JP5653437B2 - Ｔｄプローブ及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）及びその用途に関する。
ＤＮＡハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、分子生物学の基本的な過程である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを利用する多くの技術は、特定ターゲット配列検出に非常に有用な道具となり、臨床診断、遺伝子研究及び法医学的実験分析に明確に役に立つだろう。
塩濃度、温度、有機溶媒、塩基構成、相補的な鎖の長さ及びハイブリダイズした核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の数のような多くの条件によりＤＮＡハイブリダイゼーションは影響を受けるため、最近、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの特異性を向上させるために努力が重ねられている（非特許文献１〜２）。過去１０年間たくさんの方法が提案された；化学的にＤＮＡ塩基を変形して高感度のハイブリダイゼーションをする方法（非特許文献３）、及びハイブリダイゼーション後、洗浄を長時間低い温度で行って、ミスマッチ区別能を強化させる方法（非特許文献４）。最近、ＤＮＡハイブリダイゼーションによるＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）の解像能を高めるために、人為的ミスマッチを利用する他の方法が紹介された（非特許文献５）。また、特許文献１〜７を始めとしたたくさんの特許は、ハイブリダイゼーションに利用されるプローブ及びその応用を開示している。
多くの方法が、プローブを利用したターゲット配列の検出のために提案された。このような類型の方法のうち、ハイブリダイゼーションプローブと核酸分解酵素を利用した方法が多い。ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、このような原理を利用した典型的な例の一つである。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、一般に５’末端に位置した蛍光染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ）を、３’−末端に位置したクエンチング染料（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｄｙｅ）を含んでいるオリゴヌクレオチドである。照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）をすると、励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）された蛍光染料は、近接したクエンチング染料にエネルギーを転移させて蛍光を示さない。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、ＰＣＲ産物の内部部位にハイブリダイズするように製作される。ＰＣＲの間、ＴａｑＭａｎＴＭプローブが結合された鋳型がポリメラーゼに複製されると、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを切断させる。これは、蛍光とクエンチング染料を分離し、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）はそれ以上起こらない。プローブ切断比率に比例し、それぞれのサイクル毎に蛍光は増加する（非特許文献６）。即ち、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法の特徴は、ハイブリダイゼーション及びポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断反応を利用することである。しかし、この技術は、それ自体固有の限界がある。ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、プローブとターゲット配列間のハイブリダイゼーションが必然的に伴われる過程であるため、この方法の最も重大な問題は、プローブの非特異的ハイブリダイゼーション（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）である。さらに、この方法は、擬陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）シグナル（結果）、特に多数のターゲット配列の多重検出（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）で擬陽性シグナルが出る可能性が非常に高い。
ターゲット配列の検出に対するまた他の接近法は、プローブライゲーション方法を利用することである（非特許文献７〜９）。ライゲーション反応は、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を検出するための有用な道具と見なされる。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ，ＯＬＡ）で、関心のあるターゲット部位に広がる（ｓｐａｎｎｉｎｇ）二つのプローブは、ターゲット部位とハイブリダイズする。プローブが近接したターゲット塩基にハイブリダイズする場合、プローブの向き合っている末端は、ライゲーション、例えば、リガーゼ処理により連結できる。ライゲーションされたプローブは、ターゲット配列の存在を示す。ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション位置でＤＮＡ基質とミスマッチヌクレオチドの連結を媒介することが報告された（非特許文献１０）。ライゲーションに基づいたターゲット検出方法（ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）においても、ターゲット配列に結合するプローブの非特異的結合を防止することが必要な課題として残っている。また、ライゲーション反応がさらに高い特異性で起こることが要求されるが、例えば、ライゲーション部位において、単一ミスマッチヌクレオチドを分別する程度の特異性でライゲーション反応が発生することが要求される。
多数の遺伝子又は多数の遺伝子ポピュレーション（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のそれぞれに対する存在、水準又は発現パターンを同時に検出する有用な方法に対する必要性が高まっている。このような目的のための最も有用な方法の一つは、マイクロアレイに基づいた技術である（非特許文献１１〜１２）。今まで提示されたマイクロアレイ技術（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、遺伝子又はヌクレオチド変異及びこれらの発現パターン分析を検出することに関連したものである。
マイクロアレイ技術は、一般にターゲット核酸の特異的な核酸配列に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド（核酸プローブ）を利用する。しかし、従来ＤＮＡマイクロアレイはほとんど、ターゲットヌクレオチド配列を検出するためにハイブリダイゼーションに依存的であるため、高い比率の擬陽性が深刻な欠点である。特に、多くのプローブが利用される時、交差ハイブリダイゼーション（ｃｒｏｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の発生を排除することができない。この交差ハイブリダイゼーションは、データの質（ｄａｔａ ｑｕａｌｉｔｙ）に著しく影響を及ぼし、擬陽性／擬陰性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ／ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）結果を起こす。しかも、マイクロアレイは、多い液相操作工程を必要とし、単一ヌクレオチドミスマッチの分別のために、反応温度及び洗浄を、注意を払って調節しなければならない。多数のプローブ配列間の互いに異なる適正ハイブリダイゼーション条件のため、この接近法による多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）は非常に難しいことが証明された（非特許文献１３）。
各方法に対して改善された接近法がこつこつと紹介されているにもかかわらず、このようなオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション過程を含むあらゆる方法及び技術は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの非特異性に起因する限界及び問題から完璧に自由ではない。
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照され、その引用が表示されている。このような特許及び文献の公開は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
米国特許第６，０７７，６６８号明細書 米国特許第６，３２９，１４４号明細書 米国特許第６，１４０，０５４号明細書 米国特許第６，３５０，５８０号明細書 米国特許第６，３０９，８２４号明細書 米国特許第６，３４２，３５５号明細書 米国特許第６，２６８，１２８号明細書
Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９ Ａｚｈｉｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１１４６０−１１４６２ Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：５２７−５３４ Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：３３１−５ Ｐａｒａｓｈａｒ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ １２４：３８５−３９８（２００６） Ｄ．Ｙ．Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９８９） Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７（１９８８） Ｅ．Ｗｉｎｎ−Ｄｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１５２２（１９９１） Ｌｕｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓ ２４：３０７１（１９９６） Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９５．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４６７−４７０ ＤｅＲｉｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｏ Ａｎａｌｙｓｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：４５７−４６０ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｂｕｎｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｗ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １６０：４，６５７−６６６
このような条件下、本発明者らは、従来技術の問題点を克服するために、従来プローブと異なるハイブリダイゼーション方式でターゲット配列と特異的ハイブリダイゼーションができる新規なプローブが提供されるべきであることを認識した。特に、本発明者らは、ヌクレアーゼによる核酸切断反応だけではなく、ライゲーション反応で前記新規なプローブが独特のターゲット区別能を有していなければならないと判断した。
本発明者らは、ターゲット核酸配列の検出又は識別を、より簡便でありながらも擬陽性及び擬陰性の結果無しに検出できる技術を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列の互いに異なるハイブリダイゼーションパターンのため、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別する固有の能力を有する新規なターゲット区別性プローブを製作した。さらに、前記新規なターゲット区別性プローブを通じて、本発明者らは、液相（ｌｉｑｕｉｄ ｐｈａｓｅ）及び固相（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ）反応システムの両方ともに適用できるターゲット核酸配列検出プロトコールを提示した。
したがって、本発明の目的は、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別するターゲット区別性プローブ（ｔａｒｇｅｔ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅ、ＴＤプローブ）を提供することにある。
本発明の他の目的は、液相又は固相でＴＤプローブを利用する５’→３’エキソ核酸切断反応によるＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、ＴＤプローブ及びＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、ＴＤプローブを利用するライゲーション反応によるＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
本発明は、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）及びその用途又は適用に関する。
ＴＤプローブ
本発明の一様態によると、本発明は、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）構造を有し、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することを可能とするターゲット区別性プローブ（ｔａｒｇｅｔ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅ）を提供する：
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、これにより、前記ＴＤプローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。
二重−標識ＴＤプローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別を図式的に示す。前記ＴＤプローブは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子を有して、その３’−第１ハイブリダイゼーション部位にクエンチャー分子を有する。 二重−標識ＴＤプローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別を図式的に示す。前記ＴＤプローブは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を両方とも有する。 ５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子とクエンチャー分子とを有する二重−標識ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列にハイブリダイズする場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用したリアルタイムＰＣＲでシグナルが発生しないことを図式的に示す。 固相で単一−標識固定化ＴＤプローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別を図式的に示す。図４Ａは、固定化ＴＤプローブのターゲット−特異ハイブリダイゼーションにおいて、蛍光シグナル強度の変化を示す。 固相で単一−標識固定化ＴＤプローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別を図式的に示す。図４Ｂは、固定化ＴＤプローブの非ターゲットハイブリダイゼーションにおいて、蛍光シグナル強度の変化がないことを示す。 固相で二重−標識固定化ＴＤプローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別を図式的に示す。図５Ａは、固定化ＴＤプローブのターゲット−特異ハイブリダイゼーションにおいて、シグナルが発生することを示す。 固相で二重−標識固定化ＴＤプローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別を図式的に示す。図５Ｂは、固定化ＴＤプローブの非ターゲットハイブリダイゼーションにおいて、シグナル発生がないことを示す。 固相で単一−標識第１プローブとして非固定化オリゴヌクレオチド、単一−標識第２プローブとして固定化ＴＤプローブ及びリガーゼを利用した、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別を図式的に示す。図６Ａは、ターゲット−特異ハイブリダイゼーションにおける第１プローブ及び第２プローブ間のライゲーションを示す。 固相で単一−標識第１プローブとして非固定化オリゴヌクレオチド、単一−標識第２プローブとして固定化ＴＤプローブ及びリガーゼを利用した、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列の区別を図式的に示す。図６Ｂは、非ターゲットハイブリダイゼーションにおいて、プローブのライゲーションが起こらないことを示す。 単一−標識第１プローブとして非固定化オリゴヌクレオチド、非標識第２プローブとして固定化ＴＤプローブ及びリガーゼを利用した固相におけるターゲット−特異ハイブリダイゼーションにおけるライゲーションを図式的に示す ５’−末端ミスマッチプローブに対する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の切断活性の結果を示す。記号、１）鋳型は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである； ２）プローブは、その５’−末端にレポーター分子を有して、その３’−末端部位には、クエンチャー分子を有する； ３）ＳＡ＿Ｐ０は、その５’−末端部位にマッチング配列を有する； ４）ＳＡ＿Ｐ１は、その５’−末端に単一ミスマッチヌクレオチドを有する； ５）ＳＡ＿Ｐ３は、その５’−末端部位に３個のミスマッチヌクレオチドを有する； ６）ＳＡ＿Ｐ６は、その５’−末端部位に６個のミスマッチヌクレオチドを有する； ７）ＳＡ＿Ｐ９は、その５’−末端部位に９個のミスマッチヌクレオチドを有する。 二重標識ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションによる、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別の結果を示す。図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出を示す。図９Ａにおいて、記号： １）鋳型は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである； ２）ＴＤプローブは、その５’−末端にレポーター分子を有して、その３’−第１ハイブリダイゼーション部位には、クエンチャー分子を有する； ３）ＳＡ＿ＴＤ＿Ｍは、その５’− 第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する； ４）ＳＡ＿ＴＤ＿ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有する。 二重標識ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションによる、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別の結果を示す。図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出を示す。図９Ｂにおいて、記号： １）鋳型は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである； ２）ＴＤプローブは、その５’−末端にレポーター分子を有して、その３’−第１ハイブリダイゼーション部位には、クエンチャー分子を有する； ３）ＮＧ＿ＴＤ＿Ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する； ４）ＮＧ＿ＴＤ＿ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有する。 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子の検出に対するＴＤプローブ及び従来プローブ間の比較結果を示す。記号、１）鋳型は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである； ２）プローブは、その５’−末端にレポーター分子を有して、その３’−末端部位には、クエンチャー分子を有する； ３）ＳＡ＿ＴＤ＿Ｍは、ＴＤプローブであり、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する； ４）ＳＡ＿ＴＤ＿ｍ１は、ＴＤプローブであり、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位に３個のミスマッチヌクレオチドを有する； ５）ＳＡ＿Ｃｏｎ＿Ｍは、従来プローブであり、その５’−末端部位にマッチング配列を有する； ６）ＳＡ＿Ｃｏｎ＿ｍ１は、従来プローブであり、その５’−末端部位に３個のミスマッチヌクレオチドを有する。 ターゲット核酸配列の検出のために、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を両方とも有するＴＤプローブを利用したリアルタイムＰＣＲ反応の結果を示す。図１１Ａ及び１１Ｂは、それぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出を示す。図１１Ａにおいて、記号： １）鋳型は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡである； ２）ＴＤプローブは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を両方とも有する； ３）ＳＡ＿ＴＤ２＿Ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する； ４）ＳＡ＿ＴＤ２＿ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有する。 ターゲット核酸配列の検出のために、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を両方とも有するＴＤプローブを利用したリアルタイムＰＣＲ反応の結果を示す。図１１Ａ及び１１Ｂは、それぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出を示す。図１１Ｂにおいて、記号： １）鋳型は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡである； ２）ＴＤプローブは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を両方とも有する； ３）ＮＧ＿ＴＤ２＿Ｍは、その ５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する； ４）ＮＧ＿ＴＤ２＿ｍは、その５’− 第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有する。 単一ヌクレオチドミスマッチの区別のために、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を両方とも有するＴＤプローブを利用したリアルタイムＰＣＲ反応の結果を示す。記号、１）鋳型は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡである； ２）ＴＤプローブは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を両方とも有する； ３）ＳＡ＿ＴＤ＿Ｓ＿Ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する； ４）ＳＡ＿ＴＤ＿Ｓ＿ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位に単一ミスマッチヌクレオチドを有する。 固相基質の表面上に固定化された二重−標識ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションによる、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との区別結果を示す。各スポットの再現性を調べるために、２回反復実験を行った。蛍光強度を、反復されたスポットの平均値で示した。記号： ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿Ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有するＴＤプローブである； ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有するＴＤプローブである。 固相でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子の検出に対するＴＤプローブ及び従来プローブ間の比較結果を示す。記号： ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿Ｍは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有するＴＤプローブである； ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿ｍ１は、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位に３個のミスマッチヌクレオチドを有するＴＤプローブである；ＳＡ＿Ｃｏｎ＿Ｃｈｉｐ＿Ｍは、その５’−末端部位にマッチング配列を有する従来プローブである； ＳＡ＿Ｃｏｎ＿Ｃｈｉｐ＿ｍ１は、その５’−末端部位に３個のミスマッチヌクレオチドを有する従来プローブである。
本発明者らは、ターゲット核酸配列の検出又は識別を、より簡便でありながらも擬陽性及び擬陰性の結果無しに検出できる技術を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列との互いに異なるハイブリダイゼーションパターンのため、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する固有の能力を有する新規なターゲット区別性プローブを製作した。さらに、前記新規なターゲット区別性プローブを通じて、本発明者らは、液相（ｌｉｑｕｉｄ ｐｈａｓｅ）及び固相（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ）反応システムの両方ともに適用できるターゲット核酸配列検出プロトコールを提示した。
したがって、本発明に利用される前記プローブは、‘ターゲット区別性プローブ（Ｔａｒｇｅｔ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅ；ＴＤプローブ）’と呼称し、前記ＴＤプローブを利用した本発明の技術は、‘ＴＤプローブターゲット検出アッセイ’と呼称する。
本発明の前記ＴＤプローブは、一つのオリゴヌクレオチド分子の中に三つの固有の異なる部位を含む変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する：５’−第２ハイブリダイゼーション部位、３’−第１ハイブリダイゼーション部位及び分割部位。このような構造は、ＴＤプローブを、さらに高い特異性を示すものにして、これは、本発明を、先行技術に対し新規で且つ進歩性のあるものにする。
ｍＤＳＯ構造は、ＤＳＯ（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の変形された新しい構造であり、本発明者らにより最初に提示された（ＷＯ２００６／０９５９８１）。また、前記ＤＳＯ構造がプライマーの役割をする場合は、ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＤＰＯ）と命名される（Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：６ｅ４０（２００７））。
ＤＳＯは、ハイブリダイゼーション又はアニーリングが分割区域により互いに分離された５’−高Ｔｍ特異性部位（又は５’−第１ハイブリダイゼーション部位、５’−第１プライミング部位）及び３’−低Ｔｍ特異性部位（又は３’−第２ハイブリダイゼーション部位、３’−第２プライミング部位）により二重的に決定されるようにする新規な概念を具現したもので、非常に驚くべき特異性を示す（参照ＷＯ２００６／０９５９８１；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｄｕａｌ−ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９：７６−８４（２００８）；Ｋｉｍ， ｅｔ． ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １２ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ−ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２００８．１１．００７（２００８）；Ｈｏｒｉｉ ｅｔ． ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１１１／ｊ．１４７２−７６５Ｘ２００９．０２６１８ｘ（２００９）））。上述のように、ＤＳＯは、互いに異なるアニーリングを有する二つの部位を最終的に有するようになる：初期の安定したハイブリダイゼーションを開始する５’−第１ハイブリダイゼーション部位；及びターゲット特異性を決定する３’−第２ハイブリダイゼーション部位。
ｍＤＳＯ構造は、前記ＤＳＯ構造が逆転されたものである：ターゲット特異性を決定する５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び初期の安定したハイブリダイゼーションを招来する３’−第１ハイブリダイゼーション部位。
ｍＤＳＯ構造を有するＴＤプローブは、非ターゲット核酸にハイブリダイズする場合、３’−末端部位ではなく、その５’−末端部位がハイブリダイゼーションに関与せず、これは、本発明により提示された以前のＤＳＯ構造とは明らかに異なるものである。
特に、プローブに関連した擬陽性シグナル問題を完璧に克服するために、本発明者らは、さらに信頼できて正確な接近法を提示するために鋭意研究し、本発明の方法でターゲット配列を示すシグナルの発生は、プローブハイブリダイゼーション反応だけではなく、追加的な酵素反応、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ反応又は二つのプローブのライゲーション反応により達成される。本発明の新規な接近法がプローブ５’−末端部位のハイブリダイゼーションに大いに依存的であることに鑑みえ、本発明者らは、５’−末端の特異性が最大限に表れるようにプローブを設計し、公知のＤＳＯを変形してＴＤプローブを提示する。
