドによって一本鎖化された融合MHC分子と、
前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合MHC分子とを連結する第二のリンカーペプチドと、
を備え、
前記融合MHC分子が、
MHCクラスI分子のα鎖またはその断片であって、α 1 ドメイン、α 2 ドメインおよびα 3 ドメインを含む断片と、MHCクラスI分子のβ鎖と、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドと、からなる抗原ペプチド結合能を有する融合MHC分子;
MHCクラスII分子のα鎖またはその断片であって、α 1 ドメインおよびα 2 ドメインを含む断片と、MHCクラスII分子のβ鎖またはその断片であって、β 1 ドメインおよびβ 2 ドメインを含む断片と、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドと、からなる抗原ペプチド結合能を有する融合MHC分子;
のいずれかであり、
前記第二のリンカーペプチドが、配列番号4で示されるポリペプチドまたは配列番号5で示されるポリペプチドである、
融合MHC分子連結磁気微粒子。 - 前記第一のリンカーペプチドが、(グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン)を2回〜6回繰り返すアミノ酸配列のポリペプチドである、請求項1に記載の融合MHC分子連結磁気微粒子。
- 請求項1又は請求項2に記載の融合MHC分子連結磁気微粒子と抗原ペプチドを含む試料とを接触させること、
前記接触後の融合MHC分子連結磁気微粒子から、前記接触により融合MHC分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出すること、
を含む抗原ペプチドのスクリーニング方法。 - 更に、前記接触後の融合MHC分子連結磁気微粒子を磁気を利用して濃縮することを含む請求項3に記載の抗原ペプチドのスクリーニング方法。
- 前記融合MHC分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に融合MHC分子内にジスルフィド結合を形成させる処理をされたものである請求項3又は請求項4に記載の抗原ペプチドのスクリーニング方法。
- 前記融合MHC分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に洗浄されたものである請求項3から請求項5のいずれか1項に記載の抗原ペプチドのスクリーニング方法。
- 前記抗原ペプチドが癌抗原ペプチドである請求項3から請求項6のいずれか1項に記載の抗原ペプチドのスクリーニング方法。
- 磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片をコードするDNA(i)と、
第一のリンカーペプチドによって一本鎖化された融合MHC分子をコードするDNA(ii)と、
前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合MHC分子とを連結する第二のリンカーペプチドをコードするDNA(iii)と、
を含み、
前記融合MHC分子が、
MHCクラスI分子のα鎖またはその断片であって、α 1 ドメイン、α 2 ドメインおよびα 3 ドメインを含む断片と、MHCクラスI分子のβ鎖と、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドと、からなる抗原ペプチド結合能を有する融合MHC分子;
MHCクラスII分子のα鎖またはその断片であって、α 1 ドメインおよびα 2 ドメインを含む断片と、MHCクラスII分子のβ鎖またはその断片であって、β 1 ドメインおよびβ 2 ドメインを含む断片と、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドと、からなる抗原ペプチド結合能を有する融合MHC分子;
のいずれかであり、
前記第二のリンカーペプチドが、配列番号4で示されるポリペプチドまたは配列番号5で示されるポリペプチドである、
組換えベクター。 - 前記DNA(i)、前記DNA(ii)、および前記DNA(iii)が、5’側からDNA(i)、DNA(iii)、DNA(ii)の順で連続して配置されている、請求項8に記載の組換えベクター。
- 請求項8又は請求項9に記載の組換えベクターを含む磁性細菌の形質転換体。
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