JP5658902B2 - 細菌撮像装置および菌液調整装置 - Google Patents

Description

本発明は、細菌撮像装置および菌液調整装置、特に同定・薬剤感受性検査を実施する細菌分析装置および方法のためのコロニーを釣菌する前処理装置に関するものである。

感染症治療において、起炎菌を同定し、抗生剤に対する感受性を迅速に測定し、効果のある薬剤を決定し治療方針をたてることは適正な抗菌薬治療のために重要である。通常は提出された検体を培地に塗布して培養し、形成されたコロニーを釣菌して生理食塩水などに浮遊させ菌懸濁液を調製し、同定・薬剤感受性検査装置の測定用デバイスに接種する流れをとる。同定・感受性検査においては、正確な結果を得るためにはデバイスへの接種菌量を正確かつ再現性よく所定の濃度に一定にすることが必須である。多くの場合、所定の菌量を得るために、シャーレ上に生育したコロニーの中からいくつかの同一種のコロニーを複数選択して釣菌し、それを１つの容器中で生理食塩水などの液体中にて懸濁し、濁りあるいは不透明度を測定して所定の濃度（菌数）に調製する。混合するコロニーの種類は同一でなければならないが、同一のシャーレ上に複数種類のコロニーが生育しているのが普通であり、この中から同一種類のコロニーを選択するにあたっては、検査技師に高い技術が要求されている。また、大小さまざまな大きさのコロニーから複数選択するため、所定の濁度にするためには一旦調整後、コロニーの追加や、希釈のため生理食塩水の添加が必要であり、煩雑で時間がかかり大量処理には不向きとなっている。１回あたりの釣菌量を一定にする従来技術としては、一定量を釣菌し一定量の生理食塩水に浮遊させることにより所定濃度の菌液を得ることができる簡易キットが商用化されている。例えば特公第２９９４６７５号公報に記載の方法では、簡単な溝付きの棒体により菌量を一定量採取することができる例を示している。しかし、この方法では、得られる濃度，菌液量に限界があり、比較的低濃度域の少量の菌液しか得ることができない。

一方、特許文献１では、コロニートランスファー装置として、シャーレ内の細菌コロニーをテレビカメラで撮像し、モニターに映し出された画像を検査技師が目視にて確認し、釣菌するコロニーを選択、指示すると、その指示に従いコロニーの位置に釣菌治具（釣菌ツール）を自動的に移動し細菌コロニーを釣菌し、試験管等に移植する方法が記載されている。しかし、この方法は検査技師がテレビカメラにより撮影した画像をモニターで確認して釣菌するコロニーをひとつずつ選択していたため、装置を使用しても迅速化の効果はあまりない。特許文献２，特許文献３では同じくコロニートランスファー装置として、テレビカメラにより撮像した画像を検査技師がモニターで確認し、選択するコロニーのサイズなど条件を入力、あるいは排除すべきコロニーを指示するとそれに従い釣菌すべきコロニーを自動的に新しい培地に移植する方法が示されている。この方法ではシャーレ上に生育する細菌コロニーは基本的にすべて同一菌種であり、コンタミネーションなどで生育した例外を除くすべてのコロニーを移植するもので、条件さえ入力してしまえば無人動作するためかなりの省力化が図れる。しかし、移植前のシャーレからコロニーを１個ずつ釣菌し、新しいシャーレの培地に１個ずつ移植するもので、コロニーを混合する必要がなく、コロニーの種類を弁別することはない。本発明で対象とする同定検査や薬剤感受性検査のための菌液調製では、ひとつのシャーレから同一種の細菌を多数釣菌する必要があり、テレビカメラで得られた画像から異なる種類の細菌は排除、単一種類の細菌のみを選択する必要がある。しかし、テレビカメラで得られていた一枚の画像のみでは、コロニーの概観特徴をうまく抽出できず、選択の際に誤りが発生する懸念があった。一方、シャーレの表面のみならず、寒天培地中のコロニーを含めたコロニー数を計測するコロニーカウンタが市販されている。これはカメラにより撮像された二次元画像を処理し、条件に合うサイズ以上のコロニー数を計測するものであり、やはり異なる種類のコロニーの弁別はできない。以上の例では、得られた画像は平面情報によるものであり、コロニーの大きさを測定することは可能であるが、コロニー形状や高さ方向の情報を得ることはできない。

