JP5661744B2 - 腸球菌由来のポリペプチド、及びワクチン接種のためのその使用 - Google Patents
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MKKSLISAVMVCSMTLTAVASPIAAAADDFDSQIQQQDQKIADLKNQQADAQSQIDALESQVSEINTQAQDLLAKQDTLRQESAQLVKDIADLQERIEKREDTIQKQAREAQVSNTSSNYIDAVLNADSLADAIGRVQAMTTMVKANNDLMEQQKQDKKAVEDKKAENDAKLKELAENQAALESQKGDLLSKQADLNVLKTSLAAEQATAEDKKADLNRQKAEAEAEQARIREQQRLAEQARQQAAQEKAEKEAREQAEAEAQATQASSTAQSSATEESSATQSSMTEESSSATQSSATEESTTPESSTEESTAPESSATEESTTAPESSATEESTTVPESSATEESTTVPESSTTEESTTPAPTTPSTDQSVDTGNGTGSSTPAPTPTPTPEQPKPVTPAPAPSGSVNGAAIVAEAYKYIGTPYVWGGKDPSGFDCSGFTRYVYMQVTGRDIGGWTVPQESAGTKISVSQAKAGDLLFWGSQGGTYHVAIALGGGQYIHAPQPGESVKVGSVQWFAPDFAVSM(配列番号1)
エンテロコッカス・フェシウム中におけるオプソニン抗体の標的を同定する試みにおいて、バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)の院内発生と関連するクローン複合体(clonal complex)17(CC17)(Top, J. et al.,(2008). Emergence of CC17 Enterococcus faecium: from commensal tohospital-adapted pathogen. FEMS Immunol Med Microbiol 52:2997-308)に属する熱殺傷したエンテロコッカス・フェシウムE155株(Leavis, H.L. et al. (2007). Insertion sequence-drivendiversification creates a globally dispersed emerging multiresistant subspeciesof E.faecium. PLoS Pathog 3:e7)により、ウサギを免疫した。細菌を65℃で1時間熱殺傷し、1用量当たり1.4×1012cfuの最終濃度のものを、1週間に3回、計3週間静脈内注射した。得られた血清は、相同株に対してオプソニン性を有していた(血清希釈率1:100で殺傷率77.8%)。結果を図1に示す。
ウエスタンブロット分析により、細胞抽出物中に存在し、培養上清中においてさらにより明白である約54kDaの明確なタンパク質バンドが示された(結果を図2に示す)。
試験した5種類全てのエンテロコッカス・フェシウム株が、ウサギ免疫血清により検出されたものと同じサイズのタンパク質バンドを発現した(データは示していない)。クマシーブルー染色したゲルバンドのナノLC−ES−MS/MS分析により、NCBI及びMASCOTデータベースと比較される配列データが得られた。相同性の最高値(スコア1253)が、エンテロコッカス・フェシウムDO(アクセッション番号Gi│69245436)由来の55kDaのタンパク質であるNLP/P60(Anantharaman, V. et al. (2003). Evolutionary history, structuralfeatures and biochemical diversity of the NIpC/P60 superfamily of enzymes.Genome Biol 4:R11)により得られた。
ウサギを、精製したタンパク質により免疫した(不完全フロイント(Freud's)アジュバントと混合して皮下に(SC)2回(10μg)、及び2週間空けて第3週目にアジュバントを用いず静脈内に3回(5μg))。最後の注射の2週間後、力価をELISAにより(図4を参照されたい)、及びオプソニン作用アッセイにより(図5を参照されたい)調べた。
特異性を確認するためにオプソニン作用阻害アッセイを行い、100μgの精製したタンパク質が殺傷をほぼ100%阻害することができるが、より低い量では用量依存的に殺傷が阻害されることを示した(図5を参照されたい)。オプソニン作用アッセイを他で記載された(Theilacker, C. et al. Opsonic antibodies to Enterococcus faecalisstrain 12030 are directed against lipoteichoic acid. Infect Immun (2006) 74:5703-12)ように行った。簡潔に述べると、乳児ウサギ血清(希釈率1:15)、ヒトPMN、及び適当な血清希釈物を、対数期まで成長した細菌と混合した(細菌対PMNの比率1:1)。混合物をローターラック上で37℃でインキュベートした。90分後に白血球を溶解し、適当な希釈物をトリプシン大豆寒天プレート上にプレーティングした。プレートを終夜インキュベートし、翌日コロニーを計数した。
