JP5614477B2 - SARS3CL protease recombinant protein - Google Patents
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Description
本発明は、SARS 3CLプロテアーゼの組換えタンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベク
ター、及び前記組換えタンパク質のSARS 3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリー
ニングする方法等に関する。
The present invention relates to a recombinant protein, polynucleotide, recombinant vector of SARS 3CL protease, and a method for screening a substance that inhibits the SARS 3CL protease activity of the recombinant protein.
重症急性呼吸器症候群（SARS)は、新型コロナウイルス（SARS CoV)の感染により発症す
る急性呼吸器疾患である（非特許文献1〜3）。2003年にSARS CoVの存在が確認されて以降
、SARS CoVを標的としたSARSの治療方法を開発すべく研究が進められているが、いまだSA
RSに対する有効な治療方法は確立されていない。
Severe acute respiratory syndrome (SARS) is an acute respiratory disease that develops due to infection with a new coronavirus (SARS CoV) (Non-Patent Documents 1 to 3). Since the existence of SARS CoV was confirmed in 2003, research has been conducted to develop SARS treatment methods targeting SARS CoV.
An effective treatment for RS has not been established.
SARS CoVは、ポジティブセンスの一本鎖RNAウイルスであり、今日知られている中で最
大のウイルスRNAゲノムを有する（非特許文献４，５)。SARS CoVのゲノムRNAは、ポリタ
ンパク質1a(〜450kDa)および1ab(〜750kDa)という、重複配列を有する２種類の大きなタ
ンパク質をコードしている。ゲノムRNAがポリタンパク質1aおよび1abに翻訳され、さらに
、翻訳されたこの２種類のタンパク質が２種類もしくは３種類のウイルスプロテアーゼに
よって自己触媒的に切断されることで機能性ポリペプチドが生じる（非特許文献６）。こ
の切断は、主に、3C-様プロテアーゼ（3CLプロテアーゼ)と呼ばれる33kDaのプロテアーゼ
により行われる（非特許文献７，８）。3C-様プロテアーゼ（3CLプロテアーゼ)という名
前は、その基質特異性がピコルナウイルス3Cプロテアーゼのものに類似していることに由
来する。
SARS CoV is a positive-sense single-stranded RNA virus and has the largest viral RNA genome known today (Non-Patent Documents 4 and 5). SARS CoV genomic RNA encodes two large proteins with overlapping sequences, polyproteins 1a (-450 kDa) and 1ab (-750 kDa). Genomic RNA is translated into polyproteins 1a and 1ab, and these two translated proteins are autocatalytically cleaved by two or three viral proteases, resulting in a functional polypeptide (non-patented) Reference 6). This cleavage is mainly performed by a 33 kDa protease called 3C-like protease (3CL protease) (Non-patent Documents 7 and 8). The name 3C-like protease (3CL protease) comes from its substrate specificity being similar to that of picornavirus 3C protease.
天然型SARS 3CLプロテアーゼは、キモトリプシンフォールドを含むアミノ酸306残基か
らなるシステインプロテアーゼであり、ポリタンパク質1aおよび1abを、P1位置の保存さ
れたGlnやP1’位置の小さいアミノ酸（Ser、Ala又はGly)を含む１１個の保存部位で切断
する。活性型のSARS 3CLプロテアーゼはホモ二量体として存在し、各33kDaのプロトマー
は、２つの触媒残基(Cys−His)を含む活性部位を有する（図１）。
Natural SARS 3CL protease is a cysteine protease consisting of 306 amino acids including chymotrypsin fold. Is cut at 11 conserved sites. The active form of the SARS 3CL protease exists as a homodimer and each 33 kDa protomer has an active site containing two catalytic residues (Cys-His) (FIG. 1).
このようにSARS 3CLプロテアーゼは、ウイルス生活環において機能的に重要な役割を果
たしており、SARS CoVの増殖に必須のタンパク質である。ウイルスの増殖に必須のSARS 3
CLプロテアーゼの働きを阻害することで、SARS CoVの増殖を抑制することができ、SARSの
治療にもつながると考えられる。このため、SARS 3CLプロテアーゼは、構造に基づいて行
うSARSに対する薬剤設計の魅力的な標的であり、これまでにいくつかのSARS 3CLプロテア
ーゼ阻害物質が報告されている（非特許文献９）。しかし、今日までSARSの治療につなが
るようなSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質は見つかっていない。
Thus, SARS 3CL protease plays a functionally important role in the viral life cycle, and is an essential protein for SARS CoV growth. SARS 3 essential for virus propagation
By inhibiting the action of CL protease, SARS CoV growth can be suppressed, and it is thought to lead to SARS treatment. For this reason, SARS 3CL protease is an attractive target for drug design for SARS based on the structure, and several SARS 3CL protease inhibitors have been reported so far (Non-patent Document 9). To date, however, no SARS 3CL protease inhibitor has been found that could lead to SARS treatment.
このような状況の下、SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質の効率的なスクリーニン
グ方法が求められていた。
Under such circumstances, an efficient screening method for inhibitors against SARS 3CL protease has been demanded.
本発明者は、SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質の効率的なスクリーニング方法を
開発すべく検討を重ねた。本発明者は、検討を重ねる中で、天然型のSARS 3CLプロテアー
ゼは、その発現と平行してその分解が進行していることを見出した。すなわち、天然型SA
RS 3CLプロテアーゼは発現から比較的短時間で分解が進行する結果、安定なSARS 3CLプロ
テアーゼを大量に調製することができず、このため、これまでSARS 3CLプロテアーゼに対
する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができなかったことが分かった。本発明
者は、さらに検討を重ね、発現後比較的長時間の間分解がほとんど起こらない変異型SARS
3CLプロテアーゼ（安定型SARS 3CLプロテアーゼともいう）を開発した。そして、本発明
者は、この開発した変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いてSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質
をスクリーニングすることで、SARS 3CLプロテアーゼ阻害物質を効率的にスクリーニング
することができることを見出し、本発明を完成させた。
The present inventor has repeatedly studied to develop an efficient screening method for inhibitors against SARS 3CL protease. As a result of repeated studies, the present inventor has found that the degradation of the natural SARS 3CL protease proceeds in parallel with its expression. That is, natural SA
As a result of degradation of RS 3CL protease in a relatively short time after expression, stable SARS 3CL protease cannot be prepared in large quantities. Therefore, screening for inhibitors against SARS 3CL protease has been effective so far. I found out that I couldn't. The present inventor has further studied, and mutant SARS that hardly decomposes for a relatively long time after expression.
3CL protease (also called stable SARS 3CL protease) has been developed. The present inventor found that the SARS 3CL protease inhibitor can be efficiently screened by screening the SARS 3CL protease inhibitor using the developed mutant SARS 3CL protease, and completed the present invention. I let you.
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸が他のア
ミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、又は
前記置換されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテ
アーゼ活性を有する、組換えタンパク質。
（２）前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン
、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、ア
スパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸である、上記（１）に記載
の組換えタンパク質。
（３）前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸がイソロイシンである、上記
（２）に記載の組換えタンパク質。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第188番目のアミノ酸を除く１若しく
は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌ
クレオチド。
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドであって、3CLプロテアーゼ活性を有し、かつ、第188番目のアミノ酸がイソロイシンで
あるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（７）上記（５）又は（６）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
（８）上記（７）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（９）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質に候補物質を接触さ
せ、候補物質の中から前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をス
クリーニングする方法。
（１０）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質を含む、前記組換えタ
ンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
（１１）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を含む、SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤。
（１２）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を含む、SARS治療用医薬組成物。
（１３）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を用いる、SARS 3CLプロテアーゼの阻害方法。
（１４）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を患者に投与することを含む、SARSの治療方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) The amino acid sequence of the natural SARS 3CL protease consists of an amino acid sequence in which the 188th amino acid is substituted with another amino acid, or one or more of the substituted amino acid sequences excluding the 188th amino acid A recombinant protein comprising an amino acid sequence in which one amino acid is deleted, substituted, inserted and / or added, and having 3CL protease activity.
(2) The other amino acid substituted for the 188th amino acid is an amino acid selected from the group consisting of isoleucine, leucine, valine, alanine, glycine, methionine, tryptophan, serine, threonine, asparagine and glutamine. The recombinant protein according to (1) above.
(3) The recombinant protein according to (2) above, wherein the other amino acid substituted with the 188th amino acid is isoleucine.
(4) The following recombinant protein (a) or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) one or more amino acids except the 188th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted, inserted and / or added A recombinant protein comprising the amino acid sequence and having 3CL protease activity (5) A polynucleotide encoding the recombinant protein according to any one of (1) to (4) above.
(6) A polynucleotide comprising the following polynucleotide (a) or (b):
(A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) hybridizing with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions A polynucleotide encoding a protein having 3CL protease activity and wherein the 188th amino acid is isoleucine (7) a recombinant comprising the polynucleotide according to (5) or (6) above vector.
(8) A transformant comprising the recombinant vector according to (7) above.
(9) A method of contacting a candidate substance with the recombinant protein according to any one of (1) to (4) above, and screening a substance that inhibits the 3CL protease activity of the recombinant protein from the candidate substance .
(10) A kit for screening a substance that inhibits the 3CL protease activity of the recombinant protein, comprising the recombinant protein according to any one of (1) to (4).
(11) CH 3 CO-Thr -Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3) 2) -CHO, CH 3 CO-Val-Leu-NHCH (
CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and CH 3 CO-S
er-Ala-Val-Leu- NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3) 2) is selected from the group consisting of -CHO comprising at least one compound or a salt thereof, SARS 3CL protease inhibitors.
(12) CH 3 CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Val-Leu-NHCH (
CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and CH 3 CO-S
A pharmaceutical composition for treating SARS, comprising at least one compound selected from the group consisting of er-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO or a salt thereof.
(13) CH 3 CO-Thr -Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3) 2) -CHO, CH 3 CO-Val-Leu-NHCH (
CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and CH 3 CO-S
A method of inhibiting SARS 3CL protease using at least one compound selected from the group consisting of er-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO or a salt thereof.
(14) CH 3 CO-Thr -Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3) 2) -CHO, CH 3 CO-Val-Leu-NHCH (
CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and CH 3 CO-S
A method for treating SARS, comprising administering to a patient at least one compound selected from the group consisting of er-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO or a salt thereof .
本発明は、発現後比較的長時間の間分解がほとんど起こらない変異型SARS 3CLプロテア
ーゼ、及びその変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いて行うSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質
の効率的なスクリーニング方法を提供する。
The present invention provides a mutant SARS 3CL protease that hardly decomposes for a relatively long time after expression, and an efficient screening method for SARS 3CL protease inhibitors performed using the mutant SARS 3CL protease.
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されるこ
とはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施
し得る。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. However, the scope of the present invention is not limited to these descriptions, and modifications other than the following exemplifications can be made as appropriate without departing from the spirit of the present invention.
１．概要
SARS CoVのSARS 3CLプロテアーゼは、SARS CoVの増殖のための主要酵素である。したが
って、SARS 3CLプロテアーゼを阻害することができれば、SARS CoVの増殖を抑制すること
ができ、結果としてSARSの治療につながると考えられる。このため、SARSの治療につなが
るようなSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質が求められていた。しかし、現在までに、SARSの
治療につながるような有効な阻害物質は見つかっていない。SARS 3CLプロテアーゼに対す
る有効な阻害物質が見つからない原因は、これまでSARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物
質の効率的なスクリーニング方法がないことにあると考えられた。そこで、本発明者は、
SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質の効率的なスクリーニング方法を開発すべく検討
を重ねた。
1. Overview
SARS CoV SARS 3CL protease is the primary enzyme for SARS CoV growth. Therefore, if SARS 3CL protease can be inhibited, the growth of SARS CoV can be suppressed, and as a result, it is considered to lead to the treatment of SARS. For this reason, a SARS 3CL protease inhibitor that can lead to the treatment of SARS has been demanded. However, to date, no effective inhibitor has been found that could lead to SARS treatment. The reason why no effective inhibitor for SARS 3CL protease was found was thought to be the lack of an efficient screening method for inhibitors against SARS 3CL protease. Therefore, the present inventor
Studies were conducted to develop an efficient screening method for inhibitors against SARS 3CL protease.
本発明者は、天然型SARS 3CLプロテアーゼにMBP(マルトース結合タンパク質)−His（６
個のヒスチジン）−Flagタグを結合した融合タンパク質を用いた研究において、天然型SA
RS 3CLプロテアーゼがその発現と平行して２つのタンパク質断片に分解され、その結果、
SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性が低下することを見出した。さらに、そのタンパク質断
片を用いた配列決定解析により、SARS 3CLプロテアーゼが第188番目のアミノ酸であるア
ルギニンと第189番目のアミノ酸であるグルタミンの間で分解を受けることが判明した。
すなわち、天然型SARS 3CLプロテアーゼの発現と平行してその分解が進行していた結果、
安定なSARS 3CLプロテアーゼを大量に調製することができず、このため、これまでSARS 3
CLプロテアーゼに対する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができなかったと考
えられた。
The inventor of the present invention added MBP (maltose binding protein) -His (6
Natural histidine) -Flag tags in a fusion protein
RS 3CL protease is broken down into two protein fragments in parallel with its expression, resulting in
It was found that the catalytic activity of SARS 3CL protease is reduced. Furthermore, sequencing analysis using the protein fragment revealed that SARS 3CL protease was degraded between the 188th amino acid arginine and the 189th amino acid glutamine.
That is, as a result of its degradation proceeding in parallel with the expression of the natural SARS 3CL protease,
A large amount of stable SARS 3CL protease could not be prepared, and so far SARS 3
It was considered that inhibitors against CL protease could not be efficiently screened.
本発明者は、さらに検討を重ね、発現から比較的長時間分解がほとんど起こらない変異
型SARS 3CLプロテアーゼ（安定型SARS 3CLプロテアーゼともいう）を開発した。この本発
明の変異型SARS 3CLプロテアーゼは、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち
第188番目のアミノ酸がイソロイシン等の他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からな
る組換えタンパク質等である。天然型SARS 3CLプロテアーゼの第188番目の位置のアルギ
ニンをイソロイシン等の他のアミノ酸に置換することで、発現から比較的長時間の間分解
がほとんど起こらなくなり、SARS 3CLプロテアーゼの安定性が著しく向上した。後記の実
施例に示したように、天然型SARS 3CLプロテアーゼの第188番目のアミノ酸をイソロイシ
ンに置換したアミノ酸配列からなる組換えタンパク質は、ウンデカペプチド基質SO1をＫm
＝33.8μMおよびkcat＝4753s−1の効率で消化することができた。
The inventor has further studied and developed a mutant SARS 3CL protease (also referred to as a stable SARS 3CL protease) that hardly decomposes for a relatively long time after expression. The mutant SARS 3CL protease of the present invention is a recombinant protein comprising an amino acid sequence in which the 188th amino acid in the amino acid sequence of the natural SARS 3CL protease is substituted with another amino acid such as isoleucine. Substitution of arginine at position 188 of the natural SARS 3CL protease with other amino acids such as isoleucine almost eliminated degradation over a relatively long period of time, significantly improving the stability of SARS 3CL protease. . As shown in the Examples below, a recombinant protein comprising an amino acid sequence in which the 188th amino acid of natural SARS 3CL protease was replaced with isoleucine was obtained by converting undecapeptide substrate SO1 into Km.
It was possible to digest with an efficiency of 33.8 μM and kcat = 4753 s −1 .
また、この変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いてSARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物
質のスクリーニングを行うことで、阻害物質を効率的にスクリーニングすることができた
。スクリーニングの結果、テトラペプチドアルデヒドAc-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH
3)2)-CHOがSARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を中程度に阻害する物質であること、及びシ
ステインプロテアーゼに対する代表的な阻害物質であるE−64がSARS 3CLプロテアーゼに
対する阻害活性をほとんど示さない物質であることが分かった。また、CH3CO-Thr-Ser-Al
a-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、お
よびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOも、SARS 3CLプロテアーゼの触
媒活性を阻害する物質であることが分かった。
In addition, by using this mutant SARS 3CL protease to screen for inhibitors against SARS 3CL protease, the inhibitors could be efficiently screened. As a result of screening, tetrapeptide aldehyde Ac-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH
3 ) 2 ) -CHO is a substance that moderately inhibits the catalytic activity of SARS 3CL protease, and E-64, which is a typical inhibitor of cysteine protease, shows little inhibitory activity against SARS 3CL protease. It turns out that. CH 3 CO-Thr-Ser-Al
a-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and CH 3 CO -Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO was also found to be a substance that inhibits the catalytic activity of SARS 3CL protease.
２．変異型SARS 3CLプロテアーゼ
２．１．組換えタンパク質
本発明の組換えタンパク質は、天然型のSARS 3CLプロテアーゼと異なり、発現から比較
的長時間の間分解がほとんど生じない変異型SARS 3CLプロテアーゼ（安定型SARS 3CLプロ
テアーゼ）である。この変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いることで、例えば、SARS 3CL
プロテアーゼに対する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができる。SARS 3CLプ
ロテアーゼは、SARS CoVの増殖に重要な役割を果たす。このため、SARS 3CLプロテアーゼ
の働きを阻害することができれば、SARS CoVの増殖を抑制することができ、SARS患者の治
療につながる。したがって、SARS 3CLプロテアーゼに対する有効な阻害物質のスクリーニ
ングは、SARSに対する有効な治療薬を開発につながる。
2. Mutant SARS 3CL protease
2.1. Recombinant protein The recombinant protein of the present invention is a mutant SARS 3CL protease (stable SARS 3CL protease), which hardly decomposes for a relatively long time after expression, unlike a natural SARS 3CL protease. By using this mutant SARS 3CL protease, for example, SARS 3CL
Inhibitors against protease can be efficiently screened. SARS 3CL protease plays an important role in the growth of SARS CoV. For this reason, if the function of SARS 3CL protease can be inhibited, the growth of SARS CoV can be suppressed, leading to the treatment of SARS patients. Therefore, screening for effective inhibitors against SARS 3CL protease leads to the development of effective therapeutics against SARS.
天然型のSARS 3CLプロテアーゼは、306アミノ酸残基からなるシステインプロテアーゼ
であり、活性型はホモ二量体を形成する。天然型SARS 3CLプロテアーゼをコードする遺伝
子のDNA配列を配列番号３（Accession No. AY345988）に、天然型SARS 3CLプロテアーゼ
のアミノ酸配列を配列番号４（Accession No.NP_828849）に示す。SARS 3CLプロテアーゼ
のＮ末端側にはキモトリプシン様触媒ドメイン（アミノ酸残基1〜184）があり、一方、Ｃ
末端側にはαへリックスドメイン（アミノ酸残基201〜303）がある。このうちＮ末端側の
キモトリプシン様触媒ドメインに関して、Ｎ末端側のキモトリプシン様触媒ドメインのみ
を発現した場合にSARS 3CLプロテアーゼの触媒効率が低下するということが報告されてい
る（Bacha, U. et al. (2004) Biochemistry 43, 4906-4912.）。また、Ｃ末端側のαへ
リックスドメインは、SARS 3CLプロテアーゼがホモ二量体を形成する時に、一方のプロト
マーのＮ末端が他方のプロトマーの活性部位と相互作用しうる位置にくるように２つのプ
ロトマーを導く役割を果たすと考えられている（Yang, H. et al. (2003) Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 100, 13190-13195.）。このようなＮ末端側のキモトリプシン様触媒ド
メインとＣ末端側のαへリックスドメインの間には、これらのドメインをつなぐ長いルー
プ領域（アミノ酸残基１８５〜２００）が存在する。天然型のSARS 3CLプロテアーゼでは
、その発現と平行して、自己触媒的作用によりこのループ領域で分解が生じる。天然型の
SARS 3CLプロテアーゼの切断箇所は、具体的には、第188番目のアミノ酸であるアルギニ
ン（Arg）と第189番目のアミノ酸であるグルタミン（Gln）の間であると考えられる。
The natural SARS 3CL protease is a cysteine protease consisting of 306 amino acid residues, and the active form forms a homodimer. The DNA sequence of the gene encoding the natural SARS 3CL protease is shown in SEQ ID NO: 3 (Accession No. AY345988), and the amino acid sequence of the natural SARS 3CL protease is shown in SEQ ID NO: 4 (Accession No. NP_828849). There is a chymotrypsin-like catalytic domain (amino acid residues 1 to 184) on the N-terminal side of SARS 3CL protease, while CRS
On the terminal side is an α-helix domain (amino acid residues 201-303). Of these, regarding the N-terminal chymotrypsin-like catalytic domain, it has been reported that the catalytic efficiency of SARS 3CL protease decreases when only the N-terminal chymotrypsin-like catalytic domain is expressed (Bacha, U. et al. (2004) Biochemistry 43, 4906-4912.). In addition, the α-helix domain on the C-terminal side has two positions so that when the SARS 3CL protease forms a homodimer, the N-terminus of one protomer is located at a position where it can interact with the active site of the other protomer. It is thought to play a role in guiding protomers (Yang, H. et al. (2003) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 100, 13190-13195.). Between such an N-terminal chymotrypsin-like catalytic domain and a C-terminal α-helix domain, there is a long loop region (amino acid residues 185 to 200) connecting these domains. In the natural SARS 3CL protease, in parallel with its expression, degradation occurs in this loop region by autocatalytic action. Natural
Specifically, the cleavage site of SARS 3CL protease is considered to be between the 188th amino acid arginine (Arg) and the 189th amino acid glutamine (Gln).
本発明の組換えタンパク質は、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第18
8番目のアミノ酸（アルギニン）を他のアミノ酸に置換することで、発現から比較的長時
間の間分解がほとんど生じないような安定型のSARS 3CLプロテアーゼとすることができた
ものである。
具体的には、本発明の組換えタンパク質は、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配
列のうち第188番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は前記置換
されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個のアミノ酸が欠
失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテアーゼ活性
を有する、組換えタンパク質である。
The recombinant protein of the present invention is the 18th amino acid sequence of the natural SARS 3CL protease.
By substituting the 8th amino acid (arginine) with another amino acid, a stable SARS 3CL protease that hardly decomposes for a relatively long time after expression could be obtained.
Specifically, the recombinant protein of the present invention is an amino acid sequence in which the 188th amino acid in the amino acid sequence of the natural SARS 3CL protease is substituted with another amino acid, or the 188th amino acid in the substituted amino acid sequence. It is a recombinant protein consisting of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids excluding the second amino acid are deleted, substituted, inserted and / or added, and having 3CL protease activity.
