KR20080037128A - 뉴클레오타이드 변이 검출 방법 - Google Patents

뉴클레오타이드 변이 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20080037128A
KR20080037128A KR1020060103745A KR20060103745A KR20080037128A KR 20080037128 A KR20080037128 A KR 20080037128A KR 1020060103745 A KR1020060103745 A KR 1020060103745A KR 20060103745 A KR20060103745 A KR 20060103745A KR 20080037128 A KR20080037128 A KR 20080037128A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleotide
variant
primer
specificity
sequence
Prior art date
Application number
KR1020060103745A
Other languages
English (en)
Inventor
천종윤
Original Assignee
주식회사 씨젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 씨젠 filed Critical 주식회사 씨젠
Priority to KR1020060103745A priority Critical patent/KR20080037128A/ko
Priority to EP07833600A priority patent/EP2084281A1/en
Priority to JP2009530290A priority patent/JP2010504752A/ja
Priority to PCT/KR2007/005291 priority patent/WO2008051039A1/en
Publication of KR20080037128A publication Critical patent/KR20080037128A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 타깃 뉴클레오타이드 서열의 최소 2 종류 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 종래의 부가적인 제한효소 처리나 염기서열분석 과정 없이 간단한 증폭 반응을 통하여, 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 오류 없이 동시에 정확하게 검출할 수 있다.
변이, 뉴클레오타이드, 증폭, 프라이머, B형 간염 바이러스, 라미부딘

Description

뉴클레오타이드 변이 검출 방법{Method for Detecting Nucleotide Variations}
도 1은 B형 간염 바이러스(HBV)의 중합효소에서 라미부딘 내성을 유발하는 뉴클레오타이드 변이의 종류를 보여준다.
도 2는 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따라, HBV 라이부딘 내성-유발 뉴클레오타이드 변이를 검출하기 위한 프라이머의 종류 및 증폭산물의 크기를 보여준다.
도 3a는 CYP2C19 유전자에서의 SNP 검출을 본 발명의 방법에 따라 멀티플렉스 PCR을 한 결과를 보여준다.
도 3b 및 도 3c는 라미부딘에 대한 내성 여부가 염기서열분석에 의해 확인된 B형 간염 환자의 시료를 대상으로 본 발명의 방법에 따라 멀티플렉스 PCR을 한 결과를 보여준다. 도 3b는, 변이가 발생된 부위의 바깥쪽 부분(outer region)에 어닐링되는 프라이머, YVDD 변이형 및 YIDD 변이형 특이 프라이머, 총 3종의 프라이머쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시한 결과를 보여준다. 가장 바깥쪽 레인은 100 bp DNA 분자량 마커이고, 레인 N은 내부 대조군만을 증폭한 결과이다. 레인 1-2는, 라미부딘 내성이 없는 HBV에 감염된 환자의 시료에 대한 것이다. 레인 3 및 4는, 각각 YIDD 변이형 및 YIDD 변이형과 L528M 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것이다. 레인 5 및 6은 YVDD 변이형과 L528M 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것이다. 레인 7 및 8은 YIDD 변이형, YVDD 변이형 및 L528M 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것이다.
본 발명은 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
인류는 페니실린의 발견(Alexander Fleming, 1928년) 이후 수많은 종류의 항생제ㅇ 항진균제ㅇ 항바이러스제 등(이하 약제)을 개발해 왔다. 이로 인하여 인간의 사망률의 가장 큰 부분을 차지하던 병원체 감염으로 인한 죽음과 고통으로부터 인류를 해방시켜 왔다. 그리하여 지금은 병원체 감염으로 인한 사망률이 극히 미약한 부분이 되었다. 하지만 병원체들도 생물체로서 약제 내성을 키워 인류에 대항하기 시작했다. 최근 병원내 감염으로 사회적 이슈가 되고 있는 methicillin resistant Staphylococcus aureus(MRSA)나 vancomycin-resistant enterococci(VRE) 혹은 조류 독감의 유일한 치료제인 oseltamivir phosphate(Tamiflu)에 내성을 지니는 돌연 변이 AI 바이러스의 출현 등이 대표적인 예이다.
이러한 약제 내성은 약제의 표적이 되는 생체 고분자 화합물(주로 단백질)의 약제 결합 부위에 돌연변이를 유도하여 약제의 결합에 문제를 일으키는 것이다. 세균이나 진균의 경우에는 다제 약제 내성(Multi-Drug resistance)이 유발되기도 해 치료에 어려움을 준다. 또한 약제의 표적이 되는 생체 고분자 화합물이 하나가 아니라 여러 개인 경우가 많기 때문에 그 약제 내성을 분석하거나 연구하기가 쉽지 않은 경우도 많다. 반면에 바이러스의 경우엔 그 약제의 표적이 분명하기 때문에 약제 내성에 대한 분석이 쉬운 편이다.
이러한 약제 내성 병원체에 대한 극복 방법은 약제 표적 물질의 변형된 결합부위에 딱 맞게 결합하는 약제 유도체를 개발하여 새로운 약제로 사용하거나 새로운 표적 물질에 대한 새로운 약제를 개발하는 것이다.
이러한 약제 개발에 바탕한 병원체의 정복, 병원체의 돌연변이에 의한 인간에 대한 저항, 돌연변이주를 정복하기 위한 새로운 약제 개발의 역사적 전개가 분명하면서도 인류에 그 중요도가 큰 것 중의 하나가 바로 B형 간염바이러스(Hepatitis B virus, HBV)와 그 항바이러스제들의 개발 과정이다.
한국 및 전 세계적으로 대략 3억 5천만 명의 사람들이 B형 간염 바이러스에 감염되어 있다. HBV의 보균자는 대략 15-40%에서 일생동안 만성B형간염, 간경화, 간암으로 진행할 위험성이 높다. 따라서 만성B형간염의 치료목적은 HBV 복제를 억제하고 간질환으로의 진행을 막는데 있으며, 현재까지 B형간염 치료제로 인정된 약으로는 인터페론과 라미부딘(Lamivudine), 아데포비어(Adefovir) 등이 있다.
라미부딘은 뉴클레오사이드 유사체로 간세포 내에서 HBV의 프리지놈 RNA로부터 역전사되는 바이러스 DNA 염기서열내로 삽입될 때, HBV DNA 중합효소의 역전사 기능을 억제하는 약제이다. HBV 복제억제 효과가 우수하고 치료 후 조직학적 소견이 향상된다는 보고도 있어, 만성B형간염의 치료제로 널리 사용되고 있다. 그러나 1년간 라미부딘 치료를 받은 환자의 14-32% 정도에서 YMDD 모티프 변이형이 발생한다고 알려져 있다. YMDD 모티프는 HBV DNA 중합효소 유전자의 C 영역에 위치하는 것으로, 아미노산 서열 상 552번째 Met이 Valine (M552V)이나 Ile(M552I)으로 치환되어 변이형이 발생하는 부위이다. 변이형은 HBV 야생형에 비해 라미부딘에 대한 감수성이 45배 이상 낮다고 한다. 라미부딘의 치료 기간이 길수록 YMDD 모티프 변이형의 발생률이 높아진다. 라미부딘 치료로 HBV DNA 교잡반응에서 음성을 보이다가 다시 매우 높은 수준의 양성 반응을 보이는 HBV DNA 재출현(breakthrough) 현상이 나타날 때는 YMDD 변이형 출현을 의심할 수 있다.
이러한 라미부딘 내성 HBV 출현의 경우, 그 대체 약제로서 아데포비어가 개발되어 현재 점점 많이 쓰여 지고 있는 추세이다. 지난 3년간의 아데포비어 임상 시험 중 투여 환자의 약 3.9%에서 약제 내성을 지닌 바이러스가 검출되었다. 분자 생물학적으로 이들 바이러스는 HBV DNA 중합효소 D지역 236번(Asn이 Ala으로), B지역 181번(Ala이 Thr로)에서 변이가 생긴 것이다. 하지만 이들 아데포비어 내성 바이러스들은 라미부딘에 의해서 증식이 억제되는 것으로 알려져 있다. 그래서 라미부딘이나 아데포비어에 대한 약제 내성이 생기는 경우에는 두 가지 약제를 교대로 사용하여 바이러스 DNA의 재출현을 막는 방법이 사용되고 있다.
