JP2018505682A - 新規マイナー組織適合抗原およびその使用 - Google Patents

新規マイナー組織適合抗原およびその使用 Download PDF

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Abstract

新規マイナー組織適合抗原（ＭｉＨＡ）が記載される。これらの新規ＭｉＨＡは、２つの特徴に基づいて選択された：（ｉ）それらは、少なくとも０．０５のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する座位によりコードされる；および（ｉｉ）それらは適切な組織分布を有する。これらの新規ＭｉＨＡに関連する組成物、核酸および細胞も記載される。本出願はまた、これらの新規ＭｉＨＡ、および関連組成物、核酸および細胞の、癌免疫療法に関連する、例えば、白血病などの血液癌の処置のための用途における使用も開示する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年２月９日に出願された米国特許仮出願第６２／１１３，７２７号の利益を主張する。この仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は一般に、組織適合抗原、より具体的には、マイナー組織適合抗原（ＭｉＨＡ）および、例えば、免疫療法におけるその使用に関する。
いくつかの処置法が癌免疫療法にとって効果的であることが明らかになったが、癌免疫治療専門家が、治療器具として、２つ以上の武器を必要としているのは疑う余地がない。特に、高対低変異荷重を有する腫瘍に対しては異なる手法が必要である１。発癌性物質により誘発される固形腫瘍（例えば、黒色腫、肺癌）は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を生じさせる多数の変異を発現しており、このＴＳＡは、２つの手法：エクスビボで増殖させた腫瘍浸潤性リンパ球の注入およびチェックポイント分子に対する抗体の投与、を使って標的化することができる１−３。しかし、ＴＳＡは、その極めて低い変異荷重のために、血液癌（ＨＣ）上では極めて希であり、したがって、ＨＣの免疫療法のためには、代わりの標的を見つける必要がある１。遺伝子操作されたキメラ抗原受容体を有するＴ細胞をＣＤ１９またはＣＤ２０抗原標的にリダイレクトすることにより、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置にめざましい効果が得られ、癌免疫療法におけるブレークスルーとなっている４、５。しかし、キメラ抗原受容体が骨髄性悪性腫瘍の処置に使用し得るかどうかは推測の域を出ない６。
主要組織適合抗原（ＭＨＣ）分子は、人間の６番染色体上に位置する密接に連鎖した多型遺伝子座によりコードされる膜貫通型糖タンパク質である。それらの主な役割は、ペプチドを結合し、それらをＴ細胞にそれらを提示することである。ＭＨＣ分子（ヒトのＨＬＡ）は、数千のペプチドをヒト細胞の表面に提示する。これらのＭＨＣ結合ペプチド（ＭＡＰ）は、免疫ペプチドームと呼ばれる。一卵性双生児（同系個体としても知られる）の免疫ペプチドームは同一である。対照的に、ＨＬＡ同一非同系個体由来の細胞上に存在するＭＡＰは、次の２つのカテゴリーに分類される：ｉ）不変ゲノム領域が起源であり、したがって、所与のＨＬＡ型の全ての個体に存在する単型ＭＡＰ、およびｉｉ）多型ゲノム領域によりコードされ、したがって、一部の個体には存在するがその他の個体には存在しない多型ＭＡＰ（すなわちＭｉＨＡ）。ＭｉＨＡは、Ｔ細胞の視点から見ると本質的に遺伝的な多型である。ＭｉＨＡは通常、両アレルの座位によりコードされ、その座位で各アレルは優性（ＭＡＰを生成する）または劣性（ＭＡＰを生成しない）であり得る。実際に、ＭＡＰをコードするゲノム配列における非同義一塩基多型（ｎｓ−ＳＮＰ）は、ＭＡＰ生成を妨げる（劣性アレル）か、またはバリアントＭＡＰを生成する（優性アレル）。
癌免疫療法に使用できる別の戦略は、Ｔ細胞養子免疫療法（ＡＴＣＩ）である。「ＡＴＣＩ」という用語は、患者（自家輸注）、遺伝的に同一である双生児（同系輸注）、または非同一ＨＬＡ適合ドナー（同種輸注）由来のＴリンパ球での患者の輸注を意味する。これまで、ＡＴＣＩは、ワクチンよりもはるかに高い癌の寛解率および治癒率をもたらしてきており、最も広く使用されている形態の癌のＡＴＣＩは、同種造血幹細胞移植（ＡＨＣＴ）である。
同種造血細胞移植（ＡＨＣＴ）により誘導される、いわゆる移植片対白血病（ＧＶＬ）効果は、主に宿主ＭｉＨＡに対するＴ細胞応答による。ドナーが一卵性双生児（レシピエントとＭｉＨＡの相違が認められない）である場合、または移植片がＴリンパ球を枯渇させる場合、ＧＶＬは抑止されるか、または大きく縮減される。血液癌の治療を受ける４００，０００人を超える個体の生命が、ＭｉＨＡ依存性ＧＶＬ効果の恩恵を受けており、このことは、ヒト免疫系の腫瘍形成を根絶させる能力の最も顕著な証拠を示している。同種ＧＶＴ効果は、本質的に血液系腫瘍の患者を治療するために用いられるが、予備的証拠は、該効果が固形腫瘍の治療にも効果的であり得ることを示唆している。ＭｉＨＡを標的とする癌免疫療法の大きな潜在能力は、医薬として適切に活用されてこなかった。最新医療では、ＭｉＨＡをベースにした免疫療法は、「従来の」ＡＨＣＴ、すなわち、同種ＨＬＡが適合するドナー由来の造血細胞の注入に限定されている。そのような同種リンパ球の非選択的注入は、ＭｉＨＡを標的とする療法の非常に原始的な形態である。第１に、該療法は、特異性に欠け、したがって、毒性が極めて高く、非選択の同種Ｔ細胞が、多数の宿主ＭｉＨＡに対して反応し、したがってレシピエントの６０％に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を誘導する。ＧＶＨＤは、常に身体の自由を奪うものであり、また致死性であることが多い。第２に、ドナーＴ細胞が、患者への注入前に、癌細胞上に発現した特異的ＭｉＨＡに対して初回刺激（前活性化）されないため、従来のＡＨＣＴは、減弱型のＧＶＴ反応しか誘導しない。初回刺激されたＴ細胞は寛容誘導に抵抗性を示すが、ナイーブＴ細胞は腫瘍細胞によって寛容化され得る。
ＡＨＣＴのマウスモデルにおいて、非選択のドナーリンパ球を、単一ＭｉＨＡに対して初回刺激したＣＤ８＋ Ｔ細胞に置き換えることによって、ＧＶＨＤまたはいずれか他の有害作用を引き起こすことなく、白血病および黒色腫を治癒することが可能であることが実証されている。成功は次の２つの重要な要素に依存する：新生細胞上に発現される免疫原性ＭｉＨＡの選択、およびＡＨＣＴ前の、標的ＭｉＨＡに対するドナーＣＤ８＋ Ｔ細胞の初回刺激。最近の論文では、ＭｉＨＡを標的とするＡＴＣＩがなぜそんなに効果的なのか、および臨床におけるこの手法への移行が、癌免疫療法にいかに大きい影響を与えるかについて考察されている８。
同種設定において、腫瘍を根絶することが可能な結合活性の高いＴ細胞応答が生成できる。血液系腫瘍において、同種ＨＬＡ適合造血幹細胞移植（ＡＳＣＴ）は、Ｔ細胞媒介移植片対腫瘍（ＧＶＴ）免疫応答の誘導に起因する同種免疫療法のためのプラットフォームを提供する。ドナー起源のＴ細胞は、レシピエントの自己抗原に対する低い反応性のために選択されないという事実に基づいて、同種設定における免疫療法は、効率的なＴ細胞応答の誘導を可能にする。したがって、腫瘍特異的抗原またはレシピエント特異的抗原に対し高親和性のＴ細胞が、ＡＳＣＴの間または後に患者に投与されたＴ細胞接種材料中に見出すことができる。腫瘍反応性Ｔ細胞応答の主な標的は、ドナーとレシピエントが異なる多型タンパク質、すなわちＭｉＨＡである。
しかし、ヒトにおけるＭｉＨＡ標的免疫療法の実施は、主に分子的に定義されたヒトＭｉＨＡの不足によって制限されてきた。現在知られているＭｉＨＡに基づくと、白血病の患者の内の３３％のみが、ＭｉＨＡベースＡＴＣＩに適格となるであろう。ＭｉＨＡの発見は、標準的ゲノムおよびプロテオミクス法を使って達成できないという理由から、困難な作業である。実際に、ｉ）１％未満のＳＮＰがＭｉＨＡを生成し、ｉｉ）現在の質量分析法は、ＭｉＨＡを検出できない。
したがって、免疫療法に使用し得る新規ＭｉＨＡを特定するニーズが存在する。
本発明の説明では、多数の文献に言及する。これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、次の項目１〜５３に関する。
１．式Ｉ
Ｚ１−Ｘ１−Ｚ２ （Ｉ）
の８〜１４個のアミノ酸のマイナー組織適合抗原（ＭｉＨＡ）ペプチド。式中、
Ｚ１は、アミノ末端修飾基であるか、または存在せず、
Ｘ１は、表ＶＩに示すペプチド配列の内の１つの少なくとも８個の連続した残基を含む配列であり、示された多型アミノ酸を含み、
Ｚ２は、カルボキシ末端修飾基であるか、または存在しない。
２．Ｘ１が表ＶＩに示されるペプチド配列のいずれか１つからなる、項目１に記載のＭｉＨＡペプチド。
３．Ｘ１が、配列番号１〜７５に示されるペプチド配列の内の１つの少なくとも８個の連続した残基を含む配列であり、多型アミノ酸を含む、項目１に記載のＭｉＨＡペプチド。
４．Ｘ１が、配列番号１〜７５に示されるペプチド配列のいずれか１つからなる、項目３に記載のＭｉＨＡペプチド。
５．Ｚ１が存在しない、項目１〜４のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
６．Ｚ２が存在しない、項目１〜５のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
７．表ＶＩに示されるペプチド配列のいずれか１つからなる、項目１〜６のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
８．配列番号１〜７５に示されるペプチド配列のいずれか１つからなる、項目１〜７のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
９．少なくとも０．１のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する座位由来である、項目１〜８のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
１０．少なくとも０．２のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する座位由来である、項目９に記載のＭｉＨＡペプチド。
１１．主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１アレルに結合し、前記ペプチド配列が表ＶＩＩに示されている、項目１〜１０のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
１２．前記ペプチドが、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子のＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３アレルに結合し、前記ペプチド配列が表ＶＩＩＩに示されている、項目１〜１０のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
１３．項目１〜１２のいずれか１項で定義のＭｉＨＡペプチドの内の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが次の式Ｉａ：
Ｚ１−Ｘ２−Ｘ１−Ｘ３−Ｚ２ （Ｉａ）
であるポリペプチド。式中、
Ｚ１、Ｘ１およびＺ２が、項目１〜１２で定義されている通りであり、
Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立に、存在しないか、または１つまたは複数のアミノ酸の配列であり、
前記ポリペプチドが、未変性タンパク質のアミノ酸配列を含まないか、またはそれから構成されず、細胞による前記ポリペプチドのプロセッシングにより、前記細胞により発現されたＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝中へのＭｉＨＡペプチドのローディングが生じる。
１４．（ｉ）項目１〜１２のいずれか１項で定義の少なくとも２つのＭｉＨＡペプチド；（ｉｉ）項目１〜１２のいずれか１項で定義の少なくとも１つのＭｉＨＡペプチドおよび少なくとも１つの追加のＭｉＨＡペプチド、を含むペプチドの組み合わせ。
１５．項目１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドまたは項目１３に記載のポリペプチドをコードする核酸。
１６．プラスミドまたはベクター中に存在する、項目１５に記載の核酸。
１７．項目１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドを、ペプチド結合溝中に含む単離された主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子。
１８．マルチマーの形態である、項目１７に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子。
１９．前記マルチマーが四量体である、項目１８に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子。
２０．項目１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド、項目１４に記載のペプチドの組み合わせ、または項目１５もしくは１６に記載の核酸を含む単離細胞。
２１．項目１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド、または項目１４に記載のペプチドの組み合わせをペプチド結合溝中に含む主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子を表面に発現している単離細胞。
２２．抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、項目２１に記載の細胞。
２３．前記ＡＰＣが樹状細胞である、項目２２に記載の細胞。
２４．項目１７〜１９のいずれか１項に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子および／または項目２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞の表面に発現したＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
２５．項目２４に記載のＴＣＲのアルファおよびベータ鎖をコードする１種または複数の核酸。
２６．プラスミドまたはベクター中に存在する、項目２５に記載の１種または複数の核酸。
２７．項目２４に記載のＴＣＲを細胞表面で発現している単離されたＣＤ８＋ Ｔリンパ球。
２８．項目２５または２６に記載の１種または複数の核酸を遺伝子導入または形質導入される、項目２７に記載のＣＤ８＋ Ｔリンパ球。
２９．項目２７または２８に記載の少なくとも０．５％のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を含む細胞集団。
３０．（ｉ）項目１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド、（ｉｉ）項目１３に記載のポリペプチド、（ｉｉｉ）項目１４に記載のペプチドの組み合わせ、（ｉｖ）項目１５または１６に記載の核酸、（ｉｖ）項目１７〜１９のいずれか１項に記載のＭＨＣクラスＩ分子、（ｖ）項目２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞、（ｖ）項目２４に記載のＴＣＲ、（ｖｉ）項目２５または２６に記載の１種または複数の核酸；項目２７または２８に記載のＣＤ８＋ Ｔリンパ球、および／または（ｖｉｉ）項目２９に記載の細胞集団、を含む組成物。
３１．緩衝液、賦形剤、キャリア、希釈剤および／または培地をさらに含む、項目３０に記載の組成物。
３２．ワクチンであり、アジュバントをさらに含む、項目３０または３１に記載の組成物。
３３．項目１４に記載のペプチドの組み合わせ、または前記ペプチドの組み合わせ中に存在する少なくとも２種のＭｉＨＡペプチドをコードする１種または複数の核酸を含む、項目３０〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
３４．項目１９〜２２のいずれか１項に記載の細胞および項目２６または２７に記載のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を含む、項目３０〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
３５．項目１〜１２のいずれか１項で定義された１種または複数のＭｉＨＡペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋ Ｔリンパ球を増殖する方法であって、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の増殖に好適な条件下で、項目２０〜２２のいずれか１項に記載の細胞の存在下で前記１種または複数のＭｉＨＡペプチドを発現しない候補ドナー由来のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を培養することを含む方法。
３６．癌の処置方法であって、有効量の（ｉ）項目２７または２８に記載のＣＤ８＋ Ｔリンパ球、（ｉｉ）項目２９に記載の細胞集団、および／または（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）含む組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む方法。
３７．前記それを必要としている対象により発現された１種または複数のＭｉＨＡバリアントを特定することをさらに含む方法であって、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球が、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されている前記１種または複数のＭｉＨＡバリアントを特異的に認識する、項目３６に記載の方法。
３８．前記特定することが、前記ＭｉＨＡをコードする核酸を配列決定することを含む、項目３７に記載の方法。
３９．前記ＣＤ８＋ Ｔリンパ球が、項目３５に記載の方法により調製し、エクスビボで増殖させたＣＤ８＋ Ｔリンパ球である、項目３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
４０．項目３５に記載の方法によりＣＤ８＋ Ｔリンパ球を増幅することをさらに含む、項目３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
４１．前記それを必要としている対象が、同種幹細胞移植（ＡＳＣＴ）のレシピエントである、項目３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
４２．前記ＣＤ８＋ Ｔリンパ球により認識される有効量のＭｉＨＡペプチド、および／または（ｉｉ）ペプチド結合溝中に（ｉ）により定義されるＭｉＨＡペプチドを含むＭＨＣクラスＩ分子をその表面に発現している細胞を投与することをさらに含む、項目３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
４３．前記癌が血液癌である、項目３６〜４２のいずれか１項に記載の方法。
４４．前記血液癌が白血病である、項目４３に記載の方法。
４５．項目１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドまたは項目１４に記載のペプチドの組み合わせを提示する抗原提示細胞または抗原提示細胞を模倣する人工構築物。
４６．Ｔリンパ球と、好適な抗原提示細胞または抗原提示細胞を模倣する人工構築物の表面上に発現した、項目１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドまたは項目１４に記載のペプチドの組み合わせをローディングしたヒトクラスＩ ＭＨＣ分子とを、前記Ｔリンパ球を活性化するのに十分な一定時間にわたり、抗原特異的方式で接触させることを含む細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のインビトロ製造方法。
４７．項目４６に記載の方法により得られる活性化された細胞傷害性Ｔリンパ球。
４８．患者に有効量の、項目４７に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を投与することを含む、血液癌の対象を処置する方法。
４９．項目１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドまたは項目１４に記載のペプチドの組み合わせをローディングしたヒトクラスＩ ＭＨＣ分子を発現している対象の腫瘍細胞に対する免疫応答を生成する方法であって、項目４７に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を投与することを含む方法。
５０．項目１〜１２のいずれか１項で定義の１種または複数のＭｉＨＡペプチドまたは項目１４に記載のペプチドの組み合わせを人為的にローディングされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）。
５１．治療ワクチンとして使用するための項目４９に記載のＡＰＣ。
５２．対象に同種Ｔリンパ球および項目１〜１２のいずれか１項で定義の１種または複数のＭｉＨＡペプチドまたは項目１４に記載のペプチドの組み合わせを含む組成物を投与することを含む、対象の免疫応答を生成する方法。
５３．前記対象が、白血病、リンパ腫および骨髄腫から選択される血液癌を有する、項目４８、４９および５２のいずれか１項に記載の方法。
本発明の他の目的、利点および特徴は、例示のみを目的として示す、以下の特定の実施形態に関する非限定的な説明を添付の図面を参照して解釈することにより、一層明らかになるであろう。
