JP5631869B2 - 水酸基を含まないポリマー上におけるCe(IV)で開始されるグラフト重合 - Google Patents
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Description
クロマトグラフィーは、バイオポリマーを液体から単離するための最も好適な方法の1つである。ポリマーを、加工の過程において必要となる、水酸化ナトリウム溶液による、充填したクロマトグラフィーカラムのクリーニングからそれらが残存するように調製することができるため、ポリマーをベースとするクロマトグラフィー材料は、特に、シリカをベースとする材料と比較して、バイオ医薬品の精製において有利である。
したがって、本発明の目的は、表面上に反応性水酸基を有しないが、しかしCe(IV)イオンによって開始されるグラフト重合反応において単純な方法で誘導体化することができる、ポリマーを基にしてグラフト重合されたクロマトグラフィー材料を、単純かつ多用途性の方法で調製する可能性を提供するプロセスを提供することにある。本発明の他の目的は、実施することが単純かつ安価である対応するプロセスを提供すること、および広範囲の由来の物質の混合物を分離する可能性に関して、しかしまた酸、塩基、圧力または流量条件の影響に対する安定性に関して、広い適用範囲を有するクロマトグラフィー材料を提供することにある。
本目的は、OH基を表面上に有しない有機ポリマーベース材料の、Ce(IV)開始剤の存在下でのグラフト重合による、クロマトグラフィー材料を調製するための新規な方法によって達成される。用いるポリマーベース材料は、ビニル基を含み、遊離の水酸基を含まないモノマーの重合によって形成されるホモポリマーまたはコポリマーからなる粒状ポリマーを含んでいてもよい。
Yは、R4−SO3Mを示し、
R1およびR2は、互いに独立して
H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、カルボキシル、カルボキシメチルを示し、
R3は、H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、Yを示し、
R4は、8個までのC原子を有し、任意にアルコキシもしくはカルボキシル基によって単置換もしくは多置換されている、直鎖状もしくは分枝状アルキレン、
および/または
10個までのC原子を有し、任意にアルキル、アルコキシもしくはカルボキシル基によって単置換もしくは多置換されているアリーレン、または
メチレン、エチレン、プロピレン、ヘキシレン、イソプロピレン、イソブチレンまたはフェニレン
を示し、
Mは、H、Na、KまたはNH4を示し、
Zは、Yを示す、
で表される水溶性モノマー単位を用いて行う。
Yは、R5−COOMを示し、
R1およびR2は、互いに独立して
H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、カルボキシル、カルボキシメチルを示し、
R3は、H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、Yを示し、
R5は、8個までのC原子を有し、任意にアルコキシもしくはカルボキシル基によって単置換もしくは多置換されている、直鎖状もしくは分枝状アルキレン、
および/または
10個までのC原子を有し、任意にアルキル、アルコキシもしくはカルボキシル基によって単置換もしくは多置換されているアリーレン、または
メチレン、エチレン、プロピレン、ヘキシレン、イソプロピレン、イソブチレンまたはフェニレン
を示し、
Mは、H、Na、KまたはNH4を示し、
Zは、MまたはYを示す、
で表される少なくとも1種の水溶性モノマー単位を用いて調製することができる。
本発明のアニオン交換体材料を調製するためのモノマーは、例えば、第一、第二もしくは第三アミノ基を担持するか、または第四アンモニウム塩であり得る。
式中、R7およびR8は、互いに独立して水素または6個までのC原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有することができ、また式中R4は、1〜8個のC原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレンなど、または1〜8個のC原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンなどであり得、また式中R9およびR10は、互いに独立して水素、アルキル、フェニルまたはアルキルフェニル、例えばメチル、エチルまたはベンジルなどの意味を有する、
で表されるアクリレートである。アミノアルキルアクリレート、例えば2−(ジエチルアミノエチル)アクリレート、2−(ジメチルアミノエチル)アクリレートまたは2−(ジメチルアミノプロピル)アクリレート、およびアミノアルキルメタクリレート、例えば2−(ジエチルアミノエチル)メタクリレート、2−(ジメチルアミノエチル)メタクリレートまたは3−(ジエチルアミノプロピル)メタクリレートなどを例として記述する。
式中、R1、R2およびYは、互いに独立して水素または6個までのC原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有し、また式中、