이러한 약제 내성 변이는 대부분이 단일 혹은 이중 염기 서열 변이에 의한 것이기 때문에 그 검출 방법이 용이하지가 않다. 현재로서는 약제 내성 변이 바이 러스의 검출법으로는 PCR 뒤에 직접적으로 유전자 염기 서열 분석을 하거나, 제한효소 처리 후 전기영동, 제한효소 처리 후 질량분석법(PCR-RFMP법), LightCycler probe hybridization, primer-specific real-time PCR법 등이 있다. 현재 시판되고 있는 표준화된 키트는 역교잡법(reverse hybridization)으로 검출하는 INNO-LiPA HBV DR(Innogenetics, Ghent, Belgium)과 직접 염기서열분석법으로 검출하는 TRUGENE HBV genotyping 키트(Visible Genetics/Bayer, Toronto, Canada)가 있다. 유전자형이 서로 다른 바이러스가 섞여 있는 경우, 특정 유전자를 지닌 바이러스를 염기서열 분석법으로 검출하기 위해서는 전체 바이러스의 20% 이상이 특정 유전자를 지닌 바이러스이어야 검출할 수 있으며, LiPA법으로 검출하기 위해서는 10% 정도 특정 유전자를 지닌 바이러스이어야 검출할 수 있다.
상기 방법들은 많은 시간의 소요, 과도한 노동력 등의 문제나, 정확성에 문제가 있다. 따라서, 게놈 DNA와 같은 핵산 상의 단일-염기 차이를 간편하면서도 정확하고 민감하게 검출할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 발명자는 상술한 당업계의 요구를 해결하고자 노력한 결과, 독특한 구조를 가지는 프라이머를 제작하였고, 이를 이용하는 경우에는 뉴클레오타이드 변이를 오류 없이 정확하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 2 종류의 변이를 동시에 용이하게 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 뉴클레오타이드 타깃 뉴클레오타이드 서열의 최소 2 종류 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 뉴클레오타이드 변이가 나타나는 타깃 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료에서 타깃 뉴클레오타이드 서열의 최소 2 종류 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 하기 (i) 내지 (iv)의 프라이머와 타깃 뉴클레오타이드 서열을 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계:
(i) 제 1 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 갖는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 변이-발생 부위에 특이적으로 혼성화되며, 상기 제 1 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함 하는 제 1 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer 1: NVS-P1);
(ⅱ) 상기 NVS-P1 프라이머가 혼성화되는 상기 변이-발생 부위의 업스트림에 위치하는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 특정 부위에 혼성화되는 타깃 서열 특이적 프라이머 1(target specific primer 1: TSP1);
(ⅲ) 상기 제 1 뉴클레오타이드 변이가 나타나는 동일 자리, 그의 인접 자리 또는 이격된 자리에서 제 2 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 갖는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 변이-발생 부위에 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화되며, 상기 제 2 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer 2: NVS-P2); 및
(ⅳ) 상기 NVS-P2 프라이머가 혼성화되는 상기 변이-발생 부위의 다운스트림에 위치하는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 특정 부위에 혼성화되는 타깃 서열 특이적 프라이머 2(target specific primer 2: TSP2), 상기 (i) 및 (ⅱ)의 프라이머 세트와 상기 (ⅲ) 및 (ⅳ) 프라이머 세트는 서로 다른 크기의 증폭 산물이 생성되도록 선택되고 디자인된 것이고, 상기 NVS-P1 및 NVS-P2 프라이머는 다음의 일반식 I로 표시된다:
5'-Ap-Yq-Vr-3' (I)
상기 일반식에서, Ap는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 인접 특이성 구역(variation adjacent specificity portion)이고, Yq는 최소 3 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Vr은 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 특이성 구역(variation specificity portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 변이 인접 특이성 구역의 Tm은 변이 특이성 구역의 Tm 보다 높으며, 상기 분할 구역은 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 구역은 혼성화 특이성 측면에서 변이 인접 특이성 구역이 변이 특이성 구역으로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성이 변이 인접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다;
(b) 최소한 2 사이클의 프라이머 어닐링, 프라이머 신장 및 변성 단계를 실시하여 타깃 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 그리고,
(c) 단계 (b)에서 생성된 증폭 산물의 크기를 확인하여 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 단계.
본 발명은 뉴클레오타이드 서열 내의 다양한 뉴클레오타이드 변이 또는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 동시에 검출하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 뉴클레오타이드 서열 내의 동일한 염기 또는 동일한 코돈에서의 변이들을 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공한다.
현재까지, 간단한 증폭 반응(예컨대, PCR)만으로, 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이, 특히, 동일한 염기 또는 동일한 코돈에서의 2종 이상의 변이들을 동시에 검출할 수 있는 방법은 실제적으로 개발되지 않았다. 본 발명은 이러한 동시 변이 검출을 간단한 증폭반응만으로 확인할 수 있는 실제적인 방법을 최초로 제공한다.
본 명세서에서 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 야생형의 뉴클레오타이드가 변화되어 이루어진 변이(예컨대, SNP)를 의미한다. 본 발명에서의 검출 대상인 뉴클레오타이드 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 의미한다.
본 발명에서 이용되는 프라이머, 특히 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific prime: NVS)가 가지는 기본적인 구조는 본 발명자에 의해 최초로 제안되는 것이고, 이중 특이성(dual specificity) 구조라 명명할 수 있고, 이러한 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(dual specificity oligonucleotide: DSO)라 명명된다. DSO는 본 발명자에 의하여 개발된 신 개념의 올리고뉴클레오타이드로서, 분할 구역에 의해 분리된 5'-고 Tm 특이성 구역(5'-high Tm specificity portion)과 3'-저 Tm 특이성 구역(3'-low Tm specificity portion)에 의해 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다(참조: PCT/KR2005/001206).
본 발명에서의 NVS 프라이머는 상기 DSO를 변형한 것으로서, 상기 일반식 I 의 구조를 갖는다. NVS 프라이머는 변이 인접 특이성 구역(variation adjacent specificity portion), 분할 구역(separation portion) 및 변이 특이성 구역(variation specificity portion)을 포함한다.
상기 분할 구역은 변이 인접 특이성 구역 및 변이 특이성 구역을 물리적으로 그리고 기능적으로 분할시키는 기능을 갖는다. 이러한 분할에 의해, 변이 인접 특이성 구역 및 변이 특이성 구역은, 혼성화 특이성 측면에서 서로 분할된다. 이러한 특이성 분할은 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화(어닐링) 특이성이 변이 인접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
보다 상세하게는, NVS 프라이머가 뉴클레오타이드 변이-포함 타깃 서열에 어닐링 될 때, 특이성은 종래 프라이머와 같이 프라이머 전체 길이에 의해 결정되는 것이 아니라, 서로 분할된 변이 인접 특이성 구역 및 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정된다. 따라서, NVS 프라이머는 타깃 서열에 어닐링될 때, 종래의 프라이머와 다른 방식(performance)으로 어닐링되며, 이는 어닐링 특이성을 크게 향상시키는 결과를 초래한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인 돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역은 연속된 유니버설 염기를 포함한다.
바람직하게는, 상기 변이 인접 특이성 구역의 길이는 변이 특이성 구역보다 길다. 상기 변이 인접 특이성 구역은 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
상기 변이 특이성 구역은 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
상기 분할 구역은 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이 인접 특이성 구역은 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 바람직하게는, 상기 변이 특이성 구역은 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.
본 발명의 프라이머의 변이 특이성 구역은, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는(corresponding) 또는 상보적인(complementary) 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 프라이머가 타깃 뉴클레오타이드 서열의 센스 가닥과 혼성화 되는 경우에는, 변이 특이성 구역은 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 안티센스 가닥과 혼성화 되는 경우에는, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 10 염기 이격된 자리에 위치하며, 보다 바람직하게는 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 2 내지 7 염기, 보다 더 바람직하게는 3'-말단으로부터 3 내지 6 염기 이격된 자리에 위치한다. 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 가운데(center) 또는 그 근처(around the center)에 위치한다. 예컨대, 변이 특이성 구역이 8 뉴클레오타 이드를 포함하는 경우, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 3 내지 6 염기 이격된 자리, 바람직하게는 4-5 염기 이격된 자리, 보다 바람직하게는 4 염기 이격된 자리에 위치한다.