ＭｉＨＡをコードする座位のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を示す。高対低ＭＡＦのｎｓ−ＳＮＰにより生成されたＭｉＨＡの比率を示す。ＭｉＨＡをコードするｎｓ−ＳＮＰのＭＡＦ（より薄い灰色のバー）またはヨーロッパ系アメリカ人で報告されているＭＡＦ（より黒っぽい灰色のバー）をエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）（ｈｔｔｐ：／／ｅｖｓ．ｇｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＥＶＳ／）より取得し、低頻度（ＭＡＦ＜０．０５）または高頻度（ＭＡＦ≧０．０５）に分類した。通常、ｎｓ−ＳＮＰでは、ＭｉＨＡをコードするＳＮＰは、低ＭＡＦである。 ＭｉＨＡをコードする座位のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を示す。以前に発見したＭｉＨＡ２４、３４（「報告」：バーの下段のより薄い灰色の部分）および本明細書で記載のプロテオゲノミクスによる手法を使って特定された新規高頻度ＭｉＨＡ（バーの上段のより黒っぽい灰色の部分）の数を示す。 ＭｉＨＡをコードする座位のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を示す。全世界集団（ｄｂＳＮＰの報告による）、ヨーロッパ系アメリカ人（ＥＡ）（ＥＳＰによる）、１０００人ゲノムプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｏｒｇ；ＭｃＶｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍａｐ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ １，０９２ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ ４９１，５６−６５（０１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１２））で報告された、またはヨーロッパ人（ＥＵＲ）、混合アメリカ人（ＡＭＲ）、東アジア人（ＥＡＳ）、南アジア人（ＳＡＳ）およびアフリカ人（ＡＦＲ）における新規ＭｉＨＡをコードするＳＮＰのＭＡＦを示す。 検証ステップおよび新規ＭｉＨＡを選択し、優先順位を付ける選別基準を示す。ＭｉＨＡの特定に使用された選別ステップを示す。合計６，７７３個の配列決定された８〜１４量体のペプチドは、予測結合親和性（ＩＣ５０）が５，０００ｎＭ未満であり、報告されたｎｓ−ＳＮＰによりコードされたＨＬＡ−Ａ＊０．２：０１またはＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３を有していた。これら２つの判定基準に適合するＭｉＨＡをさらに検証した。 検証ステップおよび新規ＭｉＨＡを選択し、優先順位を付ける選別基準を示す。検証ステップおよび臨床開発用のリードＭｉＨＡを選択するために適用された判定基準を示す。 新規に発見したＭｉＨＡの免疫原性を示す。Ｔリンパ球は、新規に発見された４種のリードＭｉＨＡ：ＧＬＲＸ３−１Ｓ、ＭＩＩＰ−２Ｅ、ＲＡＳＳＦ１−１ＳおよびＷＤＲ２７−１Ｌに対し、初回刺激を受けた。初回刺激および発現後、Ｔ細胞はペプチドなし、ＭｉＨＡ標的ペプチドまたは無関係のペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１はエプスタイン・バールウイルスＬＭＰ２４２６−４３４ペプチドを制限した）に対し再暴露された。４つのＩＦＮγエリスポットの内の１つの代表的な結果を示す。 新規に発見したＭｉＨＡの免疫原性を示す。Ｔリンパ球は、新規に発見された４種のリードＭｉＨＡ：ＧＬＲＸ３−１Ｓ、ＭＩＩＰ−２Ｅ、ＲＡＳＳＦ１−１ＳおよびＷＤＲ２７−１Ｌに対し、初回刺激を受けた。初回刺激および発現後、Ｔ細胞はペプチドなし、ＭｉＨＡ標的ペプチドまたは無関係のペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１はエプスタイン・バールウイルスＬＭＰ２４２６−４３４ペプチドを制限した）に対し再暴露された。細胞内サイトカイン染色で評価した、ＷＤＲ２７−１Ｌに対し初回刺激を受けたＴ細胞によるサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ）産生を示す。 新規に発見したＭｉＨＡの免疫原性を示す。Ｔリンパ球は、新規に発見された４種のリードＭｉＨＡ：ＧＬＲＸ３−１Ｓ、ＭＩＩＰ−２Ｅ、ＲＡＳＳＦ１−１ＳおよびＷＤＲ２７−１Ｌに対し、初回刺激を受けた。初回刺激および発現後、Ｔ細胞はペプチドなし、ＭｉＨＡ標的ペプチドまたは無関係のペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１はエプスタイン・バールウイルスＬＭＰ２４２６−４３４ペプチドを制限した）に対し再暴露された。ブレフェルジンＡの存在下で、４時間の再刺激後のＩＦＮγ産生ＣＤ８ Ｔ細胞の平均比率を示す（ＣＤ８ Ｔ細胞ゲート）。ヒストグラムは、個体ＭｉＨＡ（ｎ＝４）または対照ペプチドに対し初回刺激を受けたＴ細胞の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。 新規に発見したＭｉＨＡの免疫原性を示す。Ｔリンパ球は、新規に発見された４種のリードＭｉＨＡ：ＧＬＲＸ３−１Ｓ、ＭＩＩＰ−２Ｅ、ＲＡＳＳＦ１−１ＳおよびＷＤＲ２７−１Ｌに対し、初回刺激を受けた。初回刺激および発現後、Ｔ細胞はペプチドなし、ＭｉＨＡ標的ペプチドまたは無関係のペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１はエプスタイン・バールウイルスＬＭＰ２４２６−４３４ペプチドを制限した）に対し再暴露された。細胞内サイトカイン染色で評価した、ＧＬＲＸ３−１Ｓ（上段パネル）、ＲＳＤＤＦ１−１Ｓ（中段パネル）およびＭＩＩＰ−２Ｅ（下段パネル）に対し初回刺激を受けたＴ細胞によるＩＦＮγ生産を示す。 ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３に結合したＭｉＨＡの特徴を示す。全ての新規ＭｉＨＡをコードする座位は両アレルである。ほとんどの座位で、単一（優性）アレルはＭｉＨＡを生成するが、その他の（劣性）アレルはＭｉＨＡを生成しない。２、３のケースでは、両方の（共優性）アレルがＭｉＨＡを生成する。オーバーラップＭｉＨＡは、同じｎｓ−ＳＮＰに由来するが、異なるゲノム開始−終了位置を有するＭｉＨＡを意味する。 ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３に結合したＭｉＨＡの特徴を示す。遺伝子当たり生成されたＭｉＨＡの数を示す。３つ以上のＭｉＨＡをコードする遺伝子は、ボックスで示されている。 ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３に結合したＭｉＨＡの特徴を示す。全てのＭＡＰをコードする遺伝子に対し、ｎｓ−ＳＮＰの数を、それぞれのペプチドをコードする転写物の長さ（ヌクレオチド単位）で除算することにより、多型密度を計算したボックスプロット（中位のバンドは、中央値を表す）は、ＭｉＨＡをコードする遺伝子と、非多型ＭＡＰをコードする遺伝子に対する多型指数の分布を示す。外れ値は示していない。ウィルコクソン順位和検定を使って、２つの分布を比較した。＊Ｐ＜０．０１． ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３に結合したＭｉＨＡの特徴を示す。単一エクソン由来のＭｉＨＡまたは２つの連続したエクソン（エクソン−エクソン接合部）由来のＭｉＨＡの比率を示す。 ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３に結合したＭｉＨＡの特徴を示す。図４Ａにより決定された、ＭｉＨＡをコードするエクソンまたはエクソン−エクソン接合部の多型密度を示すボックスプロットである。エクソン−エクソン接合領域は、２つの隣接エクソンにオーバーラップしている７８個のヌクレオチドの範囲により決定した。ウィルコクソン順位和検定を使って、２つの分布を比較した。＊Ｐ＜０．０１。 遺伝子発現パターンにより選択されたＭｉＨＡの数を示す。ＭＡＦ≧０．０５を有する、以前に報告された（ｎ＝７）２４、３４ＭｉＨＡおよび新規ＭｉＨＡ（ｎ＝３２）が由来する遺伝子の発現レベルを、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇと共同研究者の調査３０から取得した。２７の組織で１０ＦＰＫＭを超えて発現した場合、ＭｉＨＡを遍在性として分類した３０。皮膚に対する骨髄（ＢＭ）の比率が２以上の場合、造血細胞中に濃縮されているＭｉＨＡをコードする転写物を選択するようにさらに考慮した。左バー：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に結合したＭｉＨＡ；中央バー：ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３に結合したＭｉＨＡ；右バー：合計。 臨床的に最も興味のあるＭｉＨＡをコードする全ての遺伝子が原発性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）試料中で発現する。ＴＣＧＡから、１２８個のＡＭＬ試料中でＲＰＫＭ発現が得られた。ボックスプロットは、ＡＭＬ中のそれぞれのＭｉＨＡ遺伝子の発現分布を示す（発現はＬｏｇ１０スケールで示されている）。ボックスプロットの中位のラインは、中央値を示す。ＵＴＹ遺伝子は、Ｙ染色体上にあるので、男性にのみ発現される。 種々のＡＭＬサブタイプ中のＭｉＨＡ遺伝子の平均発現値を示す階層型クラスタリングおよびヒートマップの図である。見易くする目的で、値をＬｏｇ１０（１，０００ＲＰＫＭ＋１）に変換した。ＡＭＬにおけるＭｉＨＡ遺伝子発現は、ＴＣＧＡから取得し、ｂの場合と同様に解析した。ＡＭＬサブタイプは、急性白血病のフランス・アメリカ・イギリス分類に対応する。パネルの最右側の１〜４の数は、遺伝子クラスターを識別表示する。差次的に発現したＡＭＬサブタイプである９個のＭｉＨＡ遺伝子は太字で示され（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）、独特の遺伝子発現パターンを示すＡＭＬサブタイプは破線の輪郭でマークしている（テューキー検定、Ｐ＜０．０５）。 ３９個のリードＭｉＨＡ（臨床的に最も興味のある）（２４個の遺伝子によりコードされた）は共に、血液癌（ＨＣ）に罹患しているほとんど全てのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１；Ｂ＊４４：０３患者に対するＭｉＨＡ標的免疫療法を可能とすることを示す。本試験で使用された１３人の個体のコホート（１０人のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性および７人のＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３陽性）において、ＳＮＰによりコードされた、０．０５以上のＭＡＦの９４個のＭｉＨＡが特定された。ｓｃｉｐｙ Ｐｙｔｈｏｎライブラリー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｐｙ．ｏｒｇ／）を使って、追加の個体を調査することにより発見されることが予測されるＭｉＨＡの累積数を計算した。下の曲線：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に結合したＭｉＨＡ；上の曲線：ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３に結合したＭｉＨＡ。 ３９個のリードＭｉＨＡ（臨床的に最も興味のある）（２４個の遺伝子によりコードされた）は共に、血液癌（ＨＣ）に罹患しているほとんど全てのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１；Ｂ＊４４：０３患者に対するＭｉＨＡ標的免疫療法を可能とすることを示す。少なくとも１種の治療不適合を有するドナー−レシピエント対のパーセンテージは、考慮に入れるＭｉＨＡに応じて増加する。「治療不適合」は、ＭｉＨＡをコードするアレルがレシピエントに認められるが、ドナーには認められない場合に、存在すると考えられた。Ｙ染色体由来ＭｉＨＡの場合には、治療不適合は、全ての男性レシピエント：女性ドナー対において考慮された。非血縁または血縁ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／Ｂ＊４４：０３陽性の百万ドナー−レシピエント対が、ヨーロッパ系アメリカ人個体の仮想集団からランダムに選択された。それぞれのドナー−レシピエント対のＭｉＨＡハプロタイプが、ヨーロッパ系アメリカ人に関するエクソーム配列決定プロジェクトで報告されたアレル頻度に基づいて生成された。それぞれの対に対し、考慮に入れるＭｉＨＡの数を増加させて、ＭｉＨＡ不適合の数が決定された。上の曲線：非血縁；下の曲線：血縁。 ３９個のリードＭｉＨＡ（臨床的に最も興味のある）（２４個の遺伝子によりコードされた）は共に、血液癌（ＨＣ）に罹患しているほとんど全てのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１；Ｂ＊４４：０３患者に対するＭｉＨＡ標的免疫療法を可能とすることを示す。図６Ｂに記載のランダムに選択したドナー−レシピエント対で認められた治療ＭｉＨＡ不適合の平均数を示す。左のより黒っぽい灰色のバー：非血縁；右のより薄い灰色のバー：血縁。
本明細書で使用される遺伝学、分子生物学、生化学、および核酸の用語および記号は、当該技術分野の標準的な論文およびテキスト、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，２００５）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ（Ｓｄ），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１２）；Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｇａｉｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）；などのものに従う。全ての用語は、関連技術において確立されたそれらの典型的な意味を有するものと理解されたい。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、その冠詞の文法上の対象のうちの１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例えば、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。本明細書を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を意味するが、いずれか他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は意味しないと理解されたい。
用語の「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、本明細書では同じ意味で用いられ、本明細書に記載の１種または複数のＭｉＨＡを使った癌の処置を必要としている、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。これらの用語は、成体および子供の両方を包含する。
ＭｉＨＡペプチドおよび核酸
一態様では、本発明は、ＭｉＨＡペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、単離されたまたは合成ポリペプチド）を提供し、前記ポリペプチドは、次の式Ｉａ：
Ｚ１−Ｘ２−Ｘ１−Ｘ３−Ｚ２ （Ｉａ）
のポリペプチドであり、式中、
Ｚ１、Ｘ１およびＺ２は、以下で定義の通りであり、
Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立に、存在しないか、または１つまたは複数のアミノ酸の配列であり、
前記ポリペプチドが、未変性タンパク質のアミノ酸配列（例えば、ＭｉＨＡペプチドが由来する未変性タンパク質のアミノ酸配列）を含まないか、またはそれから構成されず、細胞（例えば、抗原提示細胞）による前記ポリペプチドのプロセッシングにより、前記細胞により発現されたＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝中への配列Ｘ１のＭｉＨＡペプチドのローディングが生じる。
ある実施形態では、Ｘ２および／またはＸ３は、それぞれ独立に、約１〜約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００個のアミノ酸の配列である。ある実施形態では、Ｘ２は、ＭｉＨＡが由来する天然のポリペプチド（本明細書で記載のＭｉＨＡが由来する遺伝子に対応するＥｎｓｅｎｂｌ遺伝子ＩＤについては、表ＩＩを参照されたい）のＸ１の配列のアミノ末端の直近に位置するアミノ酸配列である。ある実施形態では、Ｘ３は、ＭｉＨＡが由来する天然のポリペプチド（表ＩＩを参照されたい）のＸ１の配列のカルボキシ末端の直近に位置するアミノ酸配列である。例えば、ＭｉＨＡ Ｎｏ．１は、タンパク質アンキリン反復ドメイン１３Ａ（ＡＮＫＲＤ１３Ａ）に由来し、したがって、Ｘ２および／またはＸ３は、ＡＮＫＲＤ１３Ａ（Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＧ００００００７６５１３，ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１４９１１２．１）の配列ＳＬＬＥＳＳＲＳＱＥＬ／Ｐ（配列番号７９）のアミノおよび／またはカルボキシ末端の直近に位置する１種または複数を含んでよい。したがって、本明細書で記載のＭｉＨＡの配列のアミノおよび／またはカルボキシ末端の直近に位置する配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌ、ＮＣＢＩ、ユニプロットなどの公開データベースで利用可能な情報を使って容易に特定し得る。これらの情報は、例えば、下表ＩＩで提供されるＳＮＰ ＩＤ Ｎｏ．および／またはＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤを使って取得可能である。表ＩＩに提供されるＳＮＰ ＩＤ Ｎｏ．およびＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤに対応する転写物およびコードされたポリペプチドの完全配列を含む全内容および情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、Ｘ２および／またはＸ３が存在しない。さらなる実施形態では、Ｘ２およびＸ３の両方が存在しない。
したがって、別の態様では、本発明は、式Ｉ
Ｚ１−Ｘ１−Ｚ２ （Ｉ）
の約８〜約１４個のアミノ酸のＭｉＨＡペプチド（例えば、単離されたまたは合成ペプチド）を提供し、式中、Ｚ１は、アミノ末端修飾基であるかまたは存在せず、Ｘ１は、下表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３のペプチド配列の内の１つの少なくとも８個の（好ましくは連続した）残基を含み、かつ示された（下線が引かれた、例えば、ＭｉＨＡ Ｎｏ．１に関しては、Ｃ末端残基ＬまたはＰが、Ｘ１に含まれ、また、ＭｉＨＡ Ｎｏ．２に関しては、Ｃ末端残基ＶまたはＬがドメインＸ１に含まれる、等々）多型アミノ酸（バリエーション）を含む配列であり；およびＺ２はカルボキシ末端修飾基であるかまたは存在しない。ＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３への言及は、示した配列により規定されるそれぞれのバリアントを包含する。例えば、用語の「ＭｉＨＡ Ｎｏ．１」（ＳＬＬＥＳＳＲＳＱＥＬ／Ｐ、配列番号７９）は、ＳＬＬＥＳＳＲＳＱＥＬ（配列番号８０）および／またはＳＬＬＥＳＳＲＳＱＥＰ（配列番号８１）を意味する。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０（配列番号１〜７５）のペプチド配列の内の１つの少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示した多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４の少なくとも８個のアミノ酸の配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．９の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１０の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１４の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１５の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１６の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、表Ｉに示される（Ｎｏ．１１９または１２０）定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１８の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１９の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２０の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２４の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２５の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２６の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２７の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２８の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．２９の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３０の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３４の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３５の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３６の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３７の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３８の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．３９の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４０の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４４の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４５の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４６の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４７の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４８の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．４９の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５０の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５４の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５５の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５６の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５７の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５８の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．５９の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６０の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６４の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６５の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６６の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６７の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６８の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．６９の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７０の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７４の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７５の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７６の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７７の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７８の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．７９の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８０の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８４の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８５の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８６の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８７の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８８の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．８９の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．９０の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．９１の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．９２の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、上記で定義の式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．９３の少なくとも８個のアミノ酸を含む配列であり、前記配列は、示された多型アミノ酸を含む。
ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２分子（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１アレル）に結合し得る、またはそれにより提示され得る。別の態様では、本発明は、上記で定義の式Ｉの８〜１４個のアミノ酸の、ＨＬＡ−Ａ２結合ＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されたＭｉＨＡ Ｎｏ．１、２、１２、１７〜１９、２４〜２８、３０、３２、４９〜５３、５５、５７、５９〜６１、６５、７２〜７５、８５および９２のいずれか１つの少なくとも８個のアミノ酸の配列であり、前記配列は示された多型アミノ酸を含む。ある実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２結合ＭｉＨＡペプチドは、ＭｉＨＡ Ｎｏ．３２および４９〜５０の配列を含むかまたはそれらからなる。
ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ４４分子（ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３アレル）に結合し得る、またはそれにより提示され得る。別の態様では、本発明は、上記で定義の式Ｉの８〜１４個のアミノ酸の、ＨＬＡ−Ｂ４４結合ＭｉＨＡペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、表Ｉに示されたＭｉＨＡ Ｎｏ．３〜１１、１３〜１６、２０〜２３、２９、３１、３３〜４８、５４、５６、５８、６２〜６４、６６〜７１、７６〜８４、８６〜９１および９３のいずれか１つの少なくとも８個のアミノ酸の配列であり、前記配列は示された多型アミノ酸を含む。ある実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ４４結合ＭｉＨＡペプチドは、ＭｉＨＡ Ｎｏ．７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３３、３５、３９〜４７、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０の配列を含むかまたはそれらからなる。
ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、遍在的発現を示さない遺伝子由来である。本明細書で使われる場合、表現の「遍在的発現を示さない」は、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１４ １３：３９７−４０６のデータに従って、そこに開示された２７組織全てで１０を超えるＦＰＫＭで発現しない遺伝子を意味する。
ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）および国立心肺血液研究所（ＮＨＬＢＩ）エクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）（表ＩＩで示したような）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．０５のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．１のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）およびＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．１のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．１５のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）およびＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．１５のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．２のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）およびＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．２のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．２５のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）およびＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．２５のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．３のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）およびＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．３のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．３５のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）およびＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．３５のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．４のＭＡＦを有する座位由来である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）およびＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．４のＭＡＦを有する座位由来である。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で定義の特徴または特性の任意の組み合わせ／副組合せを含むＭｉＨＡペプチド、例えば、上記で定義の式ＩのＭｉＨＡペプチド、を提供し、ペプチドは、（ｉ）ＨＬＡ−Ａ２分子に結合し、（ｉｉ）遍在的発現を示さない遺伝子由来であり、および（ｉｉｉ）ｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）由来のデータに基づいて決定して、少なくとも０．１のＭＡＦを有する座位由来である。
一般に、ＨＬＡクラスＩに関連して提示されるペプチドは、約７〜約１５、または好ましくは８〜１４個のアミノ酸残基の長さで変化する。本発明の方法のいくつかの実施形態では、本明細書で定義のＭｉＨＡペプチド配列を含むより長いペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの細胞中に人為的にローディングされ、その細胞によりプロセッシングされて、ＭｉＨＡペプチドがＭＨＣクラスＩ分子によりＡＰＣの表面で提示される。本方法では、１５個のアミノ酸残基より長いペプチド／ポリペプチド（すなわち、上記式Ｉａにより定義されるものなどのＭｉＨＡ前駆体ペプチド）は、ＡＰＣにローディングでき、ＡＰＣサイトゾル中のプロテアーゼによりプロセッシングされて、提示のための本明細書で定義の対応するＭｉＨＡペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で定義のＭｉＨＡペプチドの生成に用いられる前駆体ペプチド／ポリペプチド（上記定義の式Ｉａのポリペプチド）は、例えば、１００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０または１５個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸である。したがって、本明細書で記載のＭｉＨＡペプチドを使った全ての方法およびプロセスは、細胞（ＡＰＣ）によるプロセッシング後に「最終的な」８〜１４個のＭｉＨＡペプチドの提示を誘導するために、より長いペプチドまたはポリペプチド（未変性タンパク質を含む）、すなわち、ＭｉＨＡ前駆体ペプチド／ポリペプチドの使用を含む。
いくつかの実施形態では、上記ＭｉＨＡペプチドは、約８〜１２個のアミノ酸長（例えば、８、９、１０、１１、または１２個のアミノ酸長）であり、ＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４分子）に直接組み込むのに十分に小さいが、１２〜約２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸などのようにさらに大きくてもよく、上記で説明したように、上記Ｘ１により定義されるドメインに対応するＭｉＨＡペプチドは、細胞取り込み、およびそのプロテアソームおよび／またはその他のプロテアーゼによる細胞内プロセシングおよび提示される前のＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４分子）の溝内への輸送の後でのみＨＬＡ分子によって提示される。
ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、８〜１４個のアミノ酸、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸のアミノ酸配列からなり、その配列は、表Ｉに示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３のいずれか１つの配列である。別の態様では、本発明は、８〜１４個のアミノ酸、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸のアミノ酸配列からなるＭｉＨＡペプチドを提供し、前記アミノ酸配列は、表ＩのＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３、好ましくは、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０の配列からなる。ある実施形態では、表ＩのＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３、好ましくは、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０の内の１つの少なくとも７または８個のアミノ酸は、連続したアミノ酸である。ある実施形態では、Ｘ１は、ＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３、好ましくは、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０の内のいずれか１つの少なくとも８個のアミノ酸を含むドメインであり、前記配列は示された多型アミノ酸を含む。別の実施形態では、Ｘ１は、ＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３、好ましくは、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０の内のいずれか１つのアミノ酸を含むか、またはそれらからなる配列である。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸のＬおよびＤ異性体と、ＭｉＨＡペプチドの合成類似体を調製するためにペプチド化学において使用される他のアミノ酸（例えば、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、核酸配列によってコードされないアミノ酸等）の両方を含む。天然アミノ酸の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニンである。
他のアミノ酸には、例えば、遺伝的にコードされていない形態のアミノ酸だけではなく、Ｌ−アミノ酸の保存的置換が含まれる。天然の遺伝的にコードされていないアミノ酸には、例えば、β−アラニン、３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、４−アミノ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン（例えば、Ｌ−オルニチン）、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン、２−ナプチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボキシリキス酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、Ｌ−ホモアルギニン（Ｈｏａｒｇ）、Ｎ−アセチルリジン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２，４，−ジアミノ酪酸（Ｄ−またはＬ−）、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン（ＨｏＳｅｒ）、システイン酸、ε−アミノヘキサン酸、δ−アミノ吉草酸、または２，３−ジアミノ酪酸（Ｄ−またはＬ−）などが挙げられる。これらのアミノ酸は、生化学／ペプチド化学の技術分野で周知である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、天然アミノ酸のみを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＭｉＨＡペプチドは、上記配列と比較して機能的に同等である、アミノ酸残基の置換を含有する改変配列を有するペプチドを含む。例えば、配列内の１種または複数のアミノ酸残基を、機能的等価物として作用する類似の極性の（類似の物理化学的特性を有する）別のアミノ酸で置換して、サイレント改変を生じさせることができる。配列内におけるアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択してよい。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジン（ならびにホモアルギニンおよびオルニチン）が含まれる。非極性（疎水性）アミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。非荷電極性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。アミノ酸グリシンは、非極性アミノ酸ファミリーまたは非荷電（中性）極性アミノ酸ファミリーのいずれに含まれてもよい。アミノ酸のファミリー内で行われる置換は、概して保存置換であると理解される。
上記ＭｉＨＡペプチドは、全てのＬ−アミノ酸、全てのＤ−アミノ酸、またはＬ−およびＤ−アミノ酸の混合物を含んでよい。ある実施形態では、上記ＭｉＨＡペプチドは、全てのＬ−アミノ酸を含む。
また、分解を防止し、安定性または取り込みを増加させるために、ＭｉＨＡペプチドのＮ末端および／またはＣ末端をキャッピングするかまたは修飾してもよい。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドのアミノ末端残基（すなわち、Ｎ末端の遊離アミノ基）は、例えば、部分／化学基（Ｚ１）の共有結合によって（例えば、分解から保護するために）修飾される。Ｚ１は、１〜８個の炭素の直鎖もしくは分岐アルキル基、またはアシル基（Ｒ−ＣＯ−）であってよく、式中、Ｒは疎水性部分（例えば、アセチル、プロピオニル、ブタニル、イソ−プロピオニル、またはイソ−ブタニル）、またはアロイル基（Ａｒ−ＣＯ−）（Ａｒはアリール基）である。ある実施形態では、アシル基は、Ｃ１−Ｃ１６もしくはＣ３−Ｃ１６アシル基（直鎖または分岐、飽和または不飽和）であり、さらなる実施形態では、飽和Ｃ１−Ｃ６アシル基（直鎖もしくは分岐）または不飽和Ｃ３−Ｃ６アシル基（直鎖もしくは分岐）は、例えば、アセチル基（ＣＨ３−ＣＯ−、Ａｃ）である。ある実施形態では、Ｚ１は存在しない。
ＭｉＨＡペプチドのカルボキシ末端残基（すなわち、ＭｉＨＡペプチドのＣ末端の遊離カルボキシル基）を、例えばアミド化（ＯＨ基のＮＨ２基による置換）によって（例えば、分解から保護するために）修飾してもよく、そのような場合、Ｚ２はＮＨ２基である。一実施形態では、Ｚ２は、ヒドロキサメート基、ニトリル基、アミド（一級、二級、または三級）基、１〜１０個の炭素の脂肪族アミン、例えば、メチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミンもしくはシクロヘキシルアミン等、芳香族アミンまたはアリールアルキルアミン、例えば、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、またはフェニルエチルアミン、アルコールもしくはＣＨ２ＯＨ等であってよい。ある実施形態では、Ｚ２は存在しない。
ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、表Ｉに示されるＮｏ．１〜９３、好ましくは、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０の配列の内の１つを含む。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、表Ｉに示されるＮｏ．１〜９３、好ましくは、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０の配列の内の１つから構成され、すなわち、Ｚ１およびＺ２が存在しない。
本発明のＭｉＨＡペプチドは、ＭｉＨＡペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞における発現（組換え発現）によって、または化学合成（例えば、固相ペプチド合成）によって生成し得る。ペプチドは、マニュアルでおよび／または当該技術分野で周知の自動化固相合成法によって容易に合成することができる。適切な合成は、例えば、「Ｔ−ｂｏｃ」または「Ｆｍｏｃ」法を利用して実施できる。固相合成のための技術および手順は、例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｂｙ Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、に記載されている。あるいは、ＭｉＨＡペプチドは、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：９３３−９３６，１９９６；Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８８１−１８８７，１９９５；Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５：２０９−２１６，１９９５；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ａｎｄ Ｋｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：２２１−２２５，１９９２；Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４１４９−４１５３，１９９４；Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６５８４−６５８８，１９９４；およびＹａｍａｓｈｉｒｏ ａｎｄ Ｌｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３１：３２２−３３４，１９８８、に記載されるようなセグメント縮合法によって調製されてもよい。ＭｉＨＡペプチドを合成するために有用な他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７−７０９２，１９８５に記載されている。ある実施形態では、式ＩまたはＩａのＭｉＨＡペプチドは、化学的に合成される（合成ペプチド）。
したがって、別の態様では、本発明は、上記ＭｉＨＡペプチドまたはＭｉＨＡ前駆体ペプチドをコードする（単離）核酸をさらに提供する。ある実施形態では、核酸は、約２１ヌクレオチド〜約４５ヌクレオチド、約２４〜約４５ヌクレオチド、例えば、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２または４５ヌクレオチドを含む。
「単離された」は、本明細書で使用される場合、分子または天然起源の高分子（例えば、他の核酸、タンパク質、脂質、糖類などを含む）の天然環境中に存在する他の成分から分離されたペプチドまたは分子を意味する。「合成の」は、本明細書で使用される場合、例えば、組換え技術によって、または化学合成によって生成される、その天然源材料から単離されていないペプチドまたは核酸分子を意味する。
ある実施形態では、上記ＭｉＨＡペプチドは実質的に純粋である。化合物は、天然の状態でそれに付随する成分から分離される場合に「実質的に純粋」である。典型的には、化合物は、試料中の全材料の少なくとも６０重量％、より一般的には、７５重量％、８０重量％、または８５重量％、好ましくは９０重量％超、より好ましくは９５重量％超である場合に実質的に純粋である。したがって、例えば、組換え技術によって化学的に合成または生成されるポリペプチドは、一般的に、その天然の状態で付随する成分、例えば、その原材料高分子の成分を実質的に含まない。核酸分子は、その核酸が由来する生物の天然のゲノム内で通常は隣接しているコード配列と、直接的に隣接（すなわち、共有結合）していない場合に実質的に純粋である。実質的に純粋な化合物は、例えば、天然原材料からの抽出によって、ペプチド化合物をコードする組換え核酸分子の発現によって、または化学合成によって得ることができる。純度は、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ等の任意の適切な方法を用いて測定することができる。
本発明の核酸は、本発明のＭｉＨＡペプチドの組換え体発現に使用し、クローニングベクターまたは発現ベクターなどのベクターまたはプラスミド中に組み込んで、これを宿主細胞に遺伝子導入してもよい。ある実施形態では、本発明は、本発明のＭｉＨＡペプチドをコードする核酸配列を含むクローニングまたは発現ベクターまたはプラスミドを提供する。あるいは、本発明のＭｉＨＡペプチドをコードする核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。いずれの場合も、宿主細胞は、核酸によりコードされたＭｉＨＡペプチドまたはタンパク質を発現する。
ベクターまたはプラスミドは、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有し、また、耐性遺伝子、クローニング部位などの他の構成要素を含有し得る。当業者に周知の方法を用いて、ペプチドまたはポリペプチドをコードする配列と、そこに機能的に連結された適切な転写および翻訳制御／調節エレメントとを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えを含む。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。