R4は、1〜8個のC原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレンなど、または1〜8個のC原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンなどであり得、また式中
R9およびR10は、互いに独立して水素、アルキル、フェニルまたはアルキルフェニル、例えばメチル、エチルまたはベンジルなどの意味を有する、
で表されるアクリルアミドを用いることである。
R7およびR8は、互いに独立して水素または6個までのC原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有することができ、また式中R4は、1〜8個のC原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレンなど、または1〜8個のC原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンなどであり得、また式中R9、R10およびR11は、互いに独立して水素、アルキル、フェニルまたはアルキルフェニル、例えばメチル、エチルまたはベンジルなどの意味を有する、
で表されるアクリレートである。
R1、R2およびYは、互いに独立して水素または6個までのC原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有し、また式中R4は、1〜8個のC原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレンなど、または1〜8個のC原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンなどであり得、また式中R9、R10およびR11は、互いに独立して水素、アルキル、フェニルまたはアルキルフェニル、例えばメチル、エチルまたはベンジルなどの意味を有する、
で表されるアクリルアミドの使用である。
式中、Y=R6であり、
また式中、
R1およびR2は、互いに独立して
H、6個までのC原子を有する非分枝状または分枝状アルキルを示し、
R3および/またはR6は、互いに独立して
H、非分枝状または分枝状アルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルを示し、
ここでアルキル基は、オキソ基を担持してもよく、
ここでアルキルおよび/またはアリール基は、アルコキシ、フェノキシ、シアノ、カルボキシル、アセトキシまたはアセトアミノ基によって単置換または多置換されていてもよく、
またここで、R3およびR6は一緒に、少なくとも6個のC原子を担持する、
で表される少なくとも1種のモノマー単位を用いて調製することができる。
R3、R6は、互いに独立して
H、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、2−、3−または4−オキサペンチル、2−、3−、4−または5−オキサヘキシル、2−、3−、4−、5−または6−オキサヘプチル、3−ブトキシプロピル、イソプロピル、3−ブチル、イソブチル、2−メチルブチル、イソペンチル、2−メチルペンチル、3−メチルペンチル、2−オキサ−3−メチルブチル、2−メチル−3−オキサヘキシル、2−フェニル−2−オキソエチル、フェノキシエチル、フェニル、ベンジル、フェニルエチルおよびフェニルプロピルを示し、
ここで、R3およびR6は、一緒に少なくとも6個のC原子を担持する、
で表される少なくとも1種のモノマー単位を用いて調製することができる。
ここでY=R6であり、式中、
R1、R2は、互いに独立してHまたはメチルを示し、
R3、R6は、互いに独立して
H、各々4個までのC原子を有するアルキル、アルコキシアルキルを示す、
で表される少なくとも1種の中性モノマー単位を用いて調製した分離材料である。
ここでY=R6であり、式中、
R1、R2は、互いに独立してHまたはメチルを示し、
R3、R6は、互いに独立して
H、メチル、エチル、ブチル、イソプロピル、3−ブチル、イソブチル、メトキシエチルまたはエトキシエチルを示す、
で表される、親水性であり得る少なくとも1種の中性モノマー単位を含む分離材料である。
a)モノマーを水に溶解し、それを任意でさらなるモノマーと混合すること、
b)0.05〜100molの全モノマーを、沈降したポリマー材料1リットルあたり用いるように、得られた溶液を担体材料と混合すること、
c)鉱酸に溶解したセリウム(IV)塩を得られた懸濁液に加え、0〜5の範囲内のpHとすること、および
d)反応混合物を0.5〜72時間にわたりグラフト重合させること
によって行う。
a)イオン強度を増大させることによって、および/または
b)溶液中のpHを変更することによって、
および/または
c)吸着緩衝液のそれとは異なる極性を有する好適な溶離剤によって、
再びイオン性および存在する場合には疎水性基との相互作用によって、分離材料に結合したバイオポリマーを脱着させることによって行うことができる。
・1種または2種以上の目標の成分の、マトリックスから分離する目的での、選択的、部分的に選択的、または非選択的結合または吸着
・1種または2種以上の第2の成分の、第2の成分をマトリックスから分離する目的での、選択的、部分的に選択的、または非選択的結合または吸着
