JPH09503698A - ポリアクリルアミドのエポキシ誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、以下のａ）〜ｄ）を特徴とする、エポキシ−置換ポリ（メタ）アクリルアミドを含む活性化基材に関する。ａ）基礎としての基体は脂肪族ヒドロキシル基を有し、ｂ）共有結合ポリマーは最終位置のモノマー単位を経由して基体に結合し、ｃ）ポリマーは以下の式（Ｉ）のモノマー単位を含み、ｄ）モノマー単位は線状に架橋する。 ［但し上式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、Ｒ⁴はＨ又は１〜５の炭素原子数を有するアルキル基であり、ｎは１と５の間の全整数である。］本発明はまた、前記活性化基体物質の使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリアクリルアミドのエポキシ誘導体 本発明は、エポキシ−置換ポリ（メタ）アクリルアミドからなる活性化基材、 ならびにその使用に関する。 活性化基材は、アフィニティクロマトグラフィーや酵素の固定化に用いる基体 の製造に重要な中間体である。さらに、ポリマー生成におけるのと類似の反応に より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉ ｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）クロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロ マトグラフィー及び金属キレートクロマトグラフィー用の分離材を製造するのに 活性化基材を使用することが可能である。 架橋したポリ（メタ）アクリレートのエポキシ誘導体から誘導される活性化基 材は公知である。しかしながら、これら物質はその剛性構造に起因する欠点を有 している。ドイツ特許出願ＤＥ ４３ １０ ９６４は、エポキシ（メタ）アク リレートに基づく非架橋グラフトポリマーについて記載している。本発明はさら に、エポキシ‐置換ポリ（メタ）アクリルアミドに基づく非架橋グラフトポリマ ーを提供するものである。 本発明は、ヒドロキシル基を有する基体を基礎とし、その表面上にポリマーが 共有結合している活性化基材に関し、以下を特徴とする。 ａ） 前記基体は脂肪族ヒドロキシル基を有し、 ｂ） 共有結合ポリマーは末端モノマー単位経由で基体に結合しており、 ｃ） 前記ポリマーは下記式（Ｉ）のモノマー単位を含み、 ｄ） 前記モノマー単位は線状に連結している。 ［但し上式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、Ｒ⁴はＨ又 は１〜５の炭素原子数を有するアルキル基であり、ｎは１と５の間の整数である ］。 本発明は、ヒドロキシル基を有する基体を基礎とし、その表面上にポリマーが 共有結合している活性化基材の製造方法に関し、以下のプロセスステップを特徴 とする。 ａ）式（ＩＩ） ［但し上式中、Ｒ⁴はＨ又は１〜５の炭素原子数を有するアルキル基であり、ｎ は１と５の間の整数である］ のクロロヒドリン−含有アルキルアミンのアクリロイル化（ａｃｒｙｌｏｙｌａ ｔｉｏｎ）、 ｂ）セリウム（IV）イオン存在下で、ａ）ステップからのモノマーの、ヒドロ キシル基を有する基礎基体粒子上へのグラフト重合、 ｃ）クロロヒドリンラジカルをエポキシドにする反応。 本発明はまた、本発明による活性化基材の、クロマトグラフィー用分離材の製 造及び酵素の固定への使用にも関する。 本発明は、分離機能材料（ｓｐａｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）を本発明 の活性化基材に結合させることを特徴とする、クロマトグラフィー用分離材の製 造方法に関し、さらにこれらの方法によって製造され たクロマトグラフィー用分離材にも関する。 