「機能的に連結された」とは、構成要素の正常な機能が行われ得るように、構成要素、特にヌクレオチド配列の並置を意味する。したがって、調節配列に機能的に連結されたコード配列は、調節制御下、すなわち、調節配列の転写および／または翻訳制御下でコード配列を発現させることができる、ヌクレオチド配列の構成を意味する。「調節／制御領域」または「調節／制御配列」は、本明細書で使用される場合、コード核酸の発現の調節に関与する非コードヌクレオチド配列を指す。したがって、調節領域という用語は、プロモーター配列、調節タンパク質結合部位、上流アクチベーター配列などを含む。
ある実施形態では、上記ＭｉＨＡペプチドは溶液である。別の実施形態では、上記ＭｉＨＡペプチドは、固形、例えば、凍結乾燥した固形である。
別の態様では、本発明は、ＭｉＨＡペプチドを含む（すなわち、ＭｉＨＡペプチドを提示するまたはそれに結合した）ＭＨＣクラスＩ分子を提供する。ある実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子であり、さらなる実施形態では、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子である。別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ｂ４４分子であり、さらなる実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３分子である。ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子に非共有結合している（すなわち、ＭｉＨＡペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝／ポケット内にローディングされる、またはその溝／ポケットに非共有結合する）。別の実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子（アルファ鎖）に共有結合的に付着／結合している。このような構築物では、ＭｉＨＡペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子（アルファ鎖）は、通常は短い（例えば、５〜２０個、好ましくは８〜１２個、例えば、約１０個の残基）可動性リンカーまたはスペーサー（例えば、ポリグリシンリンカー）を有する合成融合タンパク質として生成される。別の態様では、本発明は、ＭＨＣクラスＩ分子（アルファ鎖）に融合した上記定義のＭｉＨＡペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。ある実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子（アルファ鎖）−ペプチド複合体は、多量体化される。したがって、別の態様では、本発明は、上記ＭｉＨＡペプチドを（共有結合的にまたは非供給結合的に）ローディングしたＭＨＣクラスＩ分子の多量体を提供する。このような多量体は、タグ、例えば、蛍光タグに結合してよく、これにより、多量体の検出が可能となる。ＭＨＣの二量体、四量体、五量体、八量体などを含むＭＨＣ多量体の生成のために多数の戦略が開発されている（Ｂａｋｋｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００５，１７：４２８−４３３に概説されている）。ＭＨＣ多量体は、例えば、抗原特異的Ｔ細胞の検出および精製に有用である。したがって、別の態様では、本発明は、上記定義のＭｉＨＡペプチドに特異的なＣＤ８＋ Ｔリンパ球を検出または精製（単離、濃縮）する方法を提供し、該方法は、細胞集団を、ＭｉＨＡペプチドをローディング（共有結合的にまたは非供給結合的に）したＭＨＣクラスＩ分子の多量体と接触させること、およびＭＨＣクラスＩ多量体により結合されたＣＤ８＋ Ｔリンパ球を検出または単離することを含む。ＭＨＣクラスＩ多量体により結合されたＣＤ８＋ Ｔリンパ球は、既知の方法、例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）または磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を使用して単離し得る。
さらに別の態様では、本発明は、細胞（例えば、宿主細胞）を提供し、ある実施形態では、本発明の上記核酸、ベクターまたはプラスミド、すなわち、１種または複数のＭｉＨＡペプチドをコードする核酸またはベクターを含む単離細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明によるＭｉＨＡペプチドを結合しているまたはそれを提示しているＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４アレル分子）を表面に発現している細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞は、初代細胞、細胞株、または不死化細胞である。別の実施形態では、細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。
核酸およびベクターは、従来の形質転換または遺伝子導入技術によって細胞に導入することができる。「形質転換」および「遺伝子導入」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介トランスフェクションを含む、外来性核酸を宿主細胞に導入するための技術を意味する。宿主細胞を形質転換または遺伝子導入するための適切な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記参照）および他の実験マニュアルに見出すことができる。核酸を哺乳動物細胞にインビボで導入するための方法が知られており、遺伝子療法のために本発明のベクターＤＮＡを対象に送達するために用い得る。
当該技術分野において既知の種々の方法を使って、ＡＰＣなどの細胞に、１種または複数のＭｉＨＡペプチドをローディング可能である。本明細書で使用される場合、ＭｉＨＡペプチドを「細胞にローディング」は、ＭｉＨＡペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡ、またはＭｉＨＡペプチドが細胞に遺伝子導入されること、あるいは、ＡＰＣがＭｉＨＡペプチドをコードする核酸を使って形質転換されることを意味する。細胞は、細胞（例えば、ペプチドパルス細胞）表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子と直接結合できる外来性のＭｉＨＡペプチドと細胞を接触させることによってもローディングできる。ＭｉＨＡペプチドはまた、ＭＨＣクラスＩ分子による提示を促進するドメインまたはモチーフ、例えば、小胞体（ＥＲ）回収シグナル、Ｃ末端Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−配列に融合してもよい（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４ Ｄｅｃ；３４（１２）：３５８２−９４を参照されたい）。
組成物
別の態様では、本発明は、上記定義のＭｉＨＡペプチドのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせ（または前記ペプチド（単一または複数）をコードする核酸）を含む組成物またはペプチドの組み合わせを提供する。ある実施形態では、組成物は、上記定義のＭｉＨＡペプチドの任意の組み合わせ（例えば、表Ｉに示されるＮｏ．１〜９３、好ましくは、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０の任意の組み合わせ）、または前記ＭｉＨＡペプチドをコードする核酸の組み合わせを含む。例えば、組成物は、ＭｉＨＡ Ｎｏ．１に対応する第１のＭｉＨＡペプチドおよびＭｉＨＡ Ｎｏ．２４に対応する第２のＭｉＨＡペプチドを含んでよい。本発明により、上記定義のＭｉＨＡペプチドの任意の組み合わせ／副組み合わせを含む組成物が包含される。別の実施形態では、組み合わせは、１種または複数の既知のＭｉＨＡ、例えば、既知の本明細書で開示のＭｉＨＡ（例えば、表ＩＩＩおよびＶを参照）を含み得る。ある実施形態では、組成物またはペプチドの組み合わせは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＭｉＨＡペプチドを含み、前記ＭｉＨＡペプチドの少なくとも１つは、ＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３を含む。
さらなる実施形態では、ＭｉＨＡペプチドを提示するＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４）は、細胞、例えば、ＡＰＣの表面に発現される。ある実施形態では、本発明は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した１種または複数のＭｉＨＡペプチドをローディングしたＡＰＣを提供する。またさらなる実施形態では、本発明は、単離ＭＨＣクラスＩ／ＭｉＨＡペプチド複合体を提供する。
したがって、別の態様では、本発明は、上記定義のＭｉＨＡペプチドのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物およびＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４）を発現している細胞を提供する。本発明で使用するＡＰＣは、特定の細胞型に限定されず、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージおよびＢ細胞などのプロフェッショナルＡＰＣが含まれ、これらは、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球に認識されるように、それらの細胞表面にタンパク性抗原を提示することが知られている。例えば、ＡＰＣは、末梢血単球からＤＣを誘導し、その後、インビトロ、エクスビボまたはインビボでＭｉＨＡペプチドと接触させる（刺激する）ことにより得ることができる。また、１種または複数の本発明のＭｉＨＡペプチドが対象に投与され、ＭｉＨＡペプチドを提示するＡＰＣが対象の身体中で誘導される場合、ＭｉＨＡペプチドをインビボで提示するようにＡＰＣを活性化することができる。語句の「ＡＰＣを誘導」または「ＡＰＣを刺激」は、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４）によってペプチドがその表面に提示されるように、１種または複数のＭｉＨＡペプチド、またはそのＭｉＨＡペプチドをコードする核酸と細胞を接触させること、またはそれらを細胞にローディングすることを含む。上述のように、本発明により、ＭｉＨＡペプチドは、例えば、ＭｉＨＡの配列（未変性タンパク質を含む）を含むより長いペプチド／ポリペプチドを使って、間接的にローディングされ得る。これは、次に、ＡＰＣ内で（例えば、プロテアーゼにより）プロセッシングされて、細胞の表面にＭｉＨＡペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体を生成する。
ＡＰＣにＭｉＨＡペプチドをローディングし、ＡＰＣによるＭｉＨＡペプチドの提示を可能とした後、ＡＰＣは対象にワクチンとして投与できる。例えば、エクスビボ投与は、
（ａ）第１の対象からＡＰＣを収集するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のＡＰＣにＭｉＨＡペプチドを接触させて／ローディングして、ＡＰＣの表面に、ＭＨＣクラスＩ／ＭｉＨＡペプチド複合体を形成させるステップと、（ｃ）ペプチドをローディングしたＡＰＣを、処置を必要としている第２の対象に投与するステップと、を含めることができる。
第１の対象および第２の対象は、同じ個体（例えば、自己ワクチン）とすることができ、または異なる個体（例えば、同種ワクチン）であってもよい。あるいは、本発明では、抗原提示細胞を誘導する医薬組成物の製造のための本発明のＭｉＨＡペプチドの使用が提供される。さらに、本発明は、抗原提示細胞を誘導するための医薬組成物の製造方法またはプロセスを提供し、該方法またはプロセスは、ＭｉＨＡペプチドを薬学的に許容可能なキャリアと混合または配合するステップを含む。
上記定義のＭｉＨＡペプチドのいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせをローディングされたＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４）を発現するＡＰＣなどの細胞は、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球、例えば、自己ＣＤ８＋ Ｔリンパ球を刺激／増幅するために使用し得る。したがって、別の態様では、本発明は、上記定義のＭｉＨＡペプチド（またはこれらをコードする核酸またはベクター）；ＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４）およびＴリンパ球、より具体的にはＣＤ８＋ Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球を含む細胞集団）のいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物を提供する。
ある実施形態では、組成物は、緩衝液、賦形剤、キャリア、希釈剤および／または培地（例えば、培養培地）をさらに含む。さらなる実施形態では、緩衝液、賦形剤、キャリア、希釈剤および／または培地は、薬学的に許容可能な緩衝液（単一または複数）、賦形剤（単一または複数）、キャリア（単一または複数）、希釈剤（単一または複数）および／または培地（単一または複数）である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な緩衝液、賦形剤、キャリア、希釈剤および／または培地」は、任意のおよび全ての溶媒、緩衝液、結合剤、潤滑剤、フィラー、増粘剤、崩壊剤、可塑剤類、コーティング、バリア層配合物、潤滑剤、安定化剤、放出遅延剤、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗カビ剤、等張剤、などの生理学的に適合性があり、有効成分（単一または複数）の生物活性の効力を妨害せず、対象に有毒でないものを含む。薬剤的活性物質のためのこのような培地および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２００３，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ ＵＫ）。任意の従来の培地または薬剤が活性化合物（ペプチド、細胞）と相いれない場合を除き、本発明の組成物におけるこれらの使用が意図されている。ある実施形態では、緩衝液、賦形剤、キャリア、および／または培地は、非天然の緩衝液、賦形剤、キャリアおよび／または培地である。
一実施形態では、本発明のＭｉＨＡペプチドは、ワクチンとして使用される。
別の態様では、本発明は、上記定義のＭｉＨＡペプチド（または前記ペプチド（単一または複数）をコードする核酸）のいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせ、および緩衝液、賦形剤、キャリア、希釈剤および／または培地の内の１種または複数を含む免疫原性組成物を提供する。
細胞（例えば、Ｔリンパ球）を含む組成物に関しては、組成物は生存細胞の維持を可能とする好適な培地を含む。このような培地の代表的な例には、食塩水、アール平衡塩類溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））またはプラズマライト（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（登録商標））が挙げられる。
ある実施形態では、組成物は、「免疫原性組成物」または「ワクチン」である。本明細書で使用される場合、用語の「免疫原性組成物」または「ワクチン」は、１種または複数のＭｉＨＡペプチドまたはワクチンベクターを含む組成物または配合物を意味し、対象に投与した場合、対象に存在する１種または複数のＭｉＨＡペプチドに対して免疫応答を誘導する。哺乳動物の免疫応答を誘導するワクチン接種方法は、ワクチン分野で既知の任意の従来の経路、例えば、粘膜（例えば、鼻腔、肺、口腔、胃、腸、直腸、腟、または尿路）表面経由、非経口経由（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹腔内）経路、または局所投与（パッチなどの経皮送達システム経由）により投与されるワクチンまたはワクチンベクターの使用を含む。
ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチドは、キャリアタンパク質にコンジュゲートされ（コンジュゲートワクチン）、ＭｉＨＡペプチドの免疫原性が高められる。したがって、本発明は、ＭｉＨＡペプチドおよびキャリアタンパク質を含む組成物（コンジュゲート）を提供する。例えば、ＭｉＨＡペプチドは、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンド（例えば、Ｚｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１１４：１７７−２０１、参照）またはポリマー／デンドリマー（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１３ Ａｕｇ １２；１４（８）：２７９８−８０６、参照）にコンジュゲート化し得る。
ある実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンはさらにアジュバントを含む。「アジュバント」は、抗原（ＭｉＨＡペプチドおよび／または本発明による細胞）などの免疫原性剤に添加されると、混合物に暴露時に宿主中の作用物質に対する免疫応答を非特異的に強化または増強する物質を意味する。ワクチン分野で現在使用されているアジュバントの例には、（１）鉱物塩（リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、リン酸カルシウムゲル）、スクアレン、（２）油乳剤などの油性アジュバントおよび界面活性剤系配合物、例えば、ＭＦ５９（微小流動化合成洗剤安定化水中油型乳剤）、ＱＳ２１（精製サポニン），ＡＳ０２［ＳＢＡＳ２］（水中油型乳剤＋ＭＰＬ＋ＱＳ−２１）、（３）粒子アジュバント、例えば、ビロソーム（インフルエンザ赤血球凝集素を組み込んだ単層リポソームビークル）、ＡＳ０４（［ＳＢＡＳ４］ＭＰＬ含有アルミニウム塩）、ＩＳＣＯＭＳ（サポニンおよび脂質の構造化複合体）、ポリラクチドコグリコライド（ＰＬＧ）、（４）微生物誘導体（天然および合成）、例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｄｅｔｏｘ（ＭＰＬ＋マイコバクテリウム・フレイ細胞壁骨格）、ＡＧＰ［ＲＣ−５２９］（合成アシル化単糖）、ＤＣ＿Ｃｈｏｌ（リポソームに自己組織化可能な類脂質性免疫賦活剤）、ＯＭ−１７４（脂質Ａ誘導体）、ＣｐＧモチーフ（免疫賦活性ＣｐＧモチーフ含有合成オリゴヌクレオチド）、改変ＬＴおよびＣＴ（非毒性アジュバント効果を付与するために遺伝的に改変された細菌性毒素）、（５）内在性ヒト免疫調節物質、例えば、ｈＧＭ−ＣＳＦまたはｈＩＬ−１２（タンパク質またはコード化プラスミドとして投与できるサイトカイン）、Ｉｍｍｕｄａｐｔｉｎ（Ｃ３ｄタンデム型配列）および／または（６）金粒子などの不活性ビークル、等が挙げられる。
ある実施形態では、ＭｉＨＡペプチド（単一または複数）またはそれを含む組成物は、凍結乾燥形態である。別の実施形態では、ＭｉＨＡペプチド（単一または複数）は、液体組成物である。さらなる実施形態では、ＭｉＨＡペプチド（単一または複数）は、組成物中で、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度である。さらなる実施形態では、ＭｉＨＡペプチド（単一または複数）は、組成物中で、約０．２μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ〜約１０、２０、３０、４０または５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬの濃度である。
ＭｉＨＡ特異的ＴＣＲおよびＴリンパ球
上述のように、上記定義のＭｉＨＡペプチドのいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせをローディングされたまたはこれらに結合したＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４）を発現するＡＰＣなどの細胞は、インビボまたはエクスビボでＣＤ８＋ Ｔリンパ球を刺激／増幅するために使用し得る。
したがって、別の態様では、本発明は、上記ＭＨＣクラスＩ分子／ＭｉＨＡペプチド複合体と相互作用または結合することが可能なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子、およびこのようなＴＣＲ分子をコードする核酸分子、およびこのような核酸分子を含むベクターを提供する。本発明によるＴＣＲは、好ましくはインビトロまたはインビボの生細胞表面で、ＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４）にローディングされたまたはそれにより提示されたＭｉＨＡペプチドと特異的に相互作用または結合することが可能である。本発明のＴＣＲおよび特に、ＴＣＲをコードする核酸を適用して、例えば、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球）または他のタイプのリンパ球を遺伝的に形質転換／改変し、ＭＨＣクラスＩ ＭｉＨＡペプチド複合体を特異的に認識する新規Ｔリンパ球クローンを生成し得る。特定の実施形態では、患者から取得したＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球）を形質転換してＭｉＨＡペプチドを認識する１種または複数のＴＣＲを発現させて、その形質転換細胞を患者に投与する（自己細胞輸注）。
別の実施形態では、本発明は、ＭｉＨＡペプチド特異的ＴＣＲをコードするベクターまたはプラスミドにより形質転換／遺伝子導入されたＴリンパ球、例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ＭｉＨＡ特異的ＴＣＲで形質転換された自己または同種細胞を使って、患者を処置する方法を提供する。またさらなる実施形態では、癌の処置用の自己または同種細胞の製造におけるＭｉＨＡ特異的ＴＣＲの使用が提供される。
いくつかの実施形態では、本発明の治療用組成物で処置される患者は、同種幹細胞移植（ＡＳＣＬ）、同種リンパ球輸注または自己リンパ球輸注による処置の前、またはその後に処置される。本発明の治療用組成物は、ＭｉＨＡペプチドに対しエクスビボ活性化された同種Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球）；ＭｉＨＡペプチドをローディングした同種または自己ＡＰＣワクチン；ＭｉＨＡペプチドワクチンおよび同種または自己Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球）またはＭｉＨＡ特異的ＴＣＲで形質転換されたリンパ球を含む。