상기 NVS 프라이머의 변이 특이적 구역에서, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드가 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 3 내지 6 염기 이격된 자리에 위치하거나 또는 가운데에 치우쳐서 위치하게 되면, 다음과 같은 유리한 효과가 발생된다.
예를 들어, 일반적인 프라이머를 이용하여, SNP를 검출할 때에는 변이 발생 부위를 3'-말단에 위치하게 되는 데, 이 경우 3'-말단의 염기가 타깃 서열에 어닐링 될 때와 되지 않을 때(즉, 미스매칭이 될 때) Tm 값이 크게 차이가 나지 않는다. 따라서 미스매칭 될 때에도 어닐링 되어 증폭 반응이 일어나 위양성 결과가 나오는 경향이 크다. 반대로, 변이 발생 부위를 가운데에 치우쳐서 위치시키면, 변이 발생 부위가 타깃 서열에 어닐링 될 때와 되지 않을 때(즉, 미스매칭이 될 때) Tm 값이 어느 정도 크게 차이가 나지만, 대부분의 열안정성 중합효소는 미스매칭 되는 부분에서도 중합반응을 촉매하여 위양성 결과를 초래한다.
본 발명에 따르는 경우에는, 상술한 종래 기술의 문제점을 완벽하게 극복할 수 있다. 예컨대, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드가 변이 특이성 구역의 가운데에 치우쳐서 위치하는 경우, 만일 이 위치에서 미스매칭이 발생되면, 변이 특이성 구역만으로 볼 때에는 구조의 중앙에서 미스매칭이 발생된 것이기 때문에, 변이 특이성 구역의 Tm 값이 매칭될 때와 비교하여 크게 감소하게 되며, 프라이머 전체 구조로 볼 때에는 3'-말단에서의 미스매칭이기 때문에, 열안정성 중합효소는 중합반응을 촉매하지 않는다. 따라서, 미스매칭되는 경우, 위양성 결과가 발생되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 NVS 프라이머는 다음 일반식 Ⅱ로 표현된다:
5'-Ap-(dI)q-Vr-3' (I)
상기 일반식에서, Ap는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 인접 특이성 구역(variation adjacent specificity portion)이고, (dI)q는 연속적인 디옥시이노신 잔기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Vr은 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 특이성 구역(variation specificity portion)이고, p는 15-25이며, q는 4-8이고, r은 6-13이며, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 Vr의 가운데에 위치해 있다.
상기 일반식 Ⅱ의 NVS 프라이머에서, (dI)는 연속적인 디옥시이노신 잔기를 포함하는 분할 구역이며, 디옥시이노신 잔기의 개수는 4-8이다. 이 경우, (dI)가 분할 구역 역할을 할 수 있는 범위 내에서 다른 염기가 삽입될 수도 있다.
또한, 상기 일반식 Ⅱ의 NVS 프라이머에서, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 Vr의 가운데에 위치해 있다. 예를 들어, Vr이 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13개의 뉴클레오타이드 잔기로 이루어져 있는 경우, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 Vr의 3'-말단으로부터 각각 3-4, 3-5, 4-5, 4-6, 5-6, 5-7, 6-7 및 6-8 뉴클레오타이드에 위치해 있는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안 히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
본 명세서에서 용어"혼성화"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우 (perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 일반적으로, 혼성화 온도가 높으면, 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면, 일부 미스매치가 존재하더라고 혼성화가 일어날 수 있다. 혼성화 온도가 낮으면, 낮을수록 혼성화가 일어날 수 있는 미스매치의 정도는 증가할 것이다.
프라이머 어닐링, 프라이머 신장 및 변성 단계를 실시하여 타깃 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼성화(어닐링) 온도는 40℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 45℃ 내지 68℃이고, 보다 더 바람직하게는 50℃ 내지 65℃이며, 가장 바람직하게는 60℃ 내지 65℃이다.
변이를 포함하는 핵산 서열을 증폭하기 위한 본 발명의 방법은 소망하는 어떠한 변이도 검출할 수 있도록 한다. 이러한 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄 또는 단일쇄일 수 있고, 바람직하게는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄인 경우, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
mRNA가 출발물질로 이용되는 경우, 역전사 단계가 증폭 전에 필요로 하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용된다. 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머는 dTMPs로 이루어져 있고, dT 프라이머가 프라이머로서 작용할 수 있는 한도 내에서 dTMPs 중 하나 또는 그 이상은 다른 dNMPs로 대체될 수 있다. 역전사 단계는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 반응조건을 주의하여 선택하면 개별적인 RNase H 절단 과정을 피할 수 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건(즉, 분할 구역이 타깃 서열에 수 소결합을 할 수 없는 조건) 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 바람직하게는, 어닐링 온도는 40℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 45℃ 내지 68℃이고, 보다 더 바람직하게는 50℃ 내지 65℃이며, 가장 바람직하게는 60℃ 내지 65℃이다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.
증폭 산물의 형성 여부를 확인하는 것은, 전기영동, 예컨대, 아가로스 젤 전기영동을 통해 쉽게 실시할 수 있다. 특히, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 쌍들은 서로 증폭 크기가 다르도록 디자인된 것이기 때문에, 전기영도의 결과를 육안으로 관찰하여, 뉴클레오타이드 변이 존재 여부를 쉽게 파악할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 타깃 서열 특이적 프라이머(TSP)는 분석 목적의 변이 발생 바깥 부위(outer region)에 어닐링 되는 것이기 때문에, 종래의 프라이머 즉 분할 구역이 없는 통상적인 프라이머 구조를 가지는 프라이머가 이용될 수 있다. 바람직하게는, TSP는 상기 일반식 I로 표시되는 구조를 가지며 이 경우 변이 특이성 구역은 뉴클레오타이 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드 없이 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)는 상기 NVS-P1 프라이머와 NVS-P2 프라이머가 혼성화 되는 변이 이외의 다른 변이에 혼성화되는 1개 이상의 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer)를 추가적으로 이용하여 실시된다. 예를 들어, B형 간염 바이러스(HBV)의 라미부딘 내성 변이체를 검출하기 위하여 본 발명의 방법을 적용하는 경우, YIDD 모티프, YVDD 모티프 및 L528M의 변이에 혼성화 되는 3종 이상의 NVS-P 프라이머를 이용하여 3개의 변이를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)는 변이 검출 대상의 타깃 뉴클레오타이드 서열 이외의 다른 뉴클레오타이드 서열을 증폭하여 내부 대조군(internal control)을 생성하기 위한 프라이머 한 쌍을 추가적으로 이용하여 실시된다. 이러한 내부 대조군은 증폭 반응 자체가 제대로 이루어졌는지를 체크할 수 있도록 한다. 예를 들어, 하기의 실시예에 예시된 바와 같이, 변이 검출 대상의 HBV 지놈 서열 이외에 증폭 반응의 내부 대조군으로 사용하기 위하여, 벼(Oryza sativa)의 광합성관련 유전자인 rbcL 유전자가 증폭반응에 첨가되며, 이 rbcL 유전자를 증폭하기 위한 프라이머가 사용된다. 내부 대조군을 생성하기 위한 프라이머는, 종래의 프라이머 구조를 가질 수도 있으나, 바람직하게는 상기 일반식 I의 구조를 갖는다. 이 경우, 일반식 I의 변이 특이성 구역은 뉴클레오타이 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드 없이 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 약제 내성 병원체, 보다 바람직하게는 약제 내성 바이러스를 검출하기 위한 것이다. 상기 약제 내성 바이러스는 바람직하게는, HIV(human immunodeficiency virus)-1, HIV-2, HBV(hepatitis B virus), HCV(hepatitis C virus) 또는 인간 헤르페스 바이러스(human herpesvirus)이며, 가장 바람직하게는 HBV이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바이러스가 내성을 나타내는 약제는 지도부딘(zidovudine), 디다노신(didanosine), 잘시타빈(zalcitabine), 스타부딘(stavudine), 라미부딘(lamivudine), 네비라핀(nevirapine), 델라비르딘(delavirdine), 에파비렌즈(efavirenz), 아데포비르(adefovir), 아데포비르 디피복실(adefovir dipivoxil), FTC, D4FC, BCH-l89, F-ddA, 테트라하이드로이미다조[4,5,1-jk[]1,4]벤조디아제핀-2(1H)-온(tetrahydroimidazo[4,5,1-jk[]1,4]benzodiazepine-2(1H)-one), 테트라하이드로이미다조[4,5,1-jk[]1,4]벤조디아제핀-2(1H)-티온(tetrahydroimidazo[4,5,1-jk[]1,4]benzodiazepine-2(1H)-thione), (S)-4-이소프로폭시카보닐-6-메톡시-3-(메틸티오메틸)-3,4-디하이드로퀴녹살린-2(1H)-티온((S)-4-isopropoxycarbonyl-6-methoxy-3-(methylthiomethyl)-3,4,- dihydroquinoxaline-2(1H)-thione), 사퀴나비르(saquinavir), 리토나비르(ritonavir), 인디나비르(indinavir), 넬피나비르(nelfinavir) 암프레나비르(amprenavir), 엔테카비르(entecavir), 팜시클로비어(famciclovir), 벤조-1,2,4-티아진 항바이러스제(benzo-1,2,4-thiadiazine antiviral agent), 리바비린(ribavirin) 및 인터페론으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 항바이러스 약제이며, 가장 바람직하게는 라미부딘이다.