独特の５’−末端ハイブリダイゼーションパターンを有するＴＤプローブは、擬陽性シグナル無しにターゲット配列を検出することができ、これは、従来のプローブ及びＤＳＯプローブによっては達成されなかった。
ｍＤＳＯ構造によるＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性（又はターゲット特異性）は、本発明で擬陽性無しにターゲットを検出することができる。
興味深いことに、ｍＤＳＯ構造を有するＴＤプローブは、ターゲットと非ターゲット核酸配列とのそれぞれに対して明確に異なるハイブリダイゼーション挙動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を示す。図１〜図３から分かるように、ＴＤプローブがターゲット核酸配列にハイブリダイズする場合、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び３’−第１ハイブリダイゼーション部位がターゲット核酸配列と二本鎖を形成する。ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列にハイブリダイズする場合（即ち、非ターゲットハイブリダイゼーション又は結合）、その３’−第１ハイブリダイゼーション部位が優勢的に非ターゲット核酸配列に結合するが、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び分割部位の両方ともは、非ターゲット核酸にハイブリダイズせず、一本鎖を形成するようになる。
３’−第１ハイブリダイゼーション部位が、非ターゲット配列とアニーリングされる一方で、ＴＤプローブのターゲット−特異ハイブリダイゼーション条件下でより短い配列（低いＴｍ値）を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、非ターゲット配列とハイブリダイズしない。その理由は、ハイブリダイゼーション特異性に関して、３’−第１ハイブリダイゼーション部位及び５’−第２ハイブリダイゼーション部位が分割部位により分離されるからである。即ち、ハイブリダイゼーション特異性に関して、５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、３’−第１ハイブリダイゼーション部位とは相対的に独立的な方式でハイブリダイズし、５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションは、３’−第１ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションによる影響をあまり大きく受けない。したがって、非ターゲット配列に対する５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーション可能性は、非常に低くなる。
ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位及び５’−第２ハイブリダイゼーション部位が鋳型に相補的な配列を有する場合、ターゲット−特異的ハイブリダイゼーション条件下でＴＤプローブは、鋳型のターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る。しかし、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位のみが鋳型に相補的な配列を有する場合は、ターゲット−特異的ハイブリダイゼーション条件下でＴＤプローブは、鋳型とハイブリダイズしない。
前記上述のＴＤプローブの特徴により、下記のような二つのターゲット−監視イベント（ｔａｒｇｅｔ−ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｅｖｅｎｔ）を通じて著しく改善されたターゲット−特異性でターゲット配列が検出可能となる。第一に、上述のように、ターゲット及び非ターゲット核酸配列に対してそれぞれ異なるハイブリダイゼーションパターンを有するＴＤプローブは、非常に高い特異性で非ターゲット核酸配列からターゲット核酸配列を区別することができる。第二に、連続的な酵素反応（５’→３’エキソ核酸切断反応又はライゲーション）の発生は、ＴＤプローブのハイブリダイゼーションパターンによって決定されて、これは、ターゲット検出過程において、ターゲット特異性を上昇させる。
ＴＤプローブは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズし、二本鎖を形成する。上述のように、このような巧妙なデザインのｍＤＳＯ構造を有するＴＤプローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを完璧に区別することができるようにする。
本発明の好ましい具現例によると、分割部位に位置するユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される。より好ましくは、前記ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール又は５−ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
好ましくは、前記分割部位は、少なくとも３個のユニバーサル塩基、より好ましくは、少なくとも４個のユニバーサル塩基、最も好ましくは、少なくとも５個のユニバーサル塩基を有するヌクレオチドを含む。好ましくは、前記分割部位は、少なくとも３個のユニバーサル塩基、より好ましくは、少なくとも４個のユニバーサル塩基、最も好ましくは、少なくとも５個のユニバーサル塩基を有する連続的なヌクレオチドを含む。選択的に、前記分割部位は、３〜１０個、３〜８個、４〜７個又は４〜５個の連続したユニバーサル塩基を含む。
好ましくは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の長さは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位より長い。前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位は、好ましくは１５〜６０ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは１５〜４０ヌクレオチドの長さを有し、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドの長さを有する。
好ましくは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、少なくとも３ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、１５以下、より好ましくは１３以下、さらに好ましくは１２ヌクレオチドの長さを有する。
前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、好ましくは３〜１５ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは３〜１３ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜１２ヌクレオチド、最も好ましくは５〜１１ヌクレオチドの長さを有する。前記分割部位は、好ましくは３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは３〜８ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜７ヌクレオチド、最も好ましくは４〜５ヌクレオチドの長さを有する。５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び分割部位の全長は、少なくとも６ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも９ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドである。
本発明の好ましい具現例によると、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位は、４０〜８０℃のＴｍを有し、より好ましくは４５〜７０℃のＴｍを有する。前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、好ましくは６〜４０℃のＴｍを有し、より好ましくは１０〜４０℃のＴｍを有する。前記分割部位は、好ましくは２〜１５℃のＴｍを有し、より好ましくは３〜１５℃のＴｍを有する。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブは、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識又は多数の標識を含む相互作用的標識システムを有する。
本発明に利用された検出可能なシグナルを発生する標識は、当業界に公知のあらゆる標識を含む。ある標識は、単一分子又は単一原子標識で構成されるが；標識の大部分（例えば、相互作用的標識システム）は、少なくとも２種又はそれ以上の標識分子又は原子で構成される。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブ上の前記標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識（例えば、金）である。
前記化学的標識は、ビオチンを含む。ストレプトアビジン（又はアビジン）とビオチンとの結合特異性は、ターゲット核酸配列を示す間接的なシグナルの発生を可能とする。
前記酵素標識は、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ルシフェラーゼ、シトクロムＰ４５０及びホースラディッシュペルオキシダーゼを含む。前記酵素標識に対する基質を利用することにより、ターゲット核酸配列を示すシグナルを得ることができる。アルカリホスファターゼを利用する場合、ＢＣＩＰ（ｂｒｏｍｏｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）又はＥＣＦが発色反応に対する基質として利用でき、ホースラディッシュペルオキシダーゼを利用する場合、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトレート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ−フェニレンジアミン−ＨＣｌ及びピロカテコール）、ＴＭＢ（３，３，５，５−テトラメチルベンジジン）、ＡＢＴＳ（２，２−アジン−ジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート］）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）又はナフトール／ピロニンが基質として利用でき；そして、グルコースオキシダーゼを利用する場合、ｔ−ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）又はｍ−ＰＭＳ（フェナジンメトスルファート）が基質として利用できる。
前記放射能性標識は、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブに連結された標識は、リアルタイムのシグナルを提供できる単一標識である。例えば、前記単一標識は、蛍光テルビウムキレート（ｔｅｒｂｉｕｍ ｃｈｅｌａｔｅ）である（Ｎｕｒｍｉ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８ Ｎｏ．８）。Ｎｕｒｍｉらは、前記標識がプローブ−連結された形態では低い水準の蛍光を放出するが、５’→３’核酸切断活性によりプローブ−鋳型二合体から解離されると、蛍光シグナルが増加することを開示した。したがって、単一標識がＴＤプローブに連結された場合も、前記蛍光テルビウムキレートは、本発明でリアルタイムのターゲット検出を可能にする。
前記相互作用的標識システムは、供与体分子及び受容体分子間でエネルギーが非放射能的（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）に伝達されるシグナル発生システムである。
相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴでエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性又は非蛍光性である。
相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性又は電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。
より好ましくは、ＴＤプローブ上の標識は、相互作用的標識システムであり、さらに好ましくはＦＲＥＴ標識システムであり、最も好ましくはレポーター分子及びクエンチング分子の一対である。
好ましくは、ＦＲＥＴ標識を利用する場合、二種の標識（ＴＤプローブ上に位置したレポーター分子及びクエンチング分子）は、ＴＤプローブ内の一位置（ヌクレアーゼ切断が発生される部位）により分割されており、これにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応によりクエンチャー分子からレポーター分子を分離させることができ、これによって、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが得られる。
前記標識は、ＴＤプローブに従来方法により連結できる。例えば、前記標識は、少なくとも３個の炭素原子を含むスペーサー（例えば、３−炭素スペーサー、６−炭素スペーサー又は１２炭素スペーサー）を通じてＴＤプローブに連結され得る。
本発明の好ましい具現例によると、前記レポーター分子及びクエンチャー分子は、いずれも５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、あるいはレポーター分子及びクエンチャー分子のそれぞれは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する。例えば、レポーター分子は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置して、クエンチャー分子は、分割部位に位置する。
より好ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子の一つは、ＴＤプローブの５’−末端に位置し、他の一つは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位部位上にレポーター分子及びクエンチャー分子の一つを有して、他の一つは、３’−第１ハイブリダイゼーション部位上に有する。
より好ましく、レポーター分子及びクエンチャー分子の一つは、ＴＤプローブの５’−末端に位置して、他の一つは、３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する。
本発明の前記ＴＤプローブは、ターゲット配列の検出において、以下のように非常に多様な応用性を有する。
Ｉ．液相又は固相における５’→３’エキソ核酸切断反応によるターゲット検出方法
１．液相におけるターゲット検出方法
本発明のＴＤプローブは、ターゲット配列検出に卓越な能力を示す。
本発明の他の様態によると、本発明は、下記の工程を含み、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を前記ＴＤプローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングするクエンチャー分子で二重標識され、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子の少なくとも一つは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブ上にある前記蛍光レポーター分子が前記クエンチャー分子から分離されて、蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生しない工程と、
（ｃ）前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の切断により発生された前記蛍光シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
本発明によると、ターゲット核酸配列をＴＤプローブにハイブリダイゼーションさせる。
本発明によると、単にＴＤプローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用することにより、擬陽性シグナル無しにターゲット核酸配列を検出することができ、これは、本発明者により最初に提示される。
図１に示されたように、ＴＤプローブは、ターゲット及び非ターゲット核酸配列に対してそれぞれ明確に異なるハイブリダイゼーション挙動を示す。ＴＤプローブがターゲット核酸配列にハイブリダイズする場合、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び３’−第１ハイブリダイゼーション部位がターゲット核酸と二本鎖を形成する。ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーション（即ち、非ターゲットハイブリダイゼーション又は結合）される場合、その３’−第１ハイブリダイゼーション部位が優勢的に非ターゲット核酸配列に結合されるが、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び分割部位は、両方とも非ターゲット核酸にハイブリダイズせず、一本鎖を形成するようになる。
したがって、ＴＤプローブがターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼ）により切断されて、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子は、互いに分離されて、ターゲット核酸配列に対する蛍光シグナルが発生される。一般に、ＴＤプローブの切断は、最初にその５’−末端で始まって、その後５’→３’方向に起こる。
これと対照的に、ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方とも一本鎖を形成し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない。最終的に、ＴＤプローブは、非ターゲットハイブリダイゼーションに対するシグナルを生成しない。
このようなＴＤプローブの独特なハイブリダイゼーション挙動により、ＴＤプローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素のみを利用することにより、擬陽性無しにターゲット核酸配列を検出することができる。
本発明の好ましい具現例によると、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、二本鎖核酸の５’−末端に対してのみ作用し、５’→３’方向にエキソ核酸切断反応を促進し、一本鎖核酸は切断しない。
本発明の好ましい具現例によると、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、熱安定性酵素である。本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、より好ましくは、熱安定性鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである。
本発明の好ましい具現例によると、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び３’−第１ハイブリダイゼーション部位のそれぞれ異なる部位に位置する。例えば、蛍光レポーター分子が５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置し、クエンチャー分子は、３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置することができる。選択的に、クエンチャー分子が５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置し、蛍光レポーター分子が３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置することができる。
本発明の好ましい具現例によると、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子は、いずれも５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、あるいはレポーター分子及びクエンチャー分子のそれぞれは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する。最も好ましくは、蛍光レポーター及びクエンチャー分子が両方ともＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置することである。
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを含んだ）の一部は、一般に、非常に低いものの、エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性も有すると知られている。エンドヌクレアーゼ活性の程度は、（ｉ）酵素の種類、（ｉｉ）鋳型、反応時間及び反応組成物のような反応条件、（ｉｉｉ）プローブの長さ、配列及び５’ミスマッチ配列長さ又は（ｉｖ）ターゲット配列により影響を受ける。本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を両方とも有する酵素を利用する場合、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性を十分抑制した条件下で行う。好ましくは、本発明でエンドヌクレアーゼ活性がほとんどないか、あるいはエンドヌクレアーゼ活性がない５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して行う。
したがって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素及びＴＤプローブを利用してターゲットを検出することにおいて、エンドヌクレアーゼ活性は、考慮すべき重要要素ではない。しかし、より確実なターゲット検出のために、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位にブロッカーが含まれていてもよく、これは、非ターゲット核酸配列とハイブリダイズしたＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位のエンドヌクレアーゼ−触媒切断を抑制する。特に、ＴＤプローブが液相で利用される場合、より確実なターゲット検出のために、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子は、両方ともＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に位置してもよい。
本発明において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、一般に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含み、普段５’→３’エキソヌクレアーゼ活性だけではなく、追加的なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素も含む。本発明において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、一般に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを含み、普段５’→３’エキソヌクレアーゼ活性だけではなく、追加的なエンドヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼも含む。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブは、その５’−末端から１〜１０ヌクレオチドを含む配列のある位置（ｓｉｔｅ）、より好ましくは５’−末端から１〜５ヌクレオチドを含む配列のある位置、より好ましくはその５’−末端から１〜３ヌクレオチドを含む配列のある位置上に少なくとも一つの標識を含む。最も好ましくは、ＴＤプローブは、その５’−末端に少なくとも一つの標識を含む。
本発明の好ましい具現例によると、前記工程（ａ）は、ＴＤプローブがハイブリダイズする位置の下流位置にハイブリダイズする上流プライマーと共にＴＤプローブを利用して行って、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、上流プライマーは、前記工程（ｂ）で前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼにより延長される。
ハイブリダイゼーション以後、ターゲット核酸配列とハイブリダイズする上流プライマーは、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により延長されて、ＴＤプローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子が分離されつつ蛍光シグナルが発生される。
本発明の好ましい具現例によると、前記工程（ａ）は、ＴＤプローブ及び逆方向プライマーを共に利用して行われ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、工程（ｂ）で、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる逆方向プライマーの延長反応でＴＤプローブとハイブリダイズするターゲット核酸配列が生成される。
逆方向プライマーは、ＴＤプローブとハイブリダイズする追加的なターゲット核酸配列を生成して、ターゲット核酸配列をより明確で高い高蛍光シグナルで示す。
本発明に利用可能な蛍光分子及びクエンチャー分子は、蛍光物質であってもよい。レポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に公知されている如何なるものでも利用でき、その例は、下記の通りである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６），ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９），ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９），Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７），ＦＩＴＣ（５１８），ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９），ＡｌｅｘａＴＭ（５２０），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１１０（５２０），Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ５００（５２２），Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ４８８（５２４），ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（５２９），Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１），Ｃａｌｃｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３），ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３），ＴＯＴＯ１（５３３），ＪＯＥ（５４８），ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０），Ｄｉｌ（５６５），ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ（５６８），ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８），ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０），Ｃｙ３ＴＭ（５７０），ＡｌｅｘａＴＭ５４６（５７０），ＴＲＩＴＣ（５７２），Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５），Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５），Ｃａｌｃｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６），Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ（５８０），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０），ＴＡＭＲＡ（５８２），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ（５９０），Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６），ＲＯＸ（６０８），Ｃａｌｃｉｕｍ ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５），ＡｌｅｘａＴＭ５９４（６１５），Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５），Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８），ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１），ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１），Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２），Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８），ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０），ＴＯＴＯ３（６６０），ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５），Ｃｙ５ＴＭ（６７０），Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１），Ｃｙ５．５（６９４），ＨＥＸ（５５６），ＴＥＴ（５３６），Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ（４４７），ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０（５４４），ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０（５５９），ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０（５９１），ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（６１０），ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５（６３７），ＦＡＭ（５２０），Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０），Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０），Ｐｕｌｓａｒ ６５０（５６６），Ｑｕａｓａｒ ５７０（６６７），Ｑｕａｓａｒ ６７０（７０５）及びＱｕａｓａｒ ７０５（６１０）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。