本発明によるＭｉＨＡペプチドを認識可能なＴリンパ球クローンを提供するための方法は、対象（例えば、移植片のレシピエント）、例えば、ＡＳＣＴおよび／またはドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）のレシピエントにおいてＭｉＨＡを発現する腫瘍細胞のために作成されてもよく、またそれを特異的に標的とすることができる。したがって、本発明は、ＭｉＨＡペプチド／ＭＨＣクラスＩ分子複合体を特異的に認識するまたはそれと結合することが可能なＴ細胞受容体をコードおよび発現するＣＤ８＋ Ｔリンパ球を提供する。前記Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球）は、組換え型（遺伝子操作された）または自然に淘汰されたＴリンパ球であってよい。したがって、本明細書は、Ｔ細胞活性化および増殖を誘発する助けとなる条件下で、未分化リンパ球をＭｉＨＡペプチド／ＭＨＣクラスＩ分子複合体（典型的には、ＡＰＣなどの細胞の表面に発現される）と接触させるステップを含む、本発明のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を生成するための少なくとも２つの方法を提供し、該ステップは、インビトロまたはインビボで（すなわち、ＭｉＨＡペプチドをローディングしたＡＰＣワクチンを投与された患者において、またはＭｉＨＡペプチドワクチンで処置された患者において）実施し得る。あるいは、ＭｉＨＡ特異的または標的Ｔリンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子／ＭｉＨＡ複合体（すなわち、遺伝子操作されたまたは組換え型ＣＤ８＋ Ｔリンパ球）に特異的に結合するＴＣＲ（より具体的にはアルファおよびベータ鎖）をコードする１種または複数の核酸（遺伝子）をクローニングすることによりインビトロまたはエクスビボで製造／生成し得る。本発明のＭｉＨＡ特異的ＴＣＲをコードする核酸は、当該技術分野において既知の方法を使用して、ＭｉＨＡペプチドに対しエクスビボで（例えば、ＭｉＨＡペプチドをローディングしたＡＰＣを使って）活性化されたＴリンパ球から；またはペプチド／ＭＨＣ分子複合体に対する免疫応答を示す個体から得てよい。本発明のＭｉＨＡ特異的ＴＣＲは、移植片レシピエントまたは移植片ドナーから取得した宿主細胞中でおよび／または宿主リンパ球中で組換え発現させて、および必要に応じて、インビトロで分化させて、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を得てよい。ＴＣＲアルファおよびベータ鎖をコードする核酸（単一または複数）（導入遺伝子（単一または複数））は、遺伝子導入（例えば、電気穿孔法）または形質導入（例えば、ウイルスベクターを使って）などの任意の好適な方法を使用して、Ｔ細胞（例えば、治療される対象または別の個体由来の）に導入し得る。ＭｉＨＡ特異的ＴＣＲを発現している遺伝子操作されたＣＤ８＋ Ｔリンパ球は、周知の培養方法を使ってインビトロで増殖させ得る。
本発明は、ＭｉＨＡペプチド（すなわち、細胞表面に発現したＭＨＣクラスＩ分子に結合したＭｉＨＡペプチド）により特異的に誘発され、活性化および／または増幅（増殖）された単離ＣＤ８＋ Ｔリンパ球を提供する。本発明はまた、本発明によるＭｉＨＡペプチド（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子に結合したＭｉＨＡペプチド）を認識可能なＣＤ８＋ Ｔリンパ球および前記ＭｉＨＡペプチドを含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＭＨＣクラスＩ分子／ＭｉＨＡペプチド複合体を特異的に認識するＣＤ８＋ Ｔリンパ球が濃縮された細胞集団または細胞培養物（例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球集団）を提供する。このような濃縮された集団は、本明細書で開示の１種または複数のＭｉＨＡペプチドをローディングした（例えば、提示している）ＭＨＣクラスＩ分子を発現するＡＰＣなどの細胞を使って特定のＴリンパ球のエクスビボ増殖を実施することにより得てよい。本明細書で使用される場合、「濃縮された」は、集団中のＭｉＨＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の比率が天然の細胞集団、すなわち、特定のＴリンパ球のエクスビボ増殖ステップを経ていない細胞集団、に比べて顕著に高いことを意味する。さらなる実施形態では、細胞集団中のＭｉＨＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の比率は、少なくとも約０．５％、例えば、少なくとも約１％、１．５％、２％または３％である。いくつかの実施形態では、細胞集団中のＭｉＨＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球は、約０．５〜約１０％、約０．５〜約８％、約０．５〜約５％、約０．５〜約４％、約０．５〜約３％、約１％〜約５％、約１％〜約４％、約１％〜約３％、約２％〜約５％、約２％〜約４％、約２％〜約３％、約３％〜約５％または約３％〜約４％である。目的のＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド（ＭｉＨＡ）複合体を特異的に認識するＣＤ８＋ Ｔリンパ球が濃縮されたこのような細胞集団または培養物（例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球集団）は、以降で詳述するＭｉＨＡベース癌免疫療法に使用し得る。
いくつかの実施形態では、ＭｉＨＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の集団は、例えば、上記定義のＭｉＨＡペプチドを（共有結合または非供給結合で）ローディングしたＭＨＣクラスＩ分子の多量体などの親和性ベース系を使ってさらに濃縮される。したがって、本発明は、ＭｉＨＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の精製または単離集団を提供し、例えば、ＭｉＨＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の比率は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％である。
ＭｉＨＡベース癌免疫療法
本明細書において特定されるＭｉＨＡペプチド配列は、ｉ）移植片（ＡＨＣＴ）のレシピエントに注入されるＭｉＨＡ特異的Ｔ細胞のインビトロ初回刺激および増殖のために、および／またはｉｉ）移植後に、レシピエントにおけるＭｉＨＡ特異的Ｔ細胞の移植片対腫瘍効果（ＧｖＴＥ）を追加免疫するためのワクチンとして使用される、合成ペプチドの製造に使用し得る。
本発明により提供される治療方法、ＭｉＨＡ標的癌免疫療法の潜在的効果は極めて大きい。血液癌（例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫）では、抗ＭｉＨＡ Ｔ細胞の使用は、ＧｖＨＤを引き起こすことなく優れた抗腫瘍活性を提供することにより、従来のＡＨＣＴに取って代わり得る。これは、リスク／利益（ＧｖＨＤ／ＧＶＴ）比が高すぎるという理由から従来のＡＨＣＴによる処置を受けることができない多くの血液系腫瘍の患者に有益であり得る。最後に、マウスにおける実験では、ＭｉＨＡ標的免疫療法が固形腫瘍の治療に有効であり得ることが示されているため、ＭｉＨＡベースの癌免疫療法は、固形腫瘍などの非血液癌のＭｉＨＡ標的療法として使用されるであろう。
ある実施形態では、癌は、限定されないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛様細胞性白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病または成人Ｔ細胞白血病を含む白血病である。別の実施形態では、癌は、限定されないが、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫、前駆Ｔ細胞白血病／リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／リンパ腫またはＭＡＬＴリンパ腫を含むリンパ腫である。さらなる実施形態では、癌は、限定されないが、形質細胞性骨髄腫、骨髄腫症、およびカーラー病を含む骨髄腫（多発性骨髄腫）である。
別の態様では、本発明は、対象における癌を処置するためのワクチンとして、本発明のＭｉＨＡペプチドの使用を提供する。ある実施形態では、対象は、ＭｉＨＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球のレシピエントである。
したがって、別の態様では、本発明は、癌を処置する（例えば、腫瘍細胞の数を減らす、腫瘍細胞を死滅させる）方法を提供し、前記方法は、（ＡＰＣなどの細胞の表面に発現した）ＭＨＣクラスＩ分子／ＭｉＨＡペプチド複合体を認識する（すなわち、該複合体に結合するＴＣＲを発現する）有効量のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を、それを必要としている対象に投与（輸注）することを含む。ある実施形態では、方法は、有効量のＭｉＨＡペプチド、および／またはＭｉＨＡペプチドをローディングしたＭＨＣクラスＩ分子を発現している細胞（例えば、樹状細胞などのＡＰＣ）を、前記ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の投与／輸注の後に、前記対象に投与することをさらに含む。またさらなる実施形態では、前記方法は、１種または複数のＭｉＨＡペプチドをローディングした治療有効量の樹状細胞を、それを必要としている対象に投与することを含む。またさらなる実施形態では、方法は、ＭＨＣクラスＩ分子に提示されたＭｉＨＡペプチドに結合する組換え型ＴＣＲを発現する、治療有効量の同種または自己細胞を、それを必要としている患者に投与することを含む。
別の態様では、本発明は、対象の癌を処置する（例えば、腫瘍細胞の数を減らす、腫瘍細胞を死滅させる）ための、ＭｉＨＡペプチドをローディングした（提示している）ＭＨＣクラスＩ分子を認識するＣＤ８＋ Ｔリンパ球の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象の癌を処置する（例えば、腫瘍細胞の数を減らす、腫瘍細胞を死滅させる）医薬品の調製／製造のための、ＭｉＨＡペプチドをローディングしたＭＨＣクラスＩ分子を認識するＣＤ８＋ Ｔリンパ球の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、対象の癌を処置（例えば、腫瘍細胞数の低減、腫瘍細胞の死滅）に使用するための、ＭｉＨＡペプチドをローディングした（提示している）ＭＨＣクラスＩ分子を認識するＣＤ８＋ Ｔリンパ球を提供する。
さらなる実施形態では、使用は、前記ＭｉＨＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の使用の後の、有効量のＭｉＨＡペプチド、および／または、式Ｉのペプチドをローディングした（提示している）ＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞（例えば、ＡＰＣ）の使用をさらに含む。
ある実施形態では、ＭｉＨＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞で輸注または処置される対象は、ＡＨＣＴまたはドナーリンパ球輸注（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されたＭｉＨＡペプチドに対しインビトロで活性化されていないＴ細胞を含むリンパ球）で前処置を受けている。さらなる実施形態では、癌は、血液癌、例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫である。ある実施形態では、癌は白血病である。
処置およびドナー選択方法
本発明の同種治療用細胞は、患者の（レシピエントの）腫瘍細胞により提示されるが、ドナーの細胞により提示されないＭｉＨＡペプチドを認識するＴＣＲを発現する。本発明は、血液癌の患者のための効果的な治療用組成物を選択する方法を提供し、該方法は、（ａ）患者から生物試料を取得すること、（ｂ）表ＩＩから選択される１種または複数のＳＮＰの存在または非存在を判定すること、（ｃ）患者由来の腫瘍試料中の、表ＩＩに与えられる１種または複数のＳＮＰに対応するＲＮＡまたはタンパク質産物の発現を特定すること、を含む。同種細胞で処置するために、（ａ）レシピエントの癌細胞により発現されたＭＨＣクラスＩ分子により提示されたＭｉＨＡペプチド（すなわち、本明細書の表ＩＩにあるもの）に対応する遺伝的バリアントを発現しないドナーが選択され、（ｂ）リンパ球がドナーから取得され、および（ｃ）提示されたＭｉＨＡペプチドに特異的なＣＤ８＋ Ｔリンパ球が、本明細書で提供される方法を使って調製され、患者に投与される。あるいは、選択ドナー、すなわち、目的のＭｉＨＡを発現しないドナー、から取得した同種細胞が、遺伝的に形質転換されて、目的のＭｉＨＡに対するＴＣＲを発現し、患者に投与される。
自己細胞での処置のために、患者の癌細胞の細胞表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子により提示されたＭｉＨＡを認識するＴＣＲを発現している自己Ｔリンパ球が投与される。本発明は、患者のためのＴリンパ球療法を選択する方法を提供し、該方法は、（ａ）患者から生物試料を取得すること、（ｂ）表ＩＩから選択される１種または複数のＳＮＰの存在または非存在を判定すること、（ｃ）患者由来の腫瘍試料中の、表ＩＩに与えられる１種または複数のＳＮＰに対応するＲＮＡまたはタンパク質産物の発現を特定すること、を含む。
所与のＭｉＨＡのどのバリアントを対象の処置に使用すべきかを決定するために（例えば、ＭｉＨＡ Ｎｏ．１を一例として使って、ＳＥＤ ＩＤ Ｎｏ．８０または８１のいずれを使用すべきかを決定するために）、対象により発現されたアレルバリアントを最初に特定する必要がある。本明細書で記載の新規ＭｉＨＡ（表ＩＩ）に対応するタンパク質中のアミノ酸置換ならびに転写物中のヌクレオチド置換は、例えば、公開データベースで提供される情報を使って、当業者により容易に特定し得る。例えば、表ＩＩは、ｄｂＳＮＰデータベース中のＭｉＨＡに対する参照／識別Ｎｏ．を含み、これは、ゲノム、転写物およびタンパク質レベルでのバリエーションに関する詳細情報を提供する。この情報に基づいて、対象により発現されたバリアント（多型または一塩基多型（ＳＮＰ））の判定を、当技術分野において既知の多くの方法により、試料の核酸および／またはタンパク質レベルで容易に行い得る。表ＩＩはまた、ＭｉＨＡペプチドが由来する遺伝子のためのＥｎｓｅｍｂｌデータベースの参照ＩＤを含む。
核酸レベルの改変を検出するのに適した方法の例には、目的の核酸（例えば、ＭｉＨＡをコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の核酸配列の関連部分（バリエーションを含む）の配列決定；多型（第１のアレル）を含む目的の核酸には特異的にハイブリダイズすることができるが、多型（第２のアレル）を含まない対応する核酸にはハイブリダイズできない（またはより少ない程度でハイブリダイズする）、またはその逆の核酸プローブのハイブリダイゼーション（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件などの同等のハイブリダイゼーション条件下で）；制限酵素断片長多型分析（ＲＦＬＰ）；増幅断片長多型ＰＣＲ（ＡＦＬＰ−ＰＣＲ）；アレルのうちの１つに特異的なプライマーを使用した核酸断片の増幅（アレルが存在する場合はプライマーが増幅産物を産生し、他のアレルが増幅の鋳型として使用される場合（例えば、アレル特異的ＰＣＲ）は同じ増幅産物を産生しない）が挙げられる。他の方法には、インサイツハイブリダイゼーション分析および一本鎖高次構造多型分析が挙げられる。さらに、目的の核酸は、本明細書に記載される検出法の前にまたはそれと同時に、既知の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］）を用いて増幅してもよい。そのような増幅のための種々のプライマーのデザインは、当該技術分野において既知である。核酸（ｍＲＮＡ）はまた、分析前にｃＤＮＡに逆転写することもできる。
ポリペプチドレベルで改変／多型を検出する好適な方法の例には、目的のポリペプチドの関連のある部分（バリエーションを含む）の配列決定、ポリペプチドの消化に続くペプチド断片の質量分析またはＨＰＬＣ分析（目的のポリペプチドのバリエーション／多型は、変化した質量分析またはＨＰＬＣスペクトルをもたらす；および、例えば、アミノ酸バリエーションを含むエピトープを標的とすることによる、改変（第２のアレル）を含まない対応する未変性のポリペプチドと比べて改変（第１のアレル）を含むポリペプチドに改変された免疫反応性を示す免疫学的試薬（例えば、抗体、リガンド）を使用した免疫検出が挙げられる。免疫検出は、抗タンパク質抗体または抗タンパク質抗体に結合する二次抗体のいずれかに結合させた酵素標識、クロモ力学的標識、放射性標識、磁気標識、または発光標識の使用により、ポリペプチド分子と抗タンパク質抗体との間の結合の量を測定することができる。さらに、他の高親和性リガンドを使用してもよい。使用することのできる免疫測定法は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および当業者に既知の他の技術を含む（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９ ａｎｄ Ｅｄｗａｒｄｓ Ｒ，Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９を参照されたい）。
これらの検出技術は全て、マイクロアレイ、タンパク質アレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、電子バイオチップ、またはタンパク質チップベース技術の形式でも利用することもできる（Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓ．，２０００参照）。
一実施形態では、本発明は、患者のために効果的な治療用組成物を選択する方法を提供し、該方法は、（ａ）患者由来の血液癌からＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを単離すること、および（ｂ）前記ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドの内の、表Ｉに示す１種または複数のＭｉＨＡペプチドの存在または非存在を特定すること、を含む。さらなる実施形態では、表Ｉに示す１種または複数のＭｉＨＡペプチドの存在または非存在の特定は、質量分析により、および／または１種または複数のＭｉＨＡペプチドに対し選択性がある抗体検出試薬を使って実施される。質量分析を使ったＭｉＨＡペプチドの検出または特定は、国際公開第２０１４／０２６２７７号に記載のものなどの当該技術分野において既知の方法を使用して実施できる。ＭＨＣクラスＩ分子により提示され、癌細胞の試料から単離されたＭｉＨＡペプチドの質量分析（ＭＳ）配列決定は、単離されたおよび消化ペプチドに対し取得されたＭＳスペクトルを、ＭｉＨＡペプチドに対しコンピュータにより計算されたスペクトルと比較することを含む。
癌の患者を処置するための、本発明の治療用同種Ｔリンパ球は、患者の癌細胞により発現されるが、ドナー細胞により発現されない１種または複数のＭｉＨＡペプチド提示しているＭＨＣクラスＩ分子を標的とする。したがって、本発明の同種Ｔリンパ球生成するための適切なドナーの選択は、表ＩＩに提供される１種または複数の一塩基多型の存在または非存在に関する候補ドナーの遺伝子型解析を含む。
一実施形態では、本発明は、癌患者のために効果的免疫療法処置（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子／ＭｉＨＡペプチド複合体標的）を選択する方法を提供し、該方法は、患者由来の腫瘍細胞中のＭＨＣクラスＩ分子により提示されるＭｉＨＡペプチドの存在を特定することを含む。
別の実施形態では、本発明は、患者のために候補同種細胞ドナーを選別する方法を提供し、該方法は、ドナー由来の生物試料中の、表ＩＩに提供されるものから選択される１種または複数のＳＮＰの存在または非存在を特定することを含む。ある実施形態では、患者から取得された癌細胞中のＭＨＣクラスＩ分子により提示されることが既知のＭｉＨＡペプチドに対応するＳＮＰの、候補ドナーにおける存在または非存在が特定される。さらなる実施形態では、候補同種ドナーから取得された生物試料が遺伝子型解析されて、患者が保有することが既知の１種または複数のＳＮＰの存在または非存在が特定される。この場合、検出されるＳＮＰは表ＩＩに提供されるものから選択される。
さらなる実施形態では、本発明は、表ＩＩから選択される複数のＳＮＰの検出のために固体表面にコンジュゲートさせた複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む、遺伝子型解析システムを提供する。
例えば、ＭｉＨＡ Ｎｏ．１（配列番号８０または８１）のいずれのバリアントを対象の処置に使用すべきかを決定するために、任意の好適な方法（配列決定、など）を使用して、（ｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａ遺伝子由来転写物が、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９（ＥＮＳＧ００００００７６５１３）の１６８０位に対応する位置にＴまたはＣを含むかどうか；（ｉｉ）ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８中の染色体１２の１１００３６２６５位に対応するヌクレオチドがＣまたはＴであるかどうか；および／または（ｉｉｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａポリペプチドが、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９（ＥＮＳＧ００００００７６５１３）によりコードされるポリペプチドの５０５位に対応する位置に、ロイシンまたはプロリン残基を含むかどうか、を対象の試料に対し決定する必要がある。（ｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａ遺伝子由来の転写物が、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９の１６８０位に対応する位置にＴを含む場合、（ｉｉ）ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８中の染色体１２の１１００３６２６５位に対応するヌクレオチドがＴである場合；および／または（ｉｉｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａポリペプチドが、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９によりコードされるポリペプチドの５０５位に対応する位置にロイシン残基を含む場合、配列番号８０（ＳＬＬＥＳＳＲＳＱＥＬ）のＭｉＨＡバリアントを使用するべきである。あるいは、（ｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａ遺伝子由来の転写物が、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９の１６８０位に対応する位置にＣを含む場合、（ｉｉ）ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８中の染色体１２の１１００３６２６５位に対応するヌクレオチドがＣである場合；および／または（ｉｉｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａポリペプチドが、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９によりコードされるポリペプチドの５０５位に対応する位置にプロリン残基を含む場合、配列番号８１（ＳＬＬＥＳＳＲＳＱＥＰ）のＭｉＨＡバリアントを使用するべきである。ＭｉＨＡ Ｎｏ．２〜５、７〜２５、２７〜３０および３２〜８４のいずれかの内のどのバリアントを所与の対象で使用するべきかを決定するために、同じ手法を適用してよい。
ＭｉＨＡ Ｎｏ．３４および３５は、男性対象にのみ使用してよい（コードする遺伝子が染色体Ｙ上に位置するので、ＭｉＨＡは男性対象でのみ発現される）。