配列番号1を有するポリペプチドに対する抗体の防御の有効性を、マウス菌血症モデルにおいて示した(図6)。雌性のbalb/cマウス(1群当たりマウス8匹)に、200μlの正常ウサギ血清(NRS)、又は配列番号1を有するポリペプチドに対して産生された血清(IRS)を投与した。24時間後に動物にエンテロコッカス・フェシウムE155(1.18×1010cfu/マウス)を負荷し、接種の2時間後に2回目の用量200μlのウサギ血清(NRS又はIRS)を投与した。感染の8時間後にマウスを屠殺し、血液中のコロニー数を決定した。これらの結果により、マウスにIRSを投与した場合に、血液でのコロニー数の統計的に有意な低減が示される。
Opsonickilling of rabbit serum against E. faecium E155 エンテロコッカス・フェシウムE155に対するウサギ血清のオプソニン殺傷
% killing 殺傷率(%)
serumdillution 血清希釈率
図2
Western blotwith E155 serum against the homologue strain 相同株に対するE155血清によるウエスタンブロット
Molecularweight marker 分子量マーカー
E. faeciumE155 cells エンテロコッカス・フェシウムE155細胞
E. faeciumE155 supernatant エンテロコッカス・フェシウムE155上清
図3
Western blotwith purified polypeptide having SEQ ID NO:1 精製した配列番号1を有するポリペプチドによるウエスタンブロット
lane 1:molecular weight marker レーン1:分子量マーカー
lane 2: partiallypurified protein レーン2:部分的に精製したタンパク質
lane 3:purified polypeptide レーン3:精製したポリペプチド
図4
ELISA withpurified polypeptide having SEQ ID NO:1 精製した配列番号1を有するポリペプチドによるELISA
Sera 血清
Alpha E155 αE155
Alpha SEQ IDNO:1 α配列番号1
Serum titer 血清力価
rabbit serumbefore immunization 免疫前のウサギの血清
serum raisedagainst heat-killed bacteria 熱殺傷した細菌に対して産生された血清
serum raisedagainst recombinant protein 組換えタンパク質に対して産生された血清
図5
Opsonophagocyticinhibition with polypeptide having SEQ ID NO:1 配列番号1を有するポリペプチドによるオプソニン作用の阻害
% killing 殺傷率(%)
inhib 阻害因子
図6
MouseBacteremia with E. faecium E155 エンテロコッカス・フェシウムE155によるマウスの菌血症
unpairedt-test 独立t-検定
Claims (10)
- 配列番号1に示される配列からなるポリペプチドを含有する、エンテロコッカス・フェシウムによる細菌感染症を治療又は予防するオプソニン抗体及び/又は防御抗体誘導用薬剤。
- ポリペプチドが免疫担体、又はタンパク質、炭水化物及び/若しくは糖複合体と共有結合した、請求項1に記載の薬剤。
- 薬学的に許容可能なアジュバントを含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の薬剤。
- ワクチンであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 請求項1に記載の薬剤の調製のための、配列番号1に示される配列からなるポリペプチドの使用。
- ポリペプチドが免疫担体と共有結合した、請求項5に記載の使用。
- エンテロコッカス・フェシウムによる細菌感染症を治療又は予防するオプソニン抗体及び/又は防御抗体の調製のための、配列番号1に示される配列からなるポリペプチドの使用。
- ポリペプチドが免疫担体と共有結合した、請求項7に記載の使用。
- 配列番号1に示される配列からなるポリペプチド、又は免疫担体と共有結合的に連結した前記ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体である、オプソニン抗体及び/又は防御抗体。
- 配列番号1に示される配列からなるポリペプチド、又は免疫担体と共有結合的に連結した前記ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体である、オプソニン抗体及び/又は防御抗体。
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