適したレポーター−クエンチャー対は、下記のようなたくさんの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ，２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．３，９９６，３４５及び４，３５１，７６０。
本発明において、広範囲波長又は特定波長の蛍光をクエンチングできる非蛍光ブラッククエンチャー分子が利用できるということは、注目すべきことである。非蛍光ブラッククエンチャー分子の例は、ＢＨＱ及びＤＡＢＣＹＬである。
ＴＤプローブに適用されるＦＲＥＴ標識において、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅ）は、レポーター分子として利用されて、ローダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ）は、クエンチャー分子として利用される。
本明細書で使用される用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’又は‘ターゲット配列’は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅条件下でプライマー及びプローブとアニーリング又はハイブリダイズする。
本明細書で使用される用語‘プローブ（ｐｒｏｂｅ）’は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な一部位又は複数の部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。本発明で利用されるプローブは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、変形されたヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドが含まれる。また、プローブは、リボヌクレオチドも含んでもよい。
好ましくは、標識プローブの３’−末端は、延長が抑制されるようにブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）されている。前記ブロッキングは、非相補的な塩基を利用するか、あるいは最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にビオチン又はホスフェート基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して達成できる。また、ブロッキングは、３’−ＯＨ基を除去するか、又はジデオキシヌクレオチドのように、３’−ＯＨ基のないヌクレオチドを利用することにより達成できる。
本明細書で使用される用語‘プライマー’は、オリゴヌクレオチドを意味するもので、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在下において、そして適した温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用できる。好ましくは、プライマーは、増幅時の最大効率のために、一本鎖である。好ましくは、プライマーは、デオキシリボヌクレオチドである。本発明で利用されるプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、変形されたヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドが含まれる。また、プライマーは、リボヌクレオチドも含んでもよい。
プライマーは、重合剤の存在下で延長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの適した長さは、多数の要素、例えば、温度、応用分野及びプライマーの起源（ｓｏｕｒｃｅ）によって決定される。用語‘アニーリング’又は‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチド又は核酸が付加（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸又はその一部分に相補的な核酸分子を形成することができる。
本明細書で使用される用語‘ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。本明細書で使用された用語‘アニーリング’と‘ハイブリダイゼーション’は、差がなく、本明細書で混用される。
ＴＤプローブのアニーリング又はハイブリダイゼーションは、当業界に公知された多数のハイブリダイゼーション方法により行うことができる。本発明において、適したハイブリダイゼーション条件は、最適化手順により一連の過程で決定できる。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄時間、バッファー成分及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、多様な因子、例えば、プローブ及びターゲット核酸配列のようなオリゴヌクレオチドの長さ及びＧＣ量によって多様である。ハイブリダイゼーションの詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ５，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）で確認できる。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブの前記ハイブリダイゼーション温度は、４０℃乃至８０℃であり、より好ましくは４５℃乃至７５℃であり、さらに好ましくは５０℃乃至７２℃である。
本明細書で使用される用語‘上流プライマー（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ）’は、ＴＤプローブがハイブリダイズする位置より下流側の位置でターゲット核酸配列にアニーリングされて、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによりターゲット核酸配列に相補的な配列を形成するプライマーを意味する。
ＴＤプローブ、上流プライマー及び逆方向プライマーのそれぞれは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件又はストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションする程度に十分相補的なことを意味し、用語‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、ターゲット核酸配列に相補的である。即ち、５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、ターゲット核酸配列に完全なマッチング配列又は不完全なマッチング配列である。必要に応じて、５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、一部ミスマッチヌクレオチドを含むものとして製作できる。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、その５’−末端に追加的に１個乃至３個のミスマッチヌクレオチドを含んでもよい。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（即ち、核酸ポリメラーゼ）のうち、ターゲット配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの５’−末端から１個乃至３個のヌクレオチドを切断できる酵素が報告されている（参考：Ｍｕｒａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２６９．１１９１−１１９６（１９９４）及び実施例１）。上記のような酵素を利用する場合、ＴＤプローブは、その５’−末端に１個乃至３個の人為的ミスマッチヌクレオチドを含むように製作することができる。
本発明で検出できるターゲット核酸配列は、あらゆる核酸分子、例えば、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ又はｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子も全て含む。ターゲット核酸配列は、如何なる天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタインバールウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸又はウイロイド核酸も全て含む。
試料内ターゲット核酸配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよい。前記分子は、二本鎖又は一本鎖形態のいずれであってもよい。初期物質としての核酸が二本鎖である場合、二つの鎖を一本鎖又は部分一本鎖形態になるようにすることが好ましい。鎖を分離する公知の方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素方法（例えば、ヘリカーゼ反応）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、鎖の分離は、８０℃乃至１０５℃範囲の温度に熱を加えて達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。
ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング工程の実施以前に逆転写工程が必須であり、これの詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８）に開示されている。逆転写反応のために、ランダムヘキサマー又はｍＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用される。オリゴヌクレオチドｄＴプライマーは、ｄＴＭＰｓから構成され、ｄＴプライマーがプライマーとしての役割ができる範囲内でこのｄＴＭＰｓの一つ又はそれ以上は、他のｄＮＭＰで代替してもよい。逆転写は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素で実施できる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を利用する場合、慎重に反応条件を選択することにより、ＲＮａｓｅ Ｈ切断過程を省いてもよい。
本発明で使用されるプローブ又はプライマーは、ターゲット核酸配列（鋳型として）上の位置にハイブリダイゼーション又はアニーリングされて、二本鎖構造を形成する。このような二本鎖構造を形成するに適した核酸ハイブリダイゼーション又はアニーリングの条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＨａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）に説明されている。
本発明の好ましい具現例によると、前記上流プライマー及び／又は逆方向プライマーは、下記一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する：
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーション配列を有する３’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは、前記オリゴヌクレオチドの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
ＤＳＯ構造の詳細な説明は、ｍＤＳＯ構造を引用して説明できる。
好ましくは、ＤＳＯ構造の５’−第１ハイブリダイゼーション部位は、３’−第２ハイブリダイゼーション部位より長い。５’−第１ハイブリダイゼーション部位は、好ましくは１５〜６０ヌクレオチドの長さを有し、より好ましくは１５〜４０ヌクレオチドの長さを有し、さらに好ましくは１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する。３’−第２ハイブリダイゼーション部位は、好ましくは３〜１５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは５〜１５ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは６〜１３ヌクレオチドの長さを有する。分割部位は、好ましくは３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは４〜８ヌクレオチド、最も好ましくは５〜７ヌクレオチドの長さを有する。本発明の好ましい具現例によると、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位は、４０℃〜８０℃のＴｍを有し、より好ましくは４５℃〜６５℃のＴｍを有する。前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位は、好ましくは、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。前記分割部位は、好ましくは、３℃〜１５℃のＴｍを有する。
好ましくは、本発明で利用される５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、如何なる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ）も含むことができて、最も好ましくは、多様なバクテリア種から得る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ），Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５及びＴｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７のＤＮＡポリメラーゼを含む。最も好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼ）により、ＴＤプローブは切断され、ターゲット核酸配列を示すシグナルが発生する。各標識に対するシグナルは、従来方法により検出されるか、又は測定してもよい。例えば、蛍光シグナルは、従来方法、例えば、蛍光測定器（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）により検出されるか測定してもよい。
本明細書で使用される用語‘シグナル発生’又は‘シグナルの発生’は、蛍光シグナル強度の変化を含み、蛍光シグナル強度の増加だけではなく、減少も含む。本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、蛍光レポーター分子から出るシグナルである。選択的に、クエンチャー分子は、蛍光であり、検出されるターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、蛍光クエンチャー分子から出るシグナルである。
ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生しない。
本明細書で使用される用語‘シグナル未発生（ｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌ）’は、無視できるほどの微弱な蛍光シグナルだけではなく、何の蛍光シグナルも現れないことを意味する。例えば、前記用語は、陰性対照群又はバックグラウンドから一般的に測定されるか又は観察される蛍光強度を含む。
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程をさらに含み、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）の反復のために、本発明は、前記反復サイクルの間に変性過程をさらに含む。
変性方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素方法（例えば、ヘリカーゼ反応）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、変性は、８０℃乃至１０５℃範囲の温度に熱を加えて達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。
前記反復は、蛍光レポーター分子から出る蛍光シグナルの強度を増加させる。特に、本発明の方法において、逆方向プライマーを利用した反復は、ターゲット核酸配列の量を増加させて、蛍光レポーター分子から出る蛍光シグナルの強度を向上させるに寄与する。
本発明の好ましい具現例によると、利用されるターゲット核酸配列は、増幅プライマーにより前増幅された核酸配列である。
前増幅されたターゲット核酸配列は、工程（ａ）−（ｃ）に対する反応環境（又は反応容器（ｖｅｓｓｅｌ））と異なる反応環境（又は反応容器（ｖｅｓｓｅｌ））で前増幅されたターゲット核酸配列を含んでもよい。
本発明が工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）の反復をさらに含む場合、好ましくは、シグナル検出は、反復の各サイクルにおいて（即ち、リアルタイム方式）、反復の終了時点で（即ち、エンド−ポイント方式）又は反復において指定時間間隔のそれぞれで実施する。好ましくは、シグナル検出は、反復の各サイクルで実施してもよく、これは、検出の正確性を向上させる。
本発明の好ましい具現例によると、前増幅されたターゲット核酸配列の生成のための前記増幅プライマー（例えば、正方向プライマー及び逆方向プライマー）は、本明細書において上述の一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブは、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）を含むブロッカー部位を有する。本発明の好ましい具現例によると、前記ブロッカー部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されるＴＤプローブの一位置にあり、好ましくは、ＴＤプローブの３’−ハイブリダイゼーション部位にある。
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼ）を利用する場合、より確実なターゲット検出のために、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位にブロッカーが含まれてもよく、これは、非ターゲット核酸配列とハイブリダイズしたＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位のエンドヌクレアーゼ−触媒切断を抑制する。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブは、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカーとして含むブロッカー部位（ｓｉｔｅ）を有し、前記ブロッカー部位は、ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される部位に位置し；前記ブロッカー部位を含むＴＤプローブがターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、ＴＤプローブ上のクエンチャー分子から蛍光レポーター分子が分離されて蛍光シグナルが発生され；前記ブロッカー部位を含むＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生されない。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブのブロッカー部位は、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位上に位置する。より好ましくは、ＴＤプローブのブロッカー部位は、分割部位の３’−末端に近接した３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記ブロッカー部位は、１〜１５ブロッカーを含み、より好ましくは２〜１０ブロッカーを含み、さらに好ましくは３〜５ブロッカーを含む。
ブロッカーとしてのヌクレオチド、即ち、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、当業界に知られた如何なるものも含む。例えば、前記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート連結（ｌｉｎｋａｇｅ）、ホスホネート連結、ホスホロアミデート連結及び２’−カーボヒドレート変形を含む。本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミデート連結、アリールホスホロアミデート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピール変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリール変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形である。ＴＤプローブに存在するブロッカーヌクレオチドは、一つであるか、あるいは連続的に又は不連続的に存在する一つ以上のヌクレオチドである。
本発明の好ましい具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）、かつ前記ＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含む（好ましくは少なくとも３種であり、より好ましくは少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）、前記ＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含み（好ましくは少なくとも３種であり、より好ましくは少なくとも５種である）、かつ前記上流プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、さらに好ましくは、少なくとも５種である）、前記ＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含み（好ましくは、少なくとも３種であり、より好ましくは、少なくとも５種である）、前記逆方向プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、さらに好ましくは、少なくとも５種である）。
また、本発明は、ヌクレオチド変異の検出において非常に有用である。本発明で使用される用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続的ＤＮＡ断片又は配列が類似したＤＮＡ断片において、特定位置に存在するＤＮＡ配列のヌクレオチド多様性を意味する。そのような連続的ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子又は一つの染色体のある他の部位を含む。例えば、本発明の方法により検出できるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、欠失、挿入、置換及びトランスロケーションを含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、薬剤耐性病原体のヌクレオチド変異及び癌発生−関連ヌクレオチドの変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する。
２．固相におけるターゲット検出方法
本発明は、液相だけではなく、固相（例えば、マイクロアレイ）でも卓越な適応性を有する。
本発明の他の様態によると、本発明は、以下の工程を含み、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用し、固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を前記ＴＤプローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、３’−末端を通じて固相基質の表面に固定化されていて、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、前記ＴＤプローブは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記標識は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性が、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブから前記標識が放出されて、前記固相基質上に固定化されたＴＤプローブでシグナル変化が現れて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、前記固相基質上に固定化されたＴＤプローブでシグナル変化が現れなく、これにより、前記固相基質上のシグナル変化を検出して、前記ターゲット核酸配列の存在を決定する工程と、
（ｃ）前記固相基質上の前記シグナル変化を検出する工程であって、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の切断による前記シグナル変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
本発明の固相方法は、ＴＤプローブを利用して、上述の液相方法の工程に従うため、その重複する内容は、本明細書の複雑性を避けるために、その記載を省く。
前記固相反応のために、ＴＤプローブは、３’−末端を通じて固相基質表面に直接的又は間接的に固定化される。また、前記プローブは、共有又は非共有結合方式で固相基質表面に固定化できる。固定化されたプローブが固相基質表面に固定化される場合は、リンカーが関与する。本発明で使用できるリンカーは、マイクロアレイでプローブを固定化するに利用される如何なるリンカーも含む。例えば、アミン基を有するアルキル又はアリール化合物、又はチオール基を有するアルキル又はアリール化合物がリンカーとしてプローブ固定化に利用できる。加えて、ポリ（Ｔ）塩基又はポリ（Ａ）塩基がリンカーとして利用されて、酵素作用（例えば、酵素的切断反応）に対する空間的妨害（ｓｐａｃｅ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を最小化するか、又はハイブリダイゼーション効率を増加させることができる。ポリ（Ｔ）塩基又はポリ（Ａ）塩基がＴＤプローブをスパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）する配列としてみなされない。例えば、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位末端に連結されたポリ（Ｔ）塩基又はポリ（Ａ）塩基は、３’−第１ハイブリダイゼーション部位としてみなされない。
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用される前記固相基質は、マイクロアレイである。本発明で反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に知られた如何なるマイクロアレイも含む。本発明の全ての過程、即ち、ターゲット配列とのアニーリング、延長／切断反応及び蛍光の検出は、マイクロアレイ上でなされる。マイクロアレイで固定化プローブは、ハイブリダイズ可能なアレイ要素（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用される。マイクロアレイを製作するための固相基質（Ｓｏｌｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、例えば、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウェハー、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の複数の固定化プローブは、固相基質上の一つのアドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）区域（ｒｅｇｉｏｎ）又は複数のアドレス可能な区域に固定化されて、固相基質は、２〜１，０００，０００個のアドレサブル区域を含むことができる。フォトリソグラフィー、インクゼッティング、機械的マイクロスポッティング及びこれの類似方法のような従来製作技術により、特定応用のためのアレイを提供するために、固定化プローブが組み立てられてもよい。
本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、熱安定性酵素である。本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、より好ましくは、熱安定性鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである。
本発明の好ましい具現例によると、前記工程（ａ）は、ＴＤプローブがハイブリダイズする位置の下流位置にハイブリダイズする上流プライマーと共にＴＤプローブを利用して行われ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、上流プライマーは、前記工程（ｂ）で前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼにより延長される。
本発明の好ましい具現例によると、前記工程（ａ）は、ＴＤプローブ及び逆方向プライマーを共に利用して行われ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、前記工程（ｂ）で鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる逆方向プライマーの延長反応によりＴＤプローブとハイブリダイゼーションできるターゲット核酸配列が生成される。
本発明の好ましい具現例によると、前記標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である。
図４又は図５に示したように、本発明の固相での方法は、単一標識（例えば、単一蛍光標識）又は相互作用的標識（例えば、レポーター分子及びクエンチャー分子）を利用して行うことができる。
例えば、単一蛍光標識を含むＴＤプローブがターゲット核酸配列の検出に利用される場合、５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の蛍光標識が固相基質に固定化されたＴＤプローブから放出され、固相基質上の蛍光シグナル強度の減少を導く。蛍光シグナル減少又は消滅は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の好ましい具現例によると、前記単一標識が蛍光レポーター分子である場合、シグナル変化は、固相基質上の蛍光の減少又は消滅である。
本発明の好ましい具現例によると、前記単一蛍光標識を含むＴＤプローブである場合、工程（ｃ）の検出以前に洗浄する工程をさらに含む。あるいは、前記単一蛍光標識を含むＴＤプローブである場合、工程（ｃ）の検出以前に洗浄する工程を含まない。