ある実施形態では、上記ＣＤ８＋ Ｔリンパ球は、上述のように、インビトロまたはエクスビボで増殖させたＣＤ８＋ Ｔリンパ球である。増殖させたＣＤ８＋ Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の増殖（増幅）および／または分化を許容する条件下で初代ＣＤ８＋ Ｔリンパ球（同種ドナー由来）を培養することによってを得てもよい。このような条件は、典型的には、好適な培地（造血／リンパ球系細胞用の培地、例えば、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５およびＡＩＭ−Ｖ（登録商標））、成長因子および／またはサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５等の存在下で、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球を、表面に目的のＭｉＨＡペプチド／ＭＨＣ複合体を発現しているＡＰＣなどの細胞と接触させることを含む（例えば、Ｍｏｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｎｏｖ；１４２（２）：２９２−３０２を参照のこと）。 このような増殖したＣＤ８＋ Ｔリンパ球は、次いで、例えば、静脈内注入によってレシピエントに投与される。養子免疫療法のための抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の増幅および調製の方法および条件は、例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ２００７；９（７）：６１３−６２９およびＢｏｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１１ Ｍａｙ；１３（５）：５１８−５２２に開示されている。抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔリンパ球を増幅するための標準操作手順（ＳＯＰ）は、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｅｘａｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡから入手可能である（Ｓｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１２ Ｊａｎ；１４（１）：７−１１、補足資料、を参照されたい）。
ある実施形態では、対象（レシピエント）は、同種幹細胞移植（ＡＳＣＴ）またはドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）のレシピエントである。
別の態様では、本発明は、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球（例えば、養子Ｔ細胞免疫療法用として）を増殖させる方法を提供し、前記方法は、（ａ）ＭｉＨＡペプチドのバリアントを発現していない第１の個体由来のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を、前記ＭｉＨＡペプチドバリアントをローディングしたＨＬＡ−Ａ２および／またはＨＬＡ−Ｂ４４アレルのＭＨＣクラスＩ分子を発現している細胞の存在下、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の増殖に好適する条件下で培養することを含む。
別の態様では、本発明は、細胞免疫療法のための細胞を産生／製造する方法を提供し、該方法は、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されたＭｉＨＡペプチドを含むＡＰＣの存在下でヒトリンパ球を培養することを含み、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２またはＡＬＡ−Ｂ４４サブタイプである。この方法で使用されるヒトＴリンパ球は、同種細胞、すなわち、同種細胞でレシピエントを処置するために製造されているドナーから得られる細胞である。
別の態様では、本発明は、細胞免疫療法のための細胞を産生／製造する方法を提供し、該方法は、（ａ）培養した細胞株からリンパ球（例えば、Ｔリンパ球）を取得すること、および（ｂ）ＭＨＣクラスＩ分子／ＭｉＨＡペプチド複合体を含むＡＰＣの存在下で該細胞を培養することを含み、ＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２またはＡＬＡ−Ｂ４４サブタイプである。この方法で使用されるヒトＴリンパ球は、好ましくは、同種細胞、すなわち、同種細胞でレシピエントを処置するために製造されているドナーから得られる細胞である。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞免疫療法用の細胞を産生／製造する方法を提供し、該方法は、（ａ）ドナー、例えば、血液癌（例えば、白血病）の患者、または健康な個体から、例えば、白血球除去により細胞を取得すること、および（ｂ）ＭＨＣクラスＩ分子／ＭｉＨＡペプチド複合体に結合する組換え型ＴＣＲで該細胞を形質転換すること、を含む。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞免疫療法用の細胞を製造する方法を提供し、該方法は、本明細書で定義のＭＨＣクラスＩ分子／ＭｉＨＡペプチド複合体に結合する組換え型ＴＣＲでヒト細胞株を形質転換することを含む。
別の態様では、本発明は、養子Ｔ細胞免疫療法用ＣＤ８＋ Ｔリンパ球を増殖させる方法を提供し、前記方法は、（ａ）ＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３、好ましくは、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０、のいずれかの内のどのバリアントが対象（レシピエント）中で発現しているかを特定すること、対象により発現されているＭｉＨＡバリアントをローディングしたＨＬＡ−Ａ２および／またはＨＬＡ−Ｂ４４アレルのＭＨＣクラスＩ分子を発現している細胞の存在下、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の増殖に好適な条件下で、候補ドナー由来のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を培養することを含み、前記候補ドナーはＭｉＨＡバリアント（対象（レシピエント）により発現されている）を発現していない。
別の態様では、本発明は、白血病の患者に対する治療手法を提供し、該方法は、（ａ）患者から得た白血病細胞で発現したＭＨＣクラスＩ分子により提示されたＭｉＨＡペプチドの存在を検出すること、および（ｂ）候補ドナーから得られた生物試料における、ステップ（ａ）で検出されたＭｉＨＡペプチドに対応する、表ＩＩに示したＳＮＰの存在または非存在を特定すること、を含む。
別の態様では、本発明は、白血病の患者に対する治療用組成物を調製する方法を提供し、該方法は、（ａ）患者から得た白血病細胞で発現したＭＨＣクラスＩ分子により提示されたＭｉＨＡペプチドの存在を検出すること、（ｂ）白血球除去により患者由来のリンパ球を取得すること、および（ｃ）ステップ（ａ）で検出された提示ＭｉＨＡペプチドを認識するＴＣＲで前記リンパ球を形質転換することを含む。
別の態様では、本発明は、白血病の患者に対する治療用組成物を調製する方法を提供し、該方法は、（ａ）患者を遺伝子型解析して、表ＩＩから選択される複数のＳＮＰの存在を特定すること、（ｂ）患者における１つのＳＮＰの存在を特定すること、（ｃ）白血球除去により患者から細胞を取得すること、および（ｄ）前記患者中に存在するＳＮＰによりコードされる多型を含むＭｉＨＡペプチドを含む、ＭＨＣクラスＩ分子／ＭｉＨＡペプチド複合体を発現しているＡＰＣと共に前記細胞をインキュベートすること、を含む。
方法を例示するための代表的例としてＭｉＨＡ Ｎｏ．１（配列番号７９）を再度使用すると、（ｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａ遺伝子由来の転写物が、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９の１６８０位に対応する位置にＴを含むこと、（ｉｉ）ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８中の染色体１２の１１００３６２６５位に対応するヌクレオチドがＴであること；および／または（ｉｉｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａポリペプチドが、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９によりコードされるポリペプチドの５０５位に対応する位置にロイシン残基を含むこと、が患者由来の試料で特定される場合、候補ドナー由来のＣＤ８＋ Ｔリンパ球は、配列番号８０（ＳＬＬＥＳＳＲＳＱＥＬ）のＭｉＨＡバリアントをローディングしたＨＬＡ−Ａ２アレルのＭＨＣクラスＩ分子を発現している細胞の存在下、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球増殖に好適する条件下で培養される。あるいは、（ｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａ遺伝子由来の転写物が、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９の１６８０位に対応する位置にＣを含むこと、（ｉｉ）ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８中の染色体１２の１１００３６２６５位に対応するヌクレオチドがＣであること；および／または（ｉｉｉ）ＡＮＫＲＤ１３Ａポリペプチドが、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ Ｎｏ．ＥＮＳＴ００００２６１７３９によりコードされるポリペプチドの５０５位に対応する位置にプロリン残基を含むこと、が患者由来の試料で特定される場合、候補ドナー由来のＣＤ８＋ Ｔリンパ球は、配列番号８１（ＳＬＬＥＳＳＲＳＱＥＰ）のＭｉＨＡバリアントをローディングしたＨＬＡ−Ａ２アレルのＭＨＣクラスＩ分子を発現している細胞の存在下、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球増殖に好適する条件下で培養される。本明細書で定義のＭｉＨＡ Ｎｏ．２〜９３のいずれかに同じ手法を適用してよい。
ある実施形態では、本発明は、癌を処置する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）上記定義の方法による養子Ｔ細胞免疫療法のために、式ＩのペプチドをローディングしたＭＨＣクラスＩ分子を認識するＣＤ８＋ Ｔリンパ球を増殖させること、および（ｉｉ）有効量の増殖したＣＤ８＋ Ｔリンパ球を、それを必要としている対象に投与（輸注）すること、を含む。一実施形態では、方法は、有効量の式Ｉのペプチド、および／または式ＩのＭｉＨＡペプチドをローディングしたＭＨＣクラスＩ分子を発現している細胞（例えば、ＡＰＣ）を、前記ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の投与／輸注の後に、前記対象に投与することをさらに含む。
ある実施形態では、上記癌は、表Ｉで示されるＭｉＨＡ Ｎｏ．１〜９３、好ましくは、ＭｉＨＡ７、８、１０、１４〜１５、２０〜２１、３２、３３、３５、３９〜４７、４９〜５０、６６、７０〜７１、７６、７８、８１、８４および９０をコードする遺伝子を発現している腫瘍細胞を含む。
これまで、本発明をその特定の実施形態を使って説明してきたが、添付の特許請求の範囲で定められる本発明の主旨および性質から逸脱することなく、これらを修正することができる。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は開放型（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ ｔｅｒｍ）として使用され、「〜を含むが、これらに限定されない」という語句と実質的に同等である。単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、対応する複数の指示対象を含む。
発明を実施するための形態
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に例示される。
実施例１：材料および方法
ＭｉＨＡは、国際公開第２０１４／０２６２７７号および（３）に記載の方法／戦略に従って特定される。手順の模式的概要は図１に示される。
細胞培養。次の２つの高頻度アレルＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３の内の少なくとも１つを発現している末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を６人の女性および７人の男性ボランティアの血液試料から単離した。以前記載したように（Ｔｏｓａｔｏ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，２００７）、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したＢリンパ芽球様細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）をＰＢＭＣから誘導した。確立されたＢ−ＬＣＬを、１０％ウシ胎仔血清、２５ｍＭヘペス、２ｍＭのＬ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。
ＤＮＡ抽出。製造業者のインストラクションに従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を使用して、５００万個のＢ−ＬＣＬからゲノムＤＮＡを抽出した。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＲＮａｓｅ Ｐ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を使用してＤＮＡを定量化し、品質を評価した。
ＨＬＡタイピング。５００ｎｇのゲノムＤＮＡを使ってＭａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ−Ｒｏｓｅｍｏｎｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌで高解像度ＨＬＡ遺伝子型解析を行った。
ゲノムＤＮＡライブラリーの調製。製造業者のプロトコルに従って、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標） Ｅｘｏｍｅ ＲＤＹ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を使用して、２００ｎｇのゲノムＤＮＡからゲノムライブラリーを構築した。これには、次のステップが含まれる：標的の増幅、プライマー配列の部分消化、Ｉｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ（商標）バーコードアダプターのアンプリコンへの連結反応、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標））を使ったライブラリーの精製および非増幅ライブラリーのｑＰＣＲによる定量化。次に、ライブラリー鋳型を調製し、Ｉｏｎ ＰＩ（商標）ＩＣ２００キットおよびＩｏｎ Ｃｈｅｆ（商標）システムを使って、Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）Ｉチップにロードした
エクソーム配列決定およびバリアントコール。ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）エクソームライブラリーのデフォルトパラメータを使って、Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎシークエンサーのチップ毎に２つのエクソームライブラリーを配列決定した。Ｉｏｎ ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅの「生殖細胞系列Ｐｒｏｔｏｎ−低ストリンジェンシー」パラメータを有するＴｏｒｒｅｎｔ Ｖａｒｉａｎｔ Ｃａｌｌｅｒプラグインを使って、バリアントコールを行った。
ＲＮＡ抽出。製造業者のインストラクションに従ってＤＮａｓｅ Ｉ処理を含むＴＲｉｚｏｌ ＲＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を使用して、５００万個のＢ−ＬＣＬから全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を使用して全ＲＮＡを定量化し、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を用いてＲＮＡの品質を評価した。
トランスクリプトームライブラリーの調製。製造業者のプロトコルに従って、ＴｒｕＳｅｑ（商標）ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ｖ２）（ＲＳ−９３０−１０２１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））を使用して、１μｇの全ＲＮＡからライブラリーを作製した。簡単に説明すると、２ラウンドの精製を用いて、ポリＴオリゴを付着させた磁気ビーズを使用してポリＡ ｍＲＮＡを精製した。ポリＡ ＲＮＡの２回目の溶出中に、ＲＮＡを断片化し、ｃＤＮＡ合成のために初回刺激した。ランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎｅ（登録商標））を使用して第１の鎖の逆転写（ＲＴ）を行った。第２ラウンドのＲＴも行うことで、二本鎖ｃＤＮＡを生成し、次いで、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭｐｕｒｅ（商標）ＸＰ ＰＣＲ精製システム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標））を使用して二本鎖ｃＤＮＡを精製した。製造業者のプロトコルに従って、断片化ｃＤＮＡの末端修復、３’末端のアデニル化、およびアダプターの連結反応を行った。１５サイクルのＰＣＲ増幅、ならびにＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＰＣＲミックスおよびプライマーカクテルを使用して、両端にアダプター分子を含有するＤＮＡ断片の濃縮を行った。
全トランスクリプトーム配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）。ＴｒｕＳｅｑ（商標）ｖ３ケミストリー実行させるＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００（商標）装置を使用してペアエンド（２ｘ１００ｂｐ）シーケンシングを実施した。クラスター密度は、約６００〜８００ｋクラスター／ｍｍ２を目標とした。２つのトランスクリプトームをレーン毎に配列決定した（スライド当たり８レーン）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定技術の詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｅｔａｉｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｄｎａ＿ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｉｌｍｎで見出すことができる。
リードマッピング。ｌｌｕｍｉｎａ Ｃａｓａｖａ（商標）１．８．１およびＥｌａｎｄ（商標）ｖ２マッピングソフトウェアを使用して、ヒト参照ゲノム（ｈｇ１９、ＵＣＳＣ）に配列データをマッピングした。最初に、＊．ｂｃｌファイルを圧縮ＦＡＳＴＱファイルに変換した後、別個の多重化シーケンスランをインデックスごとに逆多重化した。その後、マルチシードアライメントおよびギャップアライメント法を用いて、単一リードをミトコンドリアゲノムを含むヒト参照ゲノムにアラインした。２ヶ所以上の位置でマッピングしたリード（マルチリード）は、さらなる分析には含めなかった。スプライスジャンクションおよび混入物（リボソームＲＮＡ）に対してさらなるアライメントを行った。
トランスクリプトーム中の単一ヌクレオチドバリエーションの特定。最初に、参照ゲノム（ＧＲＣｈ３７．ｐ２，ＮＣＢＩ）と、各々の個体の配列決定されたトランスクリプトームとの間で観察される全ての単一ヌクレオチドバリエーションのリストが取得される。これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）のＳＮＰコールプログラムＣａｓａｖａ（商標）ｖ１．８．２を使用して行われた（ｈｔｔｐ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｃａｓａｖａ．ｉｌｍｎ）。高信頼性の単一ヌクレオチドバリエーション（Ｑｍａｘ＿ｇｔ値＞２０）および少なくとも３つのリードで観察されたもの（読み深度≧３）のみが考慮に入れられた。この閾値未満のＱｍａｘ＿ｇｔ値を有するＳＮＶには、代わりに参照塩基が割り当てられる。この戦略は、各々の個体と参照ゲノムとの間で、転写レベルで単一ヌクレオチドバリエーションを特定するために使用された。
コンピュータにより翻訳されたトランスクリプトーム。特定された各個体の単一ヌクレオチドバリエーションを含む配列がさらに処理された。各配列に対し、Ｅｎｓｅｍｂｌに報告されている全ての転写物（ｈｔｔｐ：／／ｕｓｅａｓｔ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｆｏ／ｄａｔａ／ｆｔｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ，Ｆｌｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｓｅｍｂｌ ２０１２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１２ ４０ Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ：Ｄ８４−Ｄ９０）を取得し、自社内ソフトウェアｐｙＧｅｎｏ バージョン（パイソンパッケージｐｙＧｅｎｏ １．１．７、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｐｉ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ／ｐｙｐｉ／ｐｙＧｅｎｏ／１．１．７、Ｇｒａｎａｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２（ＰＭＩＤ：２２４３８２４８））を使用して、コンピュータによりタンパク質に翻訳した。コンピュータにより翻訳したトランスクリプトームは、所与の位置に２つ以上の非同義多型が見られる例を含んでいた。ほとんどのＭＡＰが１１アミノ酸（３３ｂｐ）の最大長さを有することを考慮すると、ヘテロ接合位置の存在は、それぞれのｎｓ−ＳＮＰを中心とする２１（６６ｂｐ）アミノ酸のウインドウ中にＭｉＨＡバリアントを生ずる可能性がある。ウインドウが２つ以上のｎｓ−ＳＮＰを含む場合、全ての可能な組み合わせが翻訳された。１つのｎｓ−ＳＮＰによって影響を受ける組み合わせの数は、ファイルのサイズを制限するために、１０，２４０までに限定された。このように、ｎｓ−ＳＮＰにより影響を受けた最大で１１アミノ酸の全ての可能な配列が得られ、個体特異的タンパク質データベース中に含められ、これはＭＡＰの特定のためにさらなる実施形態に使用された。