上記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸（以下、置換可能なアミノ酸とも
いう）としては、アルギニン以外のアミノ酸であれば特に限定されず、例えば、残りの１
９種の生体内のアミノ酸を挙げることができる。本発明の好ましい態様によれば、置換可
能なアミノ酸は他の酵素の認識部位になりにくいアミノ酸であり、そのようなアミノ酸と
しては、例えばイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ト
リプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択さ
れるアミノ酸を挙げることができる。置換可能なアミノ酸は、より好ましくは、イソロイ
シンである。
The other amino acid substituted with the 188th amino acid (hereinafter also referred to as a substitutable amino acid) is not particularly limited as long as it is an amino acid other than arginine.
Nine types of in vivo amino acids can be mentioned. According to a preferred embodiment of the present invention, the substitutable amino acid is an amino acid that is unlikely to be a recognition site for other enzymes. Examples of such amino acids include isoleucine, leucine, valine, alanine, glycine, methionine, tryptophan, and serine. And amino acids selected from the group consisting of threonine, asparagine, and glutamine. The substitutable amino acid is more preferably isoleucine.
上記「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加された」とは、
同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のア
ミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及
び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は
相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバ
リン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、
t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イ
ソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C
群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミ
ノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-
ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニ
ン、チロシン。
The above "one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added"
Means that there is a deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues at any position in one or more amino acid sequences in the same sequence. Two or more of these may occur simultaneously.
Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other. Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine,
t-butylalanine, cyclohexylalanine; Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid; C
Group: asparagine, glutamine; Group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid; Group E: proline, 3-hydroxyproline, 4-
Hydroxyproline; Group F: serine, threonine, homoserine; Group G: phenylalanine, tyrosine.
上記「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加された」とは、
例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、
１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１
個若しくは１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたことを意味する
。「１〜数個」とは、例えば、１〜１０個、1〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、
１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個を意味する。
The above "one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added"
For example, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18,
1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11
It means that one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added. “1 to several” means, for example, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6,
1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1 is meant.
上記第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び
／又は付加されたアミノ酸配列は、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第
188番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と例えば８０％以上、８５
％以上、好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９
５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するアミノ酸
配列などがあげられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
The amino acid sequence obtained by deleting, substituting, inserting and / or adding one or a plurality of amino acids excluding the 188th amino acid is the amino acid sequence of the natural SARS 3CL protease.
An amino acid sequence in which the amino acid at position 188 is substituted with another amino acid, for example, 80% or more, 85
% Or more, preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 9
Examples thereof include amino acid sequences having homology of 5% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more. In general, the larger the homology value, the better.
ここで、「3CLプロテアーゼ活性を有する」とは、システインプロテアーゼとして働く
こと、例えば、SARS CoVのゲノムRNAがコードするポリタンパク質１ａやポリタンパク質
１ａｂ等の基質をプロセッシングすることができることを意味する。3CLプロテアーゼ活
性を有するか否かは、例えば次のようにして判断することができる。先ず、精製した組換
えタンパク質に基質を接触させ、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）などにより基質切
断反応の分析を行い、Michaelis定数（Km）、速度定数（ｋcat）及びｋcat/Kmを求める。
そして、前記天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸が
他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる組換えタンパク質のｋcat/Kmを１とした
とき、前記置換されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個
のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる組換えタンパ
ク質のｋcat/Kmの相対比が、例えば0.2以上、より好ましくは0.4以上、0.6以上、0.8以上
、0.9以上、1.0以上、1.5以上、又は2.0以上である場合に、該欠失、置換、挿入及び／又
は付加されたアミノ酸配列からなる組換えタンパク質が3CLプロテアーゼ活性を有すると
判断することができる。
他の基質切断反応の分析方法としては、たとえばquenched-FRET assayと呼ばれる方法
がある（例えば、J.E.Blanchard et.al., Chemistry and Biology 11, 2004, 1445-1453.
、C.J.Kuo et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 318, 2004, 862-867.、及びY.C.L
iu et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 333, 2005,194-199.参照。）。この方法
では、3CLプロテアーゼの基質ペプチドのN末端に蛍光化合物を、C末端に消光化合物を結
合させたものを用いる。通常の状態でこのペプチド化合物にある一定波長の蛍光を照射し
ても、C末端に結合された消光化合物の影響によりN末端の蛍光化合物からの蛍光は観測さ
れない。しかし、3CLプロテアーゼを作用させると基質ペプチド配列で切断が生じるため
、蛍光化合物と消光化合物が離れてしまい、消光化合物の影響がなくなる。したがって、
基質ペプチドの切断とともに蛍光が観測されるようになるので、この蛍光を測定すること
によって基質の切断を間接的に測定することができる。蛍光化合物としては、例えばanth
ranilate化合物などが、消光化合物としては、例えばnitorotyrosine化合物などを用いる
ことができる。
Here, “having 3CL protease activity” means that it functions as a cysteine protease, for example, it can process a substrate such as polyprotein 1a or polyprotein 1ab encoded by the genomic RNA of SARS CoV. Whether or not it has 3CL protease activity can be determined, for example, as follows. First, a substrate is brought into contact with the purified recombinant protein, and a substrate cleavage reaction is analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography) or the like to obtain a Michaelis constant (Km), a rate constant (kcat), and kcat / Km.
When kcat / Km of a recombinant protein consisting of an amino acid sequence in which the 188th amino acid is substituted with another amino acid in the amino acid sequence of the natural SARS 3CL protease is 1, the substituted amino acid sequence Among them, the relative ratio of kcat / Km of a recombinant protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids except the 188th amino acid are deleted, substituted, inserted and / or added is, for example, 0.2 or more, more preferably When the protein is 0.4 or more, 0.6 or more, 0.8 or more, 0.9 or more, 1.0 or more, 1.5 or more, or 2.0 or more, the recombinant protein comprising the deleted, substituted, inserted, and / or added amino acid sequence has 3CL protease activity Can be determined.
As another method for analyzing the substrate cleavage reaction, for example, there is a method called quenched-FRET assay (for example, JEBlanchard et.al., Chemistry and Biology 11, 2004, 1445-1453.
, CJKuo et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 318, 2004, 862-867., And YCL
See iu et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 333, 2005, 194-199. ). In this method, a 3CL protease substrate peptide having a fluorescent compound bound to the N-terminus and a quenching compound bound to the C-terminus is used. Even if this peptide compound is irradiated with a certain wavelength of fluorescence in a normal state, no fluorescence from the N-terminal fluorescent compound is observed due to the influence of the quenching compound bonded to the C-terminal. However, when 3CL protease is allowed to act, cleavage occurs at the substrate peptide sequence, so that the fluorescent compound and the quenching compound are separated from each other, and the influence of the quenching compound is eliminated. Therefore,
Since fluorescence is observed with the cleavage of the substrate peptide, the cleavage of the substrate can be indirectly measured by measuring this fluorescence. Examples of fluorescent compounds include anth
As a quenching compound such as a ranilate compound, for example, a nitrotyrosine compound can be used.
本発明の好ましい態様の組換えタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパ
ク質である。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第188番目のアミノ酸を除く１若しく
は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質。
A preferred embodiment of the recombinant protein of the present invention is the following recombinant protein (a) or (b).
(A) A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids except the 188th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted and / or added, and have 3CL protease activity; Recombinant protein.
上記（ａ）のタンパク質は、配列番号２に示すように、天然型SARS 3CLプロテアーゼを
構成する３０６個のアミノ酸配列のうち、第188番目のアミノ酸であるアルギニン（Arg，
R）が、アルギニン以外のアミノ酸であるイソロイシン（Ile，I）に置換された組換えタ
ンパク質（R188I）である。
As shown in SEQ ID NO: 2, the protein of the above (a) is composed of arginine (Arg, 188th amino acid) among 306 amino acid sequences constituting the natural SARS 3CL protease.
R) is a recombinant protein (R188I) substituted with isoleucine (Ile, I), which is an amino acid other than arginine.
ここで、アミノ酸の表記は、一般に、３文字（「Arg」及び「Ile」等）又は１文字（「
R」及び「I」等）のアルファベットで表す。そして、例えば「R188I」と表示した場合、
数字「188」は置換されるアミノ酸の位置を表し、数字の前に表示したアルファベットは
置換前のアミノ酸を表し、数字の後に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸を表す
。したがって、「Ｒ188Ｉ」は、第188番目のアルギニンをイソロイシンに置換したことを
意味する。
Here, in general, amino acids are represented by three letters (such as “Arg” and “Ile”) or one letter (“
R ”and“ I ”). For example, when “R188I” is displayed,
The number “188” represents the position of the amino acid to be substituted, the alphabet displayed before the number represents the amino acid before substitution, and the alphabet displayed after the number represents the amino acid after substitution. Therefore, “R188I” means that the 188th arginine was replaced with isoleucine.
尚、上記（ｂ）のタンパク質における、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、
挿入及び／又は付加された」と「3CLプロテアーゼ活性を有する」に関しては、組換えタ
ンパク質に関する先の説明を同様に適用することができる。
In the protein of (b) above, “one or more amino acids are deleted, substituted,
With respect to “inserted and / or added” and “having 3CL protease activity”, the previous explanations for recombinant proteins can be applied as well.
２．２．組換えポリヌクレオチド
上述した本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されないが
、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを挙げることがで
きる。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドであって、3CLプロテアーゼ活性を有し、かつ、第188番目のアミノ酸がイソロイシンで
あるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
2.2. Recombinant polynucleotide Although the polynucleotide which codes the recombinant protein of this invention mentioned above is not limited, The polynucleotide containing the polynucleotide of the following (a) or (b) can be mentioned.
(A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) hybridizing with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions A polynucleotide encoding a protein having 3CL protease activity and wherein the 188th amino acid is isoleucine
上記（ａ）のポリヌクレオチド（具体的にはDNA。以下、これらを単に「DNA」とも称す
る）は、配列番号１に示すように、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列のうち、
翻訳後に第188番目のアミノ酸がイソロイシンに置換されるように、塩基を置換変異させ
たものである。具体的には、第562番目〜第564番目の塩基について、イソロイシンのコド
ンに対応するように「aga」を「ata」に変異させたものである。第188番目のアミノ酸を
イソロイシンに置換する場合、「aga」を「ata」に変異させる他、「aga」を「atc」や「
att」に変異させるようにしても良い。
The polynucleotide of (a) above (specifically, DNA. Hereinafter, these are also simply referred to as “DNA”), as shown in SEQ ID NO: 1, among the nucleotide sequences encoding SARS 3CL protease,
The base is substituted and mutated so that the 188th amino acid is replaced with isoleucine after translation. Specifically, “aga” is mutated to “ata” so as to correspond to the codon of isoleucine for the 562nd to 564th bases. When substituting the 188th amino acid with isoleucine, in addition to mutating “aga” to “ata”, “aga” is replaced with “atc” or “
You may make it mutate to "att".
上記（ａ）のDNAは、翻訳後に第188番目のアミノ酸がイソロイシンに置換されるように
塩基を置換変異させたものであるが、本発明はこれに限定されず、翻訳後に第188番目の
アミノ酸がアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されるように、塩基を置換変異させたも
のでも良い。アルギニンを除く他のアミノ酸としては、前述した例示が同様に適用できる
。そして第562番目〜第564番目の塩基について、アルギニンを除く他のアミノ酸のコドン
に対応するように、「aga」を変異させれば良い。
The DNA of the above (a) is obtained by substitution mutation of the base so that the 188th amino acid is replaced with isoleucine after translation, but the present invention is not limited to this, and the 188th amino acid after translation is not limited thereto. May be substituted with a base so that it is substituted with other amino acids except arginine. As other amino acids excluding arginine, the above-mentioned illustrations can be similarly applied. Then, for the 562nd to 564th bases, “aga” may be mutated so as to correspond to the codons of amino acids other than arginine.
このような変異置換型DNAは、一般には、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2n
d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecula
r Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調
製することができる。具体的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部
位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuickChangeTM Site-Direc
ted Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesi
s System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan
-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて調製することができる。
Such mutation-substituted DNA is generally used in Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2n.
d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecula
r It can be prepared according to the site-specific displacement induction method described in Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) and the like. Specifically, a mutation introduction kit using a site-directed mutagenesis method such as QuickChange TM Site-Direc by a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method.
ted Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesi
s System (manufactured by Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan
-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.
また、後述する実施例に記載のPCRプライマーを用い、SARS 3CLプロテアーゼをコード
する塩基配列を含むDNA等を鋳型として適当な条件下PCRを行うことにより調製することも
できる。PCRに用いるDNAポリメラーゼは、限定されないが、正確性の高いDNAポリメラー
ゼであることが好ましく、例えば、Pwo DNA（ポリメラーゼロシュ・ダイアグノスティッ
クス）、Pfu DNAポリメラーゼ（プロメガ）、プラチナPfx DNAポリメラーゼ（インビトロ
ジェン）、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡）等が好ましい。PCRの反応条件は、用いるDNA
ポリメラーゼの最適温度、合成するDNAの長さや種類等によって異なるが、９０〜９８℃
で５〜３０秒（熱変性）、５０〜６５℃で５〜３０秒（アニーリング）、６５〜８０℃で
３０〜１２００秒（伸長）のセットを1サイクルとして２０〜２００サイクル、特には２
０〜３５サイクル行うようにすることが好ましい。
Moreover, it can also be prepared by performing PCR under suitable conditions using the PCR primers described in the Examples described later, using DNA containing a nucleotide sequence encoding SARS 3CL protease as a template. Although the DNA polymerase used for PCR is not limited, it is preferably a highly accurate DNA polymerase. For example, Pwo DNA (Polymerase Roche Diagnostics), Pfu DNA polymerase (Promega), Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen) ), KOD DNA polymerase (Toyobo) and the like are preferable. PCR reaction conditions are the DNA used
90-98 ° C, depending on the optimal temperature of the polymerase and the length and type of DNA to be synthesized
5 to 30 seconds (thermal denaturation), 50 to 65 ° C. for 5 to 30 seconds (annealing), 65 to 80 ° C. for 30 to 1200 seconds (elongation) set as one cycle, 20 to 200 cycles, especially 2
It is preferable to perform 0 to 35 cycles.
上記（ｂ）のDNAは、上記（ａ）のDNA若しくはそれと相補的な塩基配列からなるDNA、
又はこれらの断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、及びプラー
クハイブリダイゼーション等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、cDNAライブラ
リーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製さ
れたものを利用してもよいし、市販のcDNAライブラリーやゲノムライブラリーを利用して
もよく、限定はされない。
The DNA of (b) above is the DNA of (a) above or a DNA comprising a complementary base sequence,
Alternatively, these fragments can be used as a probe, and can be obtained from a cDNA library or a genomic library by performing known hybridization methods such as colony hybridization and plaque hybridization. A library prepared by a known method may be used, or a commercially available cDNA library or genomic library may be used, and is not limited.
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laborator
y Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等を適宜参照すること
ができる。
For details on hybridization procedures, see Molecular Cloning, A Laborator.
y Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) can be referred to as appropriate.
上記「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェント
な条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」
は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件で
ある。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0
.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例
えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。
これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られる
ことが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要
素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の
要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェン
シーを実現することが可能である。
The “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, and high stringency conditions. "Low stringent conditions"
Are, for example, 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C. conditions. Further, “medium stringent conditions” include, for example, 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0
.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
Under these conditions, it can be expected that DNA having higher homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct
Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合
は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを
一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで
洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
In addition, when using a commercially available kit for hybridization, for example, Alkphos Direct
Labeling Reagents (manufactured by Amersham Pharmacia) can be used. In this case, follow the protocol supplied with the kit, incubate with the labeled probe overnight, and then wash the membrane with a primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. , Hybridized DNA can be detected.
これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフト
ウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号１に示される
塩基配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以
上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以
上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以
上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以
上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7
％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
As other hybridizable DNA, when calculated using homology search software such as FASTA and BLAST using default parameters, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is about 60% or more and about 70%. Over 71%, Over 72%, Over 73%, Over 74%, Over 75%, Over 76%, Over 77%, Over 78%, Over 79%, Over 80%, Over 81%, Over 82%, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% More than 96%, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7
% Or more, 99.8% or more, or 99.9% or more of DNA having identity.
２．３．組換えベクター
本発明の組換えタンパク質を発現させるためには、発現ベクターに、上述した本発明の
組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（必要に応じ、当該ポリヌクレオチドの
上流に転写プロモーターやSD配列（宿主が原核細胞の場合）やKozak配列（宿主が真核細
胞の場合）を、下流にターミネーターを、PCR等により付加しておく）が含まれるように
挿入して構築される、組換えベクターが用いられる。上記転写プロモーター等、タンパク
質の発現に必要な各要素は、当該ポリヌクレオチドに含まれていてもよいし、発現ベクタ
ーにもともと含まれている場合はそれを利用してもよく、限定はされない。発現ベクター
に当該ポリヌクレオチドを挿入するには、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを
用いる方法等を利用する。
発現ベクターとしては、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを保
持し得るものであれば、限定はされず、それぞれの宿主細胞に適したベクターを適宜選択
して使用することができる。
2.3. Recombinant Vector In order to express the recombinant protein of the present invention, a polynucleotide encoding the recombinant protein of the present invention described above (if necessary, a transcription promoter or SD sequence ( A recombinant vector constructed by inserting a host containing prokaryotic cells) or a Kozak sequence (when the host is a eukaryotic cell) and a terminator added downstream (by PCR, etc.). Used. Each element necessary for protein expression, such as the above transcription promoter, may be contained in the polynucleotide, or may be utilized when originally contained in the expression vector, and is not limited. In order to insert the polynucleotide into the expression vector, a method using a restriction enzyme, a method using topoisomerase, or the like is used.
The expression vector is not limited as long as it can retain the polynucleotide encoding the recombinant protein of the present invention, and a vector suitable for each host cell can be appropriately selected and used.
２．４．形質転換体
本発明の組換えタンパク質の発現は、上記組換えベクターを宿主となる細胞に導入して
形質転換体を得、これを培養等することにより行うことができる。
宿主細胞としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明の組換えタンパク質を
発現し得るものであればよく、限定はされないが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細
胞、各種植物細胞、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ等が挙げられる。宿主細胞は、好ましく
は、大腸菌である。
2.4. Transformant The recombinant protein of the present invention can be expressed by introducing the above recombinant vector into a host cell to obtain a transformant and culturing it.
The host cell is not limited as long as it can express the recombinant protein of the present invention after the introduction of the above-described recombinant vector. For example, various animal cells such as humans and mice, various plant cells, etc. , Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, mold and the like. The host cell is preferably E. coli.
形質転換の方法は、限定はされず、宿主と発現ベクターの組み合わせを考慮し、適宜選
択し実施することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショッ
ク法、PEG法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法等が好ましく挙げられる。
The transformation method is not limited and can be appropriately selected and implemented in consideration of the combination of the host and the expression vector. For example, electroporation method, lipofection method, heat shock method, PEG method, calcium phosphate method, The DEAE dextran method is preferred.
得られる形質転換体においては、実際に用いた宿主と、組換えベクターに含まれる組換
えタンパク質遺伝子のコドン型の宿主とが、一致していてもよいし、異なっていてもよく
、限定はされない。
In the obtained transformant, the host actually used and the codon type host of the recombinant protein gene contained in the recombinant vector may be the same or different, and there is no limitation. .
２．５．組換えタンパク質の製造方法
本発明の組換えタンパク質は、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドを含む発現カセットを用いて製造することができる。
具体的には、まず、遺伝子組換え法の常法に従い、前述した本発明の組換えタンパク質
をコードするポリヌクレオチドを含むようにした組換えベクターを新たに調製するか、あ
るいは本発明の組換えタンパク質の発現を誘導するタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを含むようにした組換えベクターを新たに調製する。後者の場合、本発明の組換えタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、他のベクターに組み込んで発現させるように
したものであってもよいし、宿主細胞のゲノムにコードされていて発現し得るものであっ
てもよく、限定されない。
2.5. Production Method of Recombinant Protein The recombinant protein of the present invention can be produced using an expression cassette containing a polynucleotide encoding the recombinant protein of the present invention.
Specifically, first, according to a conventional method of gene recombination, a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the recombinant protein of the present invention described above is newly prepared, or the recombinant of the present invention is prepared. A recombinant vector containing a polynucleotide encoding a protein that induces protein expression is newly prepared. In the latter case, the polynucleotide encoding the recombinant protein of the present invention may be incorporated into another vector for expression, or encoded in the genome of the host cell and expressed. There may be, and it is not limited.
本発明では、本発明の組換えタンパク質のC末端とN末端の少なくとも一方の端に他のタ
ンパク質を１つ以上結合させて、本発明の組換えタンパク質と当該他のタンパク質を含む
融合タンパク質を発現させるようしても良い。当該他のタンパク質としては、例えば、マ
ルトース結合タンパク質（MBP）、ヒスチジン（His）タグ配列、及びFlagタグ等を有する
タンパク質を挙げることができる。好ましくは、本発明の組換えタンパク質を、そのN末
端側にMBPとHisタグ配列とFlagタグを有するタンパク質（MBP-His-Flag タグ）を結合し
た融合タンパク質として発現させる。当該融合タンパク質を発現させた後、例えばMBPを
結合したタンパク質を精製するための金属カラムあるいはアミロースカラムを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーにより、MBP-His-Flagタグを結合した本発明の組換えタン
パク質を精製することができる。精製後、エンテロキナーゼ等の特異的消化酵素を用いた
処理を行うことで、本発明の組換えタンパク質からMBP-His-Flagタグを切断し、タグ等を
結合していない本発明の組換えタンパク質を得ることもできる。
In the present invention, one or more other proteins are linked to at least one of the C-terminal and N-terminal ends of the recombinant protein of the present invention to express a fusion protein containing the recombinant protein of the present invention and the other protein. You may be allowed to. Examples of the other protein include proteins having maltose binding protein (MBP), histidine (His) tag sequence, Flag tag and the like. Preferably, the recombinant protein of the present invention is expressed as a fusion protein in which a protein having MBP, a His tag sequence and a Flag tag (MBP-His-Flag tag) is bound to the N-terminal side thereof. After expressing the fusion protein, the recombinant protein of the present invention bound to the MBP-His-Flag tag is purified by affinity chromatography using, for example, a metal column or amylose column for purifying the protein bound to MBP. can do. After purification, the MBP-His-Flag tag is cleaved from the recombinant protein of the present invention by treatment with a specific digestive enzyme such as enterokinase, and the recombinant protein of the present invention to which no tag is bound You can also get
次いで、調製した組換えベクターにより形質転換された細胞を培養し、得られる培養物
から本発明の組換えタンパク質を採取することができる。なお、宿主細胞や発現ベクター
の種類等については、前述したものと同様のものが適用できる。
Next, cells transformed with the prepared recombinant vector can be cultured, and the recombinant protein of the present invention can be collected from the resulting culture. In addition, about the kind of host cell, an expression vector, etc., the thing similar to what was mentioned above is applicable.