本発明の好ましい具現例によると、前記単一蛍光分子は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置（ｓｉｔｅ）に位置する。
明確性のために、前記表現‘５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の位置（ｓｉｔｅ）’は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の全ての部分（ｐａｒｔ）、一部分又は一位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され得て、前記標識は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位が切断されるどんな位置にも位置できるということを意味する。したがって、前記表現‘５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の位置（ｓｉｔｅ）’は、‘５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される位置’とも言える。
より好ましくは、前記単一蛍光分子は、ＴＤプローブの５’−末端から１〜１０ヌクレオチド、より好ましくは１〜５ヌクレオチド、さらに好ましくは１〜３ヌクレオチドを含む配列のどんな一位置にも位置できる。最も好ましくは、単一蛍光分子は、ＴＤプローブの５’−末端に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記標識は、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対から構成される相互作用的標識システムである。
本発明の好ましい具現例によると、前記レポーター分子及びクエンチャー分子の一つは、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に位置して、他の一つは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち一つは、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される位置に位置し、他の一つは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない前記位置は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位、分割部位又は３’−第１ハイブリダイゼーション部位上に存在できる。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法を固相で行う場合、前記ＴＤプローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定されて、前記クエンチャー分子は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置（ｓｉｔｅ）に位置し、前記蛍光レポーター分子は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置し、前記ＴＤプローブがターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、蛍光レポーター分子がＴＤプローブ上にあるクエンチャー分子から分離されつつレポーター分子から蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生せず、これにより、固相基質上の蛍光シグナルは、ターゲット核酸配列の存在が決定されるように検出される。
固定化ＴＤプローブがターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’−末端から３’−末端方向の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される。この際、固定化ＴＤプローブ断片及びターゲット核酸配列間の結合が弱いと、これにより、固相基質上の固定化ＴＤプローブ断片からターゲット配列が解離される。したがって、前記固定化ＴＤプローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される部位及び非切断部位の２種の部位を含むとして考慮できる。したがって、前記プローブの非切断部位上に位置する標識は、固相基質の表面に残る。
固定化ＴＤプローブの切断パターンに鑑みて、ＴＤプローブも５’−第２ハイブリダイゼーション部位内に切断部位及び非切断部位を含むことができる。ＴＤプローブ内の切断部位及び非切断部位の形成は、分割部位により影響を受け得る。
本発明の好ましい具現例によると、クエンチャー分子及びレポーター分子間のＴＤプローブの一位置に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するように変形されたヌクレオチド又はバックボーンのようなブロッカーが含まれる場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ブロッカーのため追加的に切断できず、非切断部位になる固定化ＴＤプローブ断片を含む単一標識が固相基質上に残る。
本発明の好ましい具現例によると、前記クエンチャー分子は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記蛍光レポーター分子は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記蛍光レポーター分子は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない３’−第１ハイブリダイゼーション部位上に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置した前記蛍光レポーター分子は、工程（ｂ）以後に固相基質の表面上に残されて、これは、洗浄工程のないリアルタイム方式でレポーター分子から出た蛍光シグナルを簡便に検出可能となる。
好ましくは、クエンチャー分子は、ＴＤプローブの５’−末端に位置するか、あるいは５’−末端から１〜３ヌクレオチド離隔された所に位置して、蛍光レポーター分子は、ＴＤプローブの３’−末端に隣接して位置するか、あるいはＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位の中間に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記クエンチャー分子は、ＴＤプローブの５’−末端から１〜１０ヌクレオチド、より好ましくは１〜５ヌクレオチド、さらに好ましくは１〜３ヌクレオチドを含む配列のどんな一位置にも位置する。最も好ましくは、前記クエンチャー分子は、ＴＤプローブの５’−末端に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記レポーター分子は、ＴＤプローブの３’−末端から１〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１〜２０ヌクレオチド、さらに好ましくは１〜１５ヌクレオチドを含む配列のどんな一位置にも位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記上流プライマー及び／又は逆方向プライマーは、一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する。
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程をさらに含み、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復するために、本発明は、反復サイクルの間に変性過程をさらに含む。
本発明が工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）の反復をさらに含む場合、好ましくは、シグナル検出は、反復の各サイクルにおいて（即ち、リアルタイム方式）、反復の終了時点で（即ち、エンド−ポイント方式）又は反復において指定時間間隔のそれぞれで実施する。好ましくは、シグナル検出は、反復の各サイクルで実施してもよく、これは、検出の正確性を向上させて、追加的にターゲット核酸を定量することができる。
本発明の好ましい具現例によると、利用されるターゲット核酸配列は、増幅プライマーにより前増幅された核酸配列である。
本発明の好ましい具現例によると、前増幅されたターゲット核酸配列の生成のための前記増幅プライマー（例えば、正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む）は、本明細書に述べた一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する。
本発明の好ましい具現例によると、リアルタイム方式でターゲット核酸配列を検出するために、前記工程（ａ）及び（ｂ）は、ターゲット核酸配列の増幅と同時に行われる。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブは、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）を含むブロッカー部位を有する。本発明の好ましい具現例によると、前記ブロッカー部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されるＴＤプローブの一位置にあり、好ましくは、ＴＤプローブの３’−ハイブリダイゼーション部位にある。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＤプローブは、酵素（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼ）の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）を含むブロッカー部位を有し、ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、前記ブロッカー部位は、酵素のエンドヌクレアーゼ活性により切断される位置に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブの前記ブロッカー部位は、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する。より好ましくは、ＴＤプローブのブロッカー部位は、分割部位の３’−末端に近接した３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）、かつ前記ＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含む（好ましくは少なくとも３種であり、より好ましくは少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）、前記ＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含み（好ましくは少なくとも３種であり、より好ましくは少なくとも５種である）、かつ前記上流プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）、前記ＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含み（好ましくは少なくとも３種であり、より好ましくは少なくとも５種である）、かつ前記逆方向プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）。
さらに、本発明は、ヌクレオチド変異の検出において非常に有用である。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する。
ＩＩ．好ましい具現例：ＴＤプローブを利用したリアルタイムＰＣＲアッセイ
好ましくは、本発明は、ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーで構成された一対のプライマーを利用したターゲット拡散配列の増幅と同時に行われる。好ましくは、前記増幅は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって行われて、これは、Ｕ．Ｓ．特許番号４，６８３，１９５、４，６８３，２０２及び４，８００，１５９に開示されている。
本発明のまた他の様態は、以下の工程を含み、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）（ｉ）前記ターゲット核酸配列、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する前記ＴＤプローブ、（ｉｉｉ）それぞれ前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する正方向プライマー及び逆方向プライマーとして二つのプライマーからなる一対のプライマー、及び（ｉｖ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを含むＰＣＲ混合物を用意する工程であって、前記ＴＤプローブは、前記二つのプライマー間の位置にハイブリダイズし、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングするクエンチャー分子で二重標識されており、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置し、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記ＰＣＲ混合物を利用して少なくとも２サイクルのプライマーアニーリング、プライマー延長及び変性で前記ターゲット核酸配列を増幅させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により延長されて、前記ターゲット核酸配列を増幅して、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、前記ＴＤプローブ上にある前記クエンチャー分子から前記蛍光レポーター分子が分離されて、蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず、その結果、前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＤプローブ上にある前記クエンチャー分子から分離されず、蛍光シグナルが現れない工程と、
（ｃ）前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記発生した蛍光シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
本発明のリアルタイムＰＣＲ分析は、ＴＤプローブを利用して、上述の本発明の工程に従うため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
５’→３’核酸切断反応を利用したリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、シグナル発生だけではなく、ターゲット増幅のために利用される（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ方法）。前述したように、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を含む二つの核酸切断活性を有することができる。前記エンドヌクレアーゼ活性は、ターゲットの増幅を実施する過程で擬陽性シグナルを生じ得る。
前記エンドヌクレアーゼ活性に係わる問題を完璧に克服するために、本発明は、独特の戦略を採択し、全ての二重標識がＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に位置するようにする。
本発明の好ましい具現例によると、リアルタイムＰＣＲ反応において、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、両方ともＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれは、ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する。
ＰＣＲ反応過程において、ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性が３’−第１ハイブリダイゼーション部位に形成された分岐点（ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ）に作用するとしても、５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に位置した蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子は、お互いから分離されないため、蛍光レポーター分子から出る蛍光シグナルは、エンドヌクレアーゼ活性により発生しない。
このような点で、本発明のリアルタイムＰＣＲアッセイは、どんな擬陽性シグナル発生の可能性も除去することを完璧に保障する。
本発明の好ましい具現例によると、前記シグナル検出は、反復の各サイクルにおいて（即ち、リアルタイム方式）、反復の終了時点で（即ち、エンド−ポイント方式）又は反復において指定時間間隔のそれぞれで実施する。好ましくは、シグナル検出は、反復の各サイクルで実施してもよく、これは、検出の正確性を向上させる。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）、前記ＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含み（好ましくは少なくとも３種であり、より好ましくは少なくとも５種である）、正方向プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）、かつ逆方向プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、正方向プライマー及び／又は逆方向プライマーは、前述した一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する。
ＩＩＩ．液相又は固相におけるライゲーション反応によるターゲット検出方法
本発明のまた他の様態によると、以下の工程を含み、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応によりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を第１プローブ及び第２プローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記第１プローブは、前記ターゲット核酸配列の第１位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、第２プローブは、前記第１位置の上流に位置する前記ターゲット核酸配列の第２位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記第１プローブ及び前記第２プローブの少なくとも一つは、検出可能なシグナルを発生する標識を有して、前記第２プローブは、ＴＤプローブであり、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記第１プローブ及び前記第２プローブのライゲーションが起こり、前記第２プローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記第１プローブ及び前記第２プローブは、ライゲーションされず、これにより、前記第２プローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズした前記第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせる工程であって、これにより、ライゲーションされたプローブ（ｌｉｇａｔｅｄ ｐｒｏｂｅ）が生成される工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記ライゲーションされたプローブ上の前記標識からのシグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
ライゲーション反応を利用する本発明の方法は、ＴＤプローブを使用するため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
本発明の方法は、液相又は固相で行うことができる。好ましくは、本発明の方法は、固相で行われる。
ライゲーション反応を利用した本発明の方法は、第１プローブ及び第２プローブがターゲット核酸配列とハイブリダイズする。第２プローブは、前述したＴＤプローブである。第１プローブは、前記ターゲット核酸配列の第１位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、第２プローブは、前記第１位置の上流に位置する前記ターゲット核酸配列の第２位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む。第１プローブ及び第２プローブは、前述した順にターゲット核酸配列とハイブリダイズさせなければならない。もし第１プローブ及び第２プローブが上記のように実施されないと、本発明によるターゲット−特異検出は達成できない。
本発明の好ましい具現例によると、第１プローブ及び第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションする場合、第１プローブ及び第２プローブは、互いに直接隣接した位置に位置する。
隣接した位置に位置することが、二つのプローブ間のライゲーション反応のために必要である。本明細書において、第１プローブ及び第２プローブのハイブリダイゼーション位置を言及しながら使用される用語‘隣接した（ａｄｊａｃｅｎｔ）’は、前記二つのプローブの末端が互いに連結され得るように、前記一つのプローブの３’−末端及び他の一つのプローブの５’−末端が互いに十分隣接していることを意味する。
本発明の好ましい具現例によると、第１プローブの３’−末端は、ヒドロキシル基を有し、かつ第２プローブの５’−末端は、ホスフェート基を有する。
本明細書において、第１プローブ及び第２プローブのハイブリダイゼーション位置を言及しながら使用される用語‘直接隣接（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ａｄｊａｃｅｎｔ）’は、第２プローブの５’−末端が第１プローブの３’−末端に隣接して、前記二つのプローブが、適した作用剤、例えば、リガーゼによりライゲーションが可能な程度に十分隣接していることを意味する。第２プローブの５’−末端が第１プローブの３’−末端から０ヌクレオチド離隔された場合、二つのプローブは、リガーゼによりライゲーションされるニック（ｎｉｃｋ）を形成する。
第１プローブ又は第２プローブの一つは、検出可能なシグナルを生成する標識を有する。あるいは、第１プローブ及び第２プローブの両方とも標識を有する。
本発明の好ましい具現例によると、標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である。
より好ましくは、標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子の一対からなる相互作用的標識システムである。例えば、第１プローブがレポーター分子又はクエンチャー分子の一つで標識され、第２プローブは、クエンチャー分子又はレポーター分子の一つで標識される。
本発明の好ましい具現例によると、第１プローブは、前述した一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する。
より好ましくは、第１プローブがＤＳＯ構造を有し、第２プローブは、ＴＤプローブであり、第１プローブの３’−末端は、第２プローブの５’−末端に直接隣接した位置に位置する。
プローブを利用したターゲット配列検出の正確性は、一般にターゲット配列に対するプローブの特異性に依存的である。ＤＳＯ構造を有する第１プローブ及びｍＤＳＯ構造を有する第２プローブ（ＴＤプローブ）が利用される場合、二つのプローブがターゲット核酸配列にハイブリダイズする時、第１プローブの３’−第２ハイブリダイゼーション部位及び第２プローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、お互い直接隣接した位置に位置する。その後、第１プローブの３’−第２ハイブリダイゼーション部位及び第２プローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位がライゲーションされる。第１プローブ及び第２プローブが非ターゲット配列にハイブリダイズする場合、プローブの第１ハイブリダイゼーション部位のみが非特異ハイブリダイゼーションし、プローブの第２ハイブリダイゼーション部位のそれぞれは一本鎖を形成し、第１プローブ及び第２プローブのライゲーションが起こらない（図６）。
前述したように、ＤＳＯ構造を有する第１プローブ及びｍＤＳＯ構造を有する第２プローブの一対のプローブは、ターゲット検出において、擬陽性結果から完璧に自由になる。
ハイブリダイゼーション後、ターゲット核酸配列にハイブリダイズした第１プローブ及び第２プローブがライゲーションされる。
酵素性ライゲーションは、第１プローブ及び第２プローブを共有結合で連結させる好ましい方法であるため、用語‘ライゲーション’は、本明細書で全体的に利用される。しかし、用語‘ライゲーション’は、一般的な用語であり、二つのプローブを共有結合で連結させる如何なる方法も含むとして理解される。酵素性ライゲーションに対する他の択一的方法は、ＥＰ ０３２４６１６に詳述されたフォトライゲーション（ｐｈｏｔｏｌｉｇａｔｉｏｎ）である。
本発明のライゲーションは、二つの選択的な方法によって行うことができる：第一、ライゲーションは、ギャップフィリングライゲーション（ｇａｐ ｆｉｌｌｉｎｇ ｌｉｇａｔｉｏｎ）方法により行うことができる（米国特許第６，００４，８２６号）。ＤＮＡポリメラーゼにより延長されたプローブの３’−末端は、他のプローブの５’−末端にライゲーションされる。第二、ライゲーションは、延長反応無しにニックシーリング（ｎｉｃｋ ｓｅａｌｉｎｇ）方法により行うことができる。
本発明の好ましい具現例によると、本発明のライゲーションは、ニックシーリングにより行われて、どんな追加的な延長反応無しに、プローブの３’−末端と他のプローブの５’−末端が連結される。
ライゲーション反応は、非常に多様なライゲーション作用剤を利用して行うことができ、酵素性ライゲーション作用剤及び非酵素性ライゲーション作用剤（例えば、化学的作用剤及びフォトライゲーション作用剤）を含む。化学的ライゲーション作用剤は、カルボジイミド、ＢｒＣＮ（ｃｙａｎｏｇｅｎ ｂｒｏｍｉｄｅ）、Ｎ−シアノイミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）及びウルトラバイオレットライトのような活性剤、凝縮剤及び還元剤を含むが、これらに限定されるものではない。また、オートライゲーション、即ち、ライゲーション作用剤の不存在下での自発的ライゲーションも本発明の教示範囲に含まれる。化学的ライゲーション方法の詳細なプロトコール及び適切な作用基の詳細な説明は、Ｘｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：８７５−８１（１９９９）；Ｇｒｙａｚｎｏｖ ａｎｄ Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１４０３−０８（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：２３６６−６９（１９９４）；Ｋａｎａｙａ及びＹａｎａｇａｗａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：７４２３−３０（１９８６）；Ｌｕｅｂｋｅ及びＤｅｒｖａｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３００５−０９（１９９２）；Ｓｉｅｖｅｒｓ及びｖｏｎ Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：２２１−２４（１９９４）；Ｌｉｕ及びＴａｙｌｏｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３３００−０４（１９９９）；Ｗａｎｇ及びＫｏｏｌ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２３２６−３３（１９９４）から見つけられる。
ライゲーション作用剤として、適した波長の光を利用したフォトライゲーションも本発明の教示範囲に含まれる。本発明の具現例によると、フォトライゲーションは、ヌクレオチドアナログを含むプローブを含み、ｓ４Ｔ（４−ｔｈｉｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、５−ビニールウラシル及びその類似物又はこれらの組合物を含むが、これに限定されるものではない。本発明の具現例によると、ライゲーション作用剤は、（ａ） ＵＶ−Ａ範囲（約３２０ｎｍ乃至約４００ｎｍ）、ＵＶ−Ｂ範囲（約２９０ｎｍ乃至約３２０ｎｍ）又はこれらが組合された光、（ｂ）約３００ｎｍと約３７５ｎｍの間の波長の光、（ｃ）約３６０ｎｍ乃至約３７０ｎｍの波長の光、（ｄ）約３６４ｎｍ乃至約３６８ｎｍの波長の光又は（ｅ）約３６６ｎｍの波長の光を含む。フォトライゲーションの詳細な説明は、他の文献のうちでも、Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４２：３９−４０（１９９９）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．２０ １：１８５−８６（２００１）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｓｕｐｐｌ．，２：１５５−５６（２００２）；Ｌｉｕ及びＴａｙｌｏｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６：３３００−０４（１９９８）から見つけられる。
本発明の好ましい具現例によると、ライゲーション反応は、バクテリオファージＴ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ及び熱安定性リガーゼのようなリガーゼを利用して行われる。より好ましくは、ライゲーション反応は、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｍｔｈリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ ＨＢ８リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ａｐｅリガーゼ、ＬｉｇＴｋリガーゼ、Ａａｅリガーゼ、Ｒｍリガーゼ、及びＰｆｕリガーゼを含む熱安定性リガーゼを利用して行われる（Ｈｏｕｓｂｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：ｅ１０（２０００）；Ｔｏｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：１４４７−５４（２０００）；Ｎａｋａｔａｎｉら、Ｅｕｒ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：６５０−５６（２００２）；Ｚｉｒｖｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：ｅ４０（１９９９）；Ｓｒｉｓｋａｎｄａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２２２１−２８（２０００））。