본 발명의 방법에 따르면, 상기 약제 내성을 나타내는 병원체의 변이된 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 NVS-P 프라이머를 제작한다.
HIV-1 역전사효소에 변이가 발생되어 항바이러스제(잘시타빈, 지도부딘, 디다노신, 라미부딘 등)에 대한 내성을 나타내는 변이의 예는 다음과 같다: Met41Leu, Glu44Asp, Glu44Ala, Ile50Val, Ala62Val, Lys65Arg, Asp67Asn, Ser68Gly, Thr69Asp, Thr69Ser-Ser-Gly, Thr69Ser-Thr-Gly, Thr69Ser-Val-Gly, Lys70Arg, Lys70Glu, Leu74Ile, Leu74Val, Val75Ile, Val75Leu, Val75Thr, Phe77Leu, LeulOOIle, Lysl03Asn, VallO8Ala, VallO8Ile, Proll9Ser, Ilel35Thr, Ilel35Val, Glnl51Met, Thrl65Ile, Vall79Asp, Tyrl81Ile, Metl84Ala, Metl84Ile, Metl84Val, Tyrl88His, Tyrl88Leu, Glyl90Ala, Glyl90Cys, Glyl90Glu, Gryl90Gln, Glyl90Ser, Glyl90Thr, Leu210Trp, Leu214Phe, Thr215Tyr, Thr215Phe, Thr215Ser, Lys219Gln, Pro294Ser 및 Gly333Glu.
HIV-1 프로테아제에 변이가 발생되어 항바이러스제(사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르, 넬피나비르, 암프레나비르 등)에 대한 내성을 나타내는 변이의 예는 다음과 같다: Leu10Ile, LeulOVal, LeulOPhe, Val32Ile, Glu35Asp, Met36Ile, Met46Ile, Met45Leu, Ile47Val, Gly48Val, Ile50Val, Ile54Met, Ile54Ser, Ile54Val, Leu63Pro, Ala71Thr, Ala71Val, Val77Ile, Val82Ala, Val82Ile, Val82Phe, Val82Thr, Ile84Ala, Ile84Val, Asn88Asp, Asn88Ser, Leu89Met, Leu89Pro 및 Leu90Met
HCV RNA-의존성 RNA 중합효소에 변이가 발생되어 항바이러스제(예컨대, 벤조-1,2,4-티아진 항바이러스제)에 대한 내성을 나타내는 변이의 예는 다음과 같다: Lys50Arg, Met71Val, Asn41 lSer, Met414Thr, Phe415Ty 및 Val581Ala.
HCV NS5A 단백질에 변이가 발생되어 항바이러스제(예컨대, 인터페론 등)에 대한 내성을 나타내는 변이의 예는 다음과 같다: Leu2190Lys, Val2198Leu, Val2198Met, Val2198Glu, Thr2217Ala, Thr2217Val, Asn2218Asp, Asn2218Lys, Asn2218Ser, Asp2220Glu, Asp2223Glu, Glu2225Asp, Glu2228Gln, Glu2236Ala, Asn2248Asp, He2252Val, Ile2268Val, Arg2276Leu, Lys2277Arg, Ser2278Pro, Arg2280Lys, Arg2280Glu, Ala2282Thr, Pro2283Gln, Pro2283Arg, Val2287Ile, Leu2298Val, Leu2298Ile, Thr2300Pro, Thr2300Ala, Lys2302Asn, Lys2303Asn, Asp2305Gly 및 Pro2315Ala.
HBV 중합효소에 변이가 발생되어 항바이러스제에 대한 내성을 나타내는 예는 다음과 같다: (ⅰ) 라미부딘: Leu426Ile, Leu426Val, Val173Leu, Met552Ile, Met552Val, Met552Ser, Val555Ile, Leu528Met; (ⅱ) 엔테카비르: Ile169Thr, Thr184Gly, Ser202Ile, Met250Val; (ⅲ) 팜시클로비어: Val173Leu, Met552Ile, Val555Ile; 및 (ⅳ) 아데포비르 디피복실: Asn236Thr.
본 발명에서 사용되는 뉴클레오타이드 변이 특이적 NVS-P 프라이머는 상기한 약제 내성 병원체의 변이된 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 디자인된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 HBV의 중합효소에서의 약제 내성 뉴클레오타이드 변이, 보다 바람직하게는 HBV의 중합효소에서의 라미부딘 내성 뉴클레오타이드 변이, 가장 바람직하게는 HBV의 중합효소에서의 552번째 코돈에서의 변이를 검출하는 데 적용된다.
본 발명은 동일 자리 및/또는 서로 다른 자리에서 발생되는 2 종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 데 유용하다. 본 명세서에서 용어 "동시에"는 하나의 증폭 반응액에서 2종 이상의 변이 존재 여부를 확인할 수 있는 반응 결과물을 얻는다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에 따르면 멀티플렉스 증폭 반응이 필수적으로 수반된다.
본 발명의 방법이 동일 자리에서의 변이를 검출하는 데 이용되는 경우에는, 2종의 SNP를 동시에 검출하는 데 유용하다. 본 발명의 방법이 서로 다른 자리, 즉 인접 자리 또는 이격된 자리에서 발생되는 2종 이상의 변이를 검출하는 데 이용되는 경우에는, 크게 다음과 같은 적용성(applicability)이 있다. (ⅰ) 동일 자리는 아니지만, 동일 코돈 내의 인접한 자리에서의 2종의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출; 및 (ⅱ) 동일 코돈 내에 포함되지 않은 인접한 자리 또는 이격된 위치에서의 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출.
동일 자리 또는 동일 코돈에 있는 2 종 이상의 변이를 검출하는 경우, 본 발명은 2 종의 뉴클레오타이드를 동시에 검출하는 데에 유리하다. 이 경우 사용되는 NVS-P1 프라이머 및 NVS-P2 프라이머는 중첩되는 서열을 가지게 되는 것이 일반적이며, 서로 혼성화되어 이합체(duplex)를 형성할 수 있다. 이러한 프라이머 사이의 이합체 형성은 증폭반응을 비정상적으로 만들어, 잘못된 증폭 결과를 초래할 수 있다. 그러나 본 발명의 NVS 프라이머는 프라이머 사이의 이합체 형성에 따른 문제점을 극복하며, 이 특징 및 장점은 2 종의 변이를 동시에 검출하는 것이 실제적으로 가능하게 한다.
B형 간염 바이러스(HBV)의 라미부딘 내성 변이체를 검출하기 위한 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따라, 본 발명의 과정을 설명하면 다음과 같다.