・1種または2種以上の成分の結合または吸着を伴わない、単にサイズ排除クロマトグラフィーによる分子サイズに基づく、物質の混合物の分離
・バイオポリマーの組換え源からの単離、濃縮および/または枯渇
・バイオポリマーの不死化細胞株およびその培養上清からの単離、濃縮および/または枯渇
・タンパク質およびペプチドの単離、濃縮および/または枯渇
・酵素の単離、濃縮および/または枯渇
・モノクローナルおよびポリクローナル抗体ならびに天然に存在するかまたは組換え抗体断片の単離、濃縮および/または枯渇
・食品添加物の単離、濃縮および/または枯渇
・単糖類および多糖類の単離、濃縮および/または枯渇
・グリコシル化タンパク質の単離、濃縮および/または枯渇
・プラスミドDNAの単離、濃縮および/または枯渇
・RNAの単離、濃縮および/または枯渇
・ウイルスの単離、濃縮および/または枯渇
・オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの単離、濃縮および/または枯渇
・リポソームの単離、濃縮および/または枯渇
・血液および乳汁からの生成物の単離、濃縮および/または枯渇
・APIの、API薬剤担体(例えばAPI−リポソーム付加体またはAPI−ナノ粒子付加体)からの分離
・鏡像異性体の単離、濃縮および/または枯渇
本発明のポリマーをまた、薄層クロマトグラフィーにおいて用いることができる。
驚くべきことに、実験により、Ce(IV)で開始されるグラフト重合をまた、水酸基を含まないポリマー上でうまく行うことができることが示され、改善された特性を有する、新規なグラフト重合したクロマトグラフィー材料の調製を可能にする。
用いる粒状の担体材料は、水酸基を含まない沈降したポリマーである。
グラフト重合が完了したところで、得られた分離材料を、希薄な酸性の、または塩基性の溶液で多数回洗浄し、好適な前処理の直後に分離カラム中に導入し、物質分離のために用いることができる。
何らかが不明瞭である場合には、引用した刊行物および特許文献を参照するべきであることは言うまでもない。これらの文献は、対応して、本説明の開示内容の一部と見なされる。
例および説明において、ならびに特許請求の範囲において示す温度は、常に℃である。
例1
ベース担体ポリMMA/EGDMA(内部EGDMA−L01)の合成
2.4gのポリビニルアルコール40−88(Merck)、5.28gの硫酸ナトリウム(Merck)、0.36gのリン酸トリブチル(Merck)および0.48gの乳化剤E30(Leuna Tenside)を、1200mlの水に溶解する。この水相を、40℃に加温する。2.4gのAIBN(Merck)を、120gのトルエン(Merck)、160gのn−ヘプタノール(Merck)、1gのメチルメタクリレート(MMA、Merck)および120gのエチレングリコールジメタクリレート(EGDMA、Merck)に、室温にて溶解する(有機相)。有機相を、不活性化された重合器中の水相に、激しく撹拌しながら迅速に加える。混合物を、50分にわたり65℃に加熱する。この温度を2時間維持し、最後に、混合物を80℃にてさらに4時間重合させる。有機溶媒を、蒸気蒸留によって実質的に除去する。得られたポリマーを、吸引濾過器上でアセトンおよび水で洗浄する。ポリマーの表面積は、488m2/gである。
ベース担体ポリNVP/DVH(内部:DVH−L06)の合成
36gのポリビニルアルコール40−88(Merck)、36gの塩化ナトリウム(Merck)および0.48gの乳化剤E30(Leuna Tenside)を、1200mlの水に溶解する。この水相を、40℃に加温する。1.2gのAIBN(Merck)を、260gの酢酸ブチル(Merck)、1gのN−ビニルピロリドン(NVP、Merck)および140gの1,3−ジビニルイミダゾリン−2−オン(BASF)に、室温にて溶解する(有機相)。有機相を、不活性化された重合器中の水相に、激しく撹拌しながら迅速に加える。混合物を、50分にわたり65℃に加熱する。この温度を2時間維持し、最後に、混合物を80℃にてさらに4時間重合させる。得られたポリマーを、吸引濾過器上でアセトンおよび水で洗浄する。ポリマーの表面積は、408m2/gである。
ベース担体ポリES/DVBの合成
19.8gの水酸化マグネシウム(Merck)、32gの硫酸ナトリウム(Merck)および0.189gの乳化剤E30(Leuna Tenside)を、1050mlの水に溶解する。この水相を、50℃に加温する。1.05gのAIBN(Merck)を、185gのトルエン(Merck)、63gのジビニルベンゼン(Aldrich)および37gのエチルスチレン(Aldrich)に、室温にて溶解する(有機相)。有機相を、不活性化された重合器中の水相に、激しく撹拌しながら迅速に加える。混合物を、50分にわたり72℃に加熱する。この温度を2時間維持し、最後に、混合物を80℃にてさらに4時間重合させる。有機溶媒を、蒸気蒸留によって実質的に除去する。得られたポリマーを、吸引濾過器上でアセトンおよび水で洗浄する。ポリマーの表面積は、596m2/gである。
例1に従って調製したポリMMA/EGDMAベース担体を基にした本発明の強いカチオン交換体(内部06MJ−DZ109)の合成