特開昭５９−１１１７３号公報 特開昭５８−２０１９７６号公報 特開昭６２−２５３４８号公報 特開昭６２−６５７００号公報 特開２０００−７８９９９号公報 特開平７−３０６０２３号公報

本発明で解決しようとする課題は、撮像して得られたシャーレの画像によりコロニーを同一種類ごとに分別し、釣菌すべきコロニーを決定、選択した後、同定・感受性検査に必要な所定量のコロニーを採取するために、個々のコロニーについて、採取する細菌コロニーの高さ方向の情報を推定し、コロニーの体積を自動的に算出し、必要数量のコロニーを自動釣菌することにある。

さらにこの方法の採用により、得られた情報に従い自動釣菌後、所定濁度の菌液を自動調製する方法および装置を提供することにより、迅速、かつ省力化効果の高い微生物分析装置および方法を提供することにより、細菌検査室の人件費を削減することにある。

本発明は、カメラと、撮像対象の培地上のコロニーを載置する基台と、コロニーに対して上方の異なる位置から光を照射する複数の第１照明部と、基台に対してカメラとは反対側に位置し、下方から培地を照明する第２照明部とを備えている。

本発明によれば、コロニーに対して上方の異なる位置から光を照射する複数の第１照明部と、基台に対してカメラとは反対側に位置し、下方から培地を照明する第２照明部からコロニーの高さ情報を推定しコロニー体積を算出するため、所定濃度（濁度）の菌液を得るために必要な数量の推定が可能となる。これにより採取するコロニーの採取量の正確性が向上し、コロニーの追加や希釈などの作業が大幅に削減され、迅速に所定の濃度の菌液を作製することができる。

結果として、細菌検査全体の所要時間を短縮化することができる。

本発明に基づく一実施例を示す微生物自動分析装置の動作原理。 本発明に基づく撮像部の一実施例。 コロニー体積と濁度の関係。 所定濁度を得るのに必要な釣菌数量の例。 モニターの表示例。 モニターの他の表示例。

図１は微生物自動分析装置の一例を示す。本発明である装置の使用に先立ち、患者から採集した喀痰，尿，膿などの試料を寒天培地に塗布し、分離培養し、コロニーを形成させる。陽性判定された血液培養容器中の培養液を一定量採集して、新しい培地に接種し、培養後コロニーを形成させる場合もある。多くの場合は一晩（１２〜１８時間程度）の培養でコロニーを得ることができる。１０１はシャーレ供給スタッカ、１０２はコロニー撮像部、１０３は画像処理部、１０４はコロニー釣菌部、１０５は菌液調製部、１０６は排出スタッカである。コロニーが生育したシャーレ供給スタッカ１０１にセットされ、搬送手段１０７により、撮像部ユニット１０２に搬送され、照明ユニット１０８，１０９，１１１，カメラ１１０に対し、撮像に適した所定位置にセットされる。

コロニー撮像部１０２の照明配置の一実施例を図２に示す。１０８は低角照明ユニット、１０９は高角照明ユニット、１１０はカメラ、１１１は透過照明ユニットである。１１２は遮光板、１１３は台座、１１４はセットされたシャーレである。図１に戻り、１１４のシャーレ内の寒天培地表面上に検体から得られた細菌コロニーが生育している。

低角照明ユニット１０８，高角照明ユニット１０９，透過照明ユニット１１１は照明制御ユニット１１５に接続されており、任意の組み合わせで点灯を行わせることが可能である。透過照明ユニット１１１が点灯する際には照明光がシャーレ１１４を照明可能なように設定されており、また、低角照明ユニット１０８，高角照明ユニット１０９が点灯する際にはシャーレ１１４の底面が暗くなるようにする。シャーレ１１４上のコロニーはカメラ１１０により撮像され、得られた画像は画像入力手段１１６に転送される。１１７は画像処理手段であり、画像入力手段１１６に転送された画像データを処理して細菌コロニーの領域を抽出し、また、各抽出コロニーより画像処理手段１１７を用いて画像特徴量を算出する。画像特徴量は、例えばコロニー領域の周囲長，面積，色情報，明度情報，背景明度との差分等より構成される。１１８は二次記憶装置であり、撮影した画像、あるいは処理した画像，データ，コロニー位置，面積を格納することができる。さらに画像処理手段１１７は、得られた特徴量を分析し、二次記憶装置１１８に格納された過去のデータベースをもとにシャーレ上の複数種のコロニーのグルーピングを行う。