本発明は、酵素を本発明による活性化基材に結合させることを特徴とする固定 化酵素の製造方法に関し、さらにこれら方法により製造された固定化酵素に関す る。 式（ＩＩ）の前記クロロヒドリン−含有アルキルアミンは、市販品が得られな い場合は、当業者は慣用方法によってつくることができる。実施例は種々のプロ セスのうちの１つを説明する。 式（ＩＩ）のアルキルアミンのアクリロイル化に適するプロセスは、当業者に はよく知られているものである。例えば、適当な反応はシヨッテン−バウマン（ Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎ）の方法及びその変法である。使用されるアク リル又はメタクリル酸の誘導体は、その酸塩化物が好ましい。他の適当な誘導体 は当業者にはよく知られたものであり、例としては酸アジ化物又は無水物である 。アクリロイル化は重合抑制剤の存在下に行うのが好ましい。 ここに説明する本発明における基体は粒子状であるが、膜やフィラメントの形 態のもの、さらにまた、ネット状、ティッシュ状、又はスポンジ状のものであっ ても良く、これらの基体の上にポリマーがグラフトする。使用することのできる 基礎としての基体は、一般に、慣用の多孔性又は無孔性の基体粒子であるが、但 しこれら粒子が第１級又は第２級の脂肪族ヒドロキシル基をそれらの表面に有す るか、又はそれ自体公知の方法で導入された脂肪族ヒドロキシル基をもつことが できることを条件とする。適当な基体は、とりわけ、アガロースをベースとする 多糖類、セルロース、セルロース誘導体及びデキストランをベースとするポリマ ーを含む。好ましいのは、ポリビニルアルコールをベースとするポリマー、又は （メタ）アクリレート誘導体のコポリマー、及び脂肪族ヒドロキシル基を有する コモノマーである。特に好ましいのは、基礎基体としてのジオールで修飾したシ リカゲルであり、更に脂肪族ヒドロキシル基を有するポリビニルをベースとした コポリマーである。この種の基体材料は市場で入手可能である。その例は、脂肪 族ヒドロキシル基（１ミリ当量のＯＨ／ｇ）を有し、多孔性のビニルをベースと するコポリマーのフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ：登録商標）ＴＳＫ ＨＷ ６５ （Ｓ） ［イー、メルク社（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）製］であり、同様に脂肪 族ヒドロキシル基を有するジオール‐置換シリカゲルのリクロスファージオール （ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＤＩＯＬ）（メルク社製）である。 基礎基体への置換アクリルアミドのグラフト重合は、ミノ（Ｇ．Ｍｉｎｏ）及 びＳ．カイザーマン（Ｓ．Ｋａｉｚｅｒｍａｎ）によるジヤーナル オブポリマ ー サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）３１，２４２〜２４３，（ １９５８）及びミノらによるポリマーサイエンス３８，３９３〜４０１，（１９ ５９）に記載されているように、セリウム（IV）イオンによって開始される。ミ ノ及びカイザーマンのグラフト重合は、硝酸で酸性化された純粋な水溶液中で公 知方法により行われる。それ故、この反応は容易に水溶性のモノマーによっての み行うことができる。しかしながら、使用する溶媒がヒドロキシル基を持たない 有機溶媒と水との混合物である場合は、セリウム（IV）塩の反応も同様に可能で あることがわかった。これに関して特に好ましいのは、ジオキサンとテトラヒド ロフランである。この反応混合物中における有機溶媒の割合は、容積％で好まし くは１０〜８０％、特に好ましくは２０〜５０％である。 クロロヒドリンのエポキシドへの反応は、当業者になじみの各種方法によって 起こる。 