ここで、「培養物」とは、培養上清、培養細胞(菌体)、又は細胞(菌体)の破砕物のいず
れをも意味するものである。本発明の組換えタンパク質は、当該培養物中に蓄積される。
形質転換体の培養方法は、宿主の培養に採用される通常の方法に従って行うことができる
。
Here, the “culture” means any of culture supernatant, cultured cells (bacteria), or crushed cells (bacteria). The recombinant protein of the present invention accumulates in the culture.
The method for culturing the transformant can be performed according to a usual method employed for culturing the host.
形質転換体を培養する培地は、宿主細胞(宿主菌)が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩
類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であることが好ましく
、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えば、グルコース
、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物や、
酢酸、プロピオン酸等の有機酸や、エタノール、プロパノール等のアルコール類等が挙げ
られる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩や、
その他の含窒素化合物が挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第
二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。その他に、ペプトン、肉エキス、
コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。
The medium for culturing the transformant contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host cell (host fungus), and should be a medium that can efficiently culture the transformant. Preferably, any of a natural medium and a synthetic medium may be used. Examples of the carbon source include carbohydrates such as glucose, galactose, fructose, sucrose, raffinose, starch,
Examples thereof include organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol. Examples of the nitrogen source include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate,
Ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium acetate and ammonium phosphate,
Other nitrogen-containing compounds are mentioned. Examples of inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. Besides, peptone, meat extract,
Corn steep liquor and various amino acids may be used.
培養は、一般には、振とう培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）などの好気
的条件下、10℃〜40℃（好ましくは25℃〜37℃）で1〜100時間行うことができる。pHの調
整は、適宜、無機酸、有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。
In general, the culture can be performed at 10 ° C. to 40 ° C. (preferably 25 ° C. to 37 ° C.) for 1 to 100 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture (jar fermenter). The pH can be adjusted appropriately using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, or the like.
本発明の組換えタンパク質の収率は、SDS-PAGE等の公知のタンパク質検出方法により確
認することができる。
The yield of the recombinant protein of the present invention can be confirmed by a known protein detection method such as SDS-PAGE.
培養後、本発明の組換えタンパク質が宿主細胞(菌体)内に生産される場合は、ホモジナ
イザー処理や超音波処理等により細胞を破砕する。また、溶菌により宿主細胞を破砕する
場合は、Lysozyme処理、凍結融解処理、低張液処理等を施すようにする。破砕後の液を遠
心分離した後の上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した本発明の組換えタンパ
ク質溶液として得ることができる。
When the recombinant protein of the present invention is produced in a host cell (bacteria) after culturing, the cell is disrupted by homogenizer treatment, ultrasonic treatment, or the like. In addition, when disrupting host cells by lysis, Lysozyme treatment, freeze-thaw treatment, hypotonic solution treatment, and the like are performed. The supernatant after centrifuging the disrupted solution is a cell extract soluble fraction and can be obtained as a roughly purified recombinant protein solution of the present invention.
一方、培養後、本発明の組換えタンパク質が宿主細胞(菌体)外に生産される場合は、培
養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞(菌体)を除去する。
On the other hand, when the recombinant protein of the present invention is produced outside the host cells (cells) after culturing, the culture solution is used as it is, or the cells (cells) are removed by centrifugation or the like.
その後、硫安沈澱による抽出等により培養物中から本発明の組換えタンパク質を採取し
、必要に応じてさらに透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）を用いて、本発明の組換えタンパク質
を単離精製することができる。
Thereafter, the recombinant protein of the present invention is collected from the culture by extraction with ammonium sulfate precipitation, and further dialysis, if necessary, using various chromatography (gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.) The recombinant protein of the present invention can be isolated and purified.
また、本発明の組換えタンパク質の製造に関しては、上述したような形質転換体を用い
たタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を採用して
行うこともできる。
In addition, the production of the recombinant protein of the present invention can be carried out by adopting a cell-free protein synthesis system that uses no living cells in addition to the protein synthesis system using the transformant as described above.
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内で本発明の組
換えタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質
合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
The cell-free protein synthesis system is a system for synthesizing the recombinant protein of the present invention in an artificial container such as a test tube using a cell extract. The cell-free protein synthesis system used in the present invention includes a cell-free transcription system that synthesizes RNA using DNA as a template.
この場合、使用する細胞抽出液の由来は、前述の宿主細胞であることが好ましい。細胞
抽出液としては、例えば真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、より具体的には、小麦
胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスL-細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母、大腸菌などの
抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は、濃縮あるいは希釈された
ものであってもよいし、そのままであってもよく、限定はされない。
In this case, the cell extract to be used is preferably derived from the aforementioned host cell. Examples of cell extracts include eukaryotic or prokaryotic cell-derived extracts, and more specifically, wheat germ, rabbit reticulocyte, mouse L-cell, HeLa cell, CHO cell, budding yeast, Escherichia coli, etc. Liquid can be used. Note that these cell extracts may be concentrated or diluted, or may be as they are, and are not limited.
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿等によって
得ることができる。
The cell extract can be obtained, for example, by ultrafiltration, dialysis, polyethylene glycol (PEG) precipitation or the like.
このような無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。例えば
、試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTM System（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM
（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）等が挙げられる。
無細胞タンパク質合成によって産生された本発明の組換えタンパク質は、前述したよう
にクロマトグラフィー等の手段を適宜選択して、精製することができる。
Such cell-free protein synthesis can also be performed using a commercially available kit. For example, reagent kit PROTEIOS TM (Toyobo), TNT TM System (Promega), PG-Mate TM
(Toyobo), RTS (Roche Diagnostics) and the like.
The recombinant protein of the present invention produced by cell-free protein synthesis can be purified by appropriately selecting means such as chromatography as described above.
３．スクリーニング
３．１．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、前記本発明の組換えタンパク質に候補物質を接触させ
、候補物質の中から前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をスク
リーニングする方法である。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、SARS
3CLプロテアーゼに対する阻害活性を有するものである。SARS 3CLプロテアーゼを阻害す
ることでSARS CoVの増殖を抑制することができるので、本発明のスクリーニング方法によ
って得られる阻害物質は、SARSに対する治療に利用することができる。
ここで「接触」とは、本発明の組換えタンパク質と候補物質とを同一の反応系又は培養
系に存在させることを意味する。接触には、例えば、本発明の組換えタンパク質が含まれ
る溶液と候補物質とを混合すること、本発明の組換えタンパク質を発現する形質転換体の
培養容器に候補物質を添加すること、及び本発明の組換えタンパク質を発現する形質転換
体を候補物質の存在下で培養することなどが含まれる。
3. Screening 3.1. Screening method The screening method of the present invention is a method in which a candidate substance is brought into contact with the recombinant protein of the present invention, and a substance that inhibits the 3CL protease activity of the recombinant protein is screened from the candidate substances. The substance obtained by the screening method of the present invention is SARS.
It has inhibitory activity against 3CL protease. Since the growth of SARS CoV can be suppressed by inhibiting SARS 3CL protease, the inhibitory substance obtained by the screening method of the present invention can be used for the treatment against SARS.
Here, “contact” means that the recombinant protein of the present invention and the candidate substance are present in the same reaction system or culture system. For the contact, for example, the solution containing the recombinant protein of the present invention and the candidate substance are mixed, the candidate substance is added to the culture vessel of the transformant expressing the recombinant protein of the present invention, and the present invention. Examples include culturing a transformant expressing the recombinant protein of the invention in the presence of a candidate substance.
候補物質が、SARS 3CLプロテアーゼに対して阻害活性を有しているか否かは、例えば「
H. Naka, K. Teruya, J. K. Bang, S. Aimoto, T. Tatsumi, H. Konno, K. Nosaka, K. A
kaji; Evaluations of substrate specificity and inhibition at PR/p3 cleavage site
of HTLV-1 protease; Bioorg. Med. Chem. Lett., 16 (2006) 3761-3764.」に記載の方
法に従って判断する。具体的には、先ず、候補物質の存在下で本発明の組換えタンパク質
と基質を接触させ、HPLCなどにより組換えタンパク質が基質を切断する反応の分析を行い
、図６に示すような用量−応答曲線を引く。尚、図６中、縦軸の阻害（％）は、各濃度で
阻害剤が存在する条件下でプロテアーゼにより基質が切断される量をHPLCで定量し、阻害
剤が存在していない条件下でプロテアーゼが基質を切断する量を100として相対的に切断
率を出し、これを100から引いて阻害率としたものである。そして、その用量−応答曲線
からIC50値を求めて、IC50値が例えば50mM以下、10mM以下、6mM以下、5mM以下、1mM以下
、または500μM以下、好ましくは200μM以下、より好ましくは100μM以下である場合に、
候補物質はSARS 3CLプロテアーゼに対して阻害活性を有していると判断することができる
。
ここでIC50値とは、本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性を５０％阻害する
候補物質の濃度を意味する。候補物質のIC50値は、本発明の組換えタンパク質と基質を接
触させて基質を切断させる際に、そこに異なる濃度の候補物質を添加して、各添加濃度（
用量）での本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性（反応）を算出し、用量-反
応曲線を作成して、本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性を５０％阻害する候
補物質の添加濃度を算出することによって決定できる。
また、他の測定方法としては、例えば、先に説明したquenched-FRET assayがある。
Whether or not the candidate substance has an inhibitory activity against SARS 3CL protease is, for example, ``
H. Naka, K. Teruya, JK Bang, S. Aimoto, T. Tatsumi, H. Konno, K. Nosaka, K. A
kaji; Evaluations of substrate specificity and inhibition at PR / p3 cleavage site
of HTLV-1 protease; Bioorg. Med. Chem. Lett., 16 (2006) 3761-3764. Specifically, first, the recombinant protein of the present invention is brought into contact with the substrate in the presence of the candidate substance, and the reaction of the recombinant protein cleaving the substrate by HPLC or the like is analyzed. Draw a response curve. In FIG. 6, the inhibition (%) on the vertical axis indicates the amount by which the substrate is cleaved by the protease under the condition where the inhibitor is present at each concentration by HPLC, and under the condition where the inhibitor is not present. The relative cleavage rate is calculated with the amount of protease cleaved by the substrate being 100, and this is subtracted from 100 to obtain the inhibition rate. Then, an IC 50 value is obtained from the dose-response curve, and the IC 50 value is, for example, 50 mM or less, 10 mM or less, 6 mM or less, 5 mM or less, 1 mM or less, or 500 μM or less, preferably 200 μM or less, more preferably 100 μM or less. If there is
It can be determined that the candidate substance has inhibitory activity against SARS 3CL protease.
Here, the IC 50 value means the concentration of a candidate substance that inhibits the cleavage activity of the substrate by the recombinant protein of the present invention by 50%. The IC 50 value of the candidate substance is determined by adding different concentrations of the candidate substance to the substrate when cleaving the substrate by bringing the recombinant protein of the present invention into contact with the substrate.
The substrate cleavage activity (reaction) by the recombinant protein of the present invention at a dose) is calculated, a dose-response curve is prepared, and a candidate substance that inhibits the substrate cleavage activity by the recombinant protein of the present invention by 50% is calculated. It can be determined by calculating the addition concentration.
As another measurement method, for example, there is a quenched-FRET assay described above.
「候補物質」は、限定されないが、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合
物、合成化合物（高分子又は低分子化合物）、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、
植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど
）の組織抽出液、血漿などであり、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物
質であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩として、生
理学的に許容される酸（例えば、無機酸や有機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）な
どとの塩が用いられる。候補物質としては、例えば、次の（ａ）〜（ｈ）のいずれかの化
合物を挙げることができる。（ａ）Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
（ｂ）Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
（ｃ）Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
（ｄ）Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
（ｅ）Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
（ｆ）Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2))-CHO
（ｇ）Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
（ｈ）Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
ここで、上記（ａ）〜（ｈ）のアミノ酸配列中、Ｎ末端側のAc-は、Ｎ末端がアセチル
化していることを示す。また、Ｃ末端側の-CHOおよび-CH2OHは、それぞれ、Ｃ末端にアル
デヒドおよびヒドロキシメチルを有することを示す。さらに、Ｃ末端側の-NHCH(CH2CH2CO
N(CH3)2)-CHOおよび-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OHは、それぞれ、-Gln(Me2)-CHOおよび-
Gln(Me2)-CH2OH（Ｍｅはメチルを表す）と表記することができる。尚、上記（ａ）〜（ｈ
）の化合物は、実施例に記載の方法またはそれと同様の方法で合成することができる。
スクリーニング方法としては、例えば、上記それぞれの候補物質を混合物のままスクリ
ーニングする方法がある。また、それぞれの候補物質（例えば化合物）の一部のみの構造
が異なる混合物群を調製し、そのままスクリーニングする方法もある。後者の方法を使い
、候補物質（例えば化合物）の基本骨格の中で構造の異なる部位を少しずつずらした混合
物群のスクリーニング結果を比較することで、基本骨格のどの部分が最も阻害活性に寄与
するかをすばやく見積もることができる。
“Candidate substances” are not limited, but include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds (polymers or low molecular compounds), fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants,
Plant extracts, mammals (eg mice, rats, pigs, cows, sheep, monkeys, humans, etc.) tissue extracts, plasma, etc. These substances may be novel substances or known substances It may be. These candidate substances may form salts, and as salts of candidate substances, salts with physiologically acceptable acids (for example, inorganic acids and organic acids) and bases (for example, metal acids) are included. Used. As candidate substances, for example, any one of the following compounds (a) to (h) can be mentioned. (A) Ac-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO
(B) Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO
(C) Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CH 2 OH
(D) Ac-Thr-Ser -Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3) 2) -CHO
(E) Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CH 2 OH
(F) Ac-Ser-Ala -Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3) 2)) - CHO
(G) Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CH 2 OH
(H) Ac-Val-Leu -NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3) 2) -CHO
Here, in the amino acid sequences (a) to (h) above, Ac- on the N-terminal side indicates that the N-terminal is acetylated. Further, -CHO and -CH 2 OH on the C-terminal side indicate that aldehyde and hydroxymethyl are present at the C-terminal, respectively. Furthermore, —NHCH (CH 2 CH 2 CO on the C-terminal side
N (CH 3 ) 2 ) -CHO and -NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CH 2 OH are -Gln (Me 2 ) -CHO and-
Gln (Me 2 ) —CH 2 OH (Me represents methyl). The above (a) to (h
) Can be synthesized by the method described in the examples or by a method similar thereto.
As a screening method, for example, there is a method of screening each of the candidate substances as a mixture. There is also a method of preparing a mixture group in which only a part of each candidate substance (for example, compound) has a different structure and screening as it is. Using the latter method, by comparing the screening results of a mixture group in which the sites with different structures are gradually shifted in the basic skeleton of the candidate substance (eg compound), which part of the basic skeleton contributes most to the inhibitory activity Can be quickly estimated.
３．２．スクリーニング用キット
本発明のスクリーニング用キットは、前記本発明の組換えタンパク質を含む、前記組換
えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キットである。
キットには、さらに、必要に応じて、緩衝液、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセ
サリー及び説明書からなる群から選択される少なくとも１つが含まれて良い。
キットに含まれる「緩衝液」には、「反応緩衝液」のほかに「洗浄液」も含まれる。「
洗浄液」には、「反応緩衝液」と同じ溶媒、又はその他の水溶性溶媒、リン酸緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液などを例示することができる。
これらのキットを構成する各成分は、別個に用意しても良く、あるいは、支障がない限
り共存させても良い。
3.2. Screening Kit The screening kit of the present invention is a kit for screening for a substance that inhibits the 3CL protease activity of the recombinant protein, including the recombinant protein of the present invention.
The kit may further include at least one selected from the group consisting of a buffer solution, an auxiliary agent, a dedicated container, other necessary accessories, and instructions, if necessary.
The “buffer solution” included in the kit includes “washing solution” in addition to “reaction buffer solution”. "
Examples of the “washing solution” include the same solvent as the “reaction buffer” or other water-soluble solvent, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, and the like.
Each component constituting these kits may be prepared separately or may coexist as long as there is no trouble.
４．阻害剤
本発明は、上記本発明のスクリーニング方法で得られた化合物またはその塩（本明細書
中で、本発明の化合物と呼ぶ場合がある。）を含む、SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤（本明
細書中で、本発明の阻害剤と呼ぶ場合がある）を提供する。すなわち、本発明の阻害剤に
含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH
O、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3
)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選ば
れる少なくとも１つの化合物またはその塩である。本発明の１つの態様の阻害剤に含まれ
る化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3
CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH
O、もしくはCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOまたはその塩である。本
発明の阻害剤は、SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を阻害することができる。本発明の１
つの態様に係る阻害剤は、SARS CoVの増殖を阻害することができる。
4). Inhibitor The present invention relates to a SARS 3CL protease inhibitor (herein described) comprising a compound obtained by the above screening method of the present invention or a salt thereof (sometimes referred to herein as a compound of the present invention). (Sometimes referred to as inhibitors of the present invention). That is, the compound contained in the inhibitor of the present invention or a salt thereof is CH 3 CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CH
O, CH 3 CO-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3
2 ) -CHO, and CH 3 CO—Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) —CHO, or a salt thereof. The compound contained in the inhibitor of one embodiment of the present invention or a salt thereof is CH 3 CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3
CO-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CH
O, or CH 3 CO-Ser-Ala- Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3) 2) is a -CHO or its salt. The inhibitor of the present invention can inhibit the catalytic activity of SARS 3CL protease. 1 of the present invention
Inhibitors according to one embodiment can inhibit SARS CoV growth.
ここで、本発明の阻害剤における塩としては、塩酸塩、硫酸塩、もしくはリン酸塩など
の無機酸付加塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、もしく
は蓚酸塩などの有機酸塩、またはナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩など
の塩が挙げられる。本発明の１つの態様では、塩は、医薬的に許容される塩である。
Here, the salt in the inhibitor of the present invention includes an inorganic acid addition salt such as hydrochloride, sulfate, or phosphate, acetate, propionate, citrate, tartrate, malate, or oxalic acid. Organic acid salts such as salts, or salts such as sodium salts, potassium salts, or calcium salts. In one aspect of the invention, the salt is a pharmaceutically acceptable salt.
本発明の別の態様では、本発明の阻害剤と併用して本発明の阻害剤のSARS CoV増殖阻害
効果を高めることができる化合物をスクリーニングするために本発明の阻害剤を使用する
。具体的には、候補化合物の存在下または非存在下、SARS CoV感染細胞に、本発明の阻害
剤を接触させて、細胞を所定時間培養し、SARS CoVのウイルス量を測定する。「接触」と
は、SARS CoV感染細胞と本発明の阻害剤とを同一の反応系または培養系に存在させること
を意味し、例えば、SARS CoV感染細胞を本発明の阻害剤の存在下で培養することなどが含
まれる。尚、このとき、様々な濃度の候補化合物の存在下で、SARS CoVのウイルス量を測
定するのが好ましい。そして、候補化合物の存在下でのSARS CoVのウイルス量が、非存在
下でのSARS CoVのウイルス量と比較して低い時に（例えば、20%以上、30%以上、40%以上
、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、100%以上、150%以上、または200%以
上低い時に）、候補化合物を、本発明の阻害剤と併用して本発明の阻害剤のSARS CoV増殖
阻害効果を高めることができる化合物として選択する。SARS CoVのウイルス量は、公知の
方法を用いて測定することができる。
In another embodiment of the present invention, the inhibitor of the present invention is used for screening a compound capable of enhancing the SARS CoV growth inhibitory effect of the inhibitor of the present invention in combination with the inhibitor of the present invention. Specifically, the inhibitor of the present invention is brought into contact with SARS CoV-infected cells in the presence or absence of a candidate compound, the cells are cultured for a predetermined time, and the viral load of SARS CoV is measured. “Contact” means that the SARS CoV-infected cell and the inhibitor of the present invention are present in the same reaction system or culture system. For example, the SARS CoV-infected cell is cultured in the presence of the inhibitor of the present invention. To be included. At this time, it is preferable to measure the viral load of SARS CoV in the presence of various concentrations of candidate compounds. And when the viral load of SARS CoV in the presence of the candidate compound is low compared to the viral load of SARS CoV in the absence (for example, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more , 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more, 150% or more, or 200% or more lower) when the candidate compound is used in combination with the inhibitor of the present invention The compound is selected as a compound that can enhance the SARS CoV growth inhibitory effect of the agent. The viral load of SARS CoV can be measured using a known method.
本発明の別の態様では、哺乳動物(例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット
など)のSARSを治療するために、経口または非経口で本発明の阻害剤を哺乳動物に適用す
る。本発明のある態様では、哺乳動物はヒトを除く哺乳動物である。
In another embodiment of the present invention, the inhibitor of the present invention is applied to a mammal orally or parenterally to treat SARS in a mammal (eg, human, monkey, cow, pig, mouse, rat, etc.). . In some embodiments of the invention, the mammal is a mammal other than a human.
また、本発明の阻害剤は、使用目的に応じ、本発明の化合物に加えて、担体や添加物を
含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、有機溶剤、コラ
ーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセル
ロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチ
レングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフ
ィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソル
ビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。
Moreover, the inhibitor of this invention may contain a support | carrier and an additive in addition to the compound of this invention according to the intended purpose. Such carriers and additives include water, acetic acid, organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin , Methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, surfactant, etc. Can be mentioned.
本発明の阻害剤における本発明の化合物の使用量は、使用目的によって異なる。当業者
であれば、使用目的に応じて、本発明の化合物の使用量を適宜選択することができる。
The amount of the compound of the present invention used in the inhibitor of the present invention varies depending on the purpose of use. A person skilled in the art can appropriately select the amount of the compound of the present invention to be used according to the purpose of use.
例えば、本発明の阻害剤と併用して本発明の阻害剤のSARS CoVの増殖阻害効果を高める
ことができる化合物をスクリーニングするために本発明の阻害剤を用いる場合には、本発
明の化合物の使用量を変動させて細胞生存率を測定するのが好ましい。この場合、本発明
の化合物の使用量は、例えば、0.001mg〜100mg、好ましくは、0.01mg〜10mgである。
For example, when the inhibitor of the present invention is used to screen for a compound that can enhance the SARS CoV growth inhibitory effect of the inhibitor of the present invention in combination with the inhibitor of the present invention, It is preferable to measure the cell viability by varying the amount used. In this case, the amount of the compound of the present invention to be used is, for example, 0.001 mg to 100 mg, preferably 0.01 mg to 10 mg.