ライゲーションにより生成されたヌクレオチド間連結（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）は、ホスホジエステル結合及び他の連結を含む。例えば、リガーゼを利用したライゲーションは、一般にホスホジエステル結合を生成する。ライゲーションのための非酵素性方法は、他のヌクレオチド間連結を形成することができる。他のヌクレオチド間連結は、α−ハロアシル基及びホスホチオエート基間に形成されるチオホスホリルアセチルアミノ基、ホスホチオエート基及びトシレート基又はイオジド基間に形成される５’−ホスホロチオエステル、及びピロホスフェート連結のような、適した反応基間の共有結合の形成を含むが、これに限定されるものではない。
ライゲーション反応後、これの結果物は、変性されてターゲット核酸配列から分離される。
本発明の固相で実施する方法において、固定化プローブとしての第１プローブ又は第２プローブは、固相基質の表面上に固定化される。非固定化プローブとしての他のプローブは、固定化されない。
より好ましくは、固相で実施する方法において、第１プローブは、その５’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化されて、第２プローブは、固定化されない。選択的に、固相で実施する方法において、第２プローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化されて、第１プローブは、固定化されない（図６）。
単一標識分子を固相に利用する場合、好ましくは、前記単一標識は、非固定化プローブ上に位置する（図７）。
二つのプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、プローブは、互いにライゲーションされず、変性の間、非固定化プローブは、固定化プローブから分離されて、シグナルが生成されない。
上述のように、本発明において変性工程は、特異的にターゲット核酸配列を検出するチェックポイントの一つである。
最終的に、第１プローブ及び第２プローブのライゲーション結果物上の標識から出るシグナルが検出されて、ターゲット核酸配列の存在が確認される。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の固相方法は、工程（ｄ）以前に、固定化プローブにライゲーションされなかった非固定化プローブの除去のために、工程（ｃ）の結果物を洗浄する工程をさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、工程（ａ）−（ｃ）又は（ａ）−（ｄ）を反復する工程をさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）に利用されるターゲット核酸配列は、増幅プライマーにより前増幅された核酸配列である。好ましくは、増幅プライマーは、一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する。
前増幅されたターゲット核酸配列は、工程（ａ）−（ｃ）に対する反応環境（又は反応容器（ｖｅｓｓｅｌ））と異なる反応環境（又は反応容器）で前増幅されたターゲット核酸配列を含むことができる。選択的に、前増幅されたターゲット核酸配列は、工程（ａ）−（ｃ）に対する反応環境（又は反応容器（ｖｅｓｓｅｌ））と同一な反応環境（又は反応容器）で前増幅されたターゲット核酸配列を収得することができる。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）、第１プローブは、少なくとも２種のプローブを含み（好ましくは少なくとも３種であり、より好ましくは少なくとも５種である）、かつ第２プローブは、少なくとも２種のプローブを含む（より好ましくは少なくとも３種であり、さらに好ましくは少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含み、より好ましくは、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）である。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列上のヌクレオチド変異は、第２プローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する。
ＩＶ．液相又は固相におけるハイブリダイゼーションによる蛍光シグナル変化によるターゲット検出方法
本発明のまた他の様態によると、本発明は、以下の工程を含み、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列とＴＤプローブをハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、前記ＴＤプローブは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に蛍光レポーター分子で標識され、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導できず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別する。）
（ｂ）前記蛍光変化を検出する工程であって、前記蛍光変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
本発明は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の他のハイブリダイゼーションパターンを利用するため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
単一蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）−標識オリゴヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖状態で異なる蛍光放出を発生させるということが開示されている（参考；米国特許第７，３４８，１４１号及び第７，５３７，８８６号）。
本発明者らは、ＴＤプローブがその５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に単一蛍光レポーター分子で標識される場合、ターゲット又は非ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションによって異なる蛍光強度が発生されることを見出した。
最終的に検出される、蛍光レポーターから出る蛍光の変化は、蛍光の増加だけではなく、減少も含む。変化が検出される蛍光の種類は、蛍光強度、蛍光極性、蛍光寿命及び蛍光の量子収率を含むが、これらに限定されるものではない。最も好ましくは、検出される蛍光は、蛍光レポーター分子から出る蛍光の強度である。
ターゲット配列とのハイブリダイゼーションによって蛍光レポーターから出る蛍光の変化は、標識の種類及び位置のような幾つかの要因に依存的であり、これは、米国特許第７，３４８，１４１号及び第７，５３７，８８６号に開示されている。
本発明で利用される蛍光レポーター分子は、上述の本明細書の詳細な説明を参照して説明できる。本発明の好ましい具現例によると、蛍光レポーター分子は、フルオレセインベース分子（例えば、ＪＯＥ、ＴＥＴ又はＦＡＭ）、ローダミンベース分子（例えば、ＴＡＭＲＡ又はＲＯＸ）又はＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０である。
蛍光レポーター分子は、ＴＤプローブにおいて、ターゲット及び非ターゲット配列に対する最も大きい区別能を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に位置する。本明細書全般にかけて記載されたように、５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーション挙動は、ターゲット配列と非ターゲット配列を区分する最も決定的な要因である。
蛍光レポーター分子は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位の５’−末端、３’−末端又は内部ヌクレオチド（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）上に位置する。より好ましくは、蛍光レポーター分子は、内部ヌクレオチド上に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、蛍光レポーター分子は、ウラシル残基に連結される。
本発明の好ましい具現例によると、蛍光変化は、指定温度（Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）又は一定範囲の温度で観察される。
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、前記ＴＤプローブ、逆方向プライマー及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを共に利用して行われ、これにより、前記ＴＤプローブとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列が追加的に生成され、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光変化を増加させる。
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、ＴＤプローブ、正方向プライマー及び逆方向プライマーの二つのプライマーからなる一対のプライマー、及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを利用して行われ、ＴＤプローブとハイブリダイズするターゲット核酸配列は、ＰＣＲにより増幅され、ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光変化を向上させる。
あるいは、ＴＤプローブは、レポーター分子の蛍光をクエンチャーできるクエンチャー分子で追加的に標識される。ＴＤプローブ又はＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位がターゲット核酸配列とハイブリダイズしなかった場合は、前記クエンチャーがレポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置する。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブ又はＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位がターゲット核酸配列とハイブリダイズしない場合、前記クエンチャーがレポーター分子の蛍光を構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ）にクエンチングするように位置する。
本発明の好ましい具現例によると、クエンチャー分子は、蛍光であり、検出されるターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、蛍光クエンチャー分子から出るシグナルである。
本発明が、逆方向プライマー又は一対のプライマーを利用して行われる場合、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない熱安定性ポリメラーゼであり、これは、Ｔａｑポリメラーゼのストッフェル断片（Ｓｔｏｆｆｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ）（Ｆ Ｃ Ｌａｗｙｅｒら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２：２７５−２８７（１９９３））及びＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼの突然変異型を含む（米国特許第５８８５８１３号）。これらの例は、下記の通りである：ＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ），Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ），Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ），Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔｆｉ Ｅｘｏ（−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），Ａｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼｓｔｏｆｆｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＡＢＩ），Ｅｘｏ−Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）。
また、本発明の方法は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がある熱安定性ポリメラーゼを利用して行うことができる。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、液相又は固相で行われる。本発明の方法が固相で行われる場合、ＴＤプローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化される。
Ｖ．ターゲット配列を区別できるプローブの設計及び製造
本発明のまた他の様態によると、以下の工程を含み、プローブ分子が非ターゲット核酸配列からターゲット核酸配列を区別するようにする方法を提供する：
（ａ）ターゲット核酸配列を選択する工程と、
（ｂ）プローブ分子の配列を設計する（ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ）工程であって、これにより、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列及び（ｉｉ）少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位を有して、前記分割部位は、ハイブリダイゼーション配列内に存在し、前記プローブ分子の三つの部位を形成する工程と、
（ｃ）前記分割部位の前記５’−方向にある部位は、前記分割部位の３’−方向にある部位より低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有するように前記プローブ分子の前記分割部位位置を決定する工程であって、これにより、それぞれ異なるＴｍ値を有する三つの部位を有するプローブ分子が提供されて、前記三つの部位において、（ｉ）前記プローブ分子の５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有し、（ｉｉ）前記プローブ分子の３’−第１ハイブリダイゼーション部位は、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、（ｉｉｉ）前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位と前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位との間にある前記プローブ分子の分割部位は、少なくとも三つのユニバーサル塩基を有して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、これにより、前記プローブ分子は、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別する工程。
本発明の方法は、ターゲット配列に対するプローブの区別能を著しく増加させる新規な接近法を提供する。また、本発明の方法は、ターゲット配列に対するプローブの区別能を改善させる方法として表現することができる。
本発明の方法は、本明細書で論議されたＴＤプローブを製造するために行われる。したがって、その共通する内容は、本明細書の不要な重複をさけるためにその記載を省くが、前記記載事項は、反復記載されたも同然、本明細書に取り込まれる。
本発明の方法は、オリゴヌクレオチド配列自体に新規な特徴を導入することにより、区別能を増加させる新規な戦略を提供し、これは、新規なプローブがターゲット及び非ターゲット配列に対して、互いに異なるハイブリダイゼーション挙動を表すようにする。
本発明の方法において、プローブ分子の配列を設計することは、非常に重要なことである。前記プローブ分子は、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列及び（ｉｉ）少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位を有し、前記分割部位は、ハイブリダイゼーション配列内に存在し、プローブ分子の三つの部位を形成する。
この工程で、オリゴヌクレオチドの構造的形態が提供され、オリゴヌクレオチドに５’−末端部位／分割部位／３’−末端部位を有するようにする。５’−末端部位及び３’−末端部位は、両方ともターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有し、前記二つの部位間に分割部位が介入するようになる。
本発明において最も重要な工程は、プローブ内分割部位の位置を決定することであり、これは、分割部位の５’−方向にある部位が、分割部位の３’−方向にある部位より低いＴｍを有するようにして、分割部位は、三つの部位のうち、最も低いＴｍを有するようにして、これにより、それぞれ異なるＴｍ値を有する三つの部位を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明の方法によりオリゴヌクレオチドに導入される新規な構造的特徴は、下記の通りである：（ｉ）オリゴヌクレオチド配列において三つの異なる部位（５’−第２ハイブリダイゼーション部位、分割部位及び３’−第１ハイブリダイゼーション部位）；（ｉｉ）三つの部位の異なるＴｍ値；（ｉｉｉ）５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び３’−第１ハイブリダイゼーション部位の間に少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位；（ｉｖ）ハイブリダイゼーションにおいてターゲットとの分子的相互作用に関与する二つの部位、前記二つの部位は、ハイブリダイゼーション過程で分割部位により分離される；（ｖ）３’−第１ハイブリダイゼーション部位、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び分割部位順のＴｍ値。このような構造的特徴は、プローブのハイブリダイゼーションがターゲット配列及び非ターゲット配列に対して明確に相異なる方式で起こるようにして、これは、ターゲット配列に対するプローブのハイブリダイゼーション特異性を極めて増加させる。
ＶＩ．ターゲット検出のためのキット
１．液相におけるターゲット検出のためのキット
本発明のまた他の様態によると、本発明は、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供し、これは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別するようにする上記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を含む。
本発明のキットは、前述した本発明の検出方法を実施するために製作されるため、その重複する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブは、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識又は多数の標識を含む相互作用的標識システムを有する。
より好ましくは、相互作用的標識システムは、ＴＤプローブ上に位置したレポーター分子及びクエンチャー分子から構成された一対である。
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、両方とも５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又はレポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブは、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位にレポーター分子及びクエンチャー分子のうち一つを有し、その３’−第１ハイブリダイゼーション部位に他の一つを有する。
本発明の好ましい具現例によると、前記キットは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、キットは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸配列ポリメラーゼ、及びＴＤプローブのハイブリダイゼーション位置の下流位置にハイブリダイズする上流プライマーと逆方向プライマーのうち、少なくとも一つのプライマーをさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、増幅プライマーを利用して前増幅された核酸配列であり、キットは、増幅プライマーをさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、ＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含み、かつ上流プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含むか、又は逆方向プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異は、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に存在する。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブは、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位は、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する。
２．固相におけるターゲット検出のためのキット
本発明のまた他の様態によると、以下を含み、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する：
（ａ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する前記ＴＤプローブであって、前記ＴＤプローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化されて、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するプローブと、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、前記ＴＤプローブは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記標識は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方とも前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記非ターゲット核酸配列から前記ターゲット核酸配列を区別する。）
（ｂ）前記固相基質。
本発明のキットは、前述した本発明の検出方法を実施するために製作されるため、その重複する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。
本発明の好ましい具現例によると、標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である。より好ましくは、標識は、相互作用的標識システムは、ＴＤプローブ上に位置したレポーター分子及びクエンチャー分子から構成された一対であり、ＴＤプローブは、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置（ｓｉｔｅ）に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のうち一つを有し、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない一位置に他の一つを有する。
本発明の好ましい具現例によると、クエンチャー分子の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置（ｓｉｔｅ）に位置し、前記蛍光レポーター分子は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置し、ＴＤプローブがターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、ＴＤプローブ上の前記クエンチャー分子から蛍光レポーター分子が解離されて蛍光シグナルが発生し、ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’−第２ハイブリダイゼーション部位が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが表れず、これによりターゲット核酸配列の存在が決定されるように固相基質上の蛍光シグナルが検出される。
本発明の好ましい具現例によると、キットは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含み、ターゲット核酸配列上のヌクレオチド変異は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブは、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位は、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する。
３．ＰＣＲを利用したターゲット検出用キット
本発明のまた他の様態によると、以下を含み、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する：
（ａ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する前記ＴＤプローブと、
（ｂ）それぞれ前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する上流プライマー及び逆方向プライマーとして二つのプライマーからなる一対のプライマー；
前記ＴＤプローブは、前記二つのプライマー間の位置にハイブリダイズし、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングするクエンチャー分子で二重標識され、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置し、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方とも前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別する）。
本発明の好ましい具現例によると、キットは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼをさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、増幅プライマーを利用して前増幅された核酸配列であり、キットは、増幅プライマーをさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、ＴＤプローブは、少なくとも２種のプローブを含み、正方向プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み、かつ逆方向プライマーが少なくとも２種のプライマーを含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、正方向プライマー、逆方向プライマー又は増幅プライマーは、一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブは、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位は、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＤプローブのブロッカー部位は、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位上に位置する。より好ましくは、ＴＤプローブのブロッカー部位は、分割部位の３’−末端に隣接して位置する。
本発明の好ましい具現例によると、ブロッカー部位は、１〜１０ブロッカーを含む。
４．ライゲーション反応を利用したターゲット検出用キット。
本発明のまた他の様態によると、以下を含み、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ライゲーション反応によりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する：
（ａ）ターゲット核酸配列の第１位置に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する第１プローブと、
（ｂ）第１位置の上流に位置する前記ターゲット核酸配列の第２位置に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する第２プローブ；
前記第１プローブ及び前記第２プローブの少なくとも一つは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記第２プローブは、ＴＤプローブであり、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する：
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記第１プローブ及び前記第２プローブのライゲーションが起こり、前記第２プローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記第１プローブ及び前記第２プローブがライゲーションされず、これにより、前記第２プローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別する）。
本発明の好ましい具現例によると、キットは、ターゲット核酸配列とハイブリダイズした第１プローブ及び第２プローブをライゲーションするリガーゼをさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である。
本発明の好ましい具現例によると、標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含む相互作用的標識システムである。
本発明の好ましい具現例によると、第１プローブは、一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する。
本発明の好ましい具現例によると、利用されたターゲット核酸配列は、増幅プライマーを利用して前増幅された核酸配列であり、キットは、増幅プライマーをさらに含む。
本発明の好ましい具現例によると、キットは、固相で利用されて、前記第１プローブは、その５’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化されており、第２プローブは、固定化されない。
本発明の好ましい具現例によると、キットは、固相で利用されて、前記第２プローブは、その３’−末端を通じて前記固相基質の表面上に固定化されており、前記第１プローブは、固定化されない。