撮像後のシャーレは、搬送手段１１９によりコロニー釣菌部１０４に搬送される。１２０は釣菌針、１２１はＺステージ、１２２はＸＹステージである。取り込まれた画像情報はモニター１２３上に映し出され、検査技師は釣菌すべきコロニーを複数個選択・決定する。決定情報はコロニー位置とともにコロニー釣菌部１０４に伝達される。Ｚステージ１２１，ＸＹステージ１２２を制御することで、シャーレ１１４の釣菌すべきコロニーの座標に釣菌針１２０を移動し、コロニーをピックアップする。

図２は図１の撮像部の詳細構成例を示している。低角照明ユニット１０８は低角照明部２０１１，２０１２，２０１３，２０１４から構成されており、照明制御ユニット１１５を用いて個別に点灯制御を行うことができる。高角照明ユニット１０９は、高角照明部２０２１，２０２２，２０２３，２０２４より構成され、これも個別に点灯制御を行うことができるようにする。細菌コロニー表面は比較的滑らかであるため、照明をあてることにより、直接反射をする箇所が明るく撮影される。

方位毎に照明の点灯を行うことにより、照明とコロニーの中心とカメラ光軸を含む面における明度を求められる。細菌コロニーの詳細な形状を求める場合には、低角照明部２０１１，２０１２，２０１３，２０１４をそれぞれ１つずつ照明した画像を４種類、更に、高角照明部２０２１，２０２２，２０２３，２０２４それぞれを１つずつ照明した画像を４種類、透過照明ユニット１１１で照明した画像、またこの幾つかを同時に照明して撮影し、組み合わせた複数種類の撮影が望ましい。

高角照明では反射光の位置によりその反射光の位置の細菌コロニーの角度を求めることができる。直接反射光を得た細菌コロニーの位置において細菌コロニーの法線方向は反射光位置からカメラレンズ方向への単位ベクトルＶｃと反射光位置から照明への単位ベクトルＶｉを用いて（Ｖｃ＋Ｖｉ）／２であらわされる。コロニーが平らであれば、この反射光を検出した位置がコロニー中心付近であり、反射光位置がコロニー近傍であればコロニーは培地から高さを持っていると推定できる。また、コロニーがドーム状から崩れた形状である場合には、反射光は複数の位置で検出される。コロニーを抽出した後に、コロニー毎に画像特徴量を算出する。検出したコロニーの領域のサイズや色，表面凹凸，形状などの特徴量抽出には高角照明画像（１０９で照明），低角照明画像（１０８で照明），透過照明画像（１１１で照明）を使用して画像処理して求める。また円形度などは形状を楕円近似したときの長軸／短軸等を用いる。コロニーの明度，色，透過率，立体形状は、透過照明画像より求める。明度と高角照明画像の直接反射をもとに透過率、および培地からの高さを求めることができる。

透過照明は、培地がある程度光を通す場合のみ用いることができるが、コロニーの位置で暗くなり、コロニーの厚みが増すとともに暗くなる。コロニーの内部におけるある明度をＩＣ（ｘ，ｙ）、培地の明度の平均値をＩＭとおくと、ある（ｘ，ｙ）の位置でのコロニーの厚みＤ（ｘ，ｙ）は以下の式で求められる。
Ｄ（ｘ，ｙ）＝−Ｇ（ｌｏｇ ＩＣ（ｘ，ｙ）−ｌｏｇ ＩＭ）

ここで、Ｇはコロニー種毎に決定されるゲインである。

ある位置、（Ｘ，Ｙ）において、高角照明による反射光を検出できたと仮定する。このときの、法線ベクトルが鉛直方向からθ傾いていたとする。このとき、Δｘだけ位置のずれた際の厚みの変化は−Δｘtanθとなる。ここで、Ｄ（ｘ，ｙ）の差分を計算すると、 Ｄ（Ｘ＋Δｘ，Ｙ）−Ｄ（Ｘ，Ｙ）＝−Ｇ（ｌｏｇ ＩＣ（Ｘ＋Δｘ，Ｙ）
−ｌｏｇ ＩＣ（Ｘ，Ｙ））＝−Δｘtanθ
が成立する。