哺乳動物のSARSを治療するために本発明の阻害剤を用いる場合には、本発明の化合物の
使用量は、10kｇの動物の場合、１日あたり、例えば、0.01mg〜1000mg、好ましくは、0.1
mg〜100mgである。
When the inhibitor of the present invention is used for treating SARS in mammals, the amount of the compound of the present invention to be used is, for example, 0.01 mg to 1000 mg, preferably 0.1
mg to 100 mg.
また、本発明は、SARS CoV増殖阻害用の前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を
提供する。本発明の化合物の用法および用量は、前記阻害剤で説明したのと同様である。
The present invention also provides the above-mentioned compound or a salt thereof (the compound of the present invention) for inhibiting SARS CoV growth. The usage and dosage of the compounds of the present invention are the same as described for the inhibitors.
また、本発明は、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を用いるSARS CoV増殖阻
害方法を提供する。ここで、「本発明の化合物を用いる」ことには、例えば、本発明の化
合物と併用して本発明の化合物のSARS CoVの増殖阻害効果を高めることができる化合物を
スクリーニングするために本発明の化合物を使用すること、および哺乳動物のSARS CoV感
染症を治療するために、経口または非経口で本発明の化合物を動物に適用すること、など
が含まれるが、これらに限定されない。本発明のSARS CoV増殖阻害方法における本発明の
化合物の用法および用量は、前記阻害剤で説明したのと同様である。
The present invention also provides a method for inhibiting SARS CoV growth using the compound or a salt thereof (the compound of the present invention). Here, “using the compound of the present invention” includes, for example, the screening of a compound that can be used in combination with the compound of the present invention to enhance the SARS CoV growth inhibitory effect of the compound of the present invention. Including, but not limited to, using the compounds and applying the compounds of the invention to animals orally or parenterally to treat SARS CoV infections in mammals. The usage and dose of the compound of the present invention in the SARS CoV growth inhibition method of the present invention are the same as those described for the inhibitor.
さらに、本発明は、SARS CoV増殖阻害剤製造のための前記化合物またはその塩（本発明
の化合物）の使用を提供する。本発明の使用における本発明の化合物の用法および用量は
、前記SARS CoV増殖阻害剤で説明したのと同様である。
Furthermore, the present invention provides the use of the aforementioned compound or a salt thereof (the compound of the present invention) for producing a SARS CoV growth inhibitor. The usage and dosage of the compounds of the present invention in the use of the present invention are the same as those described for the SARS CoV growth inhibitor.
５．医薬組成物
本発明は、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を含有する医薬組成物を提供す
る。本発明の医薬組成物に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-
NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Va
l-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)
2)-CHOからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物またはその塩である。本発明の１
つの態様の医薬組成物に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NH
CH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-
Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、もしくはCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)
2)-CHO、またはその塩である。本発明の化合物における塩は、医薬的に許容される塩であ
る。医薬的に許容される塩としては、塩酸塩、硫酸塩、もしくはリン酸塩などの無機酸付
加塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、もしくは蓚酸塩な
どの有機酸塩、またはナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩などの塩が挙げ
られる。本発明の１つの態様によれば、医薬組成物は、SARSを治療するためのものである
。
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用することがで
きる。
前記剤形は常法にしたがって製剤化することができ、本発明のペプチドの他、医薬的に
許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、
水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアク
リル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスタ
ーチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、ア
ラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プ
ロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒ
ト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容さ
れる界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合
わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤
、顆粒剤、液剤、シロップ剤等として、または適当な剤形により投与が可能である。非経
口投与の場合は、注射剤形、座剤等が挙げられる。注射剤形の場合は、例えば点滴等の静
脈内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤(例えば生理食塩
水、緩衝液、ブドウ糖溶液等)に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン等）
を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍
結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブ
ドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の医薬組成物または本発明の化合物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、
投与回数、剤形によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投
与量は、例えば成人(６０ｋｇ)の場合、1日当たり０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは
０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜３０ｍｇである。投与方法は、患者の年齢、症
状により適宜選択する。投与は、例えば１日当たり、１回または２〜４回に分けてもよい
。
また、本発明は、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を患者に投与することを
含む、SARSの治療方法を提供する。さらに、本発明は、本発明のSARS治療用医薬組成物を
製造するための、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）の使用を提供する。SARSの
治療方法における、本発明の化合物の投与方法などは、上記医薬組成物で説明したのと同
様である。また、本発明の化合物の使用における、医薬組成物の製造方法なども、上記医
薬組成物で説明したのと同様である。
5. Pharmaceutical composition This invention provides the pharmaceutical composition containing the said compound or its salt (compound of this invention). The compound contained in the pharmaceutical composition of the present invention or a salt thereof is CH 3 CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-
NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Ala-Va
l-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and CH 3 CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 )
2 ) At least one compound selected from the group consisting of -CHO or a salt thereof. 1 of the present invention
The compound or salt thereof contained in the pharmaceutical composition of one embodiment is CH 3 CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NH
CH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, CH 3 CO-Ala-Val-
Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO or CH 3 CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 )
2 ) -CHO or a salt thereof. The salt in the compound of the present invention is a pharmaceutically acceptable salt. Pharmaceutically acceptable salts include inorganic acid addition salts such as hydrochloride, sulfate, or phosphate, acetate, propionate, citrate, tartrate, malate, or oxalate An organic acid salt or a salt such as a sodium salt, a potassium salt, or a calcium salt can be mentioned. According to one aspect of the invention, the pharmaceutical composition is for treating SARS.
The pharmaceutical composition of the present invention can employ both oral and parenteral dosage forms.
The dosage form can be formulated according to a conventional method, and may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive in addition to the peptide of the present invention. As such carriers and additives,
Water, pharmaceutically acceptable organic solvent, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, Xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives Etc.
The above additives are selected from the above alone or in appropriate combination depending on the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention. As for the dosage form, in the case of oral administration, it can be administered as a tablet, capsule, fine granule, powder, granule, liquid, syrup or the like, or in an appropriate dosage form. In the case of parenteral administration, injection dosage forms, suppositories and the like can be mentioned. In the case of an injection dosage form, it can be administered systemically or locally by intravenous injection such as infusion.
For example, when used as an injectable preparation, the pharmaceutical composition of the present invention is dissolved in a solvent (for example, physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.) and appropriate additives (human serum albumin, etc.) are dissolved therein.
Can be used. Alternatively, it may be freeze-dried to obtain a dosage form that dissolves before use. As the freeze-drying excipient, for example, sugar alcohols and saccharides such as mannitol and glucose can be used.
The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention or the compound of the present invention is determined by age, sex, symptom, administration route,
It depends on the number of administrations and the dosage form. The administration method is appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient. For example, in the case of an adult (60 kg), the dose is 0.01 to 1000 mg, preferably 0.1 to 100 mg, more preferably 1 to 30 mg per day. The administration method is appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient. Administration may be divided, for example, once or 2-4 times per day.
The present invention also provides a method for treating SARS, which comprises administering the compound or a salt thereof (the compound of the present invention) to a patient. Furthermore, the present invention provides use of the compound or a salt thereof (the compound of the present invention) for producing the pharmaceutical composition for treating SARS of the present invention. The method for administering the compound of the present invention in the method for treating SARS is the same as that described in the above pharmaceutical composition. In addition, the method for producing a pharmaceutical composition in the use of the compound of the present invention is the same as that described in the above pharmaceutical composition.
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報
、特許公報その他の特許文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。また
、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる日本特許出願、特願2007-219804の開示内容
を包含する。
It should be noted that all publications cited in the present specification, for example, prior art documents, and publications, patent publications, and other patent documents, are incorporated herein by reference in their entirety. In addition, this specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2007-219804, which is the basis for claiming priority of the present application.
以下実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
１．材料および方法
１．１ プラスミドおよび核酸の操作
pMAL-c2X(NEB BioLabs)をベースとした発現ベクターpMAL‐3CLを、山本典生先生(東京
医科歯科大学)より供与していただいた。pMAL-3CLは、N末端側のマルトース結合タンパク
質、6個のヒスチジンタグ及びFlagタグ(MBP-His-Flag)と完全長SARS 3CLプロテアーゼと
を含む75kDaの融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターである。この融合タン
パク質をエンテロキナーゼで処理することによって、融合タンパク質のＮ末端側のMBP-Hi
s FlagがSARS 3CLプロテアーゼから切り離され、MBP-His FlagのないSARS 3CLプロテアー
ゼが得られる。
尚、発現ベクターpMAL‐3CLは、例えば以下のようにして作製することができる。SARS
CoV感染細胞からRNAを抽出し、RT-PCRで3CL protease コード領域をクローニングするが
、その時にセンスプライマーにはBamH1認識配列、Hisタグ配列、Flag配列を5’側に付加
し、アンチセンスプライマーにはSalI認識配列を付加しておく。PCR産物をBamH1 とSalI
で切断し、pMAL-c2XのBamH1とSalIクローニング部位にリガーゼで組み込ませる。これに
より、発現ベクターpMAL‐3CLを作製できる。
1. Materials and Methods 1.1 Manipulation of plasmids and nucleic acids
An expression vector pMAL-3CL based on pMAL-c2X (NEB BioLabs) was provided by Dr. Norio Yamamoto (Tokyo Medical and Dental University). pMAL-3CL is a vector containing a gene encoding a 75 kDa fusion protein containing an N-terminal maltose-binding protein, 6 histidine tags and a Flag tag (MBP-His-Flag) and full-length SARS 3CL protease . By treating this fusion protein with enterokinase, MBP-Hi on the N-terminal side of the fusion protein
s Flag is cleaved from SARS 3CL protease, and SARS 3CL protease without MBP-His Flag is obtained.
The expression vector pMAL-3CL can be prepared, for example, as follows. SARS
RNA is extracted from CoV-infected cells, and the 3CL protease coding region is cloned by RT-PCR. At that time, a BamH1 recognition sequence, His tag sequence, and Flag sequence are added to the 5 'side of the sense primer, and the antisense primer is added. Adds a SalI recognition sequence. PCR products BamH1 and SalI
And ligase it into the BamH1 and SalI cloning sites of pMAL-c2X. Thereby, the expression vector pMAL-3CL can be prepared.
このpMAL-3CLを用いて、pGEM-3CLを次のように作製した。
先ずpMAL-3CLから、次のプライマーを用いて完全長SARS 3CLプロテアーゼをコードする
配列をPCR法により増幅した。
NheI部位を有するプライマー：5’- ccggctagcGGTTTTAGGAAAATGGCATTCC（配列番号５）
XhoI部位を有するプライマー：5’- ccgctcgagTTGGAAGGTAACACCAGAG（配列番号６）
Using this pMAL-3CL, pGEM-3CL was prepared as follows.
First, a sequence encoding full-length SARS 3CL protease was amplified from pMAL-3CL by the PCR method using the following primers.
Primer with NheI site: 5'-ccggctagcGGTTTTAGGAAAATGGCATTCC (SEQ ID NO: 5)
Primer with XhoI site: 5'-ccgctcgagTTGGAAGGTAACACCAGAG (SEQ ID NO: 6)
そして、このPCR産物をpGEM T-easy(プロメガ)に直接クローニングしてpGEM-3CLを得た
。
This PCR product was directly cloned into pGEM T-easy (Promega) to obtain pGEM-3CL.
また、qET-3CLを次のように作製した。
すなわち、qET-3CLは、pET-21a(+)(ノバゲン)のNheI/XhoI部位にpGEM-3CLのSARS 3CLプ
ロテアーゼをコードする断片に対応するNheI-XhoI断片を挿入することによって作製した
。pET-3CLは、N末端側の3種類のアミノ酸(Met-Ala-Ser)と、C末端側の2種類のアミノ酸(L
eu-Glu)及びHisタグと、完全長3CLプロテアーゼとを含む34kDaの融合タンパク質をコード
する遺伝子を含むベクターである。
In addition, qET-3CL was produced as follows.
That is, qET-3CL was prepared by inserting an NheI-XhoI fragment corresponding to the fragment encoding SARS 3CL protease of pGEM-3CL into the NheI / XhoI site of pET-21a (+) (Novagen). pET-3CL consists of 3 amino acids on the N-terminal side (Met-Ala-Ser) and 2 amino acids on the C-terminal side (L
eu-Glu) and a vector containing a gene encoding a 34 kDa fusion protein containing a His tag and a full-length 3CL protease.
さらに、pGEM-3CL-R188Iを次のように作製した。
3CL-R188Iプロテアーゼを構成するため、Stemmerらによって記述された逆PCR法によっ
て、部位特異的変異誘発を行った(Stemmer et al. (1992) Enzymatic Inverse PCR: A Re
striction Site Independent, Single-Fragment Method for High-Efficiency, Site-Dir
ected Mutagenesis. BioTechniques 13, 214-220.)。点変異を生じさせるのに使用した鋳
型はpGEM-3CLであり、使用したプライマーは次のものである。尚、下記プライマー中、下
線を引いたヌクレオチドが変異を受けたものである。
5’- atctctCGTCTCCATACAAACTGCACAGGCTG（配列番号７）
5’- atctctCGTCTCTGTATGTCAACAAATGGACC（配列番号８）
PCR実施後、直線状の完全長プラスミドの両末端をBsmBI(CGTCTCN’NNNN)で消化した。
これにより、直線状プラスミドの両末端には、オーバーハングが生じた。そして、このNN
NNオーバーハングを利用して、直線状のプラスミドの両末端を連結し、pGEM-3CL-R188Iを
得た。このライゲーションステップは直線状プラスミドの両末端に生じたNNNNオーバーハ
ングを利用したものであるので、pGEM-3CL-R188Iには余分な配列が付加されない。このた
め、pGEM-3CL-R188Iの配列は、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列うち第562番
目〜第564番目のアルギニンに対応するコドンが、イソロイシンに対応するコドンに変わ
っていることを除きpGEM-3CLと同じである。
Furthermore, pGEM-3CL-R188I was produced as follows.
To construct the 3CL-R188I protease, site-directed mutagenesis was performed by the reverse PCR method described by Stemmer et al. (Stemmer et al. (1992) Enzymatic Inverse PCR: A Re
striction Site Independent, Single-Fragment Method for High-Efficiency, Site-Dir
ected Mutagenesis. BioTechniques 13, 214-220.). The template used to generate the point mutation is pGEM-3CL and the primers used are: In the following primers, underlined nucleotides are mutated.
5'-atctctCGTCTCCA T ACAAACTGCACAGGCTG (SEQ ID NO: 7)
5'-atctctCGTCTCTGT A TGTCAACAAATGGACC (SEQ ID NO: 8)
After PCR, both ends of the linear full-length plasmid were digested with BsmBI (CGTCTCN'NNNN).
This caused overhangs at both ends of the linear plasmid. And this NN
Using the NN overhang, both ends of the linear plasmid were ligated to obtain pGEM-3CL-R188I. Since this ligation step utilizes NNNN overhangs generated at both ends of the linear plasmid, no extra sequence is added to pGEM-3CL-R188I. Therefore, the sequence of pGEM-3CL-R188I is pGEM- except that the codon corresponding to the 562th to 564th arginine in the base sequence encoding SARS 3CL protease is changed to a codon corresponding to isoleucine. Same as 3CL.
最後に、pMAL-3CL-R188IおよびpET-3CL-R188Iを次のように作製した。
すなわち、pMAL-3CLの短いSphI-StyI断片およびpET-3CLの短いNheI-XhoI断片を、各々
に対応するpGEM-3CL-R188Iの断片に置換することにより、発現ベクターpMAL-3CL-R188Iお
よびpET-3CL-R188Iを構成した。
Finally, pMAL-3CL-R188I and pET-3CL-R188I were prepared as follows.
That is, by replacing the short SphI-StyI fragment of pMAL-3CL and the short NheI-XhoI fragment of pET-3CL with the corresponding fragment of pGEM-3CL-R188I, the expression vectors pMAL-3CL-R188I and pET- 3CL-R188I was constructed.
pMAL-3CL-R188IおよびpET-3CL-R188Iについて配列決定分析を行い、pMAL-3CL-R188Iお
よびpET-3CL-R188Iには所望の変異のみが存在し、意図しない変異が全く見られないこと
を確認した。すなわち、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列うち第562番目〜第5
64番目の塩基のみが、アルギニンのコドン「aga」からイソロイシンのコドン「ata」に変
異していた（配列番号１）。
Perform sequencing analysis for pMAL-3CL-R188I and pET-3CL-R188I to confirm that only the desired mutation is present in pMAL-3CL-R188I and pET-3CL-R188I, and no unintended mutation is found at all did. That is, among the base sequences encoding SARS 3CL protease, 562nd to 5th
Only the 64th base was mutated from codon “aga” for arginine to codon “ata” for isoleucine (SEQ ID NO: 1).
１．２．3CLプロテアーゼの発現および精製
pMAL-3CL-R188IおよびpET-3CL-R188Iで、大腸菌株DH5αおよびBL21(DE3)pLysをそれぞ
れ形質転換した。
形質転換した大腸菌株を、50μg ml-1のアンピシリンを含有する10mlのLB培地内で37℃
で一晩増殖させ、ペレット化し、100mlの新鮮培地で2時間増殖させた。さらに、この大腸
菌株に0.5mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて28℃で2時間振と
うし、組換えタンパク質（3CL-R188Iプロテアーゼ）の発現を誘発した。この時、pMAL-3C
L-R188Iで形質転換した大腸菌からは、3CL-R188IプロテアーゼはそのN末端側にMBP-His-F
lagが付加した融合タンパク質として発現し、pET-3CL-R188Iで形質転換した大腸菌からは
、3CL-R188IプロテアーゼはそのN末端側にMet-Ala-Serが付加し、そのC末端側にLeu-Glu
とHisタグが付加した融合タンパク質として発現した。
1.2.3 Expression and purification of 3CL protease
Escherichia coli strains DH5α and BL21 (DE3) pLys were transformed with pMAL-3CL-R188I and pET-3CL-R188I, respectively.
The transformed E. coli strain is incubated at 37 ° C. in 10 ml LB medium containing 50 μg ml -1 ampicillin.
Overnight, pelleted and grown in 100 ml fresh medium for 2 hours. Furthermore, 0.5 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to this E. coli strain and shaken at 28 ° C. for 2 hours to induce expression of the recombinant protein (3CL-R188I protease). At this time, pMAL-3C
From E. coli transformed with L-R188I, 3CL-R188I protease is located on the N-terminal side of MBP-His-F.
From E. coli expressed as a fusion protein with lag added and transformed with pET-3CL-R188I, 3CL-R188I protease has Met-Ala-Ser added to its N-terminal side and Leu-Glu to its C-terminal side.
And expressed as a fusion protein with a His tag.
ついで、細胞をペレット化し、該ペレット化した細胞を、Hisタグ付加タンパク質の精
製のための、10mMイミダゾール、1mMフッ化フェニルメチルスルホニルおよび10μl ml-1
のプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)を含有する溶液L(50mM Na2HPO4、pH7.0、300mM Na
Cl)20mlで再懸濁し、氷水中でBioruptor(コスモ・バイオ、東京、日本)を使用し、1回に
つき200W、30秒間として120秒間隔で4回にわたり超音波処理を行った。細胞残屑を14000
×gで20分間の遠心分離で除去し、上清の粗抽出液を採集した。採集した粗抽出液を、10m
Mイミダゾールを含有する溶液Lで平衡化したベッド体積1mlのTALON Metal Affinity Resi
n (クロンテック)に適用した。SARS 3CLプロテアーゼを含む融合タンパク質を、同溶液20
mlで洗浄後、125mMイミダゾールを含有する溶液Lで溶出させた。Centricon YM-10 (10kDa
カットオフ、ミリポア)を使用した限外濾過によって緩衝液を20mMトリス-HCl pH7.5に交
換するとともに、結合させた溶出画分(1.3ml)を0.2mlに濃縮した。
The cells were then pelleted and the pelleted cells were purified with 10 mM imidazole, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and 10 μl ml −1 for purification of His-tagged protein.
Solution L (50 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.0, 300 mM Na) containing a protease inhibitor cocktail (Sigma)
Cl) was resuspended in 20 ml and sonicated in ice water using Bioruptor (Cosmo Bio, Tokyo, Japan) at 200 W for 30 seconds and 4 times at 120 second intervals. 14000 cell debris
The supernatant was extracted by centrifugation at xg for 20 minutes and the crude supernatant was collected. The collected crude extract is 10m
TALON Metal Affinity Resi with 1 ml bed volume equilibrated with solution L containing M imidazole
Applied to n (Clontech). Fusion protein containing SARS 3CL protease
After washing with ml, elution was performed with solution L containing 125 mM imidazole. Centricon YM-10 (10kDa
The buffer was changed to 20 mM Tris-HCl pH 7.5 by ultrafiltration using a cutoff (Millipore) and the bound elution fraction (1.3 ml) was concentrated to 0.2 ml.
タグが付加していない3CL-R188Lプロテアーゼの精製のため、N末端側にMBP-His-Flag-
タグを付加したプロテアーゼ(約1.5mgのタンパク質)をMetal Affinity Resinで処理した
画分を、20mMトリス-HCl pH7.4、50mM NaCl、2mM CaCl2を含有する緩衝液1ml中で17Uの組
換えエンテロキナーゼ (ノバゲン)とともに21℃で2時間さらにインキュベートした。この
エンテロキナーゼ処理により、MBP-His-Flag-タグを3CL-R188Lプロテアーゼから切り離し
た。さらに、EKapture Agarose (ノバゲン)を使用して溶液からエンテロキナーゼを除去
した後、緩衝液をCentricon YM-10を使用して20mMビス-トリスpH5.5に交換した。ついで
、エンテロキナーゼで処理した画分を同緩衝液で平衡化したベッド体積1mlのDEAE Sephar
ose (GEヘルスケア)に適用した。タグが付加していない3CL-R188LプロテアーゼはSepharo
se樹脂を通過し、MBP-His-Flag断片は樹脂中に保持された。場合により、MBP-His-Flag断
片を0.5M KClを含有する同緩衝液で溶出させることができた。
MBP-His-Flag- on the N-terminal side for purification of 3CL-R188L protease without tag
Fractions treated with Metal Affinity Resin of tagged protease (approximately 1.5 mg protein) were subjected to 17 U of recombinant enterovirus in 1 ml of buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 Further incubation with kinase (Novagen) at 21 ° C. for 2 hours. By this enterokinase treatment, the MBP-His-Flag-tag was separated from the 3CL-R188L protease. In addition, EKapture Agarose (Novagen) was used to remove enterokinase from the solution, and then the buffer was changed to 20 mM Bis-Tris pH 5.5 using Centricon YM-10. Next, the fraction treated with enterokinase was equilibrated with the same buffer, and the DEAE Sephar with a bed volume of 1 ml was used.