우선, 라미부딘 내성을 유발하는 뉴클레오타이드 변이가 발생되는 타깃 서열 로서의 HBV의 DNA 중합효소의 코딩 서열을 얻는다. 상기 서열은, 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, GenBank 접근번호 NC003977, AY167096, AY167095 및 AY306136에서 확인할 수 있다. 이 서열에서 라미부딘 내성을 유발하는 단일염기 변이는 도 1에 표시되어 있으며, 야생형에서는 메티오닌을 코딩한다(YMDD 모티프). 그러나 라미부딘 및 팜시클로비어와 같은 항바이러스 약제에 내성을 갖는 HBV는 YMDD 모티브에서 메티오닌이 이소루신(YIDD 모티프), 발린(YVDD 모티프) 또는 세린(YSDD 모티프)으로 치환된 변이를 갖는다. YIDD 모티프에서는 g가 t로 변이되어 있고, YVDD 모티프에서는 a가 g로, YSDD 모티프에서는 tg가 gt로 변이되어 있다.
변이형인 YVDD 모티프 및 YIDD 모티프를 동시에 검출하기 위하여, 서열목록 제3서열의 YVDD-R 프라이머 및 서열목록 제4서열의 YIDD-F 프라이머를 이용한다. YVDD-R 프라이머는 HLT-F 프라이머(서열목록 제1서열)와 쌍을 이루어 증폭산물을 형성하고, YIDD-F 프라이머는 HLT-R 프라이머(서열목록 제2서열)와 쌍을 이루어 증폭산물을 형성한다. HLT-F와 HLT-R은 변이가 발생된 바깥쪽(outer region)에 어닐링 하는 프라이머로서, 이 두 프라이머는 서로 쌍을 이루어 증폭산물을 형성시키기도 한다(참조: 도 2). 상기 프라이머들은 이들에 의해 생성되는 증폭산물이 소정의 크기를 가지며, 각각의 프라이머 세트에 의해 생성되는 증폭 산물의 크기는 서로 다르도록 선택되고 디자인된 것이다. 따라서 증폭산물을 간단한 전기영동을 통하여 그 크기만을 확인해 봄으로써 시료 내의 타깃 뉴클레오타이드 서열이 어떠한 변이를 가지고 있는 지를 용이하게 검출할 수 있다. NVS-P 프라이머에 해당하는 YVDD-R과 YIDD-F는 서로 혼성화될 수 있는 서열을 가지고 있음에도 불구하고, 증폭 반응에서 서로 영향을 주지 않으며, 정확한 증폭 결과를 나타낸다. YSDD 모티프를 검출하려고 하는 경우에는, 서열목록 제4서열의 YSDD-F 프라이머를 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은 서로 이격된 위치에 있는 2종 이상의 변이를 동시에 검출하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 만일, 본 발명의 방법을 HBV DNA 중합효소 유전자 상의 서로 이격된 위치에 있는 YIDD-F 모티프 및 L528M 변이를 동시에 검출하는 데 적용하는 경우, 서열목록 제4서열의 YIDD-F 프라이머 및 서열목록 제6서열의 L528M-R 프라이머를 이용한다. L528M-R은 HLT-F 프라이머와 쌍을 이루어 증폭산물을 형성하고, YIDD-F 프라이머는 HLT-R 프라이머와 쌍을 이루어 증폭산물을 형성한다.
본 발명의 방법에 따르면, 간단한 증폭 반응을 통하여, 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 오류 없이 동시에 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명의 방법은 최소 2종 이상의 프라이머 세트를 이용하는 멀티플렉스 증폭 반응에 따라 실시된다.
(ⅱ) 본 발명의 방법에 따르면, 타깃 뉴클레오타이드 서열 상의 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 매우 높은 특이성으로 동시에 검출할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명의 방법은 멀티플렉스 반응에서 매우 우수한 작동성(workability)를 나타내어, 하나의 증폭 반응 세트에서 2종 이상의 뉴클레오타이 드 변이를 동시에 검출할 수 있다.
(ⅳ) 본 발명의 방법에서 이용되는 NVS-P 프라이머에서, 뉴클레오타이드 변이에 해당하거나 또는 상보적인 뉴클레오타이드가 변이 특이성 구역의 가운데에 치우쳐서 위치하게 되면, 증폭반응에서 단일염기 미스매치를 완벽하게 구별할 수 있다.
(ⅴ) 본 발명의 방법에 따르면, 동일 자리 또는 동일 코돈 내의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 이격된 위치에 있는 2종 이상의 뉴클레오타이드도 동시에 검출할 수 있다.
(ⅵ) 일반적으로 중첩되는 서열을 가지는 프라이머 쌍이 이용되는 경우, 프라이머끼리 이합체를 형성하여 잘못된 증폭 결과를 초래할 수 있는 데, 본 발명의 방법에 따르면, 이러한 이합체 형성의 문제점을 극복할 수 있어 오류의 증폭 결과를 막을 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 I: 프라이머 디자인 및 제조
실시예 I-1: B형 간염 바이러스 핵산 증폭용 프라이머
B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 코딩하고 있는 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여, TSP(target specific primer) 역할을 할 수 있는 전방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 디자인하였다. TSP는 가능한 한 종래의 프라이머 디자인 방법에 따라 디자인 되어도, 충분한 PCR 특이성을 발휘될 수 있는 서열을 선택하여 디자인 하였다.
HLT-F 5'- CTC GTG GTG GAC TTC TCT CA -3' (제1서열)
HLT-R 5'- GTG TAA AAG GGG CAG CAA AG -3' (제2서열)
상기 두 프라이머에 의해, 781 bp의 HBV DNA 중합효소-코딩 서열이 증폭된다.
실시예 I-2: YVDD 타입 라미부딘 내성 B형 간염바이러스 핵산 증폭용 프라이머
YVDD 타입 라미부딘 내성 B형 간염바이러스 핵산 서열을 기초로 하여, YVDD 변이 발생 부위에 특이적으로 어닐링 되어 SNP 검출을 PCR 방법에 따라 성공적으로 할 수 있는 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer: NVS)를 디자인 하였다.
YVDD-R 5'- CTT GGC CCC CAA TAC CAI III ITC CAC ATA -3' (제3서열)
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다. 서열에서 밑줄 그은 C는 YMDD-->YVDD 변이를 검출하는 부위이다.
본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머는 기본적으로 일반식 I의 구조를 갖도록 하여, 매우 높은 특이성으로 타깃 서열과 혼성화 되도록 하였다. 이러한, 일반식 I의 구조를 갖는 프라이머에서 두 개의 특이성 구역은 분할 구역에 의해 물리적으로 그리고 기능적으로 분할되며, 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성은 변이 인접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 조절된다. 또한, 뉴클레오타이드 변이에 해당되거나 또는 변이에 혼성화 되는 염기는 변이 특이성 구역의 중앙 부분에 위치하도록 하여, 미스매치에 따른 Tm 값 차이를 크게 하면서도 미스매치 시 Taq 중합효소에 의한 DNA 합성이 되지 않도록 하였다.
실시예 I-3: YIDD 타입 라미부딘 내성 B형간염바이러스 핵산 증폭용 프라이머
YIDD 타입 라미부딘 내성 B형 간염바이러스 핵산 서열을 기초로 하여, YIDD 변이 발생 부위에 특이적으로 어닐링 되어 SNP 검출을 PCR 방법에 따라 성공적으로 할 수 있는 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(전방향 프라이머)를 디자인 하였다.
YIDD-F 5'- CCC CAC TGT TTG GCT TTI III IAT ATT GAT -3' (제4서열)
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다. 서열에서 밑줄 그은 T는 YMDD-->YIDD 변이를 검출하는 부위이다.
실시예 I-4: YSDD 타입 라미부딘 내성 B형 간염바이러스 핵산 증폭용 프라이머
YSDD 타입 라미부딘 내성 B형 간염바이러스 핵산 서열을 기초로 하여, YSDD 변이 발생 부위에 특이적으로 어닐링 되어 SNP 검출을 PCR 방법에 따라 성공적으로 할 수 있는 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(전방향 프라이머)를 디자인 하였다.