質量分析およびペプチド配列決定。５〜６ｘ１０８に指数関数的に増殖するＢ−ＬＣＬの３〜４個の生物学的複製物を各個体から調製した。以前記載（Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１１（ＰＭＩＤ：２１９５２１３６））したように、弱酸処理によりＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを放出させ、ＨＬＢカートリッジで脱塩することにより前処理し、３，０００Ｄａカットオフカラムで濾過した。２つの異なる方法により、試料をさらに処理した。第１の方法では、試料を真空乾燥し、ＳＣＸ再構成溶液（Ｐｒｏｔｅａ（登録商標））に再懸濁し、ＳＣＸ ｓｐｉｎｔｉｐ（Ｐｒｏｔｅａ（登録商標））およびギ酸塩アンモニウムステップ勾配（５０、７５、１００、３００、６００、１５００ｍＭ）を使って６つの画分に分割した。真空乾燥画分を５％アセトニトリル、０．２％ギ酸中に再懸濁し、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥＬＩＴＥ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ（登録商標））に連結したＥｋｓｉｇｅｎｔ（登録商標）ＬＣシステムを使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ペプチドを、流速６００ｎＬ／分および５６分の５〜４０％水性ＡＣＮ（０．２％ギ酸）の直線勾配を使って、カスタムＣ１８逆相カラム（プレカラム：０．３ｍｍ内径ｘ５ｍｍ、分析カラム：１５０μｍ内径ｘ１００ｍｍ；Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）Ｃ１８ ３μｍ ３００Å）で分離した。６０，０００（ｍ／ｚ ４００）の分解能で作動するＯｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）分析計を用いて全質量スペクトルを取得した。質量キャリブレーションには内部ロック質量（プロトン化（Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｏ））６；ｍ／ｚ ４４５．１２００２９）を用い、ペプチド測定値の質量精度は５ｐｐｍ未満であった。２８の正規化衝突エネルギーを有する高エネルギー衝突解離でＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。１０個までのプリカーサーイオンを１００ｍｓの最大の注入時間で５０，０００の目標値にまで蓄積し、フラグメントイオンをｍ／ｚ ４００で６０，０００の解像度で作動するＯｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）分析計に移送した。第２の方法では、試料を２つの同じ技術的反復実験に分け、続けて、３，０００Ｄａ濾過および真空乾燥した。１つの反復実験物を、３％アセトニトリル、０．２％ギ酸中に再懸濁し、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ（登録商標））に連結したＥＡＳＹ−ｎＬＣ（登録商標）ＩＩシステムを使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ペプチドを、流速６００ｎｌ／分および１４６分の３〜２５％水性ＡＣＮ（０．２％ギ酸）、続けて５分の２５〜４９％の直線勾配を使って、第１の方法の場合と同様に、カスタムＣ１８逆相カラムで分離した。７０，０００（ｍ／ｚ ４００）の分解能力で作動するＯｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）分析計を用いて全質量スペクトルを取得した。質量キャリブレーションには内部ロック質量（プロトン化（Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｏ））６；ｍ／ｚ ４４５．１２００２９）を用い、ペプチド測定値の質量精度は５ｐｐｍ未満であった。２５の正規化衝突エネルギーを有する高エネルギー衝突解離でＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。１２個までのプリカーサーイオンを２００ｍｓの最大の注入時間で１，０００，０００の目標値にまで蓄積し、フラグメントイオンをｍ／ｚ ４００で１７，５００の解像度で作動するＯｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）分析計に移送した。
ＭＳ／ＭＳ配列決定およびペプチドクラスタリング。それぞれの個体に特異的なデータベースに対し、ＰＥＡＫＳ（登録商標）７（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒ．ｃｏｍ／）を使って、データベース探索を行った（コンピュータにより生成したプロテオームおよび個別化データベースのセクションを参照されたい）。プリカーサーおよびフラグメントイオンの質量許容誤差は、それぞれ５ｐ．ｐ．ｍおよび０．０２Ｄａに設定した。酵素特異性なしで、およびシステイニル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒ）、酸化（Ｍｅｔ）および脱アミド化（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）に対する様々な変更を行って、探索を実施した。３０，０００カウントの閾値を超えて検出された全てのイオンの、ｍ／ｚ値、荷電状態、保持時間、および強度を含む生データファイルをペプチドマップに変換した。社内ソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｏｐｒｏｆｉｌｅ）（Ｇｒａｎａｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２０１４）を使って、全ての特定ペプチドイオンに対応するペプチドマップを一緒に整列させて、試料反復実験間のそれらの存在量を相関付けた。ＰＥＡＫＳ ｄｅｃｏｙ−ｆｕｓｉｏｎ手法を使って定量化ユニークペプチド配列の偽発見率を計算した。少なくとも１つの個体で検出された、最高スコアのＭＨＣクラスＩペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルが、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウェアバージョン２．２ＳＰ１．４８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を使って、マニュアルで検証された。
ＭｉＨＡの選択。ペプチドを長さによって選別し、標準的なＭＡＰ長さ（典型的には８〜１４量体）を有するペプチドを保持した。ＮｅｔＭＨＣバージョン３．４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／，Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００８（ＰＭＩＤ：１８４１３３２９））を使用し、アレル産物に対するペプチドの予測結合親和性（ＩＣ５０）を得た。５，０００ｎＭ未満のＩＣ５０を有するペプチドをＨＬＡバインダーと見なした。
以下の基準に従ってＭｉＨＡを選択した：
ｉ）対応するペプチド（単一または複数）の表面発現をもたらす個体のペプチドコード領域内における報告された非同義ＳＮＰ（合計６，７７３個の多型ペプチド）の存在。これらは、個体と、報告されたＳＮＰに対する別のアレルを含む他の個体との間のＭｉＨＡの差異を構成する。
ｉｉ）ＭｉＨＡの明確な起源。したがって、ＭｉＨＡは、個体のゲノム中で単一遺伝的起源を有する。
ｉｉｉ）ＭｉＨＡは免疫グロブリンまたはＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子に由来しない。理由は、これらの遺伝子が個体間で、高度に多型性で、また極めて変動性であるためである。
ｉｖ）ＭｉＨＡは、ｄｂＳＮＰデータベースビルド１３８（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）に準じて、少なくとも０．０５の報告されたマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する。
Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ ｖ２．３．２５（Ｔｈｅ Ｂｒａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、ＭｉＨＡをコードするＲＮＡ（ｃＤＮＡ）およびＤＮＡ配列をマニュアルで検査した。ＵＣＳＣのＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒによる追跡を含めることにより反復領域に対応する候補を破棄した。
アレル頻度の特定。それぞれのｎｓ−ＳＮＰのマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を、ｄｂＳＮＰデータベースビルド１３８（ＮＣＢＩ）および／またはＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）から取得した。ＭＡＦの定義は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／ｄｏｃｓ／ｒｓ＿ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ．ｈｔｍｌで見つけることができる。簡単に説明すると、ｄｂＳＮＰは、デフォルト全世界集団に含まれるそれぞれのｒｓに対しマイナーアレル頻度を報告している。これは、低頻度バリアントから高頻度多型を識別するように提供されているので、ＭＡＦは実際に２番目に高頻度のアレル値である。換言すれば、頻度が０．５０、０．４９、および０．０１の３つのアレルが存在する場合、ＭＡＦは０．４９と報告されることになる。デフォルト全世界集団は、２００１１年５月データセットの１０９４人の世界中の個体由来の１０００ゲノム第１期遺伝子型データである。
ＭｉＨＡ配列のＭＳ／ＭＳ検証。少なくとも１つの個体で検出された全ての候補ＭｉＨＡの最高スコアのＭＳ／ＭＳスペクトルが、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウェアバージョン２．２ＳＰ１．４８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を使って、マニュアルで検証された。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによる合成バージョンの合成ＭｉＨＡを使って、選択ＭｉＨＡのＭＳ／ＭＳスペクトルがさらに検証された。その後、２５０〜５００ｆｍｏｌのそれぞれのペプチドを、生物試料の分析に使用したのと同じパラメータを使って、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥＬＩＴＥ（商標）またはＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ質量分析計に注入した。
遺伝子発現の組織分布の特定。同種Ｔ細胞は、造血／リンパ系臓器以外の部位で発現した多数の宿主ＭｉＨＡに対して反応し、ＧＶＨＤを誘導する。したがって、ＧＶＨＤを避けるために、ＭｉＨＡ発現は遍在性であるべきではない。都合の悪いことに、現在の技術的制約は、これらの組織におけるＭｉＨＡ発現を、質量分析により実験的に評価するのを妨げる。別の方法として、ＭＡＰが豊富な転写物から選択的に派生することを以前に示した（Ｇｒａｎａｄｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１２）。したがって、ＭｉＨＡをコードする転写物の発現レベルが、ＭｉＨＡ発現の指標として使用可能である。Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１４ １３：３９７−４０６からの公的に入手可能なデータを使用した。これは、２７組織に対するヒト遺伝子の発現プロファイルを記載している、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ａｔｌａｓ（ＴＨＰＡ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ｔｉｓｓｕｅ，Ｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１０）．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（１２）：１２４８−５０）の一部である。このデータから、特定されたＭｉＨＡをコードする遺伝子の発現レベルを取得した。その後、遺伝子は、２７組織中で、「百万個のマッピングしたリード当たり、エクソンのキロベース当たりのフラグメント数（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎｓ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）（ＦＰＫＭ）」＞１０の発現の場合、「遍在性」に分類され、２７全ての組織中で、ＦＰＫＭ＞１０で発現しない場合、「非遍在性」に分類される。また、これらのデータを使って、皮膜と比較した骨髄中のＭｉＨＡ遺伝子発現の比率の計算を行った。注目すべきことは、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇら（上記）により使用され骨髄試料は、フィコール（商標）分離した調製物で、これは、ストローマ、脂肪細胞、骨および血管の非造血成分、ならびに完全に分化した赤血球新生および骨髄造血集団の大部分が除去されてしまっていることである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ｈｕｍａｎｐｒｏｔｅｏｍｅ／ｂｏｎｅ＋ｍａｒｒｏｗ）。ＡＭＬ試料中のＭｉＨＡをコードする遺伝子の、百万個のマッピングしたリード当たり、キロベース当たりのリード数（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）（ＲＰＫＭ）の値を、ＴＣＧＡ Ｇａｔａ Ｐｏｒｔａｌバージョン３．１．６から取得した。ＡＭＬデータには、異なるサブタイプ：１２Ｍ０、３６Ｍ１、２９Ｍ２、１２Ｍ３、２３Ｍ４、１４Ｍ５、２つの非分類のものからなる１２８試料が含まれていた。見易くする目的で、値をＬｏｇ１０（１，０００ＲＰＫＭ＋１）に変換した。１２８ＡＭＬを使って平均値を計算し、６５人の男性の試料のみが考慮されるＹ染色体コードＵＴＹ遺伝子を除いた。
個体当たりの特定されたＭｉＨＡの累積数。カスタムソフトウェアツールを使って、それぞれの追加の調査個体で予測されるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１またはＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３結合ＭｉＨＡの累積数を推定した。この数は、それぞれの個体中に存在するＭｉＨＡにより、および個体が解析される順番により影響を受けるので、我々は、調査個体群の全ての組み合わせおよび順列における、それぞれの追加の調査個体に対し予測される新規特定ＭｉＨＡの数を網羅的に列挙した。その後、我々は、調査個体のそれぞれの数に対するＭｉＨＡの平均数を計算した。最大２０個体に対するＭｉＨＡの累積数を近似するために、予測的曲線をデータポイント上にマッピングした。「ｓｃｉｐｙ」Ｐｙｔｈｏｎライブラリーの「ｏｐｔｉｍｉｚｅ」モジュールのｃｕｒｖｅ＿ｆｉｔツールを使って、曲線を関数に当てはめた（Ｊｏｎｅｓ Ｅ，Ｏｌｉｐｈａｎｔ Ｅ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．ＳｃｉＰｙ：Ｏｐｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｙｔｈｏｎ，２００１−，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｐｙ．ｏｒｇ／）。下記の式を使って、特定されたＭｉＨＡの累積数を表した：
治療的ＭｉＨＡ不適合頻度。治療的ＭｉＨＡ不適合の数を推定するために、生物情報学的シミュレーション手法を使用した。３９最適ＭｉＨＡをコードするそれぞれのｎｓ−ＳＮＰに対し、エクソーム配列決定プロジェクト（ＥＰＳ）のヨーロッパ系アメリカ人集団から、または利用できない場合には、「Ｔｈｅ １，０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｏｒｇ／）のヨーロッパ人集団から報告されたアレルを取得した。次に、ペプチドの観点から、アレルを、ＭｉＨＡがＭＳにより検出されたか、もしくは免疫原性があるとわかっている場合、「優性」として、またはＭｉＨＡがＭＳで検出されず、免疫原性であることもわかっていない場合、「劣性」として分類した。注目すべきことは、一部の座位では、両方のアレルが共優性であったことである。優性アレルの存在は常に、ＭｉＨＡの発現をもたらすと仮定した。同じｎｓ−ＳＮＰ由来のオーバーラップＭｉＨＡの場合には、ＭｉＨＡ座位は１回のみ考慮に入れた。このシミュレーションではまた、ＭｉＨＡをコードするＳＮＰは独立したイベントであるということも仮定した。Ｙ染色体由来ＭｉＨＡ（女性には存在しない）の場合には、治療不適合は、全ての男性レシピエント／女性ドナー対において発生した。報告されたマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）に基づいて、全てのＭｉＨＡをコードする座位における「優性」または「劣性」ＭｉＨＡのアレル頻度が特定された。１：１の女性／男性の比率を仮定して、１ｘ１０６非血縁ドナー／レシピエント対をランダムに生成し、このＭｉＨＡ順位付けリストのサブセットを増加（１〜３０）させて、仮想的に遺伝子型解析を行った。したがって、それぞれのＭｉＨＡサブセットに対して１つの集団を生成した。それぞれのＭｉＨＡのＭＡＦを、各個体の母系および父系ＭｉＨＡアレルを生成する確率として使用した。それぞれの試験したＭｉＨＡサブセットに対し、この手順により各個体で２セットのＭｉＨＡアレル（またはＭｉＨＡハプロタイプ）を得た。各対で見つかったＭｉＨＡ不適合の数を決定し、少なくとも１つの不適合が生じれば、治療不適合とした。サンプリング集団が親集団の子孫に対応し、かつサンプリング集団がメンデル型遺伝により生成された場合を除いて、同一手順を血縁対にも使用した。この手順を、血縁および非血縁対の両方に対し、１ｘ１０６回反復した。
統計解析およびデータ可視化。別に定める場合を除き、解析および図は、ＲＳｔｕｄｉｏ（商標）バージョン０．９８．１０９１、Ｒバージョン３．１．２およびＰｒｉｓｍ（商標）バージョン５．０ｄソフトウェアを使って実施した。ウィルコクソン順位和検定を使って、エクソンおよびエクソン−エクソン接合部の多型指数分布、またはＭｉＨＡをコードする遺伝子の多型指数分布、および非多型ＭＡＰをコードする遺伝子の多型指数分布を比較した。Ｒのｇｐｌｏｔパッケージを使って、異なるＡＭＬサブタイプにおける、階層型クラスタリングおよびＭｉＨＡ遺伝子発現のヒートマッピングを実施した。ＡＭＬサブタイプ中のＭｉＨＡ遺伝子の平均発現を、ＡＮＯＶＡ、続けて、テューキーの多重比較検定を使って比較した。
特定されたＭｉＨＡの免疫原性の特定。ＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（登録商標））またはＥａｓｙＳｅｐ（商標）キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を使って、ＭｉＨＡ陰性個体から取得した１００〜１５０ｘ１０６ＰＢＭＣからＴ細胞および単球を精製した。単球由来樹状細胞を以前記載（３）したようにして精製し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＰＧＥ２、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＦＮγで熟成させた。その後、これらの樹状細胞を４０Ｇｙで照射し、２μｇ／ｍＬの合成ＭｉＨＡペプチド（ＧＬＲＸ３−１Ｓ、ＷＤＲ２７−１Ｌ、ＭＩＩＰ−２Ｅ、またはＲＡＳＳＦ１−１Ｓ）またはネガティブコントロールとして使用される無関係のペプチド（エプスタイン・バールウイルスＬＭＰ２４２６−４３４）でパルスした。次に、パルスまたは非パルス樹状細胞を、前もって濃縮した自己Ｔ細胞（５ｘ１０５／ウエル）と共に４８ウエルプレートの１０％のヒト血清、１％のＬ−グルタミンおよび３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１を補充（１：４の刺激薬：エフェクター比）した最新ＲＰＭＩ培地中で同時培養した。培養の３、５および７日後に、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を補充した培地を加え、さらに５日目および７日目に細胞を１２ウエルプレートおよび６ウエルプレートにそれぞれ移した。培養の１０日後に、Ｔ細胞を採取し、ＩＦＮγに対するエリスポットおよび多官能性細胞内サイトカイン染色を使って、抗原反応性を測定した。簡単に説明すると、エリスポット分析は製造業者（Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標））のインストラクションに従って行い、細胞内染色はＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａの存在下で５μｇ／ｍＬのペプチドによる４時間の再刺激後に実施した。その後、細胞のＣＤ３およびＣＤ８表面マーカーを、細胞内染色用の次のサイトカイン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）から入手）：ＩＦＮγ（Ａｂ ４Ｓ．Ｂ３）、ＩＬ−２（Ａｂ ＭＱ１−１７Ｈ１２）、ＴＮＦα（Ａｂ ＭＡｂ１１）に対する抗体で染色した。取得をＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使って実施し、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃ（商標）ソフトウェア（Ｉｎｉｖａｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を使ってデータを解析した。
実施例２：新規ヒトＭｉＨＡの特定および特性評価
ＭｉＨＡは、本質的にはｎｓ−ＳＮＰを含むゲノム領域によりコードされたＭＡＰである１３、２１。現在までに発見された全てのヒトＭｉＨＡは、２つの共優性アレルまたは１つの優性および１つの劣性アレルを有する両アレル座位に由来する。実際に、ＭＡＰコード配列中のｎｓ−ＳＮＰは、ＭＡＰ生成を妨げるか、またはバリアントＭＡＰを生成する１１。したがって、ペプチドミクスレベルでは、それぞれのアレルは、優性（ＭＡＰ生成）または劣性（ＭＡＰを生成しないヌルアレル）であり得る。全てのこの研究で報告されたＭｉＨＡは、ＭＳにより検出され、したがって、優性アレルによりコードされる。２つの特徴が、これらのＭｉＨＡのどちらがＨＣの免疫療法にとって適切な標的であり得るかを必然的に決めるはずであると結論づけられた。第１に、ＭｉＨＡの有用性は、ＭｉＨＡをコードするｎｓ−ＳＮＰのアレル頻度により決定される。実際に、同種Ｔ細胞により認識されるためには、ＭｉＨＡは宿主細胞上に存在し、ドナー細胞中には存在しない必要がある（そうでなければ、ドナーＴ細胞は、ＭｉＨＡを非自己として認識しないであろう）。この状況は、「治療不適合」と呼ばれる。治療不適合を有する確率は、標的ＭｉＨＡのアレル頻度が０．５である場合に最大であり、アレル頻度が２つの極値の０および１に近づくに伴い確率は減少する１４。したがって、０．０１または０．９９のアレル頻度を有するＭｉＨＡは、低い頻度の治療不適合となるであろう：最初のケースでは、ＭｉＨＡ陽性レシピエントは、低頻度であり、一方、第２のケースでは、ＭｉＨＡ陰性ドナーを見つけるのが難しいであろう。通常、ＭＡＦ≧０．０５のバリアントのみが高頻度であり、釣り合いのとれた遺伝的多型と見なされる３３。したがって、最小頻度（マイナー）アレルが０．０５未満の頻度を有する座位によりコードされる全てのＭｉＨＡは、さらなる解析から除外した。第２に、ＭｉＨＡの組織分布は、ＭｉＨＡ標的化の効力と無害性の両方に関連する。ＨＣ免疫療法では、標的ＭｉＨＡは、造血細胞（ＨＣ細胞を含む）中で発現される必要があるが、宿主組織により遍在的に発現されてはならない。
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１および／またはＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３アロタイプを発現している１３人の個体由来のＢリンパ芽球様細胞株（ＢＬＣＬ）に対しプロテオゲノミクスの解析を実施した。約５５％のヨーロッパ系アメリカ人がこれらの２つのアロタイプの内の少なくとも１つを発現する。それぞれの細胞株に対し、ｎｓ−ＳＮＰを特定するために全エクソームおよびトランスクリプトーム配列決定を実施し、その後、ゲノム配列をコンピュータにより翻訳し、個別化されたプロテオームを生成した。その後、それぞれのプロテオームを個体特異的ＭＡＰレパートリーを高スループットＭＳにより配列決定するための基準として使用した２６。ｎｓ−ＳＮＰにより生成された合計６，７７３個のＭｉＨＡ候補をＭＳにより特定した。しかし、これらのｎｓ−ＳＮＰの９６．２％は、ＭＡＦ＜０．０５の低頻度バリアントであったため、臨床的関心が限られていた（図１Ａ）。さらなる解析は、ＭＡＦ≧０．０５の高頻度バリアントに注力した３３。選別およびマニュアルによるＭＳ検証後、合計１００個の高頻度ＭｉＨＡを特定し（方法のセクション、図２Ａおよび表ＩＩ）、その内の９３個は新規であった（表ＩＩの白地の部分）。さらに、ほとんどの高頻度ＭｉＨＡのＭＳ／ＭＳスペクトルは、合成バージョンのペプチドを使って確認された。