Applied to ose (GE Healthcare). 3CL-R188L protease without tag is Sepharo
The se resin passed through and the MBP-His-Flag fragment was retained in the resin. In some cases, the MBP-His-Flag fragment could be eluted with the same buffer containing 0.5M KCl.
１．３．3CLプロテアーゼの分解についての検討および切断部位の同定
3CLプロテアーゼの分解について検討するため、C末端側にHis-タグを付加した3CLプロ
テアーゼのMetal Affinity Resinで処理した画分を基質として使用した。画分(約4μgの
タンパク質)を0.05Uのエンテロキナーゼまたは0.5μgの精製した3CL-R188Lプロテアーゼ
とともに室温で14時間インキュベートした後、溶液を15% SDS-PAGEゲル上で分離し、ポリ
ビニリデンジフルオライド(PVDF)膜にエレクトロブロットした。His-タグ付加3CLプロテ
アーゼおよびその切断された産物を、抗-His-タグのモノクローナル抗体(ノバゲン)、ビ
オチン化抗-マウスIgG(ベクター)、および増幅されたアルカリホスファターゼImmun-Blot
アッセイキット(バイオ・ラッド)を使用して視覚化した。
1.3.3 Examination of 3CL protease degradation and identification of cleavage site
In order to examine the degradation of 3CL protease, a fraction treated with Metal Affinity Resin of 3CL protease with a His-tag added on the C-terminal side was used as a substrate. After incubating the fraction (approximately 4 μg protein) with 0.05 U enterokinase or 0.5 μg purified 3CL-R188L protease for 14 hours at room temperature, the solution was separated on a 15% SDS-PAGE gel and polyvinylidene difluoride. Electroblotted to a ride (PVDF) membrane. His-tagged 3CL protease and its cleaved products are converted to anti-His-tag monoclonal antibody (Novagen), biotinylated anti-mouse IgG (vector), and amplified alkaline phosphatase Immun-Blot
Visualization was performed using an assay kit (Bio-Rad).
3CLプロテアーゼの切断部位を同定するため、N末端側にMBP-His-Flag-タグを付加した3
CLプロテアーゼのMetal Affinity Resin（金属アフィニティー樹脂）で精製した画分(12
μgタンパク質)を1Uのエンテロキナーゼとともに21℃で30分間インキュベートし、ついで
15% SDS-PAGEゲル上で分離し、PVDF膜に移した。Coomassieブルー染色後、20kDaおよび13
kDaバンドを分析した。この時、N末端側の配列決定は、Edmanシーケンシングに従った（M
atsudaira, P. (1987) Sequence from picomole quantities of proteins electroblotte
d onto polyvinylidene difluoride membranes.J. Biol. Chem. 262, 10035-10038.）。
この分析はアプロサイエンス生命科学研究所(鳴門、日本)でApplied Biosystems 491 Pro
tein Sequencerを使用して行った。
In order to identify the cleavage site of 3CL protease, MBP-His-Flag-tag was added to the N-terminal side3
Fraction purified with Metal Affinity Resin (12)
μg protein) with 1U enterokinase at 21 ° C for 30 minutes,
They were separated on a 15% SDS-PAGE gel and transferred to a PVDF membrane. 20 kDa and 13 after Coomassie blue staining
The kDa band was analyzed. At this time, sequencing on the N-terminal side followed Edman sequencing (M
atsudaira, P. (1987) Sequence from picomole quantities of proteins electroblotte
d onto polyvinylidene difluoride membranes. J. Biol. Chem. 262, 10035-10038.).
This analysis was performed at Applied Biosystems 491 Pro at the Institute of Life Sciences, ApproScience (Naruto, Japan)
This was done using a tein Sequencer.
１．４．基質ペプチド
Rinkアミド樹脂(4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノメチル)-フェノキシ樹脂)
(Rink, H. (1987) Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using a t
rialkoxy-diphenyl-methylester resin. Tetrahedron Lett. 28, 3787-3790.)から出発す
るFmoc型固相ペプチド合成法(SPPS)( Atherton, E et al. (2004) Synthesis of Peptide
s and Peptidemimetics E22a, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, pp740-754.)に従い、
以下の基質ペプチド（SO1, SO3, SR1）を合成した。
SO1; H-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-NH2（配列番号９）
SO3; H-Lys-Val-Ala-Thr-Val-Gln-Ser-Lys-Met-Ser-Asp-NH2（配列番号１０）
SR1; H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-Gln-Thr-Ala-Gln-Ala-Ala-Gly-Thr-Asp-Thr-NH2（配
列番号１１）
上記各アミノ酸配列において、右端の-NH2は、これらのペプチドのC末端がアミドにな
っていることを示している。
1.4. Substrate peptide
Rink amide resin (4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-Fmoc aminomethyl) -phenoxy resin)
(Rink, H. (1987) Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using at
Fmoc-type solid phase peptide synthesis (SPPS) starting from rialkoxy-diphenyl-methylester resin.Tetrahedron Lett. 28, 3787-3790. (Atherton, E et al. (2004) Synthesis of Peptide
s and Peptidemimetics E22a, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, pp740-754.)
The following substrate peptides (SO1, SO3, SR1) were synthesized.
SO1; H-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-NH 2 (SEQ ID NO: 9)
SO3; H-Lys-Val-Ala-Thr-Val-Gln-Ser-Lys-Met-Ser-Asp-NH 2 (SEQ ID NO: 10)
SR1; H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-Gln-Thr-Ala-Gln-Ala-Ala-Gly-Thr-Asp-Thr-NH 2 (SEQ ID NO: 11)
In each amino acid sequence described above, the rightmost —NH 2 indicates that the C-terminus of these peptides is an amide.
具体的には、20%ピペリジン/DMFを用いたFmocの脱保護と標準のジイソプロピルカルボ
ジイミド/HOBtプロトコルを用いた縮合反応とを組み合わせることによって固相合成を行
った。各ペプチドを、25℃で3時間にわたるTFA-チオアニソール(10:1)処理によって樹脂
から切断した後、分取HPLCによって精製した。さらにMALDI-TOF MS分析によって均一性を
確認した。
Specifically, solid phase synthesis was performed by combining Fmoc deprotection with 20% piperidine / DMF and a condensation reaction using standard diisopropylcarbodiimide / HOBt protocol. Each peptide was cleaved from the resin by treatment with TFA-thioanisole (10: 1) for 3 hours at 25 ° C. and then purified by preparative HPLC. Furthermore, the homogeneity was confirmed by MALDI-TOF MS analysis.
SO1; HPLC[コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150mm)、1.0ml/分、CH3CN(10〜20%)/30
分] 溶出時間19.62分、[M+H]+ 1192.714(計算値1192.681)。
SO3; HPLC[コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150 mm)、1.0 ml/分、CH3CN(10〜20%)/
30 分] 溶出時間8.58分、[M+H]+ 1192.288(計算値1192.637)。
SR1; HPLC [コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150mm)、1.0 ml/分、CH3CN(10〜50%)/
30 分] 溶出時間11.07分、[M+H]+ 1633.758(計算値1633.794)。
SO1; HPLC [Cosmosil 5C18 AR column (4.6 × 150 mm), 1.0 ml / min, CH 3 CN (10-20%) / 30
Min] Elution time 19.62 min, [M + H] + 1192.714 (calculated value 1192.681).
SO3; HPLC (Cosmosil 5C18 AR column (4.6 × 150 mm), 1.0 ml / min, CH 3 CN (10-20%) /
30 min] Elution time 8.58 min, [M + H] + 1192.288 (calculated value 1192.637).
SR1; HPLC (Cosmosil 5C18 AR column (4.6 x 150 mm), 1.0 ml / min, CH 3 CN (10-50%) /
30 min] Elution time 11.07 min, [M + H] + 1633.758 (calculated value 1633.794).
１．５．3CLプロテアーゼ活性
分析HPLCを用いた基質ペプチドの切断アッセイにより、3CLプロテアーゼのタンパク質
分解活性を検出した。具体的には、7mM DTTを含有する20mMトリス-HCl緩衝液 pH7.5中の
各基質ペプチドを3CLプロテアーゼとともに37℃でインキュベートし、0.1%トリフルオロ
酢酸中のアセトニトリルの直線勾配を用いた分析HPLC(コスモシール製5C18逆相カラム、4
.6×150mm)によって切断反応を監視した。各加水分解産物をMALDI-TOF MS分析によって同
定した。
37℃での精製プロテアーゼ変異体による各基質の加水分解反応の初期速度測定値により
、速度論的パラメータのKmおよびkcatを判定した。プロテアーゼを異なる最終濃度の各基
質(0〜168μM)を含有する様々な溶液に添加することにより、各反応を開始した。異なる
基質に対して切断活性が異なることから、酵素の最終濃度と消化時間は適宜変更した（変
異型プロテアーゼで10〜170nM、反応時間15〜90分）。反応後、分析HPLC(コスモシール製
5C18逆相カラム、4.6×150mm、0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの10%〜20%直線
勾配を使用)によって加水分解物を分析した。各基質のピーク面積の減少から初期消化速
度を計算した。Kmを[S]/v対[S]（[S]は基質の濃度、vは初期反応速度）のプロットから計
算した。すべての反応を3回繰り返し、結果を平均化した。
1.5.3CL Protease Activity The proteolytic activity of 3CL protease was detected by substrate peptide cleavage assay using analytical HPLC. Specifically, analytical HPLC using a linear gradient of acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid, each substrate peptide in 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 containing 7 mM DTT incubated with 3CL protease at 37 ° C (Cosmo Seal 5C18 reverse phase column, 4
The cleavage reaction was monitored by .6 × 150 mm). Each hydrolyzate was identified by MALDI-TOF MS analysis.
The kinetic parameters K m and k cat were determined by initial rate measurements of the hydrolysis reaction of each substrate by purified protease mutants at 37 ° C. Each reaction was initiated by adding protease to various solutions containing different final concentrations of each substrate (0-168 μM). Since the cleavage activity was different for different substrates, the final enzyme concentration and digestion time were changed as appropriate (10-170 nM for mutant protease, reaction time 15-90 minutes). After the reaction, analytical HPLC (Cosmo Seal
The hydrolyzate was analyzed by 5C18 reverse phase column, 4.6 × 150 mm, using a 10% -20% linear gradient of acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid. The initial digestion rate was calculated from the reduction in the peak area of each substrate. K m was calculated from a plot of [S] / v vs. [S] ([S] is the substrate concentration, v is the initial reaction rate). All reactions were repeated 3 times and the results were averaged.
１．６．阻害物質
チオールプロテアーゼに対する代表的阻害物質E-64(Hanada, K. et al. (1978) Isolat
ion and Characterization of E-64, a New Thiol Protease Inhibitor. Agric. Biol. C
hem. 42, 523-528.)を（株）ペプチド研究所(大阪府箕面市、日本)から購入した。
1.6. Inhibitors Representative inhibitors of thiol protease E-64 (Hanada, K. et al. (1978) Isolat
ion and Characterization of E-64, a New Thiol Protease Inhibitor. Agric. Biol. C
hem. 42, 523-528.) was purchased from Peptide Research Institute (Mino City, Osaka, Japan).
また、基質のテトラペプチド配列およびC末端側にアルデヒドを有するアルデヒド型阻
害物質（Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2
CON(CH3)2)-CHO、Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-L
eu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO）をNa- Fmoc-保護基を用いた従来の溶液相合成によって
合成した。具体的にはEt2NHによるFmocの脱保護とBOP試薬による対応するFmoc-アミノ酸
の縮合の組み合わせにより、Fmoc-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CON(OCH3)CH3から出発して連
続的にペプチド鎖を伸長した。鎖伸長の完了後、LiAlH4を用いてC末端側のアミドを還元
し、対応するペプチド-アルデヒドを生成した(Nahm, S.et al. (1981) N-methoxy-n-meth
ylamides as effective acylating agents. Tetrahedron Lett. 22, 3815-3818.)。0.1%
トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの15〜25%の直線勾配(60分、流速3ml/分)を用いた
セミ分取HPLC(コスモシール、5C18逆相カラム、1.0×250mm)等によって粗生成物を精製し
、さらに1H-NMR(Bruker AV300M分光計)等によって均一性等を確認した。
In addition, an aldehyde-type inhibitor (Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, Ac- Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2
CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, Ac-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and Ac-Ser-Ala-Val-L
eu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO) was synthesized by conventional solution phase synthesis using Na a -Fmoc-protecting group. Specifically, Fmoc-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CON (OCH 3 ) CH 3 is obtained by combining Fmoc deprotection with Et 2 NH and condensation of the corresponding Fmoc-amino acid with BOP reagent. Starting from, the peptide chain was continuously extended. After completion of chain extension, LiAlH 4 was used to reduce the C-terminal amide to produce the corresponding peptide-aldehyde (Nahm, S. et al. (1981) N-methoxy-n-meth.
ylamides as effective acylating agents. Tetrahedron Lett. 22, 3815-3818.). 0.1%
Purify the crude product by semi-preparative HPLC (Cosmosil, 5C18 reverse phase column, 1.0 x 250 mm) using a 15-25% linear gradient of acetonitrile in trifluoroacetic acid (60 min, flow rate 3 ml / min), etc. Further, uniformity and the like were confirmed by 1 H-NMR (Bruker AV300M spectrometer) or the like.
ここで、Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu- NHCH(CH2
CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-V
al-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOは、より詳細には、次のように合成した。
尚、下記合成において、分取HPLC分析はELITE LaChrom system(OD, 220nm)（HITACHI）
を用いて行った。このとき、カラムはCOSMOSIL 5C18-AR-II (4.6x150 mm または10x250 m
m)（Nacalai tesque）を用いた。
また、1H(300MHz)NMRおよび13C(75MHz)NMRのスペクトログラムをAM-300（Bruker）に記
録した。化学シフトは、TMS(0ppm)またはCHCl3(1Hについては7.28ppm、また、13Cについ
ては77.0ppm)に対するppmで表わした。
また、Autoflex-II(Bruker)により高分解能MALDI TOF-MSマススペクトルを測定した。
さらに、旋光度は、SEPA-300 polarimeter(HORIBA)を用いて、ナトリウムD線で測定し
た。
Where Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, Ac-Val-Leu- NHCH (CH 2
CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, Ac-Ala-Val-Leu- NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and Ac-Ser-Ala-V
al-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO was synthesized in more detail as follows.
In the following synthesis, preparative HPLC analysis is performed using ELITE LaChrom system (OD, 220nm) (HITACHI)
It was performed using. At this time, the column is COSMOSIL 5C18-AR-II (4.6x150 mm or 10x250 m
m) (Nacalai tesque) was used.
In addition, spectrograms of 1 H (300 MHz) NMR and 13 C (75 MHz) NMR were recorded on AM-300 (Bruker). Chemical shifts were expressed in ppm relative to TMS (0 ppm) or CHCl 3 (7.28 ppm for 1 H and 77.0 ppm for 13 C).
In addition, a high-resolution MALDI TOF-MS mass spectrum was measured by Autoflex-II (Bruker).
Further, the optical rotation was measured with sodium D line using a SEPA-300 polarimeter (HORIBA).
(1) Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOの合成
(1-1)Fmoc-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Glu-OBut(1.28 g, 3 mmol)をCH2Cl2(10 ml)に溶解し、HN(Me)2塩酸塩(0.29 g, 3.
56 mmol)、BOP(1.59 g, 3.56 mmol)、DIEA(1.91 ml, 12 mmol)を加え、室温で2時間撹拌
した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％Na
HCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を
溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し
、目的物をさらに精製することなくそのまま次のTFA処理を行った。目的物にanisole (0.
65 ml, 6.0 mmol)とTFA (7.0 ml)を加え、室温で1時間撹拌した。室温でTFAを留去、残渣
をヘキサンで洗浄した後減圧下で乾燥した。得られた残渣をDMF (10 ml)に溶解し、HN(OM
e)Me塩酸塩(0.38 g, 3.90 mmol)、BOP(1.72 g, 3.90 mmol)、DIEA(1.70 ml, 11 mmol)を
加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5％
クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶
媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量
1.13 g (85 %), [a]D 27 +46.7 (c 0.24, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 2.00 (m, 1H), 2.
16 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.94 (s, 3H), 2.95 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 3.79 (s, 3H)
, 4.22 (t, J=7.1 Hz, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.76 (br s, 1H), 5.91 (d, J=8.1 Hz, 1H),
7.31 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.61 (br t, J=8.3 Hz, 2H), 7.75
(d, J=8.3 Hz, 2H); 13C NMR d; 27.72, 29.13, 32.29, 35.63, 37.24, 47.27, 51.04,
61.72, 67.09, 120.05, 125.23, 125.34, 127.15, 127.78, 141.37, 141.40, 143.89, 14
4.12, 156.39, 162.44, 171.99; MALDI TOF-MS; Calcd. 462.201 for C24H29N3O5Na, Fou
nd. 462.126 for [M+Na]+
(1) Synthesis of Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO
(1-1) Fmoc-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me
Fmoc-Glu-OBu t (1.28 g, 3 mmol) was dissolved in CH 2 Cl 2 (10 ml) and HN (Me) 2 hydrochloride (0.29 g, 3.
56 mmol), BOP (1.59 g, 3.56 mmol) and DIEA (1.91 ml, 12 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After the solvent was distilled off and the residue was extracted with ethyl acetate, the organic layer was diluted with 5% aqueous citric acid solution and 5% Na
Washed with aqueous HCO 3 solution and saturated brine. The organic layer was dried over MgSO 4 and the solvent was distilled off. The residue was purified by silica gel column chromatography using CHCl 3 : MeOH = 10: 0.5 as an eluent, and the target product was directly subjected to the next TFA treatment without further purification. Anisole (0.
65 ml, 6.0 mmol) and TFA (7.0 ml) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. TFA was distilled off at room temperature, and the residue was washed with hexane and dried under reduced pressure. The resulting residue was dissolved in DMF (10 ml) and HN (OM
e) Me hydrochloride (0.38 g, 3.90 mmol), BOP (1.72 g, 3.90 mmol) and DIEA (1.70 ml, 11 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 8 hours. The solvent was distilled off and the residue was extracted with ethyl acetate.
Washed with aqueous citric acid solution, 5% aqueous NaHCO 3 solution, and saturated brine. The organic layer was dried over MgSO 4 and the solvent was distilled off. The residue was purified by silica gel column chromatography using CHCl 3 : MeOH = 10: 0.5 as an eluent to obtain the desired product (Fmoc-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me) as an oily substance. yield
1.13 g (85%), [a] D 27 +46.7 (c 0.24, CHCl 3 ), 1 H NMR (CDCl 3 ) d; 2.00 (m, 1H), 2.
16 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.94 (s, 3H), 2.95 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 3.79 (s, 3H)
, 4.22 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.76 (br s, 1H), 5.91 (d, J = 8.1 Hz, 1H),
7.31 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.61 (br t, J = 8.3 Hz, 2H), 7.75
(d, J = 8.3 Hz, 2H); 13 C NMR d; 27.72, 29.13, 32.29, 35.63, 37.24, 47.27, 51.04,
61.72, 67.09, 120.05, 125.23, 125.34, 127.15, 127.78, 141.37, 141.40, 143.89, 14
4.12, 156.39, 162.44, 171.99; MALDI TOF-MS; Calcd. 462.201 for C 24 H 29 N 3 O 5 Na, Fou
nd. 462.126 for [M + Na] +
(1-2)Fmoc-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Gln-N(OMe)Me (0.73 g, 1.66 mmol)をCH3CN (8 ml)に溶解し、Et2NH (8.6 ml)を
加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製
することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をCH2Cl2(5 ml)に溶解し、Fmoc-L
eu-OH (0.49 g, 1.39 mmol)、BOP(0.61 g, 1.39 mmol)、DIEA(0.44 ml, 2.77 mmol)を加
え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5％ク
エン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒
を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収
量 0.60 g (91 %), [a]D 27 -27.6 (c 1.1, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.94 (s, 3H), 0
.96 (s, 3H), 1.53-1.63 (m, 2H), 1.66-1.72 (m, 1H), 2.00 (br s, 1H), 2.14-2.21 (m
, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 4.19-4.24 (m, 1H)
, 4.22 (d, J=6.9 Hz, 1H), 4.29-4.42 (m, 2H), 4.92 (br s, 1H), 5.40 (d, J=8.4 Hz,
1H), 7.32 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.
75 (d, J=7.5 Hz, 2H); 13C NMR d; 22.06, 23.12, 24.77, 26.77, 29.18, 32.33, 35.70
, 37.20, 42.19, 47.32, 49.64, 53.66, 61.71, 67.09, 120.06, 120.08, 125.22, 127.2
0, 127.82, 141.40, 143.97, 144.02, 156.19, 171.80, 172.36, 172.43; MALDI TOF-MS;
Calcd. 575.285 for C30H40N4O6Na, Found. 575.174 for [M+Na]+
(1-2) Fmoc-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me
Fmoc-Gln-N (OMe) Me (0.73 g, 1.66 mmol) was dissolved in CH 3 CN (8 ml), Et 2 NH (8.6 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 40 minutes. The solvent was distilled off and the residue was dried under reduced pressure. The product was subjected to the next condensation without further purification. The resulting residue was dissolved in CH 2 Cl 2 (5 ml) and Fmoc-L
eu-OH (0.49 g, 1.39 mmol), BOP (0.61 g, 1.39 mmol) and DIEA (0.44 ml, 2.77 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 8 hours. After the solvent was distilled off and the residue was extracted with ethyl acetate, the organic layer was washed with 5% aqueous citric acid solution, 5% aqueous NaHCO 3 solution and saturated brine. The organic layer was dried over MgSO 4 and the solvent was distilled off. The residue was purified by silica gel column chromatography using CHCl 3 : MeOH = 10: 0.5 as an eluent to obtain the desired product (Fmoc-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me) as an oily substance. Yield 0.60 g (91%), [a] D 27 -27.6 (c 1.1, CHCl 3 ), 1 H NMR (CDCl 3 ) d; 0.94 (s, 3H), 0
.96 (s, 3H), 1.53-1.63 (m, 2H), 1.66-1.72 (m, 1H), 2.00 (br s, 1H), 2.14-2.21 (m
, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 4.19-4.24 (m, 1H)
, 4.22 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.29-4.42 (m, 2H), 4.92 (br s, 1H), 5.40 (d, J = 8.4 Hz,
1H), 7.32 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.