本発明の好ましい具現例によると、第１プローブ及び第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションする場合、第１プローブ及び第２プローブは、互いに直接隣接した位置に位置する。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ第１プローブ及び第２プローブのそれぞれは、少なくとも２種のプローブを含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異は、第２プローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に存在する。
５．ハイブリダイゼーションベースのターゲット検出用キット
本発明のまた他の様態によると、以下を含み、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する：
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）は、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別することができる下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する：
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位（５’−ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位（３’−ｆｉｒｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、前記ＴＤプローブは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に蛍光レポーター分子で標識され、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導して、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導できず、これにより、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
本発明の好ましい具現例によると、本発明のキットは、ＴＤプローブにハイブリダイズするターゲット核酸配列を追加的に生成するために、逆方向プライマー及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを含み、これは、ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光の変化を増加させる。
好ましくは、キットは、ＴＤプローブにハイブリダイズするターゲット核酸配列をＰＣＲで増幅させるために、正方向プライマー及び逆方向プライマーの二つのプローブから構成された一対のプライマー及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを含み、これは、ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光の変化を増加させる。
あるいは、ＴＤプローブは、レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子で追加的に標識される。クエンチャーは、ＴＤプローブがターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションに関与しない場合は、ＴＤプローブ上で自発的クエンチング（Ｓｅｌｆ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）を誘導することができるように位置する。
本発明のキットが逆方向プライマー又は一対のプライマーを含む場合、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない熱安定性ポリメラーゼであり、これは、Ｔａｑポリメラーゼのストッフェル断片（Ｓｔｏｆｆｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ）（Ｆ Ｃ Ｌａｗｙｅｒら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２：２７５−２８７（１９９３））及びＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼの突然変異型を含む（米国特許第５８８５８１３号）。
本発明のキットは、液相用又は固相用である。
本明細書で詳述した本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。任意に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。また、キットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必須的な試薬を含むことができる。ある一つの特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、上記言及された構成成分を含む別途の包装又は区分で製作される。
本発明の特徴と利点は、以下のように要約できる：
（ａ）ｍＤＳＯ構造を有するＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び３’−第１ハイブリダイゼーション部位を含むその全体的な配列を通じてターゲット核酸配列とハイブリダイズし、これは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び３’−第１ハイブリダイゼーション部位を含む。ＴＤプローブのターゲット特異ハイブリダイゼーションの条件下で、ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その３’−第１ハイブリダイゼーション部位が非ターゲット核酸配列と非特異性結合をするが、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び分割部位が両方とも非ターゲット核酸配列にハイブリダイズせず、一本鎖を形成して、これは、低いＴｍ値に起因する。
上述のように、ＴＤプローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とに対して、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションパターンに差があり、これは、より高い特異性でターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別するようにする。
（ｂ）ＴＤプローブを利用したターゲット検出応用は、極めて改善されたターゲット−特異性を示し、これは、下記のようなターゲット−監視イベント（ｔａｒｇｅｔ−ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｅｖｅｎｔ）に起因する：第一に、上述のように、ターゲット及び非ターゲット核酸配列に対してそれぞれ異なるハイブリダイゼーションパターンを有するＴＤプローブは、非常に高い特異性でターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することができる。第二に、連続的な酵素反応（５’→３’エキソ核酸切断反応又はライゲーション）の発生は、ＴＤプローブのハイブリダイゼーションパターンによって決定されて、これは、ターゲット検出過程において、ターゲット特異性を上昇させる。
（ｃ）ＴＤプローブのハイブリダイゼーションパターンの差によるターゲット区別性特徴は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したターゲット検出方法に成功的に適用されることにより、擬陽性シグナル（結果）生成を完璧に防止する。例えば、５’−末端部位に標識を含む従来プローブがその５’−部位で非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により５’−部位が切断されて、擬陽性シグナルを発生させることができる。これと異なって、ＴＤプローブは非ターゲット核酸配列にハイブリダイズしても、５’−第２ハイブリダイゼーション部位はハイブリダイズしないため、擬陽性シグナルが発生しない。
（ｄ）ターゲット核酸配列の検出のためのリアルタイムＰＣＲ方法において、レポーター分子及びクエンチャー分子が両方とも５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、あるいはそれぞれ５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び分割部位に位置するＴＤプローブは、卓越な擬陽性シグナル生成防止効果を示す。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ方法のような従来の技術は、特にマルチプレックスターゲット検出時に擬陽性シグナルがさらに問題になるが、本発明は、レポーター分子及びクエンチャー分子を両方とも５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置させたＴＤプローブを使用することにより、このような問題を効果的に克服する。また、前述した５’−第２ハイブリダイゼーション部位に二重標識があるＴＤプローブを使用することにより、使用されるポリメラーゼの種類及び反応条件によって問題になりえるポリメラーゼの５’→３’エンドヌクレアーゼに係わる短所を克服することができる。
（ｅ）ＴＤプローブの独特のハイブリダイゼーションパターンは、ライゲーション活性を利用したターゲット検出方法における擬陽性シグナルを卓越に抑制する。一般に、二つのプローブ（上流第１プローブ及び下流第２プローブ）のライゲーションによりターゲット核酸配列を検出する方法は、ライゲーションのために両プローブの隣接末端部位が二重鎖（二合体）を形成しなければならない。第２プローブとしてＴＤプローブを使用する本発明のライゲーションアッセイにおいて、ＴＤプローブが非ターゲット配列にハイブリダイズする場合、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位は一本鎖を形成することにより、ライゲーション反応が防止されて、擬陽性シグナルが発生しない。
（ｆ）５’−第２ハイブリダイゼーション部位の他のハイブリダイゼーションパターンを利用することにより、ＴＤプローブは、単一塩基変異を区別する卓越な特異性を提供する。ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位と核酸配列間にただ一つのミスマッチ塩基がある場合でも、ＴＤプローブは非ターゲットと認識し、５’−第２ハイブリダイゼーション部位がハイブリダイズせず、一本鎖を形成して、擬陽性シグナルが発生しない。したがって、ＴＤプローブは、ＳＮＰ検出において非常に優れた区別能を有する。
（ｇ）ＴＤプローブは、固相で使用されて、正確で且つ大容量のターゲット核酸配列検出用マイクロアレイシステムを具現することができるようにする。従来のプローブを利用したマイクロアレイシステムは、非特異ハイブリダイゼーションにより擬陽性シグナルが発生する問題がある。これとは対照的に、５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションパターンの差からターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別するＴＤプローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（又はライゲーション活性）による本発明の固相アッセイは、リアルタイム方式でターゲット核酸配列を検出できるようにするだけではなく、正確で且つ迅速にターゲット核酸配列を検出する。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
実施例１：５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の５’−末端ミスマッチプローブに対する切断活性評価
本発明者らは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が５’−末端部位にミスマッチされたヌクレオチドを有するプローブを切断できるかどうかを実験した。
この評価を実験するために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。５個の異なる類型の二重−標識（ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ）プローブを利用し、それらは、それぞれ５’−末端部位にマッチング（ｍａｔｃｈｉｎｇ）配列、１個のミスマッチヌクレオチド、３個のミスマッチヌクレオチド、６個のミスマッチヌクレオチド及び９個のミスマッチヌクレオチドを含む。前記二重ヌクレオチドを含む。前記二重−標識プローブは、蛍光レポーター分子として５’−末端部位に６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を有しており、クエンチャー分子として３’−末端部位にＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １）を有している。前記二重−標識プローブは、それの３’−末端部位にあるＣ３スペーサーにより変形（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）されたが、このような二重−標識プローブは、延長されない。
前記二重−標識プローブ及び鋳型（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子）の５’→３’エキソ核酸切断反応（５’→３’ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程でシグナルを測定した。
本実施例で利用されたＳ． ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成鋳型及び二重−標識プローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、ミスマッチヌクレオチドを示す。）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する合成オリゴヌクレオチド０．２ｐｍｏｌｅ、二重−標識プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２，３，４，５又は６）５ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス１０μＬを含有した２０μＬの最終容量でエキソ核酸切断反応を行った。前記マスターミックスは、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ及びＤｉａＳｔａｒ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔが含有されている；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後、９５℃で２０秒間及び６０℃で６０秒間過程を４０回繰り返した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程（６０℃）で発生されたシグナルを検出した。
図８に示されたように、５’−末端部位にマッチング配列を有する二重−標識プローブ及び５’−末端部位に１個ミスマッチヌクレオチドを有する二重−標識プローブが利用される場合、ＳＡに対する蛍光シグナルが発生した（ＮＯｓ．１及び３）。一方、５’−末端部位に少なくとも３個のミスマッチヌクレオチドを有する二重−標識プローブを利用する場合は、ＳＡに対する如何なる蛍光シグナルも得られなかった（ＮＯｓ．５、７及び９）。鋳型のない陰性対照群の場合、シグナルもなかった（ＮＯｓ．２、４、８及び１０）。
このような結果は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’−末端部位に少なくとも３個のミスマッチヌクレオチドを有する二重−標識プローブを切断しないということを示す。
実施例２：５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したターゲット核酸配列及び非ターゲット核酸配列の区別に対する二重−標識ＴＤプローブの評価
二重−標識ＴＤプローブが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して非ターゲット核酸配列からターゲット核酸配列を区別できるかどうかについて、本発明のＴＤプローブを評価した。
まず、本発明者らは、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位（ｓｅｃｏｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）の相異なるハイブリダイゼーションパターンによりターゲット−特異シグナルが発生するかを確認した。
この評価を実験するために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。各遺伝子に対するＴＤプローブの二つの異なる類型は、それぞれ５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列及びミスマッチ配列を有する。二重−標識ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子として５’−末端に６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を有しており、クエンチャー分子として３’−第１ハイブリダイゼーション部位にＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １）を有している。前記二重−標識プローブは、それの３’−末端にあるＣ３スペーサーにより変形（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）されたが、そのような二重−標識プローブは、延長されない。
前記二重−標識ＴＤプローブ及び前記ターゲット鋳型（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ又はＮ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子）の５’→３’エキソ核酸切断反応のために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程でシグナルを測定した。
Ａ．ＴＤプローブを利用したＳ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対するターゲット−特異シグナルの発生
本実施例で利用されたＳ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成鋳型及び二重−標識ＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、ミスマッチヌクレオチドを示す。）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する合成オリゴヌクレオチド０．２ｐｍｏｌｅ、二重−標識プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又は８）５ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス１０μＬを含有した２０μＬの最終容量でエキソ核酸切断反応を行った。前記マスターミックスは、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ及びＤｉａＳｔａｒ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔが含有されている；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、９５℃で２０秒間及び６０℃で６０秒間過程を４０回繰り返した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程（６０℃）で発生されたシグナルを検出した。
図９Ａに示されたように、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する二重−標識プローブが利用される場合、ＳＡターゲット核酸配列に対する蛍光シグナルが発生した（ＮＯ．１）。一方、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有する二重−標識ＴＤプローブを利用する場合は、ＳＡターゲット核酸配列に対する如何なる蛍光シグナルも得られなかった（ＮＯ．３）。鋳型のない陰性対照群の場合、シグナルもなかった（ＮＯｓ．２及び４）。
Ｂ．ＴＤプローブを利用したＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子に対するターゲット−特異シグナル発生
本実施例で利用されたＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子に対する合成鋳型及び二重−標識ＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、前記ミスマッチされたヌクレオチドを示す。）
鋳型（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ２ｐｍｏｌｅ）及び二重−標識ＴＤプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又は１１）を除いては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して利用されたものと同一なプロトコールでエキソ核酸切断反応を行った。
図９Ｂに示されたように、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する二重−標識プローブが利用される時、ＮＧターゲット核酸配列に対する蛍光シグナルが発生した（ＮＯ．１）。一方、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有する二重−標識ＴＤプローブを利用する場合は、ＮＧターゲット核酸配列に対する如何なる蛍光シグナルも得られなかった（ＮＯ．３）。鋳型のない陰性対照群の場合、シグナルもなかった（ＮＯｓ．２及び４）。
このような結果は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションに依存的なＴＤプローブのターゲットシグナル発生を示し、これは、ＴＤプローブがターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別できることを示す。
実施例３：ＴＤプローブ及び従来プローブの５’−末端部位の効果
従来プローブの５’−末端部位がＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位と同一な効果を有するかどうかについて調べた。
この実験のために、二つの異なる形態のＴＤプローブを利用した；一つのＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有して、他の一つは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に３個のミスマッチヌクレオチドを有する。従来プローブは、デオキシイノシン（ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ）を除いては、前記ＴＤプローブと同一な配列を有する。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。前記従来プローブ及びＴＤプローブは、それぞれ蛍光レポーター分子として５’−末端に６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を有しており、クエンチャー分子として３’−末端部位にＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １）を有している。全てのプローブは、それの３’−末端にあるＣ３スペーサーにより修飾（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）されている。
前記二重−標識ＴＤプローブ及び前記ターゲット鋳型（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の５’→３’エキソ核酸切断反応のために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用した。
本実施例で利用されたＳ． ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成鋳型及び二重−標識従来プローブ及びＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、前記ミスマッチされたヌクレオチドを示す。）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する合成オリゴヌクレオチド０．２ｐｍｏｌｅ、前記二重−標識ＴＤプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１２、１３又は１４）５ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス１０μＬを含有した２０μＬの最終容量でエキソ核酸切断反応を行った。前記マスターミックスは、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ及びＤｉａＳｔａｒ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔが含有されている；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、９５℃で２０秒間及び６０℃で６０秒間過程を４０回繰り返した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程（６０℃）で発生されたシグナルを検出した。
図１０に示されたように、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する二重−標識ＴＤプローブが利用される場合、ターゲット核酸配列に対する蛍光シグナルが発生した（ＮＯ．１）。一方、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に３個のミスマッチヌクレオチドを有するＴＤプローブを利用する場合は、如何なる蛍光シグナルも得られなかった（ＮＯ．３）。逆に、５’−末端部位に３個のミスマッチヌクレオチドを有する従来プローブだけではなく、５’−末端部位にマッチング配列を有する従来プローブが利用される時も（ＮＯ．５及び７）、シグナルが発生された。鋳型のない陰性対照群の場合、シグナルもなかった（ＮＯｓ．２、４、６及び８）。
このような結果は、ＴＤプローブとは対照的に、従来プローブは、非特異ハイブリダイゼーションにおいて擬陽性シグナルを発生させるということを示す。したがって、ＴＤプローブは、擬陽性シグナル無しにターゲット核酸配列を検出できるということが分かる。
実施例４： ターゲット核酸配列の検出のためにＴＤプローブを利用したリアルタイムＰＣＲ
本発明者らは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用しつつ、ターゲット核酸配列の検出のために、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）にＴＤプローブを適用した。
この適用のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡを各細胞株から抽出して利用した。ＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列又はミスマッチ配列を有する。レポーター分子及びクエンチャー分子は、両方とも二重−標識ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置する。
Ａ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子の検出のためのリアルタイムＰＣＲ
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子のターゲット核酸配列を鋳型として利用する時、本実施例で利用されたプライマー配列及び二重−標識ＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、前記ミスマッチされたヌクレオチドを示す。）
Ｓ．ａｕｒｅｕゲノムＤＮＡ １ｎｇ、二重−標識ＴＤプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７又は１８）５ｐｍｏｌｅ、正方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）１０ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）１０ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス１０μＬを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲ反応を行った。前記マスターミックスは、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ及びＤｉａＳｔａｒ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔが含有されている；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、９５℃で２０秒間及び６０℃で６０秒間過程を４０回繰り返した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程（６０℃）で発生されたシグナルを検出した。
図１１Ａに示されたように、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する前記二重−標識ＴＤプローブが利用される場合、Ｓ．ａｕｒｅｕ遺伝子に対するターゲット蛍光シグナルが発生した（ＮＯ．１）。一方、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有する二重−標識ＴＤプローブを利用する場合は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子のターゲット核酸配列に対する蛍光シグナルが得られなく（ＮＯ．３）、これは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置しているレポーター分子及びクエンチャー分子が分離されなかったことを示す。鋳型のない陰性対照群の場合、シグナルがなかった（ＮＯｓ．２及び４）。
Ｂ．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの検出のためのリアルタイムＰＣＲ
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子のターゲット核酸配列を鋳型として利用する時、本実施例で利用されたプライマー配列及び二重−標識ＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、前記ミスマッチされたヌクレオチドを示す。）