すなわち、
Ｇ＝Δｘtanθ／（ｌｏｇ ＩＣ（Ｘ＋Δｘ，Ｙ）−ｌｏｇ ＩＣ（Ｘ，Ｙ））
で求められることになり、これにより、コロニーの厚みは任意の位置で求められることになる。このＧは、同一のコロニー種（あるいはコロニー）で一定になる。高角照明の直接反射が得られる場所で、Ｇは求まる。このＧは直接反射が得られない場所でも使うことができる。立体形状は高さを求めることにより決まる。高さは透過照明画像で得られる（ｘ，ｙ）における明度とＧで決まる。Ｇは高角照明画像での直接反射の情報で決まる。Ｇは、同一のコロニー種（あるいはコロニー）で一定になるので、反射した任意の点（ｘ，ｙ）１点で良い。

よって、比較的透過度の高い培地の場合には、直接反射光の発生する箇所さえ見つかれば、コロニーの立体的な形状および体積を求めることができる。体積は、求めた厚み（高さ）をエリアで積分して求めることができる。

以上の説明のように、論理的には、体積を求めるという目的においては、高角照明および透過照明だけで算出可能で、低角照明は必須でない。しかしながら、高角照明は、直接反射は一部のコロニー（コロニー周辺，縁部が反射した場合）においては、コロニー形状がわからなくなる。このような場合には、高角照明の代わりに、低角照明を用いることができる。

図３に細菌種別のコロニー体積（mm³）と濁度（ＭｃＦ）の関係を示す。菌種により同一体積でも懸濁した菌液の濁度は異なることがわかる。これは細菌ごとに細胞壁を構成するムコイドなど多糖類の含有量の違いによるものが原因のひとつと考えられている。図３によれば、ＭｃＦ０.６の菌液３ｍＬを調製する場合、少なくとも総量で１mm³以上のコロニーを採取すれば、ほとんど全ての菌種でＭｃＦ０.６より高濃度側に調製できる。１mm³を上記した本発明の手法により算出したコロニー体積で除すれば、菌液調製に必要な最低限のコロニー数量を求めることができる。一方、図３に示したように菌種により一定体積あたりの濁度は異なるため、コロニーの菌種がわかれば、より正確に菌液調製に必要なコロニー数が算出可能である。しかし、通常細菌検査においてこの時点で菌種の同定はなされておらず、釣菌時、菌種名はわからない。ここで本発明では、先に説明したように複数方向照明でのコロニー画像を分析し、特徴量の抽出を行い、あらかじめ格納してあるデータベースによりコロニーのグルーピングを行い、コロニーの種類を推測する。グルーピングが成立されれば、データベースから一定体積あたりの濁度がわかり、菌液調製に必要な釣菌数量は、画像から得られたコロニーの推定体積と菌種ごとの係数を考慮することにより、より正確に求めることができる。参考まで実際に所定濁度を得るのに必要な釣菌数量を図４に示した。

グルーピングが不可能な場合には最も濁度が小さい菌種にあわせ固定値で計算してもよい。以上のように画像処理手段１１７により個々のコロニー体積を求めると同時に、所定菌液濃度を得るために必要なコロニー数量が算出される。その情報をコロニー釣菌部１０４に伝達する。コロニー釣菌部１０４は釣菌すべきコロニーの位置情報，必要コロニー数の情報に従い、複数のコロニーを釣菌し、試験管１２４中の生理食塩水に懸濁する。濁度計（図示せず）により懸濁した菌液の濁度が測定され、必要な希釈液量を算出、希釈液である生理食塩水が添加され、再度濁度を確認し、所定の濁度であれば試験管は排出される。

一方で、正確なコロニーの厚み情報が得られなかった場合には、あらかじめコロニー面積に応じて数段階（高，中，低など）に規定した厚み情報を二次記憶装置１１８に格納しておき、撮像画像を基に画像処理手段１１７により得られたコロニー面積に応じて自動的に厚み情報を対応させ、おおよその体積を推定しても良い。格納する厚み情報は、菌種によるコロニー形状の特徴に従い、菌種ごとに設定しても良いし、一定値でも良い。グルーピングが成功した場合は、菌種に固有の正確な厚み情報を使用し、撮像画像から算出したコロニー面積に乗じてコロニー体積を推定することができる。グルーピングが出来なかった場合は、菌種によらない、面積に応じた一定値を二次記憶装置１１８から引き出し、使用することによりおおよその体積が求まる。また、面積に応じて厚み情報を自動的に算出するのではなく、ユーザが情報を画像処理部１０３から入力、あるいは数段階の候補の中から選択し、指定しても良い。