6.22gの2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(AMPS、Merck)および17gの脱塩水を、最初に250mlの3つ口フラスコ(滴下漏斗、ガス入口管および精密ガラス撹拌器)中に導入する。フラスコを、8℃に冷却する(溶液中における、大気中の酸素の過度の蓄積を防止するため、窒素の穏やかな流れを用いる)。2mlの2M水酸化ナトリウム溶液(Merck)を加え、硝酸(65%、Merck)を用いて、pH5.8に設定する。フラスコを、再び放置して室温とし、これにさらに窒素を流す。一晩重力下で沈降した、例1に従って調製した20mlのポリマーを、この溶液に加える。混合物を、脱塩水で60mlの総容積とする。pHを、5.8に再設定する。また、16μlのドデカノールを加える。1.4gの脱塩水を、ビーカー中で0.29gの65%硝酸と混合する。0.66gの硝酸アンモニウムセリウム(IV)(Merck)を、この溶液に溶解する。フラスコ中の懸濁液を、42℃に加温する。
例2に従って調製したポリNVP/DVHベース担体を基にした、本発明の強いカチオン交換体(内部07MJ−DZ078)の合成
3.73gの2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(AMPS、Merck)および25gの脱塩水を、最初に250mlの3つ口フラスコ(滴下漏斗、ガス入口管および精密ガラス撹拌器)中に導入する。フラスコを、8℃に冷却する(溶液中における、大気中の酸素の過度の蓄積を防止するため、窒素の穏やかな流れを用いる)。2mlの2M水酸化ナトリウム溶液(Merck)を加え、硝酸(65%、Merck)を用いて、pH5.8に設定する。フラスコを再び室温に放冷し、これにさらに窒素を流す。一晩重力下で沈降した、例2に従って調製した15mlのポリマーを、この溶液に加える。混合物を、脱塩水で90mlの総容積とする。pHを、5.8に再設定する。また、24μlのドデカノールを加える。1.0gの脱塩水を、ビーカー中で0.44gの65%硝酸と混合する。0.49gの硝酸アンモニウムセリウム(IV)(Merck)を、この溶液に溶解する。フラスコ中の懸濁液を、42℃に加温する。
例3に従って調製したポリES/DVBベース担体を基にした、強いカチオン交換体(内部07MJ−PP005)の合成
15.55gの2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(AMPS、Merck)および34gの脱塩水を、最初に250mlの3つ口フラスコ(滴下漏斗、ガス入口管および精密ガラス撹拌器)中に導入する。フラスコを、8℃に冷却する(溶液中における、大気中の酸素の過度の蓄積を防止するため、窒素の穏やかな流れを用いる)。3gの32%水酸化ナトリウム溶液(Merck)を加え、硝酸(65%、Merck)を用いて、pH5.8に設定する。フラスコを再び室温に放冷し、これにさらに窒素を流す。一晩重力下で沈降した、例3に従って調製した50mlのポリマーを、この溶液に加える。混合物を、脱塩水で120mlの総容積とする。pHを、5.8に再設定する。また、32μlのドデカノールを加える。6.75gの脱塩水を、ビーカー中で0.725gの65%硝酸と混合する。1.65gの硝酸アンモニウムセリウム(IV)(Merck)を、この溶液に溶解する。フラスコ中の懸濁液を、42℃に加温する。
例4からの記載に従って調製した強いイオン交換体の静的タンパク質結合能
静的タンパク質結合能を決定するために、例4に従って調製した強いイオン交換体を、pH5.0に調整された25mMのリン酸塩および25mMの酢酸塩からなる緩衝液混合物で洗浄する。100μlのゲルを、pH5.0の25mMのリン酸塩および25mMの酢酸塩中の、12.5mg/mlのリゾチーム溶液1mlで帯電させ、シェーカー上で120分間インキュベートする。未結合のリゾチームを除去するために、ゲルを、その後、pH5.0に調整された25mMのリン酸塩および25mMの酢酸塩を含む緩衝液混合物で洗浄する。強いイオン交換体に結合したタンパク質を、pH7.0の25mMのリン酸塩、25mMの酢酸塩および1M NaClからなる緩衝液混合物を用いて溶出する。溶離液中のタンパク質濃度を、254nmにおけるUV吸収によって決定する。用いた強いイオン交換体1mlあたり、67.3mgのタンパク質の結合能が得られる。
例5からの記載に従って調製した強いイオン交換体の静的タンパク質結合能
静的タンパク質結合能を決定するために、例5に従って調製した強いイオン交換体を、pH5.0に調整された25mMのリン酸塩および25mMの酢酸塩からなる緩衝液混合物で洗浄する。100μlのゲルを、pH5.0の25mMのリン酸塩および25mMの酢酸塩中の、12.5mg/mlのリゾチーム溶液1mlで帯電させ、シェーカー上で120分間インキュベートする。未結合のリゾチームを除去するために、ゲルを、その後、pH5.0に調整された25mMのリン酸塩および25mMの酢酸塩を含む緩衝液混合物で洗浄する。強いイオン交換体に結合したタンパク質を、pH7.0の25mMのリン酸塩、25mMの酢酸塩および1M NaClからなる緩衝液混合物を用いて溶出する。溶離液中のタンパク質濃度を、254nmにおけるUV吸収によって決定する。用いた強いイオン交換体1mlあたり、67.5mgのタンパク質の結合能が得られる。
