JP2011020926A - Modified peptide, and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、修飾ペプチド及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a modified peptide and a method for producing the same.
近年、医薬、食品、又は化粧品等の様々な分野において、ペプチドが注目されている。例えば、生理活性、及び抗微生物活性等をはじめとする有用活性を示す種々の機能性ペプチドを有効成分として配合すること等が広く行われている。 In recent years, peptides have attracted attention in various fields such as pharmaceuticals, foods, and cosmetics. For example, various functional peptides exhibiting useful activity including physiological activity and antimicrobial activity are widely used as active ingredients.
しかしながら、生体内又は生体表面等の生体環境において従来のペプチドは加水分解されやすく、このため目的を達成する前に分解してしまう等の問題点があった。 However, the conventional peptide is easily hydrolyzed in a living environment such as in vivo or on the surface of the living body, and there is a problem that it is degraded before achieving the purpose.
そこで、機能性ペプチドに対して化学修飾を施すことにより加水分解耐性を付与しようとする試みが行われてきた。例えば、配列中のペプチド結合をその構造等価体に置き換えて加水分解耐性を付与し、構造および機能の特徴を維持した類縁体を設計・合成する試みが行われている（非特許文献１）。 Thus, attempts have been made to impart hydrolysis resistance by chemically modifying functional peptides. For example, an attempt has been made to design and synthesize analogs that maintain the characteristics of structure and function by replacing the peptide bond in the sequence with its structural equivalent to impart hydrolysis resistance (Non-patent Document 1).
しかしながら、機能性ペプチドを修飾することによってその有用活性が劇的に低下してしまうことが報告されている（非特許文献２）。このため機能性ペプチドに対してその有用活性を維持しつつ加水分解耐性を付与することは困難を極め、この課題は長らく解決されていなかった。 However, it has been reported that the useful activity is dramatically reduced by modifying a functional peptide (Non-patent Document 2). For this reason, it is extremely difficult to impart hydrolysis resistance to functional peptides while maintaining their useful activity, and this problem has not been solved for a long time.
また、ペプチドの製造方法としては、「化学合成法」と組換えＤＮＡ技術による「生物学的生産法」の２種類が主に用いられている。化学合成法では、任意のアミノ酸および修飾基からなるペプチドの製造が可能であるものの、大量の有機溶媒・副生成物の生成を伴うとともに、生産コストが極めて高い。一方、生物学的生産法では、水性の培養液中等で大量生産が可能であるものの、生産生物が利用可能なアミノ酸（一般的には、天然アミノ酸）からなるペプチド配列のみに限定され、特に、ペプチド両末端には修飾基が施されない状態で単離されることが一般的である。これらの生産法の利点を活用する方法として、まず目的ペプチドを含む融合タンパク質もしくは融合ペプチドをいったん取得してから、次に目的ペプチドを切り出すという方法が行われている。例えば、培養微生物において目的ペプチドを含む融合タンパク質もしくは融合ペプチドをいったん発現により取得した後、目的ペプチドを化学的処理により切り出すことが行われている。 In addition, two types of peptide production methods are mainly used: “chemical synthesis” and “biological production” using recombinant DNA technology. The chemical synthesis method can produce a peptide comprising any amino acid and a modifying group, but involves a large amount of organic solvent / by-product and is extremely expensive to produce. On the other hand, in the biological production method, although mass production is possible in an aqueous culture solution or the like, it is limited only to peptide sequences composed of amino acids (generally natural amino acids) that can be used by the production organism, In general, the peptide is isolated without modifying groups at both ends. As a method of utilizing the advantages of these production methods, a method of first obtaining a fusion protein or fusion peptide containing a target peptide and then cutting out the target peptide is performed. For example, after obtaining a fusion protein or fusion peptide containing a target peptide in a cultured microorganism by expression, the target peptide is excised by chemical treatment.
しかしながら、従来の製造方法は目的ペプチドの生産収率が悪い等の問題点があった。 However, the conventional production method has problems such as poor production yield of the target peptide.
本発明は、生体内又は生体表面等の生体環境においても持続的に使用できるペプチドを提供することを課題とする。また、ペプチドの製造方法において高い収率を達成することも課題とする。 An object of the present invention is to provide a peptide that can be used continuously in a living environment such as in vivo or on the surface of a living body. Another object is to achieve a high yield in the peptide production method.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、種々の処理方法を検討する等して多大な試行錯誤を重ねた結果、格段に優れた加水分解耐性を示す修飾されたペプチド（以下、本明細書において修飾されたペプチドのことを単に「修飾ペプチド」ということがある。）を取得することに成功した。機能性ペプチドを修飾して得られる修飾ペプチドはその有用活性を失うであろうことが従来技術から予測された。本発明者らは、この修飾が驚くべきことに予測に反してペプチドの有用活性に大きな影響を与えないことを見出した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors made extensive trial and error by examining various treatment methods and the like, and as a result, modified peptides exhibiting outstanding hydrolysis resistance (hereinafter referred to as the present specification). The peptide modified in the book was sometimes simply referred to as “modified peptide”.) It was predicted from the prior art that modified peptides obtained by modifying functional peptides would lose their useful activity. We have found that this modification surprisingly does not significantly affect the useful activity of the peptide.