鋳型（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １ｎｇ）、二重−標識ＴＤプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２１及び２２）及びプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１９及び２０）を除いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して利用されたものと同一なプロトコールでリアルタイムＰＣＲ反応を行った。
図１１Ｂに示されたように、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する二重−標識ＴＤプローブが利用される場合、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子に対するターゲット蛍光シグナルが発生した（ＮＯ．１）。一方、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有する二重−標識ＴＤプローブを利用する場合は、Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子のターゲット核酸配列に対する蛍光シグナルが得られなく（ＮＯ．３）、これは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置しているレポーター分子及びクエンチャー分子が分離されなかったことを示す。鋳型のない陰性対照群の場合、シグナルがなかった（ＮＯｓ．２及び４）。
このような結果は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に相互作用的標識システムを有するＴＤプローブが、非ターゲット核酸配列からターゲット核酸配列を区別するためのリアルタイムＰＣＲに利用できるということを示す。
実施例５：リアルタイムＰＣＲ反応において、二重−標識ＴＤプローブを利用した単一ヌクレオチド変異の検出
本発明者らは、ＴＤプローブが核酸配列上の単一ヌクレオチド変異を区分できるかどうかについて調べた。
この実験のために、ＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列又は単一ミスマッチヌクレオチドを有する。レポーター分子及びクエンチャー分子は、両方とも二重−標識ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置する。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡを鋳型として利用した。本実施例で利用されたプライマー配列及び二重−標識ＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
Ｓ．ａｕｒｅｕゲノムＤＮＡ ５００ｐｇ、二重−標識ＴＤプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３又は２４）５ｐｍｏｌｅ、正方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）１０ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）１０ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス１０μＬを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲ反応を行った。前記マスターミックスは、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ及びＤｉａＳｔａｒ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔが含有されている；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、９５℃で２０秒間及び６３℃で６０秒間過程を４０回繰り返した。各サイクルの前記ハイブリダイゼーション工程（６３℃）で発生されたシグナルを検出した。
図１２に示されたように、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する二重−標識ＴＤプローブが利用される場合、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する蛍光シグナルが発生した（ＮＯ．１）。一方、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に単一ミスマッチヌクレオチドを有する二重−標識ＴＤプローブを利用する場合は、蛍光シグナルが得られなかった（ＮＯ．３）。鋳型のない陰性対照群の場合、シグナルがなかった（ＮＯｓ．２及び４）。
このような結果は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に単一ヌクレオチドミスマッチがある場合も、ＴＤプローブが異なるハイブリダイゼーションパターンを表すことを示す。したがって、ＴＤプローブは、リアルタイムＰＣＲで擬陽性シグナル無しに、ＳＮＰを含んだ単一ヌクレオチド変異を区別する高い特異性を有するということを把握することができる。
実施例６：５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した固相における固定化ＴＤプローブの評価
本発明者らは、固相で固定化Ｔｄプローブ（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＴＤ ｐｒｏｂｅ）が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して、非ターゲット核酸配列からターゲット核酸配列を区別できるかどうかについてさらに評価した。
この評価のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。ＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列又はミスマッチ配列を有する。ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子として３’−第１ハイブリダイゼーション部位にＱｕａｓａｒ５７０を有しており、クエンチャー分子として５’−末端にＢＨＱ−２（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２）を有しており、リンカーとしてポリ（Ｔ）７を有する。前記二重−標識ＴＤプローブは、３’−末端のアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）を利用して固相基質（ｓｏｌｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の表面上に固定した。５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを５’→ ３’エキソ核酸切断反応に利用した。
本実施例で利用された合成鋳型配列及び二重−標識ＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、ミスマッチヌクレオチドを示す。）
ＴＤプローブの二つの異なる類型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５及び２６）をＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）上に固定化させた。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度２０μＭになるように溶解させたＴＤプローブを、ＯｍｎｉＧｒｉｄ Ａｃｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（ＤＩＧＩＬＡＢ、ＵＳ）を利用してＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリントした。それぞれのＴＤプローブを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合されたＴＤプローブを除去するために、前記スライドを２ｘＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有したバッファー溶液に３７℃で１０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
ＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する合成オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー３μＬ、各１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．６μＬ及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）２ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量で、ＤＮＡ−機能化されたスライドの表面上でエキソ核酸切断反応を行った。ＴＤプローブが交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ ｓｉｔｕブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に位置させた。エキソ核酸切断反応を５０℃で３０分間行って、９５℃で蒸留水で１分間洗浄して停止させた。イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、５−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ５．１ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。各スポットの再現性を調べるために、２回反復実験を行った。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
図１３に示されたように、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する二重−標識ＴＤプローブ及び鋳型を利用した場合、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する蛍光シグナルが発生した（ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿Ｍ、ＲＦＵ ６５４７２．０±４．２）。一方、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にミスマッチ配列を有する二重−標識ＴＤプローブを利用した場合は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する蛍光シグナルが得られなかった（ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿ｍ、ＲＦＵ ３２２７．０±１７．０）。鋳型のない陰性対照群の場合、シグナルがなかった（ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿Ｍ、ＲＦＵ ２７９８．０±４．２又はＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿ｍ、ＲＦＵ ３０７７．０±９．９）。
このような結果は、前記固定化ＴＤプローブがマイクロアレイに適用されて、非ターゲット核酸配列からターゲット核酸配列を区別することができることを示す。
実施例７：固定化ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の効果
本発明者らは、固定化ＴＤプローブが５’−第２ハイブリダイゼーション部位の効果により固相で擬陽性シグナルを除去できるかどうかについてさらに実験した。
この実験のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。ＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列又は３個のミスマッチ配列を有する。従来プローブは、デオキシイノシンを除いては、ＴＤプローブと同一な配列を有する。前記ＴＤプローブ及び従来プローブは、蛍光レポーター分子として３’−第１ハイブリダイゼーション部位にＱｕａｓａｒ５７０を有しており、クエンチャー分子として５’−末端にＢＨＱ−２（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２）を有しており、リンカーとしてポリ（Ｔ）７を有する。前記二重−標識ＴＤプローブは、３’−末端のアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）により固相基質の表面上に固定した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを５’→３’エキソ核酸切断反応に利用した。
本実施例で利用された合成鋳型、二重−標識ＴＤプローブ及び従来プローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、ミスマッチヌクレオチドを示す。）
前記プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２７、２８及び２９）をＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）上に固定化させた。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度２０μＭになるように溶解させた各プローブを、ＯｍｎｉＧｒｉｄ Ａｃｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（ＤＩＧＩＬＡＢ、ＵＳ）を利用してＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリントした。それぞれのプローブを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合されたプローブを除去するために、前記スライドは、２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有したバッファー溶液に３７℃で１０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
ＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する合成オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー３μＬ、各１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．６μＬ及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）２ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量で、ＤＮＡ−機能化されたスライドの表面上でエキソ核酸切断反応を行った。プローブが交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ ｓｉｔｕブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に位置させた。エキソ核酸切断反応を５０℃で３０分間行って、９５℃で蒸留水で１分間洗浄して停止させた。イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、５−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ５．１ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。各スポットの再現性を調べるために、２回反復実験を行った。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
図１４に示したように、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する前記二重−標識固定化プローブ及び鋳型を利用した場合、ＳＡのターゲット核酸配列に対する蛍光シグナルが発生した（ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿Ｍ、ＲＦＵ：６５４６７．０±５．７）。５’−第２ハイブリダイゼーション部位に３個のミスマッチヌクレオチドを有するＴＤプローブを利用する場合、シグナルが得られなかった（ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿ｍ１、ＲＦＵ：６６７９．５±２２２．７）。一方、マッチング配列（ＳＡ＿Ｃｏｎ＿Ｃｈｉｐ＿Ｍ、ＲＦＵ：６５４６４．５±６．４）を有する前記従来プローブだけではなく、３個のミスマッチヌクレオチド（ＳＡ＿Ｃｏｎ＿Ｃｈｉｐ＿ｍ１、ＲＦＵ：６５４６４．０±５．７）を有する従来プローブを利用する時、シグナルが発生した。鋳型のない陰性対照群の場合、シグナルがなかった（ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿Ｍ、ＲＦＵ：２７１６．５±１２．０） （ＳＡ＿ＴＤ１＿Ｃｈｉｐ＿ｍ１、ＲＦＵ：２８１０．５±１４．８） （ＳＡ＿Ｃｏｎ＿Ｃｈｉｐ＿ｍ１、ＲＦＵ：３２１６．５±４１．７） （ＳＡ＿Ｃｏｎ＿Ｃｈｉｐ＿Ｍ、ＲＦＵ：２７４９．５±１９．１）。
このような結果は、固定化ＴＤプローブとは反対に、従来固定化プローブは、非特異ハイブリダイゼーションにより擬陽性シグナルを発生させるということを示す。したがって、固定化ＴＤプローブが擬陽性シグナル無しにターゲット核酸配列を検出できるということが分かる。
実施例８：固相基質の表面上に固定化された単一−標識ＴＤプローブを利用したターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、固相におけるターゲット核酸配列の検出のために単一−標識ＴＤプローブをさらに利用した。
この評価のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。ＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列又はミスマッチ配列を有する。前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子として５’−末端に６−ＦＡＭ又は６−ＴＡＭＲＡ（６−Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を有しており、リンカーとしてポリ（Ｔ）７を有する。前記単一−標識ＴＤプローブは、３’−末端のアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）を利用して固相基質（ｓｏｌｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の表面上に固定した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＢｓｔ又はＴａｑポリメラーゼを５’→３’エキソ核酸切断反応に利用した。
Ａ．エキソ核酸切断反応によるシグナル発生
本実施例で利用された合成鋳型配列及び単一−標識ＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、ミスマッチヌクレオチドを示す。）
前記プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０及び３１）をＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）上に固定化させた。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度２０μＭになるように溶解させた各プローブを、ＯｍｎｉＧｒｉｄ Ａｃｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（ＤＩＧＩＬＡＢ、ＵＳ）を利用してＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリントした。それぞれのプローブを２ｘ１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合されたプローブを除去するために、前記スライドは、２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有したバッファー溶液に３７℃で１０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
ＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する合成オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー３μＬ、各５０μＭ ｄＮＴＰ ０．６μＬ及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ２ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量で、ＤＮＡ−機能化されたスライドの表面上でエキソ核酸切断反応を行った。プローブが交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ ｓｉｔｕブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に位置させた。エキソ核酸切断反応を５０℃で３０分間行って、９５℃で蒸留水で１分間洗浄して停止させた。イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、５−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ５．１ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。各スポットの再現性を調べるために、２回反復実験を行った。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
Ｂ．反復的酸切断反応によるシグナル発生
本実施例で利用された合成鋳型配列及び単一−標識ＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、ミスマッチヌクレオチドを示す。）
前記プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２及び３３）をＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）上に固定化させた。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度２０μＭになるように溶解させた各プローブを、ＯｍｎｉＧｒｉｄ Ａｃｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（ＤＩＧＩＬＡＢ、ＵＳ）を利用してＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリントした。それぞれのプローブを２ｘ１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合されたプローブを除去するために、前記スライドは、２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有したバッファー溶液に３７℃で１０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
ＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する合成オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー（５ｍＭ ＭｇＣｌ２）３μＬ、各５０μＭ ｄＮＴＰ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量で、ＤＮＡ−機能化されたスライドの表面上に反復的（ｃｙｃｌｉｃ）エキソ核酸切断反応を行った。プローブが交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ ｓｉｔｕブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に位置させた。熱循環反応（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）を以下のように行った：９５℃で２分変性後、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間の過程反復（５、１０、２０、３０、４０又は５０サイクル）。イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、５−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ５．１ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。各スポットの再現性を調べるために、２回反復実験を行った。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
エキソ核酸切断反応において、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有する前記単一−標識固定化ＴＤプローブ及び鋳型を利用した場合、固相基質上の蛍光シグナルが最終的に消滅された。反復的エキソ核酸切断反応の場合において、固相基質上の蛍光強度がサイクル数によって減少された。
実施例９：ＴＤプローブ及びリガーゼを利用した固相における単一ヌクレオチド変異の検出
本発明者らは、固相において、リガーゼ反応でＴＤプローブが核酸配列上の単一ヌクレオチド変異を区別できるかどうかをさらに実験した。
この実験のために、ＤＳＯ構造を有する第１プローブ（ｆｉｒｓｔ ｐｒｏｂｅ）は、蛍光レポーター分子として５’−末端にＱｕａｓａｒ５７０を有しており、非固定化（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）プローブとして利用された。第２プローブ（ｓｅｃｏｎｄ ｐｒｏｂｅ）としてＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列又は１個のミスマッチヌクレオチドを有する。ＴＤプローブは、リンカーとしてポリ（Ｔ）７を有する。３’−末端のアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）を通じてＴＤプローブを固相基質の表面上に固定した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＢｓｔ又はＴａｑポリメラーゼを５’→３’エキソ核酸切断反応に利用した。アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ）をライゲーションに利用した。
本実施例で利用された合成鋳型、第１プローブ及び第２（ＴＤ）プローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、ミスマッチヌクレオチドを示す。）
前記ＴＤプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５及び３６）をＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）上に固定化させた。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度２０μＭになるように溶解させた各プローブを、ＯｍｎｉＧｒｉｄ Ａｃｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（ＤＩＧＩＬＡＢ、ＵＳ）を利用してＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリントした。それぞれのプローブを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合されたプローブを除去するために、前記スライドは、２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有したバッファー溶液に３７℃で１０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
ＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）に対する合成オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌｅ、第１プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）５ｐｍｏｌｅ、アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）１０×反応バッファー３μＬ及びアンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、５Ｕ／μＬ，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）０．２μＬを含有した３０μＬの最終容量でＤＮＡ−機能化されたスライドの表面上にリガーゼ反応を行った。前記アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）１０×反応バッファーは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），２５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＮＡＤ及び０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ（Ｒ）Ｘ−１００を含有する。プローブが交互結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。上記反応を以下のように行った：ターゲット核酸配列、第１プローブ及び固定化ＴＤプローブのハイブリダイゼーションを４５℃で５分間行って、リガーゼ反応は、追加的に６５℃で３０分間行った。前記反応を停止して、蒸留水で９５℃で２分間洗浄して変性させた。イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を利用し、５−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ５．１ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。各スポットの再現性を調べるために、２回反復実験を行った。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
第２プローブとして、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列を有するＴＤプローブ及び鋳型を利用した場合、ＳＡのターゲット核酸配列に対する蛍光シグナルが発生した。５’−第２ハイブリダイゼーション部位に１個のミスマッチヌクレオチドを有するＴＤプローブを第２プローブとして利用する場合は、シグナルが得られなかった。このような結果は、本発明のライゲーション反応が単一ヌクレオチド変異を検出できることを示す。