75 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13 C NMR d; 22.06, 23.12, 24.77, 26.77, 29.18, 32.33, 35.70
, 37.20, 42.19, 47.32, 49.64, 53.66, 61.71, 67.09, 120.06, 120.08, 125.22, 127.2
0, 127.82, 141.40, 143.97, 144.02, 156.19, 171.80, 172.36, 172.43; MALDI TOF-MS;
Calcd. 575.285 for C 30 H 40 N 4 O 6 Na, Found. 575.174 for [M + Na] +
(1-3)Fmoc-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.60 g, 1.09 mmol)をCH3CN (6 ml)に溶解し、Et2NH (5.6 ml
)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに
精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をCH2Cl2-DMF(2.5 ml-2.5 ml
)に溶解し、Fmoc-Val-OH (0.44 g, 1.30 mmol)、BOP(0.58 g, 1.30 mmol)、DIEA(0.41 ml
, 2.58 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した
後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMg
SO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油
状物質として得た。収量 0.61 g (86 %), [a]D 27 -11.6 (c 1.0, CHCl3), 1H NMR (CDCl3
) d; 0.86 (m, 12H), 1.49-1.65 (m, 2H), 1.97 (br s, 1H), 2.12-2.17 (m, 2H), 2.37-
2.39 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 2.94 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 4.03 (br t
, J=7.2 Hz, 1H), 4.21 (t, J=6.9 Hz, 1H), 4.31-4.53 (m, 3H), 4.92 (br s, 1H), 5.5
8 (br d, J=8.7 Hz, 1H), 6.56 (br d, J=7.5 Hz, 1H), 7.30 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.39
(t, J=7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.5 Hz, 2H); 13C NMR d; 17
.97, 19.38, 22.10, 23.03, 24.83, 29.20, 31.25, 35.73, 37.28, 41.79, 47.32, 49.56
, 52.01, 60.61, 61.71, 67.24, 120.08, 125.22, 127.21, 127.84, 141.43, 144.05, 15
6.58, 171.32, 171.85, 172.36; MALDI TOF-MS; Calcd. 674.353 for C35H49N5O7Na, Fou
nd. 674.211 for [M+Na]+
(1-3) Fmoc-Val-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me
Fmoc-Leu-Gln-N (OMe) Me (0.60 g, 1.09 mmol) was dissolved in CH 3 CN (6 ml) and Et 2 NH (5.6 ml
) And stirred at room temperature for 40 minutes. The solvent was distilled off and the residue was dried under reduced pressure. The product was subjected to the next condensation without further purification. The resulting residue was CH 2 Cl 2 -DMF (2.5 ml-2.5 ml
), Fmoc-Val-OH (0.44 g, 1.30 mmol), BOP (0.58 g, 1.30 mmol), DIEA (0.41 ml
, 2.58 mmol) and stirred at room temperature for 8 hours. After the solvent was distilled off and the residue was extracted with ethyl acetate, the organic layer was washed with 5% aqueous citric acid solution, 5% aqueous NaHCO 3 solution and saturated brine. Mg organic layer
It was dried over SO 4 and the solvent was distilled off. The residue was purified by silica gel column chromatography using CHCl 3 : MeOH = 10: 0.5 as an eluent to obtain the desired product (Fmoc-Val-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me) as an oily substance. It was. Yield 0.61 g (86%), [a] D 27 -11.6 (c 1.0, CHCl 3 ), 1 H NMR (CDCl 3
) d; 0.86 (m, 12H), 1.49-1.65 (m, 2H), 1.97 (br s, 1H), 2.12-2.17 (m, 2H), 2.37-
2.39 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 2.94 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 4.03 (br t
, J = 7.2 Hz, 1H), 4.21 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.31-4.53 (m, 3H), 4.92 (br s, 1H), 5.5
8 (br d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.56 (br d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.39
(t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13 C NMR d; 17
.97, 19.38, 22.10, 23.03, 24.83, 29.20, 31.25, 35.73, 37.28, 41.79, 47.32, 49.56
, 52.01, 60.61, 61.71, 67.24, 120.08, 125.22, 127.21, 127.84, 141.43, 144.05, 15
6.58, 171.32, 171.85, 172.36; MALDI TOF-MS; Calcd. 674.353 for C 35 H 49 N 5 O 7 Na, Fou
nd. 674.211 for [M + Na] +
(1-4)Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.60 g, 0.92 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml-3 ml)に溶解
し、Et2NH (4.8 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた
。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(5 ml
)に溶解し、Fmoc-Ala-OH (0.34 g, 1.09 mmol)、BOP(0.49 g, 1.09 mmol)、DIEA(0.35 ml
, 2.20 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した
後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMg
SO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)
を油状物質として得た。収量 0.51 g (77 %), [a]D 27 -30.3 (c 0.90, CHCl3), 1H NMR (
CDCl3) d; 0.87 (d, J=6.6 Hz, 6H), 0.93 (d, J=6.6 Hz, 6H), 1.36 (d, J=6.9 Hz, 3H)
, 1.51-1.67 (m, 3H), 1.95-2.14 (m, 3H), 2.33-2.38 (m, 2H), 2.88 (s, 6H), 3.17(s,
3H), 3.72 (s, 3H), 4.20 (t, J=7.2 Hz, 1H), 4.28-4.41 (m, 2H), 4.46 (br s, 1H),
4.57 (br s, 1H), 4.83 (br s, 1H), 5.08 (br s, 1H), 6.21 (br s, 1H), 7.24 (t, J=7
.2 Hz, 2H), 7.37 (t, J=7.4 Hz, 2H), 7.60 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J=7.5 Hz, 2
H), 7.95 (br s, 1H); 13C NMR d; 18.66, 19.42, 22.65, 22.88, 25.04, 27.92, 29.34,
31.51, 32.33, 35.58, 37.20, 42.06, 47.27, 49.01, 50.59, 51.76, 58.92, 61.79, 67
.19, 120.06, 125.32, 127.17, 127.81, 141.39, 144.05, 162.49, 171.03, 172.07, 172
.94; MALDI TOF-MS; Calcd. 745.390 for C38H54N6O8Na, Found. 745.199 for [M+Na]+
(1-4) Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me
Fmoc-Val-Leu-Gln-N (OMe) Me (0.60 g, 0.92 mmol) was dissolved in CH 2 Cl 2 -CH 3 CN (3 ml-3 ml), Et 2 NH (4.8 ml) was added, Stir at room temperature for 40 minutes. The solvent was distilled off and the residue was dried under reduced pressure. The product was subjected to the next condensation without further purification. The resulting residue was DMF (5 ml
), Fmoc-Ala-OH (0.34 g, 1.09 mmol), BOP (0.49 g, 1.09 mmol), DIEA (0.35 ml
, 2.20 mmol) and stirred at room temperature for 8 hours. After the solvent was distilled off and the residue was extracted with ethyl acetate, the organic layer was washed with 5% aqueous citric acid solution, 5% aqueous NaHCO 3 solution and saturated brine. Mg organic layer
It was dried over SO 4 and the solvent was distilled off. The residue was purified by silica gel column chromatography using CHCl 3 : MeOH = 10: 0.5 as an eluent, and the desired product (Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me)
Was obtained as an oil. Yield 0.51 g (77%), [a] D 27 -30.3 (c 0.90, CHCl 3 ), 1 H NMR (
CDCl 3 ) d; 0.87 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.36 (d, J = 6.9 Hz, 3H)
, 1.51-1.67 (m, 3H), 1.95-2.14 (m, 3H), 2.33-2.38 (m, 2H), 2.88 (s, 6H), 3.17 (s,
3H), 3.72 (s, 3H), 4.20 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.28-4.41 (m, 2H), 4.46 (br s, 1H),
4.57 (br s, 1H), 4.83 (br s, 1H), 5.08 (br s, 1H), 6.21 (br s, 1H), 7.24 (t, J = 7
.2 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 7.5 Hz, 2
H), 7.95 (br s, 1H); 13 C NMR d; 18.66, 19.42, 22.65, 22.88, 25.04, 27.92, 29.34,
31.51, 32.33, 35.58, 37.20, 42.06, 47.27, 49.01, 50.59, 51.76, 58.92, 61.79, 67
.19, 120.06, 125.32, 127.17, 127.81, 141.39, 144.05, 162.49, 171.03, 172.07, 172
.94; MALDI TOF-MS; Calcd. 745.390 for C 38 H 54 N 6 O 8 Na, Found. 745.199 for [M + Na] +
(1-5)Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.56 g, 0.77 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml-3 ml)に
溶解し、Et2NH (4.0 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥さ
せた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(
5 ml)に溶解し、Fmoc-Ser(But)-OH (0.36 g, 0.94 mmol)、BOP(0.41 g, 0.94 mmol)、DIE
A(0.30 ml, 1.89 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで
抽出した後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有
機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用い
るシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-G
ln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量 0.58 g (86 %), [a]D 27 -22.8 (c 0.15,
CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.84-0.92 (m, 12H), 1.15 (s, 9H), 1.34 (d, J=6.6 Hz,
3H), 1.55-1.63 (m, 3H), 1.89-1.99 (m, 1H), 2.07-2.17 (m, 2H), 2.36 (br s, 2H), 2
.88 (s, 3H), 2.89 (s, 3H), 3.17 (s, 3H), 3.47 (t, J=7.8 Hz, 1H), 3.71 (t, J=7.8
Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 4.21 (t, J=7.1 Hz, 1H), 4.29-4.50 (m, 4H), 4.83 (br s, 1H
), 4.94 (br s, 1H), 5.09 (br s, 1H), 6.39 (br s, 1H), 7.26 (br t, J=7.4 Hz, 2H),
7.37 (br t, J=7.4 Hz, 2H), 7.62 (br d, J=6.9 Hz, 2H), 7.74 (br d, J=7.2 Hz, 2H)
, 7.83 (br s, 1H), 8.03 (br s, 1H); 13C NMR d; 18.51, 19.26, 22.36, 22.79, 24.95
, 27.35, 27.90, 29.20, 31.57, 35.42, 37.09, 41.80, 47.15, 48.99, 51.67, 54.98, 5
8.70, 61.70, 62.20, 67.05, 119.89, 125.22, 127.02, 127.65, 141.26, 143.92, 162.3
4, 170.02, 171.00, 172.00; MALDI TOF-MS; Calcd. 888.041 for C45H66N7O10Na, Found
. 888.253 for [M+Na]+
(1-5) Fmoc-Ser (Bu t ) -Ala-Val-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me
Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln-N (OMe) Me (0.56 g, 0.77 mmol) was dissolved in CH 2 Cl 2 -CH 3 CN (3 ml-3 ml), and Et 2 NH (4.0 ml) was dissolved. The mixture was further stirred at room temperature for 40 minutes. The solvent was distilled off and the residue was dried under reduced pressure. The product was subjected to the next condensation without further purification. The resulting residue was DMF (
5 ml), Fmoc-Ser (Bu t ) -OH (0.36 g, 0.94 mmol), BOP (0.41 g, 0.94 mmol), DIE
A (0.30 ml, 1.89 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After the solvent was distilled off and the residue was extracted with ethyl acetate, the organic layer was washed with 5% aqueous citric acid solution, 5% aqueous NaHCO 3 solution and saturated brine. The organic layer was dried over MgSO 4 and the solvent was distilled off. The residue, CHCl 3 as eluent: MeOH = 10: 0.5 was purified by silica gel column chromatography using, the desired product (Fmoc-Ser (Bu t) -Ala-Val-Leu-G
ln (Me) 2 -N (OMe) Me) was obtained as an oil. Yield 0.58 g (86%), [a] D 27 -22.8 (c 0.15,
CHCl 3 ), 1 H NMR (CDCl 3 ) d; 0.84-0.92 (m, 12H), 1.15 (s, 9H), 1.34 (d, J = 6.6 Hz,
3H), 1.55-1.63 (m, 3H), 1.89-1.99 (m, 1H), 2.07-2.17 (m, 2H), 2.36 (br s, 2H), 2
.88 (s, 3H), 2.89 (s, 3H), 3.17 (s, 3H), 3.47 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 3.71 (t, J = 7.8
Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 4.21 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.29-4.50 (m, 4H), 4.83 (br s, 1H
), 4.94 (br s, 1H), 5.09 (br s, 1H), 6.39 (br s, 1H), 7.26 (br t, J = 7.4 Hz, 2H),
7.37 (br t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.62 (br d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.74 (br d, J = 7.2 Hz, 2H)
, 7.83 (br s, 1H), 8.03 (br s, 1H); 13 C NMR d; 18.51, 19.26, 22.36, 22.79, 24.95
, 27.35, 27.90, 29.20, 31.57, 35.42, 37.09, 41.80, 47.15, 48.99, 51.67, 54.98, 5
8.70, 61.70, 62.20, 67.05, 119.89, 125.22, 127.02, 127.65, 141.26, 143.92, 162.3
4, 170.02, 171.00, 172.00; MALDI TOF-MS; Calcd. 888.041 for C 45 H 66 N 7 O 10 Na, Found
888.253 for [M + Na] +
(1-6)Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.57 g, 0.66 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml
-3 ml)に溶解し、Et2NH (3.4 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧
下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残
渣をDMF(5 ml)に溶解し、Fmoc-Thr(But)-OH (0.33 g, 0.80 mmol)、BOP(0.35 g, 0.80 mm
ol)、DIEA(0.25 ml, 1.57 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。溶媒を留去し残渣にH2O
を加え、析出する沈殿を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、水で洗浄した。DMF/Et2O
で再沈殿し、目的物(Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を固形物
として得た。収量 0.40 g (59 %), [a]D 27 -13.2 (c 0.68, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d;
0.93-0.95 (br s, 12H), 1.17 (s, 12H), 1.31 (s, 9H), 1.41 (br d, J=6.0 Hz, 3H), 1
.67 (br s, 3H), 1.93 (br s, 1H), 2.13 (br s, 1H), 2.38 (br s, 3H), 2.92 (s, 3H),
2.97 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.51 (br s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.87 (br d, J=7.8 Hz
, 1H), 4.22 (br s, 4H), 4.42 (br s, 4H), 4.96 (br s, 1H), 6.78-6.81 (m, 2H), 7.1
4-7.41 (m, 7H), 7.58 (br d, J=5.7 Hz, 2H), 7.77 (br d, J=6.3 Hz, 2H); 13C NMR d;
17.28, 17.35, 17.89, 19.33, 21.48, 23.24, 24.73, 27.45, 28.30, 29.08, 29.65, 35
.51, 37.23, 40.50, 47.22, 49.11, 50.49, 51.89, 54.52, 59.07, 60.83, 61.58, 66.72
, 67.19, 120.08, 124.98, 125.08, 127.12, 127.84, 141.39, 143.61, 143.75, 156.07,
162.36, 169.63, 171.05, 171.35, 171.94, 172.31; MALDI TOF-MS; Calcd. 1045.252 f
or C53H81N8O12Na, Found. 1045.426 for [M+Na]+
(1-6) Fmoc-Thr (Bu t) -Ser (Bu t) -Ala-Val-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me
Fmoc-Ser (Bu t ) -Ala-Val-Leu-Gln-N (OMe) Me (0.57 g, 0.66 mmol) was added to CH 2 Cl 2 -CH 3 CN (3 ml
-3 ml), Et 2 NH (3.4 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 40 minutes. The solvent was distilled off and the residue was dried under reduced pressure. The product was subjected to the next condensation without further purification. The resulting residue was dissolved in DMF (5 ml), Fmoc- Thr (Bu t) -OH (0.33 g, 0.80 mmol), BOP (0.35 g, 0.80 mm
ol) and DIEA (0.25 ml, 1.57 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Remove the solvent and add H 2 O to the residue
And the precipitated precipitate was washed with 5% citric acid aqueous solution, 5% NaHCO 3 aqueous solution and water. DMF / Et 2 O
In reprecipitation to obtain the desired product (Fmoc-Thr (Bu t) -Ser (Bu t) -Ala-Val-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me) as a solid. Yield 0.40 g (59%), [a] D 27 -13.2 (c 0.68, CHCl 3 ), 1 H NMR (CDCl 3 ) d;
0.93-0.95 (br s, 12H), 1.17 (s, 12H), 1.31 (s, 9H), 1.41 (br d, J = 6.0 Hz, 3H), 1
.67 (br s, 3H), 1.93 (br s, 1H), 2.13 (br s, 1H), 2.38 (br s, 3H), 2.92 (s, 3H),
2.97 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.51 (br s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.87 (br d, J = 7.8 Hz
, 1H), 4.22 (br s, 4H), 4.42 (br s, 4H), 4.96 (br s, 1H), 6.78-6.81 (m, 2H), 7.1
4-7.41 (m, 7H), 7.58 (br d, J = 5.7 Hz, 2H), 7.77 (br d, J = 6.3 Hz, 2H); 13 C NMR d;
17.28, 17.35, 17.89, 19.33, 21.48, 23.24, 24.73, 27.45, 28.30, 29.08, 29.65, 35
.51, 37.23, 40.50, 47.22, 49.11, 50.49, 51.89, 54.52, 59.07, 60.83, 61.58, 66.72
, 67.19, 120.08, 124.98, 125.08, 127.12, 127.84, 141.39, 143.61, 143.75, 156.07,
162.36, 169.63, 171.05, 171.35, 171.94, 172.31; MALDI TOF-MS; Calcd. 1045.252 f
or C 53 H 81 N 8 O 12 Na, Found. 1045.426 for [M + Na] +
(1-7)Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (78 mg, 75 mmol)をCH2Cl2-CH3CN
(1.5 ml-1.5 ml)に溶解し、Et2NH (0.59 ml)を加え、室温で60分撹拌した。溶媒を留去
し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った
。得られた残渣をDMF(3 ml)に溶解し、Ac2O(0.14 ml, 1.48 mmol)、DIEA(0.24 ml, 1.48
mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣にH2Oを加え、析出する沈殿をDMF
/Et2Oで再沈殿し、目的物(Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を固
形物として得た。収量 40 mg (63 %), [a]D 27 -17.5 (c 0.20, DMF), 1H NMR (DMSO-d6)
d;0.80-0.88 (m, 12H), 1.04 (d, J=6.3 Hz, 3H), 1.10 (s, 9H), 1.11 (d, J=6.6 Hz, 3
H), 1.17 (s, 9H), 1.36-1.46 (m, 2H), 1.53-1.60 (m, 1H), 1.63-1.83 (m, 2H), 1.91
(s, 3H), 1.97 (m, 1H), 2.30 (br t, J=7.4 Hz, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.
10 (s, 3H), 3.41-3.46 (m, 1H), 3.51-3.59 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.87-3.90 (m, 1H
), 4.10-4.15 (m, 1H), 4.30-4.39 (m, 4H), 4.71 (br s, 1H), 7.61-7.97 (m, 6H); 13C
NMR d; 18.49, 18.92, 19.64, 21.94, 22.97, 23.54, 24.40, 27.57, 28.45, 30.75, 35
.29, 37.01, 48.61, 53.60, 57.75, 58.10, 62.25, 67.50, 169.89, 170.98, 171.64, 17
2.23; MALDI TOF-MS; Calcd. 865.538 for C40H74N8O11Na, Found. 865.476 for [M+Na]
+
(1-7) Ac-Thr (Bu t) -Ser (Bu t) -Ala-Val-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me
Fmoc-Thr (Bu t) -Ser (Bu t) -Ala-Val-Leu-Gln-N (OMe) Me (78 mg, 75 mmol) and CH 2 Cl 2 -CH 3 CN
(1.5 ml-1.5 ml), Et 2 NH (0.59 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 60 minutes. The solvent was distilled off and the residue was dried under reduced pressure. The product was subjected to the next condensation without further purification. The obtained residue was dissolved in DMF (3 ml), Ac 2 O (0.14 ml, 1.48 mmol), DIEA (0.24 ml, 1.48).
mmol) was added and stirred at room temperature for 8 hours. Evaporate the solvent and add H 2 O to the residue.
/ Et 2 O was reprecipitated to obtain the target product (Ac-Thr (Bu t ) -Ser (Bu t ) -Ala-Val-Leu-Gln (Me) 2 -N (OMe) Me) as a solid . Yield 40 mg (63%), [a] D 27 -17.5 (c 0.20, DMF), 1 H NMR (DMSO-d 6 )
d; 0.80-0.88 (m, 12H), 1.04 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.10 (s, 9H), 1.11 (d, J = 6.6 Hz, 3
H), 1.17 (s, 9H), 1.36-1.46 (m, 2H), 1.53-1.60 (m, 1H), 1.63-1.83 (m, 2H), 1.91
(s, 3H), 1.97 (m, 1H), 2.30 (br t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.