図５は入力のための画面の例である。モニター１２３にはコロニー画像エリア３０１のほかに厚み入力エリア３０２がある。カメラ１１０により撮像されたシャーレ上のコロニーは、画像処理され、ここではコロニー画像エリア上に３０３（グループα），３０４（グループβ），３０５（グループγ）の３グループに分類されて表示されている。ユーザは例えば３０３のグループαのコロニーについて、端部厚みＡに０.１mm、中間部厚みＢに０.１５mm、中心部厚みＣに０.２mmと厚みを入力する。入力は釣菌対象のコロニーグループごとに行う。あるいはＡ，Ｂ，Ｃの数値は、それぞれに選択肢があり選択できるようにしても良い。

図６は他の画面の例である。コロニーの１箇所の厚みを入力もしくは選択しても良い。ユーザの入力はさらに簡略化され、低（Low），中（Ｍedium），高（High）のいずれかを選択する。ここでは、Mediumを選択した例を示している。体積を算出した後、体積と濁度の関係より、釣菌すべきコロニー数量の算出する方法は、正確に高さ情報を求めた場合の工程と同様である。さらに、工業分野での利用の場合など、初めからある特定の菌種を想定していて、コロニーの特徴量によるグルーピングをする必要がない場合は、低角照明ユニット１０８，高角照明ユニット１０９，透過照明ユニット１１１の複数の照明組み合わせが不要となり、装置構成が簡略化され、製造コストも低くすることができる。この場合は撮像画像から画像処理手段１１７により面積を算出し、一定の厚み情報を入力、あるいは複数の候補から選択し、面積に乗じておおよその体積を求めることができる。

１０１ シャーレ供給スタッカ
１０２ 撮像部ユニット（コロニー撮像部）
１０３ 画像処理部
１０４ コロニー釣菌部
１０５ 菌液調製部
１０６ 排出スタッカ
１０７，１１９ 搬送手段
１０８ 低角照明ユニット
１０９ 高角照明ユニット
１１０ カメラ
１１１ 透過照明ユニット
１１２ 遮光板
１１３ 台座
１１４ シャーレ
１１５ 照明制御ユニット
１１６ 画像入力手段
１１７ 画像処理手段
１１８ 二次記憶装置
１２０ 釣菌針
１２１ Ｚステージ
１２２ ＸＹステージ
１２３ モニター
１２４ 試験管
３０１ コロニー画像エリア
３０２ 厚み入力エリア
３０３ グループα
３０４ グループβ
３０５ グループγ
２０１１，２０１２，２０１３，２０１４ 低角照明部
２０２１，２０２２，２０２３，２０２４ 高角照明部

Claims (1)

1. カメラと、
   撮像対象の培地上のコロニーを載置する基台と、
   コロニーに対して上方の異なる位置から光を照射する複数の第１照明部と、
   基台に対してカメラとは反対側に位置し、下方から培地を照明する第２照明部と、
   カメラからの情報を基にコロニーを分類する機構と、
   コロニーを釣菌する釣菌機構と、
   釣菌したコロニーを用いて菌液を調製する菌液調整機構とを備え、
   前記第１照明部は、高角照明および低角照明を備えており、
   第１の照明部および第２照明部を用いてコロニーの形状特徴を求め、この形状特徴からコロニーが予め用意したグループのいずれのグループに属するかを判定し、
   第１照明部を用いた反射光からコロニー種毎に決定されるゲインを求め、第２照明部から培地の明度を求め、ゲインと培地の明度からコロニーの厚みを次式により求め、
   Ｄ（ｘ，ｙ）＝−Ｇ（ｌｏｇ ＩＣ（ｘ，ｙ）−ｌｏｇ ＩＭ）
   （ｘ，ｙ）は位置、ＩＣは明度、ＩＭは明度の平均、Ｇはゲイン
   上記により求めた、コロニーの厚みからコロニーの体積を求め、
   求めた体積と、上記のいずれのグループに属するかの判定を基にそのグループ固有の単位体積あたりの濁度係数を用いて所定濃度の菌液調製に必要な釣菌数を算出することを特徴とする、菌液調整装置。

Images