YSDD-F 5'- CCC CAC TGT TTG GCT TTI III IAT AGT GA -3' (제5서열)
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다. 서열에서 밑줄 그은 GT는 YMDD-->YSDD 변이를 검출하는 부위이다.
실시예 I-5: L528M 타입 라미부딘 내성 B형 간염바이러스 핵산 증폭용 프라이머
L528M 타입 라미부딘 내성 B형 간염바이러스 핵산 서열을 기초로 하여, L528M 변이 발생 부위에 특이적으로 어닐링 되어 SNP 검출을 PCR 방법에 따라 성공적으로 할 수 있는 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(역방향 프라이머)를 디자인 하였다.
L528M-R 5'- AAC AAA TGG CGC TAG TAA III IIG CCA TGA G -3' (제6서열)
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다. 서열에서 밑줄 그은 T는 L528M 변이를 검출하는 부위이다.
실시예 Ⅱ: B형 간염바이러스 DNA의 준비
B형 간염바이러스에 감염된 사람의 혈액을 사용하여 B형 간염바이러스 핵산을 AccuPrep TM Genomic DNA Extraction 키트(Bioneer, South Korea)를 이용하여 추출하여, PCR 증폭의 주형으로 이용하였다.
실시예 Ⅲ: 내부 대조군 (internal control)
PCR 반응의 내부 대조군으로 쓰기 위하여 벼(Oryza sativa)의 광합성관련 유전자인 rbcL 유전자 서열에서 발굴된 서열 중, 상기 일반식 I의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 및 역방향 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
IC-F 5'- TAA ATC ACA GGC CGA AAC CGI III IAT TAA GGG GC -3' (제7서열)
IC-R 5'- GTG AAT GTG AAG AAG TAG GCC GTT III IIG GCA ATA ATG -3'(제8서열)
사람이나 사람의 병원체에는 없는 벼의 광합성관련 유전자 rbcL을 이용하여, 각각의 PCR 튜브 내에서의 PCR 성공 여부를 확인하기 위한 내부대조군 증폭용으로 상기 프라이머를 제작하였다.
실시예 Ⅳ: 라미부딘 내성 B형 간염바이러스의 핵산 서열을 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR
실시예 Ⅱ에서 얻은 바이러스 DNA 시료를 이용하여 하기 표 1과 표 2의 프라이머쌍들을 각각 사용하여 각각 멀티플렉스 PCR를 수행하였다.
타깃 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
HBV DNA 중합효소 유전자 HLT-F / HLT-R 781
YVDD 변이형 바이러스 HLT-F / YVDD-R 511
YIDD 변이형 바이러스 YIDD-F / HLT-R 320
내부대조군 IC-F / IC-R 205
타깃 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
HBV DNA 중합효소 유전자 HLT-F / HLT-R 781
L528M 변이형 바이러스 HLT-F / L528M-R 442
YSDD 변이형 바이러스 YSDD-F / HLT-R 320
내부대조군 IC-F / IC-R 205
15 mM MgCl2을 함유하는 2 ㎕의 10x PCR 반응 완충액(Roche), 1.25 μM 프라이머 쌍 4 ㎕, 2 ㎕의 dNTP (각각 2 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 주형 DNA 1 ㎕ 및 0.5 ㎕의 Taq 중합효소(5 units/㎕, Roche)를 포함하는 최종 20 ㎕의 반응혼합물을 사용하여 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. 반응혼합물을 포함하는 튜브를 전가열(94℃) 된 온도 사이클러(thermal cycler)에 넣고, 94℃ 15분에서 변성 반응시킨 후, 94℃ 30초, 60-65℃ 1.5분 및 72℃ 1.5분의 30-45 사이클 처리하고, 이어 72℃에서 10분 반응시켰다. PCR 산물을 EtBr을 포함하는 아가로스 젤에 전기영동하고, 나타난 밴드를 확인하였다(도 3a-3b).
도 3b는, 표 1에 기재된 변이가 발생된 부위의 바깥쪽 부분(outer region)에 어닐링되는 프라이머, YVDD 변이형 및 YIDD 변이형 특이 프라이머, 총 3종의 프라이머쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시한 결과를 보여준다. 도 3b에서 볼 수 있듯이, 라미부딘 내성이 없는 HBV에 감염된 환자의 시료에서는, 변이가 발생된 부위의 바깥쪽 부분(outer region)에 어닐링되는 프라이머에 의해 생성된 증폭물(781 bp) 및 내부 대조군 증폭물(205 bp)에 해당되는 밴드만 관찰되었다(레인 1 및 2). 레인 3은 YIDD 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것인데, 본 실험에서 디자인한 YIDD 변이형 프라이머에 의해 320 bp 증폭 산물이 정확하게 검출되었고, 위양성 및 위음성 결과는 관찰되지 않았다. 레인 4는 YIDD 변이형 및 L528M 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것인데, 본 실험에서 디자인한 YIDD 변이형 프라이머에 의해 320 bp 증폭 산물이 정확하게 검출되었고, 위양성 및 위음성 결과는 관찰되지 않았다. 레인 5 및 6은 YVDD 변이형 및 L528M 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것인데, 본 실험에서 디자인한 YVDD 변이형 프라이머에 의해 511 bp 증폭 산물이 정확하게 검출되었고, 위양성 및 위음성 결과는 관찰되지 않았다. 레인 7 및 8은 YIDD 변이형, YVDD 변이형 및 L528M 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것인데, 본 실험에서 디자인한 YIDD 변이형 프라이머 및 YVDD 변이형 프라이머에 의해 각각 320 bp 및 511 bp 증폭 산물이 정확하게 검출되었고, 위양성 및 위음성 결과는 관찰되지 않았다.
도 3c는, 표 2에 기재된 변이가 발생된 부위의 바깥쪽 부분(outer region)에 어닐링되는 프라이머, YSDD 변이형 및 L528M 변이형 특이 프라이머, 총 3종의 프라이머쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시한 결과를 보여준다. 도 3c에서 볼 수 있듯이, 라미부딘 내성이 없는 HBV에 감염된 환자의 시료에서는, 변이가 발생된 부위의 바깥쪽 부분(outer region)에 어닐링되는 프라이머에 의해 생성된 증폭물(781 bp) 및 내부 대조군 증폭물(205 bp)에 해당되는 밴드만 관찰되었다(레인 1 및 2). 레인 3은 YIDD 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것인데, 여기에서도 위양성 및 위음성 결과는 관찰되지 않았다. 레인 4는 YIDD 변이형 및 L528M 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것인데, 본 실험에서 디자인한 L528M 변이형 프라이머에 의해 442 bp 증폭 산물이 정확하게 검출되었고, 위양성 및 위음성 결과는 관찰되지 않았다. 레인 5 및 6은 YVDD 변이형 및 L528M 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것인데, 본 실험에서 디자인한 L528M 변이형 프라이머에 의해 442 bp 증폭 산물이 정확하게 검출되었고, 위양성 및 위음성 결과는 관찰되지 않았다. 레인 7 및 8은 YIDD 변이형, YVDD 변이형 및 L528M 변이형을 가지는 HBV-감염 환자의 시료에 대한 것인데, 본 실험에서 디자인한 L528M 변이형 프라이머에 의해 442 bp 증폭 산물이 정확하게 검출되었고, 위양성 및 위음성 결과는 관찰되지 않았다.
실험 결과를 종합하면, 본 발명의 방법에 따르는 경우에는, 멀티플렉스 PCR의 조건에서도 위-양성 및 위-음성 오류 없이 B형 간염 바이러스의 약제 내성 유전자형을 정확히 구분해 낼 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 따르는 경우에는, 유전자 변이가 동일 염기 또는 동일 코돈에서 발생된 것뿐만 아니라, 인접한 유전자 변이들(예컨대, YIDD 변이형과 L528M 변이형)도 동시에 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 Ⅴ: CYP2C19 유전자에서의 SNP를 검출하기 위한 오버랩핑 PCR
인간의 염색체 10q24에 위치한 유전자인 사이토크롬 P450, 서브패밀리 IIC (mephenytoin 4-hydroxylase), 폴리펩타이드 19 (CYP2C19)를 코딩하고 있는 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여, TSP(target specific primer) 역할을 할 수 있는 전방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 디자인하였다.