10 (s, 3H), 3.41-3.46 (m, 1H), 3.51-3.59 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.87-3.90 (m, 1H
), 4.10-4.15 (m, 1H), 4.30-4.39 (m, 4H), 4.71 (br s, 1H), 7.61-7.97 (m, 6H); 13 C
NMR d; 18.49, 18.92, 19.64, 21.94, 22.97, 23.54, 24.40, 27.57, 28.45, 30.75, 35
.29, 37.01, 48.61, 53.60, 57.75, 58.10, 62.25, 67.50, 169.89, 170.98, 171.64, 17
2.23; MALDI TOF-MS; Calcd. 865.538 for C 40 H 74 N 8 O 11 Na, Found. 865.476 for [M + Na]
+
(1-8)Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (30 mg, 36 mmol)をDMF-THF (1.5 m
l-1.5 ml)に溶解し、LiAlH4(30 mg)を加え、室温で90分撹拌した。反応液をセライトろ過
し溶媒を減圧留去した。生成物をCosmosil 5C18 (10 x 250 mm)を用いるHPLC (0.1 % TFA
containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 15% to 60% in 60 min) で精製した
。目的物を含むピーク（42分に溶出）を集め、凍結乾燥し白色粉末を得た。収量 5.2 mg
(19 %) 1H NMR (CD3CN containing D2O) d; 0.82-0.93 (m, 12H), 1.10-1.14 (m, 3H), 1
.14 (s, 9H), 1.17 (s, 9H), 1.31-1.36 (m, 3H), 1.56-1.64 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2
.10-2.17 (m, 1H), 2.28-2.33 (m, 2H), 2.85 (br s, 3H), 2.97 (br s, 3H), 3.61-3.70
(m, 2H), 3.97-4.02 (m, 1H), 4.10-4.24 (m, 6H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd
. 806.501 for C38H69N7O10Na, Found. 806.121 for [M+Na]+
得られた粉末 (7.1 mg, 9 mmol) にanisole (15 ml, 6.0 mmol)とTFA (0.5 ml)を加え、
室温で2時間撹拌した。室温でTFAを留去、残渣にエーテル(5 ml)と0.1% aq.TFA (5 ml)を
加えた。水層をエーテル(5 ml) で洗浄後、水層を凍結乾燥した。生成物をCosmosil 5C18
(10 x 250 mm)を用いるHPLC (0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradie
nt, 10% to 40% in 60 min) で精製した。目的物(Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2
CON(CH3)2)-CHO)を含むピーク（25.6分に溶出）を集め、凍結乾燥し白色粉末を得た。収
量 1.8 mg (30 %), HPLC retention time, 14.36 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm),
0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1
H NMR (CD3CN containing D2O) d; 0.84-0.94 (m, 12H), 1.14-1.17 (m, 3H), 1.33-1.37
(m, 3H), 1.56-1.63 (m, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.02-2.09 (m, 1H), 2.32-2.35 (m, 2H),
2.84-2.87 (m, 3H), 2.94-2.99 (m, 3H), 3.74-3.76 (m, 1H), 3.81-3.85 (m, 1H), 4.1
7-4.33 (m, 6H), 4.77-4.82 (m, 1H), 9.44 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 694.375 for
C30H53N7O10Na, Found. 694.337 for [M+Na]+
(1-8) Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO
Ac-Thr (Bu t) -Ser (Bu t) -Ala-Val-Leu-Gln-N (OMe) Me (30 mg, 36 mmol) of DMF-THF (1.5 m
1-1.5 ml), LiAlH 4 (30 mg) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 90 minutes. The reaction solution was filtered through Celite, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The product is HPLC (0.1% TFA) using Cosmosil 5C18 (10 x 250 mm)
containing CH 3 CN: 0.1% aq.TFA; CH 3 CN gradient, 15% to 60% in 60 min). A peak containing the desired product (eluted at 42 minutes) was collected and lyophilized to obtain a white powder. Yield 5.2 mg
(19%) 1 H NMR (CD 3 CN containing D 2 O) d; 0.82-0.93 (m, 12H), 1.10-1.14 (m, 3H), 1
.14 (s, 9H), 1.17 (s, 9H), 1.31-1.36 (m, 3H), 1.56-1.64 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2
.10-2.17 (m, 1H), 2.28-2.33 (m, 2H), 2.85 (br s, 3H), 2.97 (br s, 3H), 3.61-3.70
(m, 2H), 3.97-4.02 (m, 1H), 4.10-4.24 (m, 6H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd
806.501 for C 38 H 69 N 7 O 10 Na, Found. 806.121 for [M + Na] +
Anisole (15 ml, 6.0 mmol) and TFA (0.5 ml) were added to the obtained powder (7.1 mg, 9 mmol),
Stir at room temperature for 2 hours. TFA was distilled off at room temperature, and ether (5 ml) and 0.1% aq.TFA (5 ml) were added to the residue. The aqueous layer was washed with ether (5 ml), and the aqueous layer was lyophilized. Product Cosmosil 5C18
HPLC using (10 x 250 mm) (0.1% TFA containing CH 3 CN: 0.1% aq.TFA; CH 3 CN gradie
nt, 10% to 40% in 60 min). Target (Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu- NHCH (CH 2 CH 2
A peak containing CON (CH 3 ) 2 ) -CHO) (eluted at 25.6 minutes) was collected and lyophilized to obtain a white powder. Yield 1.8 mg (30%), HPLC retention time, 14.36 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm),
0.1% TFA containing CH 3 CN: 0.1% aq.TFA; CH 3 CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1
H NMR (CD 3 CN containing D 2 O) d; 0.84-0.94 (m, 12H), 1.14-1.17 (m, 3H), 1.33-1.37
(m, 3H), 1.56-1.63 (m, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.02-2.09 (m, 1H), 2.32-2.35 (m, 2H),
2.84-2.87 (m, 3H), 2.94-2.99 (m, 3H), 3.74-3.76 (m, 1H), 3.81-3.85 (m, 1H), 4.1
7-4.33 (m, 6H), 4.77-4.82 (m, 1H), 9.44 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 694.375 for
C 30 H 53 N 7 O 10 Na, Found. 694.337 for [M + Na] +
上記合成中間体より同様の操作により以下の各誘導体を合成した。 The following derivatives were synthesized from the above synthetic intermediate by the same operation.
(2)Ac-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
HPLC retention time, 18.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containi
ng CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1H NMR (CD3CN) d; 0
.86-0.99 (m, 12H), 1.51-1.64 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.31-2.37 (m, 2H), 3.98 (br
t, J=5.9 Hz, 1H), 4.27-4.33 (m, 1H), 4.55-4.63 (m, 1H), 4.78-4.86 (m, 1H), 6.82
(br d, J=7.8 Hz, 2H), 6.96 (br d, J=8.7 Hz, 1H); MALDI TOF-MS; Calcd. 435.259 fo
r C20H46N4O5Na, Found. 435.955 for [M+Na]+
(2) Ac-Val-Leu- NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO
HPLC retention time, 18.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1% TFA containi
ng CH 3 CN: 0.1% aq.TFA; CH 3 CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1 H NMR (CD 3 CN) d; 0
.86-0.99 (m, 12H), 1.51-1.64 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.31-2.37 (m, 2H), 3.98 (br
t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.27-4.33 (m, 1H), 4.55-4.63 (m, 1H), 4.78-4.86 (m, 1H), 6.82
(br d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.96 (br d, J = 8.7 Hz, 1H); MALDI TOF-MS; Calcd. 435.259 fo
r C 20 H 46 N 4 O 5 Na, Found. 435.955 for [M + Na] +
(3)Ac-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
HPLC retention time, 12.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containi
ng CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1H NMR (D2O) d; 0.8
6-0.94 (m, 12H), 1.33 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.57-1.67 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.00-2
.22 (m, 3H), 2.45-2.49 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 4.08 (d, J=8.1 Hz, 1
H), 4.28 (q, J=7.2 Hz, 1H), 4.38-4.42 (m, 2H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd.
506.296 for C23H41N5O6Na, Found. 506.216 for [M+Na]+
(3) Ac-Ala-Val-Leu- NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO
HPLC retention time, 12.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1% TFA containi
ng CH 3 CN: 0.1% aq.TFA; CH 3 CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1 H NMR (D 2 O) d; 0.8
6-0.94 (m, 12H), 1.33 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.57-1.67 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.00-2
.22 (m, 3H), 2.45-2.49 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 4.08 (d, J = 8.1 Hz, 1
H), 4.28 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.38-4.42 (m, 2H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd.
506.296 for C 23 H 41 N 5 O 6 Na, Found. 506.216 for [M + Na] +
(4)Ac-Ser-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
HPLC retention time, 14.38 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containi
ng CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1H NMR (CD3CN conta
ining D2O) d; 0.85-0.92 (m, 12H), 1.36 (d, J=7.5 Hz, 3H), 1.56-1.66 (m, 3H), 1.9
8 (s, 3H), 2.07-2.10 (m, 1H), 2.30-2.35 (m, 2H), 2.86 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.6
4-3.69 (m, 1H), 3.77-3.83 (m, 1H), 4.00-4.02 (m, 1H), 4.19-4.30 (m, 23H), 9.44 (
br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 593.328 for C26H46N6O8Na, Found. 593.258 for [M+Na]+
(4) Ac-Ser-Ala-Val-Leu- NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO
HPLC retention time, 14.38 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1% TFA containi
ng CH 3 CN: 0.1% aq.TFA; CH 3 CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1 H NMR (CD 3 CN conta
ining D 2 O) d; 0.85-0.92 (m, 12H), 1.36 (d, J = 7.5 Hz, 3H), 1.56-1.66 (m, 3H), 1.9
8 (s, 3H), 2.07-2.10 (m, 1H), 2.30-2.35 (m, 2H), 2.86 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.6
4-3.69 (m, 1H), 3.77-3.83 (m, 1H), 4.00-4.02 (m, 1H), 4.19-4.30 (m, 23H), 9.44 (
br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 593.328 for C 26 H 46 N 6 O 8 Na, Found. 593.258 for [M + Na] +
１．７．阻害活性
基質として前記合成ウンデカペプチドSO1を用い、阻害活性について検討した。上記の
ように、分析HPLCにより、様々な濃度の阻害物質の存在下における精製3CLプロテアーゼ
変異体による基質の切断を監視した。阻害活性を、S字形用量-応答曲線から得られるIC50
値を用いて評価した。反応を3回繰り返し、結果を平均化した。
1.7. Inhibitory activity The synthetic undecapeptide SO1 was used as a substrate, and the inhibitory activity was examined. As described above, analytical HPLC monitored substrate cleavage by purified 3CL protease mutants in the presence of various concentrations of inhibitors. Inhibitory activity was determined by IC 50 from the sigmoidal dose-response curve.
The value was used for evaluation. The reaction was repeated 3 times and the results averaged.
２．結果
２．１．成熟3CLプロテアーゼの発現
本発明者は、大腸菌内で、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側にMBP-His-Flagタグを結合
した融合タンパク質を発現させた後、まず、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側のMBP-His-F
lagタグを切断することによって、タグを結合していない3CLプロテアーゼ（成熟3CLプロ
テアーゼ）を得ようとした。
2. Result 2.1. Expression of mature 3CL protease The present inventors expressed a fusion protein in which an MBP-His-Flag tag was bound to the N-terminal side of SARS 3CL protease in E. coli, -His-F
By cleaving the lag tag, an attempt was made to obtain 3CL protease (mature 3CL protease) not bound to the tag.
IPTG誘導による全細胞抽出物中の主な産物として、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側にM
BP-His-Flagタグを結合した融合タンパク質に対応する約75kDaの産物が生成された(図2A
、レーン1)。粗抽出物の金属アフィニティー樹脂への吸着後、目的の75kDa産物がイミダ
ゾールで容易に溶出され、過剰量のイミダゾールを限外濾過によって除去した(図2A、レ
ーン2)。75kDaの産物は3CLプロテアーゼのP1/P2切断部位を有するウンデカペプチド基質S
01を切断しなかった。これは、N末端側の分子の大きいMBP-His-Fragタグの影響だと考え
られる。融合タンパク質の通常のエンテロキナーゼ処理により、Coomassie染色後にSDS-P
AGE上でN末端側のMBP-His-Flagタグに対応する42kDaの産物が得られたが、MBP-His-Flag
タグが切り離された3CLプロテアーゼ（成熟3CLプロテアーゼ）に対応する33kDaの産物は
ほとんど検出されなかった(図2A、レーン3)。このエンテロキナーゼで処理した調製物で
は、SO1基質に対するタンパク質分解活性は全く検出されなかった。しかし、エンテロキ
ナーゼの添加に先立ちSO1を75kDaの産物と混合すると、SO1が効率的に切断された(図3A)
。この反応混合物では、想定されたSO1の断片ペプチドが明確に検出され、MALDI-TOF MS
分析によって同定された(図3A;ピーク1、H-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-NH2の場合で[M+H]+ 593
.365(計算値593.353); ピーク2、H-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-OHの場合で[M+H]+ 618.288
(計算値618.347))。この結果は、75kDaの融合タンパク質がエンテロキナーゼで消化され
て成熟3CLプロテアーゼが一時的に生成し、それがS01基質を切断したことを示唆している
。
As the main product in the whole cell extract induced by IPTG, M on the N-terminal side of SARS 3CL protease
An approximately 75 kDa product corresponding to the fusion protein bound with the BP-His-Flag tag was generated (Figure 2A).
Lane 1). After adsorption of the crude extract to the metal affinity resin, the desired 75 kDa product was readily eluted with imidazole and excess imidazole was removed by ultrafiltration (FIG. 2A, lane 2). The 75kDa product is an undecapeptide substrate S with the P1 / P2 cleavage site of 3CL protease
Did not cut 01. This is thought to be due to the large MBP-His-Frag tag of the N-terminal molecule. SDS-P after Coomassie staining by normal enterokinase treatment of the fusion protein
A 42kDa product corresponding to the MBP-His-Flag tag on the N-terminal side was obtained on AGE, but MBP-His-Flag was obtained.
Almost no 33 kDa product corresponding to the 3CL protease from which the tag was cleaved (mature 3CL protease) was detected (FIG. 2A, lane 3). In this enterokinase-treated preparation, no proteolytic activity against the SO1 substrate was detected. However, when SO1 was mixed with a 75 kDa product prior to addition of enterokinase, SO1 was efficiently cleaved (FIG. 3A).
. In this reaction mixture, the expected fragment peptide of SO1 was clearly detected and MALDI-TOF MS
Identified by analysis (Figure 3A; Peak 1, H-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-NH 2 in the case of [M + H] + 593
.365 (calculated 593.353); peak 2, in the case of H-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-OH [M + H] + 618.288
(Calculated value 618.347)). This result suggests that the 75 kDa fusion protein was digested with enterokinase to temporarily produce mature 3CL protease, which cleaved the S01 substrate.
本発明者は、C末端側にHisタグを有する3CLプロテアーゼも発現させたが、N末端側にMB
P-His-Flagタグを有するプロテアーゼと異なり、IPTG誘導による全細胞抽出物の主な産物
として目的の34kDaのタンパク質が検出されなかった(図4A、レーン1)。しかし、金属アフ
ィニティー樹脂を用いて目的のタンパク質を部分精製することができ(図4A、レーン2)、
抗-His-タグ抗体を使用したウエスタンブロット分析によって所望の34kDaの産物が確認さ
れた(図4B、レーン1)。本発明者は、イミダゾールを除去して室温に放置すると、34kDaの
タンパク質の免疫染色強度が低下し、新たに14kDaのタンパク質が現れることを見いだし
た(図4B、レーン2)。さらに、プロテアーゼをエンテロキナーゼとともに室温で一晩イン
キュベートすると、この3CLプロテアーゼの分解産物と考えられるものが検出された(図4B
、レーン3)。これらの結果を組み合わせると、天然型成熟3CLプロテアーゼがタンパク質
分解を受けやすいことが強く示唆される。
The present inventor also expressed 3CL protease having a His tag on the C-terminal side, but MB on the N-terminal side.
Unlike the protease having the P-His-Flag tag, the target 34 kDa protein was not detected as the main product of the whole cell extract induced by IPTG (FIG. 4A, lane 1). However, the protein of interest can be partially purified using a metal affinity resin (Figure 4A, lane 2),
Western blot analysis using an anti-His-tag antibody confirmed the desired 34 kDa product (FIG. 4B, lane 1). The present inventor found that when imidazole was removed and allowed to stand at room temperature, the immunostaining intensity of the 34 kDa protein decreased and a new 14 kDa protein appeared (FIG. 4B, lane 2). Furthermore, when the protease was incubated with enterokinase at room temperature overnight, what was thought to be a degradation product of this 3CL protease was detected (Figure 4B).
Lane 3). Combining these results strongly suggests that native mature 3CL protease is susceptible to proteolysis.
２．２．3CLプロテアーゼの切断部位の同定
3CLプロテアーゼの切断部位を同定するため、成熟3CLプロテアーゼとN末端側のMBP-His
-Flagタグとからなる75kDaの融合タンパク質のエンテロキナーゼ消化(図2B)について注意
深く検討した。金属アフィニティー樹脂処理後の試料では、融合タンパク質に対応する75
kDaの産物が検出された(図2B、レーン１)。次に、前記画分を少量のエンテロキナーゼで1
5分間処理すると、目的の33kDaの産物がCoomassie染色でかすかに検出されるとともに、3
3kDaの産物の分解産物と考えられる産物として、20kDaおよび13kDaで2つのバンドも検出
された(図2B、レーン2)。処理時間が30分、60分と経過すると33kDaのバンドは徐々に消失
した(図2B、レーン3（30分）、レーン4（60分）)。この新たに現れた13kDaのタンパク質
は、免疫染色によって検出されるC末端側にHis-タグを付加した3CLプロテアーゼのタンパ
ク質分解産物と同一であるように思われた(図4B、レーン2〜4)。13kDaのタンパク質をPVD
Fメンブランにブロッテングし、アミノ酸シークエンサーで解析したところ、産物のN末端
側配列がGln-Thr-Ala-Gln-Alaであると判定された。この結果は、成熟3CLプロテアーゼが
188Arg/189Gln部位で切断されることを示している。さらに、188Arg/189Gln部位を有する
ヘキサデカペプチドであるSR1基質を用いて、成熟3CLプロテアーゼが生成されるときにタ
ンパク質分解活性が発現されるか検討した(図3B)。予想どおり、75kDaの融合タンパク質
が通常のエンテロキナーゼ処理の間にヘキサデカペプチドを切断する一方(図3B; ピーク1
、H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-OHの場合で[M+H]+ 690,282(計算値690.358))、同一条件下
でエンテロキナーゼ単独によってSR1ペプチドを切断することができなかった。
2.2. Identification of cleavage site of 3CL protease
To identify the cleavage site of 3CL protease, mature 3CL protease and N-terminal MBP-His
The enterokinase digestion of the 75 kDa fusion protein consisting of the -Flag tag (FIG. 2B) was carefully examined. In the sample after the metal affinity resin treatment, 75 corresponding to the fusion protein.
A kDa product was detected (Figure 2B, lane 1). The fraction is then diluted with a small amount of enterokinase.
When treated for 5 minutes, the desired 33 kDa product is faintly detected by Coomassie staining.
Two bands at 20 kDa and 13 kDa were also detected as products that were considered to be degradation products of the 3 kDa product (FIG. 2B, lane 2). When the treatment time was 30 minutes and 60 minutes, the 33 kDa band gradually disappeared (FIG. 2B, lane 3 (30 minutes), lane 4 (60 minutes)). This newly appearing 13 kDa protein appeared to be identical to the proteolytic product of the 3CL protease with His-tag attached to the C-terminus detected by immunostaining (Figure 4B, lanes 2-4). . 13 kDa protein PVD
When blotted to F membrane and analyzed with an amino acid sequencer, the N-terminal sequence of the product was determined to be Gln-Thr-Ala-Gln-Ala. This result shows that mature 3CL protease
It shows that it is cleaved at the 188Arg / 189Gln site. Furthermore, using SR1 substrate, which is a hexadecapeptide having a 188Arg / 189Gln site, whether proteolytic activity was expressed when mature 3CL protease was produced was examined (FIG. 3B). As expected, the 75 kDa fusion protein cleaves the hexadecapeptide during normal enterokinase treatment (Figure 3B; peak 1
In the case of H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-OH [M + H] + 690,282 (calculated value 690.358)), SR1 peptide cannot be cleaved by enterokinase alone under the same conditions It was.
２．３．3CL-R188I-プロテアーゼ変異体（組換えタンパク質）の発現および精製
ついで本発明者は、タンパク質分解に抵抗性を示す活性を持つ安定な3CLプロテアーゼ
を得るため、Arg-188が部位特異的変異誘発によりIleと置換された3CLプロテアーゼ変異
体(3CL-R188I)を構築した。
2.3. Expression and purification of 3CL-R188I-protease mutant (recombinant protein) Next, in order to obtain a stable 3CL protease having an activity that is resistant to proteolysis, the present inventor has made Arg-188 site-specific. A 3CL protease mutant (3CL-R188I) was constructed in which Ile was replaced by mechanical mutagenesis.
天然型3CLプロテアーゼと同様、細菌細胞内でN末端側にMBP-His-FlagタグまたはC末端
側にHisタグを有する3CL-R188Iプロテアーゼを発現させた。N末端側にタグを有する3CL-R
188Iプロテアーゼの75kDaの産物を金属アフィニティー樹脂によって部分精製した（図5A
、レーン2）。尚、図5A、レーン１はこの金属アフィニティー樹脂精製前の粗抽出液をSDS
-PAGEで分離したものである。通常のエンテロキナーゼ処理後、3CL-R188Iプロテアーゼに
対応する目的の33kDaの産物（組換えタンパク質）およびMBP-His-Flagに対応する42kDaの
断片はSDS-PAGE上でCoomassie色素に強く染色されたが、タンパク質分解産物は全く検出
されなかった(図5A、レーン3)。本発明者は、この段階で、アフィニティーアガロースに
よりエンテロキナーゼを除去した後に、組換えタンパク質のSO1基質に対するタンパク質
分解活性を確認した。pH5.5でのアニオン交換クロマトグラフィーにより、3CL-R188Iプロ
テアーゼをさらに精製した。つまり、予想どおり計算値pI6.24の3CL-R188Iプロテアーゼ
が樹脂を通過し、計算値pI5.08のMBP-His-Flagが樹脂上に吸着された(図5A、レーン4（通
過画分）、レーン5（樹脂の保持画分）)。細菌培養物100mlから約0.10mgの精製したタグ
が付加していない組み換えタンパク質が得られた。
Similar to the natural 3CL protease, 3CL-R188I protease having MBP-His-Flag tag on the N-terminal side or His tag on the C-terminal side was expressed in bacterial cells. 3CL-R with a tag on the N-terminal side
The 75 kDa product of 188I protease was partially purified by metal affinity resin (FIG. 5A).
Lane 2). Fig. 5A, Lane 1 shows the crude extract before purification of the metal affinity resin.
-Separated by PAGE. After normal enterokinase treatment, the desired 33 kDa product (recombinant protein) corresponding to 3CL-R188I protease and the 42 kDa fragment corresponding to MBP-His-Flag were strongly stained with Coomassie dye on SDS-PAGE. No proteolytic products were detected (Figure 5A, lane 3). At this stage, the present inventor confirmed the proteolytic activity of the recombinant protein against the SO1 substrate after removing enterokinase with affinity agarose. The 3CL-R188I protease was further purified by anion exchange chromatography at pH 5.5. That is, as expected, 3CL-R188I protease with calculated value pI6.24 passed through the resin, and MBP-His-Flag with calculated value pI5.08 was adsorbed on the resin (FIG. 5A, lane 4 (passed fraction), Lane 5 (resin retained fraction)). Approximately 0.10 mg of purified tag-free recombinant protein was obtained from 100 ml of bacterial culture.
同様に、C末端側にHisタグを有する3CL-R188Iプロテアーゼに対応する34kDaのタンパク
質がIPTG誘導後の全細胞溶解物の主な産物として生成された(図5B、レーン1)。金属アフ
ィニティー樹脂による単一ステップによる操作で、十分に精製された目的物が得られた(
図5B、レーン2)。この場合、約0.13mgのC末端側にHis-タグが付加した精製タンパク質が1
00mlの培養物から得られた。
Similarly, a 34 kDa protein corresponding to 3CL-R188I protease having a His tag on the C-terminal side was produced as the main product of whole cell lysate after IPTG induction (FIG. 5B, lane 1). A fully purified target was obtained in a single step with a metal affinity resin.
FIG. 5B, lane 2). In this case, about 0.13 mg of purified protein with His-tag added to the C-terminal side is 1
Obtained from 00 ml culture.
限外濾過により緩衝液を交換するとともに、タグのない精製タンパク質及びC末端側にH
isタグを有する精製タンパク質を濃縮し、等容量のグリセロールを添加した。各溶液を-2
0℃で保存したところ、少なくとも数か月間、触媒活性の低下は全くなかった。
While exchanging the buffer by ultrafiltration, purified protein without tag and H on the C-terminal side
The purified protein with the is tag was concentrated and an equal volume of glycerol was added. -2 for each solution
When stored at 0 ° C., there was no decrease in catalytic activity for at least several months.