実施例１０：Ｔｄプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションによる蛍光変化によるターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、標識された部位のハイブリダイゼーションによる蛍光シグナル変化に基づいたターゲット検出に、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に蛍光分子を有するＴＤプローブが応用できるかどうかを追加的に実験した。
このような応用のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡを鋳型として利用した。ＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位にマッチング配列又はミスマッチ配列を有する。蛍光分子をＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の内部ヌクレオチドに連結した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型−依存的核酸ポリメラーゼをターゲット増幅に利用した。
本実施例で利用されたプライマー及び単一−標識ＴＤプローブの配列は、下記の通りである：
（下線及び太字は、ミスマッチヌクレオチドを示す。）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡ １ｎｇ、単一−標識ＴＤプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又は３９）５ｐｍｏｌｅ、正方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）１０ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）１０ｐｍｏｌｅ、１０×ストッフェルバッファー（Ｓｔｏｆｆｅｌ ｂｕｆｆｅｒ）［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び１００ｍＭ ＫＣｌを含有した］２μＬ、四つのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）をそれぞれ２００μＭ、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ及びＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ、ストッフェルフラグメント（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳ）１ｕｎｉｔを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲ反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させて、９５℃で２０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１０秒間の過程を４０回繰り返した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程（５５℃）で発生したシグナルを検出した。
上記の結果は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位のハイブリダイゼーションによる単一標識分子から出る蛍光変化を測定することにより、ＴＤプローブがターゲット配列を分別的に検出できるということを示す。
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

Claims (40)

  1. ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することを可能とする下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有することを特徴とするターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）。
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の長さが３〜１５ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の長さが１５〜６０ヌクレオチドであり、前記分割部位の長さが３〜１０ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位より長く、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、前記分割により、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにし、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
    （Ａ）前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、（Ｂ）前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記（Ａ）及び（Ｂ）により、前記ＴＤプローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
  2. 前記プローブが、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識又は多数の標識を含む相互作用的標識システムを有する請求項１に記載のＴＤプローブ。
  3. 前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の前記Ｔｍが、４０℃乃至８０℃である請求項１に記載のＴＤプローブ。
  4. 前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の前記Ｔｍが、６℃乃至４０℃である請求項１に記載のＴＤプローブ。
  5. 前記分割部位の前記Ｔｍが、２℃乃至１５℃である請求項１に記載のＴＤプローブ。
  6. ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）前記ターゲット核酸配列を前記ＴＤプローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングするクエンチャー分子で二重標識され、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子の少なくとも一つは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の長さが３〜１５ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の長さが１５〜６０ヌクレオチドであり、前記分割部位の長さが３〜１０ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位より長く、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、前記分割により、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにし、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
    （Ａ）前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、（Ｂ）前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、前記（Ａ）及び（Ｂ）により、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する）
    （ｂ）前記工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブ上にある前記蛍光レポーター分子が前記クエンチャー分子から分離されて、蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生しない工程と、
    （ｃ）前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の切断により発生された前記蛍光シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
  7. 前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである請求項６に記載の方法。
  8. 前記工程（ａ）が、前記ＴＤプローブがハイブリダイズする位置（ｓｉｔｅ）の下流位置にハイブリダイズする上流プライマーと共に前記ＴＤプローブを利用して行われ、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、前記上流プライマーが、前記工程（ｂ）で前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼにより延長される請求項６に記載の方法。
  9. 前記工程（ａ）が、逆方向プライマーと共に前記ＴＤプローブを利用して行われ、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、前記工程（ｂ）で前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる逆方向プライマーの延長反応によりＴＤプローブとハイブリダイゼーションできる前記ターゲット核酸配列が生成される請求項６に記載の方法。
  10. 前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子が、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項６に記載の方法。
  11. 前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項６に記載の方法。
  12. 前記方法が、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程と、反復サイクルの間の変性過程とをさらに含み、前記変性が、二本鎖核酸分子を一本鎖核酸分子に分離するものである請求項６に記載の方法。
  13. 前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが、少なくとも２種のプローブを含む請求項６に記載の方法。
  14. 前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＤプローブが少なくとも２種のプローブを含み、かつ前記上流プライマーが少なくとも２種のプライマーを含むか、又は前記逆方向プライマーが少なくとも２種のプライマーを含む請求項８に記載の方法。
  15. 前記ターゲット核酸配列がヌクレオチド変異を含み、かつ前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項６に記載の方法。
  16. 前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位は、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項６に記載の方法。
  17. ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）前記ターゲット核酸配列を前記ＴＤプローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、３’−末端を通じて固相基質の表面に固定化されており、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記標識は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置し、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の長さが３〜１５ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の長さが１５〜６０ヌクレオチドであり、前記分割部位の長さが３〜１０ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位より長く、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、前記分割により、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにし、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
    （Ａ）前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、（Ｂ）前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、前記（Ａ）及び（Ｂ）により、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する）
    （ｂ）前記工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、（Ｃ）前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブから前記標識が放出されて、前記固相基質上に固定化されたＴＤプローブでシグナル変化が現れ、（Ｄ）前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、前記固相基質上に固定化されたＴＤプローブでシグナル変化が現れず、前記（Ｃ）及び（Ｄ）により、前記固相基質上のシグナル変化を検出し、前記ターゲット核酸配列の存在を決定する工程と、
    （ｃ）前記固相基質上の前記シグナル変化を検出する工程であって、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の切断による前記シグナル変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
  18. 前記標識が、蛍光レポーター分子であり、前記シグナル変化が、前記固相基質上において蛍光シグナルの減少又は消滅である請求項１７に記載の方法。
  19. 前記標識が、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含む相互作用的標識システムであり、前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子の一つを有し、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に他の一つを有する請求項１７に記載の方法。
  20. 前記クエンチャー分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に位置し、前記蛍光分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置し、
    （Ｅ）前記プローブがターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記ＴＤプローブのクエンチャー分子が蛍光レポーター分子から分割されるように、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて蛍光シグナルが発生し、（Ｆ）前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生せず、前記（Ｅ）及び（Ｆ）により、前記ターゲット核酸配列の存在が決定されるように前記固相基質上の前記蛍光シグナルが検出される請求項１９に記載の方法。
  21. 前記方法が、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程と、反復サイクルの間の変性過程とをさらに含み、前記変性が、二本鎖核酸分子を一本鎖核酸分子に分離するものである請求項１７に記載の方法。
  22. 前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが、少なくとも２種のプローブを含む請求項１７に記載の方法。
  23. 前記ターゲット核酸配列がヌクレオチド変異を含み、かつ前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項１７に記載の方法。
  24. 前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカーとして含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位が、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項１７に記載の方法。
  25. ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）（ｉ）前記ターゲット核酸配列、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する前記ＴＤプローブ、（ｉｉｉ）それぞれ前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する正方向プライマー及び逆方向プライマーとして二つのプライマーからなる一対のプライマー、及び（ｉｖ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを含むＰＣＲ混合物を用意する工程であって、前記ＴＤプローブは、前記二つのプライマー間の位置にハイブリダイズし、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングするクエンチャー分子で二重標識されており、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の長さが３〜１５ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の長さが１５〜６０ヌクレオチドであり、前記分割部位の長さが３〜１０ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位より長く、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、前記分割により、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにし、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
    （Ａ）前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、（Ｂ）前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず、前記（Ａ）及び（Ｂ）により、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
    （ｂ）前記ＰＣＲ混合物を利用して少なくとも２サイクルのプライマーアニーリング、プライマー延長及び変性で前記ターゲット核酸配列を増幅させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により延長されて、前記ターゲット核酸配列を増幅して、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、前記ＴＤプローブ上にある前記クエンチャー分子から前記蛍光レポーター分子が分離されて、蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず、その結果、前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＤプローブ上にある前記クエンチャー分子から分離されず、蛍光シグナルが現れない工程と、
    （ｃ）前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記発生した蛍光シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
  26. 前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＤプローブが、少なくとも２種のプローブを含み、前記正方向プライマーが、少なくとも２種のプライマーを含み、かつ前記逆方向プライマーが、少なくとも２種のプライマーを含む請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ターゲット核酸配列がヌクレオチド変異を含み、かつ前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項２５に記載の方法。
  28. ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ライゲーション反応によりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）前記ターゲット核酸配列を第１プローブ及び第２プローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記第１プローブは、前記ターゲット核酸配列の第１位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、第２プローブは、前記第１位置の上流に位置する前記ターゲット核酸配列の第２位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記第１プローブ及び前記第２プローブの少なくとも一つは、検出可能なシグナルを発生する標識を有して、前記第２プローブは、ＴＤプローブであり、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の長さが３〜１５ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の長さが１５〜６０ヌクレオチドであり、前記分割部位の長さが３〜１０ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位より長く、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、前記分割により、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにし、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
    （Ａ）前記第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記第１プローブ及び前記第２プローブのライゲーションが起こり、（Ｂ）前記第２プローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記第１プローブ及び前記第２プローブは、ライゲーションされず、前記（Ａ）及び（Ｂ）により、前記第２プローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
    （ｂ）前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズした前記第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせる工程であって、前記ライゲーションにより、ライゲーションされたプローブが生成される工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
    （ｄ）前記ライゲーションされたプローブ上の前記標識からのシグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
  29. 前記標識が、レポーター分子及びクエンチャー分子の一対からなる相互作用的標識システムである請求項２８に記載の方法。
  30. 前記第１プローブが、下記一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する請求項２８に記載の方法。
    ５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （ＩＩ）
    （式中、Ｘｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、前記分割により、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにし、前記オリゴヌクレオチドの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
  31. 前記方法が、工程（ａ）−（ｃ）又は（ａ）−（ｄ）を反復することをさらに含む請求項２８に記載の方法。
  32. 前記方法が固相で行われ、前記第１プローブが固相基質の表面上にその５’−末端を通じて固定化され、かつ前記第２プローブが固定化されない請求項２８に記載の方法。
  33. 前記方法が固相で行われ、前記第２プローブが固相基質の表面上にその３’−末端を通じて固定化され、かつ前記第１プローブが固定化されない請求項２８に記載の方法。
  34. 前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記第１プローブ及び前記第２プローブのそれぞれが少なくとも２種のプローブを含む請求項２８に記載の方法。
  35. 前記ターゲット核酸配列がヌクレオチド変異を含み、かつ前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項２８に記載の方法。
  36. ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）前記ターゲット核酸配列とＴＤプローブとをハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に蛍光レポーター分子で標識され、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の長さが３〜１５ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の長さが１５〜６０ヌクレオチドであり、前記分割部位の長さが３〜１０ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位より長く、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、前記分割により、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにし、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
    （Ａ）前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導し、（Ｂ）前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導できず、前記（Ａ）及び（Ｂ）により、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
    （ｂ）前記蛍光変化を検出する工程であって、前記蛍光変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
  37. 前記工程（ａ）が、前記ＴＤプローブ、逆方向プライマー及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを共に利用して行われることにより、前記ＴＤプローブとハイブリダイゼーション可能な前記ターゲット核酸配列が追加的に生成され、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光変化を増加させる請求項３６に記載の方法。
  38. 前記工程（ａ）が、前記ＴＤプローブに、正方向プライマー及び逆方向プライマーとして二つのプライマーからなる一対のプライマー及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを共に利用して行われることにより、前記ＴＤプローブとハイブリダイゼーション可能な前記ターゲット核酸配列がＰＣＲにより増幅され、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光変化を増加させる請求項３６に記載の方法。
  39. 前記ＴＤプローブが、前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子で追加的に標識された請求項３６に記載の方法。
  40. プローブ分子がターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することを可能とする方法であって、
    （ａ）ターゲット核酸配列を選択する工程と、
    （ｂ）プローブ分子の配列を設計する工程であって、前記プローブ分子の配列を設計する工程により、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列及び（ｉｉ）少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位を有し、前記分割部位は、ハイブリダイゼーション配列内に存在し、前記プローブ分子の三つの部位を形成する工程と、
    （ｃ）前記分割部位の前記５’−方向にある部位は、前記分割部位の３’−方向にある部位より低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有するように前記プローブ分子の前記分割部位位置を決定する工程であって、前記プローブ分子の前記分割部位位置を決定する工程により、それぞれ異なるＴｍ値を有する三つの部位を有するプローブ分子が提供されて、前記三つの部位において、（ｉ）前記プローブ分子の５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有し、（ｉｉ）前記プローブ分子の３’−第１ハイブリダイゼーション部位は、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、（ｉｉｉ）前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位と前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位との間にある前記プローブ分子の分割部位は、少なくとも三つのユニバーサル塩基を有して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の長さが３〜１５ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の長さが１５〜６０ヌクレオチドであり、前記分割部位の長さが３〜１０ヌクレオチドであり、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位より長く、
    （Ａ）前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、（Ｂ）前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記（Ａ）及び（Ｂ）により、前記プローブ分子は、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する工程と、を含むことを特徴とする方法。
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