CYP-TSP-F 5'-AGA GAA GAA TTG TTG TAA AAA GTA III IIA TTA ATA TAA-3'(제9서열)
CYP-TSP-R 5'-AAA CTA GTC AAT GAA TCA CAA ATI III IAG CAG TCA C-3' (제10서열)
CYP2C19의 효소 활성에 영향을 미치는 SNP 유전형 중에서 allele 1(681G)과 allele 2A(681A)에 특이적으로 어닐링 되어 SNP 검출을 PCR 방법에 따라 성공적으로 할 수 있는 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer: NVS)를 디자인 하였다.
NVS-Allele2-F 5'-TAA TTT TCC CAC TAT CAT TGA III IIT CCC AGG A-3'(제11서열)
NVS-Allele1-R 5'-CAA GGT TTT TAA GTA ATT TGT TII III TTC CCG GG-3' (제12서열)
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다. 서열에서 밑줄 그은 C와 A는 allele 1 (681G)와 allele 2 (681A) 변이를 검출하는 부위이다.
본 발명에서 이용되는 TSP 전방향 및 역방향 프라이머, 그리고 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머는 기본적으로 일반식 I의 구조를 갖도록 하여, 매우 높은 특이성으로 타깃 서열과 혼성화 되도록 하였다. 이러한, 일반식 I의 구조를 갖는 프라이머에서 두 개의 특이성 구역은 분할 구역에 의해 물리적으로 그리고 기능적으로 분할되며, 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성은 변이 인접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 조절된다. 또한, 뉴클레오타이드 변이에 해당되거나 또는 변이에 혼성화 되는 염기는 변이 특이성 구역의 중앙 부분에 위치하도록 하여, 미스매치에 따른 Tm 값 차이를 크게 하면서도 미스매치 시 Taq 중합효소에 의한 DNA 합성이 되지 않도록 하였다.
표 3과 같이 위 네 가지 프라이머들을 모두 섞어서 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.
타깃 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
CYP2C19 Control 유전자 CYP-TSP-F / CYP-TSP-R 492
allele 1 (681G) CYP-TSP-F / NVS-Allele1-R 321
allele 2 (681A) NVS-Allele2-F / CYP-TSP-R 232
15 mM MgCl2을 함유하는 2 ㎕의 10x PCR 반응 완충액(Roche), 1.25 μM 프라이머 쌍 4 ㎕, 2 ㎕의 dNTP (각각 2 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 주형 DNA 1 ㎕ 및 0.5 ㎕의 Taq 중합효소(5 units/㎕, Roche)를 포함하는 최종 20 ㎕의 반응혼합물을 사용하여 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. 반응혼합물을 포함하는 튜브를 전가열(94℃) 된 온도 사이클러(thermal cycler)에 넣고, 94℃ 15분에서 변성 반응시킨 후, 94℃ 30초, 60-65℃ 1.5분 및 72℃ 1.5분의 30-45 사이클 처리하고, 이어 72℃에서 10분 반응시켰다. PCR 산물을 EtBr을 포함하는 아가로스 젤에 전기영동하고, 나타난 밴드를 확인하였다(도 3a).
도 3a는, 표 3에 기재된 변이가 발생된 부위의 바깥쪽 부분(outer region)에 어닐링되는 프라이머, allele 1 야생형 및 allele 2 변이형 특이 프라이머, 총 3종의 프라이머쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시한 결과를 보여준다. 도 3a에서 볼 수 있듯이, allele 1/ allele 2 Hetero인 경우에는 바깥쪽 부분(outer region)에 어닐링되는 프라이머에 의해 생성된 증폭물(492 bp) 및 allele 1에 특이적으로 생성된 증폭물(321 bp), allele 2 특이적으로 생성된 증폭물(232 bp) 모두가 관찰되었다(레인 1, 2, 3). allele 1 homo 유형의 경우에는 바깥쪽 부분(outer region)에 어닐링되는 프라이머에 의해 생성된 증폭물(492 bp) 및 allele 1에 특이적으로 생성된 증폭물(321 bp)만이 관찰되었다(레인 4, 5, 6). allele 2 homo 유형의 경우에는 바깥쪽 부분(outer region)에 어닐링되는 프라이머에 의해 생성된 증폭물(492 bp) 및 allele 2에 특이적으로 생성된 증폭물(232 bp)만이 관찰되었다(레인 7, 8, 9). 본 실험에서 디자인한 단일염기서열 구분형 allele 1 프라이머와 allele 2 프라이머에 의해 각각 321 bp, 232 bp 증폭 산물이 정확하게 검출되었고, 위양성 및 위음성 결과는 관찰되지 않았다. 그러나 종래의 방법에 따르는 경우(도 3a의 아래쪽 패널)에는 잘못된 증폭 결과가 나왔다.
실험 결과를 종합하면, 본 발명의 방법에 따르는 경우에는, 멀티플렉스 PCR의 조건에서도 위-양성 및 위-음성 오류 없이 인간 유전자의 단일염기서열다양성(Single Nucleotide Polymorphism)을 정확히 구분해 낼 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 종래의 부가적인 제한효소 처리나 염기서열분석 과정 없이 간단한 증폭 반응을 통하여, 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 오류 없이 동시에 정확하게 검출할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seegene, Inc. <120> Method for Detecting Nucleotide Variations <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLT-F <400> 1 ctcgtggtgg acttctctca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLT-R <400> 2 gtgtaaaagg ggcagcaaag 20 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YVDD-R <220> <221> misc_feature <222> (18)..(22) <223> n denotes deoxyinosine <400> 3 cttggccccc aataccannn nntccacata 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YIDD-F <220> <221> misc_feature <222> (18)..(22) <223> n denotes deoxyinosine <400> 4 ccccactgtt tggctttnnn nnatattgat 30 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YSDD-F <220> <221> misc_feature <222> (18)..(22) <223> n denotes deoxyinosine <400> 5 ccccactgtt tggctttnnn nnatagtga 29 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L528M-R <220> <221> misc_feature <222> (19)..(23) <223> n denotes deoxyinosine <400> 6 aacaaatggc gctagtaann nnngccatga g 31 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-F <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 7 taaatcacag gccgaaaccg nnnnnattaa ggggc 35 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-R <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 8 gtgaatgtga agaagtaggc cgttnnnnng gcaataatg 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP-TSP-F <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 9 agagaagaat tgttgtaaaa agtannnnna ttaatataa 39 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP-TSP-R <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 10 aaactagtca atgaatcaca aatnnnnnag cagtcac 37 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NVS-Allele2-F <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 11 taattttccc actatcattg annnnntccc agg 33 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NVS-Allele1-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 12 caaggttttt aagtaatttg ttnnnnnttc ccggg 35

Claims (23)

  1. 다음의 단계를 포함하는 뉴클레오타이드 변이가 나타나는 타깃 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료에서 타깃 뉴클레오타이드 서열의 최소 2 종류 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 방법:
    (a) 하기 (i) 내지 (iv)의 프라이머와 타깃 뉴클레오타이드 서열을 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계:
    (i) 제 1 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 갖는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 변이-발생 부위에 특이적으로 혼성화되며, 상기 제 1 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 제 1 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer 1: NVS-P1);
    (ⅱ) 상기 NVS-P1 프라이머가 혼성화되는 상기 변이-발생 부위의 업스트림에 위치하는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 특정 부위에 혼성화되는 타깃 서열 특이적 프라이머 1(target specific primer 1: TSP1);
    (ⅲ) 상기 제 1 뉴클레오타이드 변이가 나타나는 동일 자리, 그의 인접 자리 또는 이격된 자리에서 제 2 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 갖는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 변이-발생 부위에 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화되며, 상기 제 2 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer 2: NVS-P2); 및
    (ⅳ) 상기 NVS-P2 프라이머가 혼성화되는 상기 변이-발생 부위의 다운스트림에 위치하는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 특정 부위에 혼성화되는 타깃 서열 특이적 프라이머 2(target specific primer 2: TSP2), 상기 (i) 및 (ⅱ)의 프라이머 세트와 상기 (ⅲ) 및 (ⅳ) 프라이머 세트는 서로 다른 크기의 증폭 산물이 생성되도록 선택되고 디자인된 것이고, 상기 NVS-P1 및 NVS-P2 프라이머는 다음의 일반식 I로 표시된다:
    5'-Ap-Yq-Vr-3' (I)
    상기 일반식에서, Ap는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 인접 특이성 구역(variation adjacent specificity portion)이고, Yq는 최소 3 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Vr은 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 특이성 구역(variation specificity portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 변이 인접 특이성 구역의 Tm은 변이 특이성 구역의 Tm 보다 높으며, 상기 분할 구역은 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 구역은 혼성화 특이성 측면에서 변이 인접 특이성 구역이 변이 특이성 구역으로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성이 변이 인 접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다;