分析物とクロマトグラフィー用分離材との間の相互作用には、分離機能材が必 要とされる。当業者は多くの分離機能材を知っており、これをクラマトグラフィ ー用分離方法にしたがって選択するであろう。そのような分離方法の例には、イ オン交換クロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、疎水 性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティクロ マトグラフィーがある。 イオン交換クロマトグラフィーに関して知られている分離機能材は、例えば第 ４級アンモニウムアルキル基及びＳＯ₃‐基などのイオン基、ならびに一定のｐ Ｈ条件でイオンを生成するイオノゲン基である。後者の基は、例えばアルキル化 アミノ基、カルボキシル基及びリン酸基を有する。 疎水性相互作用クロマトグラフィー用の慣用分離機能材は、例えばＣ₁〜Ｃ₂₀ ‐アルキル基、Ｃ₆〜Ｃ₂₅−アリール基、Ｃ₇〜Ｃ₂₅−アルキルアリール基、又は Ｃ₇〜Ｃ₂₅−アリールアルキル基などの非荷電疎水性分離機能材であり、これら はニトリル又はＣ₁〜Ｃ₅−アルコキシ基により１回以上誘導体化することもでき ；１以上の非隣接ＣＨ₂基についてはＮＨ又はＯによって置き換えることが可能 であり、さもなくば１以上のＣＨ基についてはＮによって置き換えることも可能 であり；さらに他の例は、ポリオキシエチレン又はポリオキシプロピレン誘導体 ［（ＣＨ₂）m−Ｏ−］o−Ｒ⁹であり、上式中、ｍは２又は３、ｏは１〜２００の 間の整数、そしてＲ⁹はＨ又はＣ₁〜Ｃ₅−アルキル基である。特に好ましいのは 、中程度又は低い疎水性のラジカルである。 アフィニティクロマトグラフィー用には、当業者は極めて多くのアフィニティ リガンドを知っており、各 それらのリガンドは分析物との間で構造的に規定された結合をなし、分離機能材 として適当である。例は以下のようである：アフィニティリガンド 分析物（例） プロテイン Ａ 免疫グロブリン コンカナバリン Ａ 糖蛋白質 ビオチン アバジン／ ストレプトアビジン アビジン ビオチン ストレプトアビジン ビオチン ５’‐アデノシンモノ ＮＤＡ−依存酸化還元酵素 フォスフェート ２’，５’‐アデノシン ＮＡＤＰ‐依存酸化還元酵 ジフォスフェート 素 アミノアクリジン ＲＮＡ又はＤＮＡ ホウ酸（bronic acid） カテコールアミン ホウ酸（bronic acid） グリコシル化ヘモグロビン イミノジ酢酸 金属蛋白質 チオフィリックリガンド 免疫グロブリン （thiophilic ligand） シバクロン ブルー モノクローナル抗体 （Cibacron blue） 活性化基材の活性エポキシド基との反応によって分離機能材を導入し、使用す る分離機能材により予め決 められる特定用途のためのクロマトグラフィー用分離材を生成させることができ る。適当な反応は原則として知られており、例えばそれらは以下のａ）〜ｃ）を 含む。 ａ）イオン交換体を与えるための、亜硫酸又はその塩、あるいは第１級、第２ 級又は第３級アミンとの反応； ｂ）疎水性分離材を与えるための、アルコール、フェノール又は第１級アミン との反応； ｃ）アフィニティクロマトグラフィー用の基体を与えるための、イミノジ酢酸 との反応、あるいはチオフィリックリガンド又はプロテインＡのような他のアフ ィニティリガンドの導入。 さらに述べるまでもなく、当業者は上述の説明を最大限において利用すること ができるものと思われる。したがって、好ましい実施態様はひとえに説明するた めのものであり、いかなる意味においても限定する開示としてでは決してないと 解釈さるべきである。 以上及び以下に説明のすべての出願、特許、刊行物の完全な開示、ならびに１ ９９３年１０月８日提出の該当出願ＤＥ ４３ ３４ ３５９を参考文献として 本願中に引用する。 