例6からの記載に従って調製した強いイオン交換体の静的タンパク質結合能
静的タンパク質結合能を決定するために、例6に従って調製した強いイオン交換体を、pH5.0に調整された25mMのリン酸塩および25mMの酢酸塩からなる緩衝液混合物で洗浄する。100μlのゲルを、pH5.0の25mMのリン酸塩および25mMの酢酸塩中の、12.5mg/mlのリゾチーム溶液1mlで帯電させ、シェーカー上で120分間インキュベートする。未結合のリゾチームを除去するために、ゲルを、その後、pH5.0に調整された25mMのリン酸塩および25mMの酢酸塩を含む緩衝液混合物で洗浄する。強いイオン交換体に結合したタンパク質を、pH7.0の25mMのリン酸塩、25mMの酢酸塩および1M NaClからなる緩衝液混合物を用いて溶出する。溶離液中のタンパク質濃度を、254nmにおけるUV吸収によって決定する。用いた強いイオン交換体1mlあたり、57.6mgのタンパク質の結合能が得られる。
Claims (16)
- クロマトグラフィー材料の調製方法であって、表面上にOH基を有しない有機ポリマーベース材料を、
Ce(IV)触媒の存在下でグラフト重合させ、
ここで、ポリマーベース材料が、ビニル基を含み、遊離の水酸基を含まないモノマーの重合によって形成されるポリマーを含むことを特徴とする、前記方法。 - 用いるポリマーベース材料が、ポリビニル基含有モノマーであるジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルピリジン、ジビニルナフタレン、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリプロピレングリコールジメタクリレート、N,N−メチレンビスアクリルアミド、N,N−ジビニルエチレン尿素およびN,N−ジビニルプロピレン尿素、ならびにモノビニル基含有モノマーの群から選択されるモノマーを重合または共重合することによって調製される粒子状ポリマーまたは成形ポリマーであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- モノビニル基含有モノマーが、グリシジルメタクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、ブチルメタクリレート、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、ブチルアクリレート、N−ビニルピロリドン、N−メチル−N−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、クロロスチレンおよびアミノスチレンの群から選択されるモノマーである、請求項2に記載の方法。
- 用いるベース材料が、20nm〜1000μmの範囲内の平均粒径を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 用いるベース材料が、20〜1200m2/gの範囲内の平均粒子表面積を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 用いるベース材料が、100〜600m 2 /gの範囲内の粒子表面積を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- モノリシック体の形態のベースポリマーをグラフト重合させることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- グラフト重合を、触媒としての硝酸アンモニウムセリウム(IV)の存在下で行うことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- Ce(IV)イオンで触媒される反応を、硝酸、硫酸および塩酸の群から選択される少なくとも1種の無機酸の存在下で行うことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- グラフト重合を、プロトン性溶媒中で行うことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 用いる溶媒が水であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- a)親水性モノマーを、水に溶解し、それを任意でさらなるモノマーと混合し、
b)得られた溶液を担体材料と混合することにより、沈降したポリマー材料1リットルあたり0.05〜100molの全モノマーを用いるようにし、
c)鉱酸に溶解したセリウム(IV)塩を、得られた懸濁液に加え、0〜5の範囲内のpHとし、
d)反応混合物を、0.5〜72時間にわたりグラフト重合させる
ことを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法によって調製される、分離材料。
- 請求項13に記載の分離材料を含有する、クロマトグラフィーカラム。
- 請求項13に記載の分離材料の、クロマトグラフィーカラムにおける使用。
- バイオポリマーを液状媒体から分離するための、請求項13に記載の分離材料の使用。
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