    (b) 최소한 2 사이클의 프라이머 어닐링, 프라이머 신장 및 변성 단계를 실시하여 타깃 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 그리고,
    (c) 단계 (b)에서 생성된 증폭 산물의 크기를 확인하여 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 변이 인접 특이성 구역은 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 변이 특이성 구역은 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 분할 구역은 3-10 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 변이 인접 특이성 구역은 40-80℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 변이 특이성 구역은 10-40℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 분할 구역은 3-15℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단에 위치해 있거나 또는 3'-말단으로부터 1 내지 10 염기 이격된 자리에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴 클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 2 내지 7 염기 이격된 자리에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 3 내지 6 염기 이격된 자리에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 중앙 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 타깃 서열 특이적 프라이머(TSP)는 상기 일반식 I로 표시되는 구조를 가지며 이 경우 변이 특이성 구역은 뉴클레오타이 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드 없이 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 NVS-P1 프라이머와 NVS-P2 프라이머의 변이 특이성 구역은 서로 부분적으로 중첩되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 NVS-P1 프라이머와 NVS-P2 프라이머가 혼성화 되는 변이 이외의 다른 변이에 혼성화되는 1개 이상의 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer)를 추가적으로 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열 이외의 다른 뉴클레오타이드 서열을 증폭하여 내부 대조군(internal control)을 생성하기 위한 프라이머 한 쌍을 추가적으로 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 약제 내성 병원체를 검출하기 위한 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 병원체는 HIV(human immunodeficiency virus)-1, HIV-2, HBV(hepatitis B virus), HCV(hepatitis C virus) 또는 인간 헤르페스 바이러스(human herpesvirus)인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 약제는 지도부딘(zidovudine), 디다노신(didanosine), 잘시타빈(zalcitabine), 스타부딘(stavudine), 라미부딘(lamivudine), 네비라핀(nevirapine), 델라비르딘(delavirdine), 에파비렌즈(efavirenz), 아데포비르(adefovir), 아데포비르 디피복실(adefovir dipivoxil), FTC, D4FC, BCH-l89, F-ddA, 테트라하이드로이미다조[4,5,1-jk[]1,4]벤조디아제핀-2(1H)-온(tetrahydroimidazo[4,5,1-jk[]1,4]benzodiazepine-2(1H)-one), 테트라하이드로이미다조[4,5,1-jk[]1,4]벤조디아제핀-2(1H)-티온(tetrahydroimidazo[4,5,1-jk[]1,4]benzodiazepine-2(1H)-thione), (S)-4-이소프로폭시카보닐-6-메톡시-3-(메틸티오메틸)-3,4-디하이드로퀴녹살린-2(1H)-티온((S)-4-isopropoxycarbonyl-6-methoxy-3-(methylthiomethyl)-3,4,- dihydroquinoxaline-2(1H)-thione), 사퀴나비르(saquinavir), 리토나비르(ritonavir), 인디나비르(indinavir), 넬피나비르(nelfinavir) 암프레나비르(amprenavir), 엔테카비르(entecavir), 팜시클로비어(famciclovir), 벤조-1,2,4-티아진 항바이러스제(benzo-1,2,4-thiadiazine antiviral agent), 리바비린(ribavirin) 및 인터페론으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 항바이러스 약제인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 방법은 HBV의 라미부딘 내성을 유발하는 최소 2 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하기 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 라미부딘 내성을 유발하는 뉴클레오타이드 변이는 HBV의 중합효소 유전자의 552번째 코돈에서의 변이인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 NVS-P1 프라이머 또는 NVS-P2 프라이머는 서열목록 제3-6서열 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020060103745A 2006-10-25 2006-10-25 뉴클레오타이드 변이 검출 방법 KR20080037128A (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060103745A KR20080037128A (ko) 2006-10-25 2006-10-25 뉴클레오타이드 변이 검출 방법
EP07833600A EP2084281A1 (en) 2006-10-25 2007-10-25 Method for detecting nucleotide variations
JP2009530290A JP2010504752A (ja) 2006-10-25 2007-10-25 ヌクレオチド変異検出方法
PCT/KR2007/005291 WO2008051039A1 (en) 2006-10-25 2007-10-25 Method for detecting nucleotide variations

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060103745A KR20080037128A (ko) 2006-10-25 2006-10-25 뉴클레오타이드 변이 검출 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080037128A true KR20080037128A (ko) 2008-04-30

Family

ID=39324779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060103745A KR20080037128A (ko) 2006-10-25 2006-10-25 뉴클레오타이드 변이 검출 방법

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP2084281A1 (ko)
JP (1) JP2010504752A (ko)
KR (1) KR20080037128A (ko)
WO (1) WO2008051039A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101369462B1 (ko) * 2011-08-05 2014-03-06 울산대학교 산학협력단 헤파티티스 ｂ 바이러스의 아미노산 변이를 검출하는 키트 및 방법

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009159844A (ja) * 2007-12-28 2009-07-23 Hiromitsu Kumada Ｂ型肝炎ウイルス量が低下する可能性を予測する方法
WO2011027966A2 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Seegene, Inc. Td probe and its uses
CN103635575B (zh) * 2011-06-15 2019-03-01 盖立复治疗公司 用于测定人免疫缺陷病毒（hiv）的方法、组合物和试剂盒
KR101856205B1 (ko) * 2017-11-16 2018-06-20 제노플랜코리아 주식회사 핵산의 대립형질 특이적 프라이머 및 이를 이용한 유전형 판별 방법
CA3095112A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Seegene, Inc. Method and apparatus for detecting a plurality of target nucleic acid sequences in sample
JP2021048785A (ja) * 2019-09-24 2021-04-01 キヤノンメディカルシステムズ株式会社 内部コントロール核酸、内部コントロールキット及び核酸検出方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19855469C2 (de) * 1998-12-01 2001-01-11 Michael Esrich Verfahren zur Bestimmung des Apolipoprotein-E-Genotyps in einer menschlichen Probe
CA2468754C (en) * 2001-12-08 2011-11-15 Seegene, Inc. Annealing control primer and its uses
AU2003201778A1 (en) * 2003-01-13 2004-08-10 Seegene, Inc. Dna size markers and method for preparing them
WO2005083121A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-09 Seegene, Inc. Method for amplifying members of a gene family

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101369462B1 (ko) * 2011-08-05 2014-03-06 울산대학교 산학협력단 헤파티티스 ｂ 바이러스의 아미노산 변이를 검출하는 키트 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008051039A1 (en) 2008-05-02
JP2010504752A (ja) 2010-02-18
EP2084281A1 (en) 2009-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10870675B2 (en) Process using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
EP1856257B1 (en) Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
AU2012304520B2 (en) Circularized templates for sequencing
AU2012304537B2 (en) Closed nucleic acid structures
WO2012162621A1 (en) Methods for suppression pcr
KR20080037128A (ko) 뉴클레오타이드 변이 검출 방법
JP5197579B2 (ja) 既知の配列に隣接した未知のｄｎａ配列を増幅する方法
CN106868165B (zh) 一种快速简易的基因多态性检测方法及试剂盒和应用
KR100881924B1 (ko) 레이블링된 프라이머를 이용한 뉴클레오타이드 변이 검출방법
WO2008143367A1 (en) Haplotyping method by multiplex amplification
KR101948816B1 (ko) B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물
KR20100048028A (ko) 식물 감염성 세균 또는 곰팡이 검출용 올리고뉴클레오타이드

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application