実施例 以下の実施例は本発明を説明するためのものであっ て、限定するものではない。 実施例１： アクリルアミドのクロロヒドリン誘 導体の合成 ステップ１ ６０ｇの乾燥フタルイミドカリウムと１２０ｇの１，３‐ジクロロヒドリンを 還流下に６時間に亘って２００℃に加熱した。この反応生成物を次いで水で煮沸 して抽出した。次いでこの水をロータリーエバポレーターで減圧下に除去し、残 留物を次の合成ステップに直接使用した。 ステップ２ ステップ１からの反応生成物３０ｇを、５０％ヒドラジン水和物と５０％エタ ノールの溶液中において６０℃で２時間加熱した。次いで１モル塩酸の１００ｍ ｌを加え、この混合物を再び６０℃で２時間加熱した。フタル酸ヒドラジドが沈 澱し、これを瀘過した。次いで瀘液を減圧下にロータリーエバポレーターで濃縮 した。この反応生成物を次いで１モル水酸化ナトリウム溶液の１００ｍｌ中に取 り入れた。得られた溶液を次の合成ステップ用に使用した。 ステップ３ ステップ２からの溶液に、氷冷と撹拌をしながら、２０ｍ１の塩化アクリロイ ルを滴下しながら添加した。この混合物を続いてさらに２時間撹拌した。 実施例２： アクリルアミドのクロロヒドリン誘導 体のグラフト重合 実施例１のステップ３からの溶液を５０ｍｌの水で湿らせたフラクトゲル（登 録商標）ＴＳＫ ＨＷ ６５ （Ｓ）（メルク社）に加えた。この反応溶液を１ ５０ｒｐｍの回転数で撹拌した。次いで開始剤溶液（２５ｍｌの水中に３ｇの硝 酸セリウム（IV）アンモニウムと３ｇの濃硝酸を加えたもの）を加えた。３時間 後重合を停止させ、ゲルを１モル水酸化ナトリウム溶液中の稀硫酸で洗浄した。 実施例３： オキシラン誘導体を与えるポリマー類似反応 クロロヒドリン誘導体のポリマーを対応するオキシラン誘導体に転化させるた め、実施例２によって製造されたゲルを１モル水酸化ナトリウム溶液中において ６０℃で５時間撹拌した。冷却後、このゲルを中性になるまで洗浄した。 オキシラン基の含量（過塩素酸による滴定で測定）は、１ｇのゲル当たり０． ５ミリモルであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒドロキシル基を有する基体を基礎とし、その表面上にポリマーが共有結合 している活性化基材であって、以下： ａ）該基礎基体は脂肪族ヒドロキシル基を有し、 ｂ）該共有結合ポリマーは該基体に末端モノマー単位を経由して結合しており 、 ｃ）該ポリマーは下記式（Ｉ）のモノマー単位を含み、 ｄ）該モノマー単位は線状に連結している。 ［但し上式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、Ｒ⁴はＨ又 は１〜５の炭素原子数を有するアルキル基であり、ｎは１と５の間の整数である ］ を特徴とする前記活性化基材。 ２．ヒドロキシル基を有する基体を基礎とし、その表面上にポリマーが共有結合 している活性化基材の製造方法であって、以下のプロセスステップ： ａ）式（ＩＩ） ［但し上式中、Ｒ⁴はＨ又は１〜５の炭素原子数を有するアルキル基であり、ｎ は１と５の間の整数である。］ のクロロヒドリン−含有アルキルアミンのアクリロイル化、 ｂ）セリウム（IV）イオン存在下における、ステップａ）からのモノマーのヒ ドロキシル基を有する基礎基体粒子上へのグラフト重合、及び ｃ）クロロヒドリンラジカルのエポキシドへの反応： を特徴とする前記製造方法。 ３．請求項１に記載の活性化基材の、クロマトグラフィー用分離材の製造への使 用。 ４．請求項１に記載の活性化基材の、酵素の固定化への使用。 ５．分離機能材が請求項１に記載の活性化基材に結合することを特徴とする、ク ロマトグラフィー用分離材の製造方法。 ６．請求項５に記載の方法によって製造することがで きるクロマトグラフィー用分離材。 ７．請求項１に記載の活性化基材に結合することを特徴とする、酵素の固定化方 法。 ８．請求項７に記載の方法によって製造することができる固定化酵素。