N末端側にタグが付加した成熟3CLプロテアーゼをエンテロキナーゼ消化する間にSR1オ
リゴペプチドが効率的に切断されたことから、本発明者は3CLプロテアーゼ変異体がエン
テロキナーゼの非存在下で成熟3CLプロテアーゼを切断しうる否かを検討した。精製した3
CL-R188IプロテアーゼとC末端側にHis-タグが付加した成熟3CLプロテアーゼとの室温での
インキュベーションによって3CLプロテアーゼ由来の分解産物が確かに得られた（図4B、
レーン4）。なお、精製3CL-R188I試料にはエンテロキナーゼの基質でコンタミネーション
の指標に用いられるCleavege Conttol Protein（ノバゲン）を切断する活性は認められな
かった。これらの結果は、成熟プロテアーゼは自己タンパク質分解を受けるという可能性
を示唆している。
Since the SR1 oligopeptide was efficiently cleaved during enterokinase digestion of the mature 3CL protease with a tag attached to the N-terminal side, the present inventor Whether or not can be cut was examined. Purified 3
Incubation at room temperature with CL-R188I protease and mature 3CL protease with His-tag added on the C-terminal side certainly yielded a degradation product derived from 3CL protease (Fig. 4B,
Lane 4). In the purified 3CL-R188I sample, the activity of cleaving Cleavege Conttol Protein (Novagen) used as an indicator of contamination with the enterokinase substrate was not observed. These results suggest the possibility that mature proteases undergo autoproteolysis.
２．４．3CL-R188Iプロテアーゼの速度論的特性
3つの異なる基質(SO1、SO3、SR1)を用い、タグのない精製3CL-R188Iプロテアーゼ及びC
末端側にHisタグを有する精製3CL-R188Iプロテアーゼの触媒活性について検討した。その
速度論的データを表1にまとめる。タグが付加していない3CL-R188Iプロテアーゼは、SO1
の消化を最も効率的に触媒した(Km=33.8μM、kcat=4753 s-1)。SO1基質におけるkcat/Km
と比較した場合、SO3およびSR1基質における相対効率はそれぞれ0.06および0.01であった
。C末端側にHis-タグを有する3CL-R188Iのkcat/Km値は、kcat値が顕著な低下を示すこと
からタグが付加していない酵素の0.03倍である。一方、Km値における有意差は2種類のタ
ンパク質間で全く認められなかった。この結果は、残基数個をC末端に付加すると3CLプロ
テアーゼの触媒効率が影響を受けることを示している。
2.4.3 Kinetic properties of 3CL-R188I protease
Using 3 different substrates (SO1, SO3, SR1), untagged purified 3CL-R188I protease and C
The catalytic activity of purified 3CL-R188I protease having a His tag on the terminal side was examined. The kinetic data is summarized in Table 1. The untagged 3CL-R188I protease is SO1
Was most efficiently catalyzed (K m = 33.8 μM, k cat = 4753 s −1 ). K cat / K m on SO1 substrate
When compared to, the relative efficiencies for the SO3 and SR1 substrates were 0.06 and 0.01, respectively. The k cat / K m value of 3CL-R188I having a His-tag on the C-terminal side is 0.03 times that of the enzyme without the tag, since the k cat value shows a marked decrease. On the other hand, significant differences in K m values were not observed between the two proteins. This result shows that the catalytic efficiency of 3CL protease is affected when several residues are added to the C-terminus.
２．５．阻害活性
タグのない精製3CL-R188Iプロテアーゼを用い、E-64および新規に合成した基質をベー
スとするアルデヒド型阻害物質の阻害効果を解析した。1.6mM E-64の存在下であっても、
3CL-R188IプロテアーゼによるSO1基質の分解は全く低下しなかった。それに対し、1.6mM
のAc-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO（合成ペプチドアルデヒド1とも言う）は3
CL-R188Iの活性をほぼ完全に阻害した。用量-応答曲線(図6)から、合成ペプチドアルデヒ
ド1のIC50値が155μMであることが分かった。また、Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH
2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-Leu-
NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO（それぞれ、合成ペプチドアルデヒド2〜4とも言う）も3CL-R
188Iの活性を阻害する作用があることが分かった。図7の用量-応答曲線から、合成ペプチ
ドアルデヒド2のIC50値が26μMであることが分かった。また、図8の用量-応答曲線から、
合成ペプチドアルデヒド3のIC50値が〜6mMであることが分かった。さらに、図9の用量-応
答曲線から、合成ペプチドアルデヒド4のIC50値が37μMであることが分かった。これらの
結果を、下記表2にまとめる。
2.5. Inhibitory activity The purified 3CL-R188I protease with no tag was used to analyze the inhibitory effect of aldehyde-type inhibitors based on E-64 and newly synthesized substrates. Even in the presence of 1.6mM E-64,
The degradation of SO1 substrate by 3CL-R188I protease was not reduced at all. In contrast, 1.6mM
Ac-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO (also called synthetic peptide aldehyde 1) is 3
CL-R188I activity was almost completely inhibited. From the dose-response curve (FIG. 6), it was found that the IC 50 value of synthetic peptide aldehyde 1 was 155 μM. Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH
2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, Ac-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and Ac-Ser-Ala-Val-Leu-
NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO (also referred to as synthetic peptide aldehydes 2 to 4, respectively) is also 3CL-R
It was found to have an effect of inhibiting the activity of 188I. From the dose-response curve of FIG. 7, it was found that the IC 50 value of synthetic peptide aldehyde 2 was 26 μM. From the dose-response curve in FIG.
The IC 50 value of synthetic peptide aldehyde 3 was found to be ˜6 mM. Furthermore, from the dose-response curve of FIG. 9, it was found that the IC 50 value of synthetic peptide aldehyde 4 was 37 μM. These results are summarized in Table 2 below.
尚、図６〜９中、横軸は、阻害物質（合成ペプチドアルデヒド）の濃度であり、縦軸は
阻害（％）である。縦軸の阻害（％）は、各濃度の阻害剤が存在する条件下でプロテアー
ゼにより基質が切断される量をHPLCで定量し、阻害剤が存在していない条件下でプロテア
ーゼが基質を切断する量を100とする切断率を出し、これを100から引いて阻害率としたも
のである。
6 to 9, the horizontal axis represents the concentration of the inhibitor (synthetic peptide aldehyde), and the vertical axis represents the inhibition (%). The inhibition (%) on the vertical axis indicates the amount of the substrate cleaved by the protease under the presence of each concentration of the inhibitor by HPLC, and the protease cleaves the substrate under the absence of the inhibitor. A cutting rate with an amount of 100 is obtained, and this is subtracted from 100 to obtain an inhibition rate.
３．考察
これまで成熟SARS CoV 3CLプロテアーゼタンパク質は大腸菌で発現することができ、そ
の結晶構造も解析されていたが、今回、成熟3CLプロテアーゼがタンパク質分解による分
解を受けやすいことが見いだされた。
エンテロキナーゼは本来の切断部位（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）のLys以外の塩基性残基で
タンパク質を切断することが報告されているが、エンテロキナーゼが3CLプロテアーゼを
分解することが明らかとなった(Collins-Racie, L.A. et al. (1995) Production of rec
ombinant bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli using the nov
el secretory fusion partner DsbA. Biotechnology 13, 982-987.)。
3. Discussion Until now, mature SARS CoV 3CL protease protein can be expressed in E. coli and its crystal structure has been analyzed, but now it has been found that mature 3CL protease is prone to proteolytic degradation.
Enterokinase has been reported to cleave proteins at basic residues other than Lys at the original cleavage site (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), but it is clear that enterokinase degrades 3CL protease (Collins-Racie, LA et al. (1995) Production of rec
ombinant bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli using the nov
el secretory fusion partner DsbA. Biotechnology 13, 982-987.).
しかし、本発明者は以下の結果から3CLプロテアーゼは自己分解すると考えた：(a) N末
側にMBP-His-Flagタグを有する触媒活性を示さない3CLプロテアーゼを大腸菌で発現させ
ると3CLプロテアーゼが抽出液中に多量に得られたが、C末側にHisタグを有する活性を持
つ3CLプロテアーゼを発現させると3CLプロテアーゼが抽出液中にわずかしか存在しなかっ
た；(b) N末側にタグを有する精製野生型3CLプロテアーゼをエンテロキナーゼ処理すると
SO1およびSR1オリゴペプチドを切断する活性が認められたが、エンテロキナーゼ単独では
同一条件下で3種類のオリゴペプチド基質を切断しなかった；(C) C末側にHisタグを有す
る野生型3CLプロテアーゼが精製3CL-R188Iプロテアーゼにより分解された。
However, the present inventor considered that 3CL protease was autolyzed based on the following results: (a) When 3CL protease having MBP-His-Flag tag on the N-terminal side and not showing catalytic activity was expressed in E. coli, 3CL protease was Although a large amount was obtained in the extract, when 3CL protease having an activity having a His tag on the C-terminal side was expressed, there was little 3CL protease in the extract; (b) a tag on the N-terminal side Treating purified wild-type 3CL protease with enterokinase
Although the activity of cleaving SO1 and SR1 oligopeptides was observed, enterokinase alone did not cleave the three oligopeptide substrates under the same conditions; (C) Wild-type 3CL protease with a His tag at the C-terminus Was degraded by purified 3CL-R188I protease.
分解産物断片のアミノ酸配列決定を行うことにより、成熟3CLプロテアーゼが188Arg/18
9Gln部位で切断されることが見いだされた。同部位は、成熟3CLプロテアーゼのキモトリ
プシン様触媒ドメイン(1-184)とC末端α-ヘリックスドメイン(201-303)とをつなぐ長いル
ープ領域(残基185-200)内に存在する(図1)。成熟3CLプロテアーゼのホモ二量体構造では
、α-ヘリックスドメインは一方の単量体のアミノ末端を他方の単量体の活性部位と相互
作用しうる位置に方向づける役割を担うと想定されている(Yang, H. et al. (2003) The
crystal structures of severe acute respiratory syndrome virus main protease and
its complex with an inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13190-13195.)
。また、N末端側の触媒領域のみの発現では、発現したタンパク質の触媒効率が低下する
ことも報告されている(Bacha, U. et al. (2004) Identification of Novel Inhibitors
of the SARS Coronavirus Main Protease 3CLpro. Biochemistry 43, 4906-4912.)。これ
らの知見は、188Arg/189Gln部位でのタンパク質分解によって成熟3CLプロテアーゼの触媒
効率が速やかに低下するという本発明者の知見と一致する。成熟プロテアーゼにおける発
現の間での自己タンパク質分解による分解がHIV-1およびHTLV-1プロテアーゼなどのアス
パラギン酸プロテアーゼにおいて報告されており(Rose, J. R. et al. (1993) Regulatio
n of autoproteolysis of the HIV-1 and HIV-2 proteases with engineered amino acid
substitutions. J. Biol. Chem. 268, 11939-11945.；Laco, G. S. et al. (1997) Mole
cular analysis of the feline immunodeficiency virus protease: generation of a no
vel form of the protease by autoproteolysis and construction of cleavage-resitan
t proteases. J. Viol. 71, 5505-5511.；Louis, J. M. et al. (1999) Stabilization f
rom Autoproteolysis and Kinetic Characterization of the Human T-cell Leukemia Vi
rus Type 1 Proteinase. J. Biol. Chem. 274, 6660-6666.)、これらはプロテアーゼの速
やかな分解がウイルスプロテアーゼにおいてあり得ることを示唆している。
By determining the amino acid sequence of the degradation product fragment, the mature 3CL protease was converted to 188Arg / 18
It was found to be cleaved at the 9Gln site. This site is present in the long loop region (residues 185-200) that connects the chymotrypsin-like catalytic domain (1-184) of mature 3CL protease and the C-terminal α-helix domain (201-303) (Figure 1). . In the homodimeric structure of the mature 3CL protease, the α-helical domain is assumed to play a role in directing the amino terminus of one monomer to a position where it can interact with the active site of the other monomer ( Yang, H. et al. (2003) The
crystal structures of severe acute respiratory syndrome virus main protease and
(its complex with an inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 13190-13195.)
. It has also been reported that the expression of only the N-terminal catalytic domain reduces the catalytic efficiency of the expressed protein (Bacha, U. et al. (2004) Identification of Novel Inhibitors.
of the SARS Coronavirus Main Protease 3CL pro . Biochemistry 43, 4906-4912.). These findings are consistent with the inventors' knowledge that the catalytic efficiency of mature 3CL protease is rapidly reduced by proteolysis at the 188Arg / 189Gln site. Autoproteolytic degradation during expression in mature proteases has been reported for aspartic proteases such as HIV-1 and HTLV-1 protease (Rose, JR et al. (1993) Regulatio
n of autoproteolysis of the HIV-1 and HIV-2 proteases with engineered amino acid
substitutions. J. Biol. Chem. 268, 11939-11945 .; Laco, GS et al. (1997) Mole
cular analysis of the feline immunodeficiency virus protease: generation of a no
vel form of the protease by autoproteolysis and construction of cleavage-resitan
t proteases. J. Viol. 71, 5505-5511 .; Louis, JM et al. (1999) Stabilization f
rom Autoproteolysis and Kinetic Characterization of the Human T-cell Leukemia Vi
rus Type 1 Proteinase. J. Biol. Chem. 274, 6660-6666.), these suggest that rapid degradation of the protease may be in the viral protease.
3CLプロテアーゼのタンパク質分解を抑制するため、本発明者は成熟3CLプロテアーゼの
第188番目の位置でArg残基を置換した。適切な置換残基としてIleを選択してイオン性グ
アニジン基を除去した。この変異により、本発明者は、タグのない精製3CL-R188Iプロテ
アーゼとC末端側にHisタグを有する精製3CL-R188Iプロテアーゼを容易に得ることができ
た。
In order to suppress proteolysis of 3CL protease, the inventor substituted an Arg residue at position 188 of mature 3CL protease. Ile was chosen as the appropriate replacement residue to remove the ionic guanidine group. By this mutation, the present inventors could easily obtain purified 3CL-R188I protease having no tag and purified 3CL-R188I protease having a His tag on the C-terminal side.
ついで、3つの異なる基質であるSO1、SO3およびSR1基質を用い、R188I 3CLプロテアー
ゼ変異体の触媒活性について検討した。P1/P2切断部位を有するSO1基質は、3CLプロテア
ーゼのN末端側の自己切断部位であり、3CLプロテアーゼにとって最適な基質であることが
報告されている(Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purification, and Substrate S
pecificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 3C-like Proteinase.
J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.)。SO3基質は3CLプロテアーゼのP3/P4切断部位を有する
ウンデカペプチドである。SR1基質は今回新規に見いだされたタンパク質分解部位(188Arg
/189Gln)を有するヘキサデカペプチドである。タグのない成熟3CL-R188Iプロテアーゼの
触媒能がC末端側にHisタグを有する成熟3CLプロテアーゼと比べて極めて高く、それが特
にkcat値で顕著であり、成熟3CLプロテアーゼでは12.2/分、3CL-R188Iでは4753/秒である
ことが見いだされた。HisタグをC末端側に付加した3CL-R188Iプロテアーゼ変異体では、
触媒活性が3CL-R188Iプロテアーゼの3%にまで低下した。これらの結果は、成熟3CLプロテ
アーゼのNおよびC末端側での付加的配列により、数個の残基付加によっても触媒活性が顕
著な影響を受けることを示唆している(Hsu, M. -F. et al. (2005) Mechanism of the Ma
turation Process of SARS-CoV 3CL Protease. J. Biol. Chem. 280, 31257-31266.)。
Subsequently, the catalytic activity of the R188I 3CL protease mutant was examined using three different substrates, SO1, SO3 and SR1. An SO1 substrate with a P1 / P2 cleavage site is an N-terminal self-cleavage site for 3CL protease and has been reported to be an optimal substrate for 3CL protease (Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis , Purification, and Substrate S
pecificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 3C-like Proteinase.
J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.). The SO3 substrate is an undecapeptide having a P3 / P4 cleavage site for 3CL protease. The SR1 substrate is a newly discovered proteolytic site (188 Arg).
/ 189Gln). The catalytic ability of mature untagged 3CL-R188I protease is very high compared to mature 3CL protease with His-tag on the C-terminal side, which is particularly noticeable in k cat value, 12.2 / min for mature 3CL protease, 3CL- R188I was found to be 4753 / sec. In the 3CL-R188I protease mutant with His tag added to the C-terminal side,
The catalytic activity was reduced to 3% of 3CL-R188I protease. These results suggest that additional activity on the N- and C-terminal sides of the mature 3CL protease can significantly affect catalytic activity even with the addition of several residues (Hsu, M.-F et al. (2005) Mechanism of the Ma
turation Process of SARS-CoV 3CL Protease. J. Biol. Chem. 280, 31257-31266.).
タグが付加していない3CL-R188IプロテアーゼのSO3基質とSO1基質に対する相対効率（S
O3/SO1比）がC末端側にHisタグを有する成熟3CLプロテアーゼに対して報告されたものと
正確に同一であったことは注目される(Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purificat
ion, and Substrate Specificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus
3C-like Proteinase. J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.)。一方、SR1基質に対する触媒の
相対効率は、成熟3CLプロテアーゼの11の切断部位のひとつであるP5/P6部位での切断に対
して報告されたものとほぼ同一であった(Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purific
ation, and Substrate Specificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronaviru
s 3C-like Proteinase. J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.)。これらのデータは、成熟3CL
プロテアーゼがArg188/Gln189部位でSARS CoVのポリタンパク質前駆体を本来の切断部位
の場合とほぼ等しい効率で消化しうることを示唆している。したがって、成熟3CLプロテ
アーゼと大きさが等しいプロテアーゼ変異体を応用することがSARS CoV 3CLプロテアーゼ
に対して有効な阻害物質をスクリーニングするのに有効であると考えられる。
Relative efficiency of untagged 3CL-R188I protease against SO3 and SO1 substrates (S
It is noted that the O3 / SO1 ratio) was exactly the same as reported for mature 3CL protease with His-tag on the C-terminal side (Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purificat
ion, and Substrate Specificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus
3C-like Proteinase. J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.). On the other hand, the relative efficiency of the catalyst for the SR1 substrate was almost identical to that reported for cleavage at the P5 / P6 site, one of the 11 cleavage sites of the mature 3CL protease (Fan, K. et al (2004) Biosynthesis, Purific
ation, and Substrate Specificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronaviru
s 3C-like Proteinase. J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.). These data are mature 3CL
This suggests that the protease can digest the SARS CoV polyprotein precursor at the Arg188 / Gln189 site with almost the same efficiency as the original cleavage site. Therefore, it is considered that application of protease mutants having the same size as mature 3CL protease is effective for screening effective inhibitors against SARS CoV 3CL protease.
タグが付加していない3CL-R188Iプロテアーゼを用いたに関するスクリーニングにおい
て、基質をベースとするアルデヒド型阻害物質(Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-
CHO)はSO1基質の消化を中程度に阻害した。これまで報告された様々な阻害物質と比較す
ると活性は高くなかったが(IC50=155μM)、3CLプロテアーゼについて先に報告された基質
をベースとする阻害物質の構造-活性の関係性に関する研究(Ghosh, A. K. et al. (2005)
Design and Synthesis of Peptidomimetic Severe Acute Respiratory Syndrome Chymot
rypsin-like Protease Inhibitors. J. Med. Chem. 48, 6767-6771.; Shie, J. -J. et a
l. (2005) Discovery of Potent Anilide Inhibitors against the Severe Acute Respir
atory Syndrome 3CL Protease.J. Med. Chem. 48, 4469-4473.; Chen, L. -R. et al. (2
005) Synthesis and evaluation of isatin derivatives as effective SARS coronaviru
s 3CL protease inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15, 3058-3062.; Shie, J. -J.
et al. (2005) Inhibition of the severe acute respiratory syndrome 3CL protease
by peptidomimetic α, β-unsaturated esters. Bioorg. Med. Chem. 13, 5240-5252.;
Jain, R. P. et al. (2004) Synthesis and Evaluation of Keto-Glutamine Analogues a
s Potent Inhibitors of Severe Acute Respiratory Syndrome 3CLpro. J. Med. Chem. 4
7, 6113-6116.)を参照することにより、阻害能を増強することができると予想される。
In screening for untagged 3CL-R188I protease, a substrate-based aldehyde inhibitor (Ac-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 )-
CHO) moderately inhibited the digestion of the SO1 substrate. Although the activity was not high compared to the various inhibitors reported so far (IC 50 = 155 μM), the structure-activity relationship of the substrate-based inhibitors previously reported for 3CL protease ( Ghosh, AK et al. (2005)
Design and Synthesis of Peptidomimetic Severe Acute Respiratory Syndrome Chymot
rypsin-like Protease Inhibitors. J. Med. Chem. 48, 6767-6771 .; Shie, J. -J. et a
l. (2005) Discovery of Potent Anilide Inhibitors against the Severe Acute Respir
atory Syndrome 3CL Protease.J. Med. Chem. 48, 4469-4473 .; Chen, L.-R. et al. (2
005) Synthesis and evaluation of isatin derivatives as effective SARS coronaviru
s 3CL protease inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15, 3058-3062 .; Shie, J. -J.
et al. (2005) Inhibition of the severe acute respiratory syndrome 3CL protease
by peptidomimetic α, β-unsaturated esters. Bioorg. Med. Chem. 13, 5240-5252 .;
Jain, RP et al. (2004) Synthesis and Evaluation of Keto-Glutamine Analogues a
s Potent Inhibitors of Severe Acute Respiratory Syndrome 3CL pro .J. Med. Chem. 4
7, 6113-6116.), It is expected that the inhibitory ability can be enhanced.
また、本実施例において、Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-V
al-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)
-CHOも3CL-R188IプロテアーゼによるSO1基質の消化を阻害することが分かった。これらの
阻害物質(Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH
2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOおよびAc-Ser-Ala-Val-Le
u-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO)は、SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を阻害するので、SA
RSの治療のために使用し得る。
In this example, Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, Ac-V
al-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, and Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 )
-CHO was also found to inhibit the digestion of SO1 substrate by 3CL-R188I protease. These inhibitors (Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, Ac-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH
2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO, Ac-Ala-Val-Leu-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO and Ac-Ser-Ala-Val-Le
u-NHCH (CH 2 CH 2 CON (CH 3 ) 2 ) -CHO) inhibits the catalytic activity of SARS 3CL protease, so SA
Can be used for the treatment of RS.
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