原理の証明として、４つの新規ＭｉＨＡ：ＧＬＲＸ３−１Ｓ、ＭＩＩＰ−２Ｅ、ＲＡＳＳＦ１−１ＳおよびＷＤＲ２７−１Ｌの免疫原性を試験した（図３Ａ〜３Ｄ）。４人のＭｉＨＡ陰性個体由来のＴ細胞を、合成ＭｉＨＡまたは無関係のペプチドパルス自己樹状細胞で初回刺激した。抗原反応性の出力をエリスポット（図３Ａ）および細胞内染色アッセイ（図３Ｂ〜３Ｄ）で評価した。初回刺激を受けたＴ細胞は、全ての試験したドナー中で、ＭｉＨＡ特異的にサイトカインを産生し、ＭｉＨＡがＣＤ８＋ Ｔリンパ球を増幅／活性化できることを確証した。
以前のＭｉＨＡ発見の努力は、大部分はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に注力し、また、より少ない程度に、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３に注力した１４、２４、３４。本明細書で使用するプロテオゲノミクスの手法は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１により提示されるＭｉＨＡの合計数を２１から５２に、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３より提示されるＭｉＨＡを４から６７に増やした（図１Ｂ）。９４個の新規ＭｉＨＡを生成している一部のｎｓ−ＳＮＰは異なる集団で類似のＭＡＦを有するが、いくつかのｎｓ−ＳＮＰのＭＡＦは、集団間で変動する（図１Ｃ）。地球全体の観点から、これらの結果は、ヨーロッパ系アメリカ人起源の個体で発見された大部分のＭｉＨＡは、アフリカ人およびアジア人を含むその他の集団由来の患者を処置するためにも使用可能である。小セットのＭｉＨＡに対する以前の調査は、ほとんどのＭｉＨＡ座位では、１つの（優性）アレルがＭｉＨＡを生成するが、その他の（劣性）アレルはＭｉＨＡを生成しない２１、２６ことを示した。大きなＭｉＨＡデータセット（７３個の遺伝子によりコードされた９４個のＭｉＨＡ）は、この観察を確証し、拡大した：すなわち、ほとんどのＭｉＨＡをコードするｎｓ−ＳＮＰは、単一ＭｉＨＡバリアントを生成した（図４Ａ）。特に、１８個の遺伝子は、２個以上のＭｉＨＡを生成するので、特に興味深い（図４Ｂ）。論理的推論は、ＭｉＨＡをコードする遺伝子は、高度の遺伝的多型を示すということであろう。これに合致して、ＭｉＨＡをコードする遺伝子は、不変のＨＬＡクラスＩペプチドをコードする遺伝子より高いｎｓ−ＳＮＰ密度を有することが見出された（図４Ｃ）。また、約７２％のＭｉＨＡが、エクソン−エクソン接合部（すなわち、２つの隣接エクソン）ではなく、単一エクソンから生じた（図４Ｄ）。ＭｉＨＡをコードする遺伝子では、ｎｓ−ＳＮＰの密度は、接合部に近い領域よりもエクソンの中央で大きいことから、この結果は、遺伝子内ｎｓ−ＳＮＰ分布を反映している（図４Ｅ）。
実施例３：遺伝子によりコードされるＭｉＨＡは、造血細胞中で選択的に発現される。
ＨＣ免疫療法では、最適ＭｉＨＡは、標的ＨＣ細胞を含む造血細胞中で発現されるべきであるが、理想的には、遍在的に発現されてはならないことが前提とされた。実際に、遍在的発現は、ＭｉＨＡ特異的Ｔ細胞の枯渇を引き起こすことにより、免疫療法の効力を低下させ、正常な宿主上皮細胞に対する毒性のリスク（移植片対宿主病、ＧｖＨＤ）を伴う。ＭＡＰの存在量は、転写物源の存在量と良好な相関を示し２２、３８−４０、ＲＮＡ−Ｓｅｑは、転写物存在量の評価として現時点で最も正確な方法であるので、ＭｉＨＡをコードする転写物の発現レベルをＲＮＡ−Ｓｅｑにより評価した。全ての解剖部位からの精製された初代上皮細胞に対して、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータは利用可能ではないが、この情報は、全組織および臓器に対し利用可能である。したがって、異なる個体由来の２７人のヒト組織に関する公的に利用可能なＲＮＡ−Ｓｅｑデータ３０を使って、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１；Ｂ＊４４：０３ハロタイプにより提示された１１９個の高頻度ＭｉＨＡ（９４個は本明細書で報告、２５個は以前に報告）をコードする遺伝子の発現プロファイルを評価した（図５Ａ）。以前に報告されたＭｉＨＡのリストを下表ＩＩＩに示す。
造血細胞対上皮細胞中でのＭｉＨＡをコードする遺伝子の相対発現を評価するために、骨髄細胞対皮膚細胞から得たＲＮＡ−Ｓｅｑデータを使用した。皮膚細胞は上皮細胞の純粋な集団ではない（単球および樹状細胞系統の細胞を含む）が、それにもかかわらず、造血細胞に比べて上皮の細胞中に極めて濃縮されている。造血細胞中の選択発現の基準として、皮膚に対する骨髄における発現比率≧２を使用した。１１９個のＭｉＨＡの内、３９個（３２．８％）が非遍在性で、造血細胞中に過剰発現した（図５Ａおよび図２Ｂ）。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＩＢＭＴＲ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｂｍｔｒ．ｏｒｇ）によるＡＨＣＴの最も一般的な適応症である。したがって、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から入手した１２８個のＡＭＬ試料由来のＲＮＡ−Ｓｅｑデータを使って、ＡＭＬ細胞中での最も有望なＭｉＨＡをコードする遺伝子の発現が解析された（図５Ｂ）。３９個の最適ＭｉＨＡをコードする２４個の遺伝子がＡＭＬ中で全て発現したことが明らかになった。新規リードＭｉＨＡの特徴を表ＩＶに示す。２５個の以前に報告されたＭｉＨＡ中で特定されたその他の７個のリードＭｉＨＡを表Ｖに示す。階層型クラスタリングにより、ＡＭＬ中での発現に応じて、ＭｉＨＡ遺伝子を４つの主要クラスターに分類可能であることを示した（図５Ｃ）。これは、別々のクラスターにおけるＭｉＨＡ遺伝子の相互作用または同時制御の存在を主張する４１。クラスター４は、最高の発現のＭｉＨＡ遺伝子を含む。さらに、９個のＭｉＨＡ遺伝子は、フランス・アメリカ・イギリス分類（急性骨髄性白血病ＦＡＢ分類）４２に従って分類したＡＭＬサブタイプ中で発現差異を示した（図５Ｃ）。ＭＡＰ存在量とｍＲＮＡ発現との間での相関を考慮すれば、ＭｉＨＡ遺伝子発現のトランスクリプトーム評価は、所与の患者に対する最良のＭｉＨＡ標的を選択するために有用な可能性がある。
配列中で、多型残基は下線を引き、ＭＳにより検出されたＭｉＨＡバリアントは太字で示す。ＳＮＰ ＩＤ＝ＳＮＰ識別子（ＳＮＰ ＩＤ）；ＭＡＦ 全世界／ＥＡ：ｄｂＳＮＰの報告による全世界集団のＭＡＦ、およびＥＳＰで報告されたヨーロッパ系アメリカ人（ＥＡ）のＭＡＦ；ＩＣ５０（ｎｍ）：ＮｅｔＭＨＣ（ｖ．３．４）５８に従って検出されたＭｉＨＡバリアントの予測ＨＬＡ結合親和性（ＩＣ５０）；ＢＭ／皮膚比：ＭｉＨＡをコードする転写物の相対的ＢＭ／皮膚発現。ＡＭＬ（ＲＰＫＭ）：ＴＣＧＡから得られた原発性ＡＭＬ試料中の平均ＭｉＨＡ遺伝子発現（ＲＰＫＭ）。
本調査で使用した１３人の個体のコホート（１０人のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性および７人のＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３陽性）では、９４個の新規高頻度ＭｉＨＡが特定された。これら２種のアロタイプのそれぞれに対し、個体の数を２０人に増やすことにより、高頻度ＭｉＨＡの合計数を最大１２５個まで増やせることが予測し得る（図６Ａ）。このような収穫逓減は、臨床的観点から、その他の高頻度ＨＬＡアロタイプのプロテオゲノミクスの調査により、さらに多くの報酬が得られることを示唆する。最近の報告は、ゼネラリストとスペシャリストＭＨＣクラスＩアロタイプとの二分を示唆し、このことは、それぞれより大きいまたはより小さいＭＡＰレパートリーを提示することを示唆する４３、４４。したがって、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３がより多くのＭｉＨＡを提示するという観察結果は、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３がよりゼネラリストアロタイプであり、一方、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１がよりスペシャリストアロタイプであることを示唆する。
実施例４：ドナー−レシピエント対における治療的ＭｉＨＡ不適合頻度の推定
本調査で明確にされた３９セットの最適ＭｉＨＡが、ほとんどの患者のＭｉＨＡ標的免疫療法にとって十分であるかどうかを次に評価した。血縁または非血縁ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３陽性ヨーロッパ系アメリカ人ドナー−レシピエント対の間の百万件の移植症例を、ランダムにシミュレートし、それぞれの症例で認められた治療的ＭｉＨＡ不適合の数を特定した。図６Ｂに示すように、これらのシミュレーションに基づいて、血縁（下側曲線）および非血縁（上側曲線）ドナー−レシピエント対のそれぞれ９０％および９８％で、少なくとも１つの治療不適合が見つかるであろうということが予測された。ＣＩＢＭＴＲによれば、近年では、非血縁ドナー移植の数が、血縁ドナー移植の数を上回る結果となっている。非血縁ドナー移植状況では、４種の不適合モードを有する、２つ以上の治療的ＭｉＨＡ不適合が９２％の症例で予測されるであろう（図６Ｃ、左側のバー）。したがって、３９セットの最適ＭｉＨＡは、事実上すべてのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１；Ｂ＊４４：０３のＨＣ患者のＭｉＨＡ標的免疫療法を可能とするであろうということを推測し得る。
請求項の範囲は、実施例で示された好ましい実施形態に限定されるべきではなく、全体としての記載と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。
（参考文献）

Claims (53)

  1. 式Ｉ
    Ｚ１−Ｘ１−Ｚ２ （Ｉ）
    の８〜１４個のアミノ酸のマイナー組織適合抗原（ＭｉＨＡ）ペプチドであり、式中、
    Ｚ１は、アミノ末端修飾基であるか、または存在せず、
    Ｘ１は、表ＶＩに示すペプチド配列の内の１つの少なくとも８個の連続した残基を含む配列であり、かつ示された多型アミノ酸を含み、
    Ｚ２は、カルボキシ末端修飾基であるか、または存在しない。
  2. Ｘ１が表ＶＩに示されるペプチド配列のいずれか１つからなる、請求項１に記載のＭｉＨＡペプチド。
  3. Ｘ１が、配列番号１〜７５に示されるペプチド配列の内の１つの少なくとも８個の連続した残基を含む配列であり、および前記多型アミノ酸を含む、請求項１に記載のＭｉＨＡペプチド。
  4. Ｘ１が、配列番号１〜７５に示されるペプチド配列のいずれか１つからなる、請求項３に記載のＭｉＨＡペプチド。
  5. Ｚ１が存在しない、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
  6. Ｚ２が存在しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
  7. 表ＶＩに示されるペプチド配列のいずれか１つからなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
  8. 配列番号１〜７５に示されるペプチド配列のいずれか１つからなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
  9. 前記ＭｉＨＡが少なくとも０．１のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する座位由来である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
  10. 前記ＭｉＨＡが少なくとも０．２のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する座位由来である、請求項９に記載のＭｉＨＡペプチド。
  11. 主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１アレルに結合し、前記ペプチド配列が表ＶＩＩに示されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
  12. 前記ペプチドが、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子のＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３アレルに結合し、前記ペプチド配列が表ＶＩＩＩに示されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項で定義のＭｉＨＡペプチドの内の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、次の式Ｉａ：
    Ｚ１−Ｘ２−Ｘ１−Ｘ３−Ｚ２ （Ｉａ）
    であり、式中、
    Ｚ１、Ｘ１およびＺ２が、請求項１〜１２のいずれか１項で定義されている通りであり、
    Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立に、存在しないか、または１つまたは複数のアミノ酸の配列であり、
    未変性タンパク質のアミノ酸配列を含まないか、またはそれから構成されず、細胞による前記ポリペプチドのプロセッシングにより、前記細胞により発現されたＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝中への前記ＭｉＨＡペプチドのローディングが生じる、ポリペプチド。
  14. （ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項で定義の少なくとも２つのＭｉＨＡペプチド；（ｉｉ）請求項１〜１２のいずれか１項で定義の少なくとも１つのＭｉＨＡペプチドおよび少なくとも１つの追加のＭｉＨＡペプチド、を含むペプチドの組み合わせ。
  15. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドまたは請求項１３に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  16. プラスミドまたはベクター中に存在する、請求項１５に記載の核酸。
  17. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドを、ペプチド結合溝中に含む単離された主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子。
  18. マルチマーの形態である、請求項１７に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子。
  19. 前記マルチマーが四量体である、請求項１８に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子。
  20. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド、請求項１３に記載のポリペプチド、請求項１４に記載のペプチドの組み合わせ、または請求項１５もしくは１６に記載の核酸を含む単離細胞。
  21. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド、または請求項１３に記載のペプチドの組み合わせをペプチド結合溝中に含む主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子をその表面に発現している単離細胞。
  22. 抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項２１に記載の細胞。
  23. 前記ＡＰＣが樹状細胞である、請求項２２に記載の細胞。
  24. 請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子および／または請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞の表面に発現したＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  25. 請求項２４に記載のＴＣＲのアルファおよびベータ鎖をコードする１種または複数の核酸。
  26. プラスミドまたはベクター中に存在する、請求項２５に記載の１種または複数の核酸。
  27. 請求項２４に記載のＴＣＲを細胞表面で発現している単離されたＣＤ８＋ Ｔリンパ球。
  28. 請求項２５または２６に記載の１種または複数の核酸を遺伝子導入または形質導入される、請求項２７に記載のＣＤ８＋ Ｔリンパ球。
  29. 請求項２７または２８に記載の少なくとも０．５％のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を含む細胞集団。
  30. （ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチド、（ｉｉ）請求項１３に記載のポリペプチド、（ｉｉｉ）請求項１４に記載のペプチドの組み合わせ、（ｉｖ）請求項１５または１６に記載の核酸、（ｉｖ）請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のＭＨＣクラスＩ分子、（ｖ）請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞、（ｖ）請求項２４に記載のＴＣＲ、（ｖｉ）請求項２５または２６に記載の１種または複数の核酸；請求項２７または２８に記載のＣＤ８＋ Ｔリンパ球、および／または（ｖｉｉ）請求項２９に記載の細胞集団、を含む組成物。
  31. 緩衝液、賦形剤、キャリア、希釈剤および／または培地をさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
  32. ワクチンであり、アジュバントをさらに含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
  33. 請求項１３に記載のペプチドの組み合わせ、または前記ペプチドの組み合わせ中に存在する少なくとも２種のＭｉＨＡペプチドをコードする１種または複数の核酸を含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
  34. 請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の細胞および請求項２６または２７に記載のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
  35. 請求項１〜１２のいずれか１項で定義された１種または複数のＭｉＨＡペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋ Ｔリンパ球を増殖する方法であって、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の増殖に好適な条件下で、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の細胞の存在下で前記１種または複数のＭｉＨＡペプチドを発現しない候補ドナー由来のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を培養することを含む方法。
  36. 癌の処置方法であって、有効量の（ｉ）請求項２７または２８に記載のＣＤ８＋ Ｔリンパ球、（ｉｉ）請求項２９に記載の細胞集団、および／または（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）含む組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む方法。
  37. 前記それを必要としている対象により発現された１種または複数のＭｉＨＡバリアントを特定することをさらに含む方法であって、前記ＣＤ８＋ Ｔリンパ球が、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されている前記１種または複数のＭｉＨＡバリアントを特異的に認識する、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記特定することが、前記ＭｉＨＡをコードする核酸を配列決定することを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＣＤ８＋ Ｔリンパ球が、請求項３５に記載の方法により調製し、エクスビボで増殖させたＣＤ８＋ Ｔリンパ球である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 請求項３５に記載の方法によりＣＤ８＋ Ｔリンパ球を増幅することをさらに含む、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記それを必要としている対象が、同種幹細胞移植（ＡＳＣＴ）のレシピエントである、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記ＣＤ８＋ Ｔリンパ球により認識される有効量の前記ＭｉＨＡペプチド、および／または（ｉｉ）ペプチド結合溝中に（ｉ）により定義される前記ＭｉＨＡペプチドを含むＭＨＣクラスＩ分子をその表面に発現している細胞を投与することをさらに含む、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記癌が血液癌である、請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記血液癌が白血病である、請求項４３に記載の方法。
  45. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドまたは請求項１４に記載のペプチドの組み合わせを提示する抗原提示細胞または抗原提示細胞を模倣する人工構築物。
  46. Ｔリンパ球と、好適な抗原提示細胞または抗原提示細胞を模倣する人工構築物の表面上に発現した、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドまたは請求項１４に記載のペプチドの組み合わせをローディングしたヒトクラスＩ ＭＨＣ分子とを、前記Ｔリンパ球を活性化するのに十分な一定時間にわたり、抗原特異的方式で接触させることを含む細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のインビトロ製造方法。
  47. 請求項４６に記載の方法により得られる活性化された細胞傷害性Ｔリンパ球。
  48. 前記患者に有効量の、請求項４７に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を投与することを含む、血液癌の対象を処置する方法。
  49. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭｉＨＡペプチドまたは請求項１４に記載のペプチドの組み合わせをローディングしたヒトクラスＩ ＭＨＣ分子を発現している対象の腫瘍細胞に対する免疫応答を生成する方法であって、請求項４７に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を投与することを含む方法。
  50. 請求項１〜１２のいずれか１項で定義の１種または複数のＭｉＨＡペプチドまたは請求項１４に記載のペプチドの組み合わせを人為的にローディングされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）。
  51. 治療ワクチンとして使用するための請求項５０に記載のＡＰＣ。
  52. 対象に同種Ｔリンパ球および請求項１〜１２のいずれか１項で定義の１種または複数のＭｉＨＡペプチドまたは請求項１４に記載のペプチドの組み合わせを含む組成物を投与することを含む、前記対象の免疫応答を生成する方法。
  53. 前記対象が、白血病、リンパ腫および骨髄腫から選択される血液癌を有する、請求項４８、４９および５２のいずれか１項に記載の方法。
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