さらに本発明者らは、所定の方法によることでこの修飾ペプチドを高収率で製造できるという驚くべき知見を得た。 Furthermore, the present inventors have obtained a surprising finding that this modified peptide can be produced in a high yield by a predetermined method.
この技術的思想を基礎として、本発明者らはさらに多大な時間と労力をかけることにより一層優れた修飾ペプチド及びその製造方法を開発することに成功し、本発明を完成させた。 On the basis of this technical idea, the present inventors have succeeded in developing a more excellent modified peptide and a method for producing the same by spending much more time and effort, and completed the present invention.
すなわち、本発明は次の通りである：
項１．Ｎ末端がチアゾリジン環であり、かつＣ末端がリジンε−ラクタム環であることを特徴とする両端が修飾されたペプチド。
That is, the present invention is as follows:
Item 1. A peptide modified at both ends, wherein the N-terminus is a thiazolidine ring and the C-terminus is a lysine ε-lactam ring.
項２．前記ペプチドが、生理活性又は抗微生物活性を有するものである、項１記載の修飾されたペプチド。 Item 2. Item 2. The modified peptide according to Item 1, wherein the peptide has physiological activity or antimicrobial activity.
項３．前記ペプチドが、抗ウイルス活性を有するものである、項２記載の修飾されたペプチド。
項４．前記ペプチドが、抗ＨＩＶ活性を有するものである、項２記載の修飾されたペプチド。
Item 4.
項５．前記ペプチドが、
（ａ）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
を有するものである、項４記載の修飾されたペプチド。
Item 5. The peptide is
(A) an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3; or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3. Item 5. A modified peptide according to Item 4, which has the modified peptide.
項６．項２〜５のいずれか記載の修飾されたペプチドを含む、医薬組成物。
項７．項２〜５のいずれか記載の修飾されたペプチドを含む、食品。
Item 7.
項８．項１〜５のいずれか記載のペプチドを製造する方法であって、
（１）次の式：
Ｘ１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ２
（式中、Ａは、システイン残基を含まない項１〜５のいずれか記載のペプチドのアミノ酸配列であり、かつ
Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基若しくは任意のアミノ酸配列である）
で表されるペプチド
をＳ−シアノ化する工程；及び
（２）工程（１）により得られるＳ−シアノ化ペプチドをアルカリ処理する工程
を含む方法。
Item 8. A method for producing the peptide according to any one of Items 1 to 5,
(1) The following formula:
X 1 -Cys-A-Lys- Cys-X 2
(Wherein, A is the amino acid sequence of the peptide according to any one of Items 1 to 5 not containing a cysteine residue, and X 1 and X 2 are the same or different and are any amino acid residue or any amino acid. Is an array)
And (2) a step of subjecting the S-cyanated peptide obtained by the step (1) to an alkali treatment.
項９．前記Ｘ１がアミノ酸残基である場合にはそのアミノ酸残基がアスパラギン残基若しくはリジン残基であり；
前記Ｘ１がアミノ酸配列である場合にはそのアミノ酸配列のＣ末端がアスパラギン残基若しくはリジン残基である、項８に記載の方法。
Item 9. When X 1 is an amino acid residue, the amino acid residue is an asparagine residue or a lysine residue;
The C-terminus of its amino acid sequence when X 1 is an amino acid sequence is an asparagine residue or a lysine residue A method according to claim 8.
項１０．前記工程（２）におけるアルカリ処理を、炭酸塩により行う、項８又は９に記載の方法。 Item 10. Item 10. The method according to Item 8 or 9, wherein the alkali treatment in the step (2) is performed with a carbonate.
本発明の修飾ペプチドは、加水分解耐性を有している。特に、高いエキソペプチダーゼ耐性を有している。 The modified peptide of the present invention has hydrolysis resistance. In particular, it has high exopeptidase resistance.
また、本発明の修飾ペプチドは、生理活性及び抗微生物活性をはじめとする有用活性を修飾前と比べて著しく損なうことなく維持している。 In addition, the modified peptide of the present invention maintains useful activities including physiological activity and antimicrobial activity without significantly impairing the activity before modification.
このように本発明の修飾ペプチドは、生体内又は生体表面等の生体環境において持続的に使用できる。特に、血清中において持続的な生物活性を示す。 As described above, the modified peptide of the present invention can be used continuously in a living environment such as in vivo or on the surface of a living body. In particular, it exhibits sustained biological activity in serum.
そして、本発明の修飾ペプチドの製造方法は、目的のアミノ酸配列を含むペプチドから高い効率で一部を切り出して、そのアミノ酸配列からなる修飾ペプチドを取得することができる。 And the manufacturing method of the modified peptide of this invention can cut out a part with high efficiency from the peptide containing the target amino acid sequence, and can acquire the modified peptide which consists of the amino acid sequence.
このように本発明の修飾ペプチドの製造方法は、修飾ペプチド製造において高い収率を達成できる。このため、より安価に、かつより大量に修飾ペプチドを製造できる。特に、組換えタンパク質から一部を切り出して修飾ペプチドを取得しようとする場合に高い収率を達成できる。 Thus, the method for producing a modified peptide of the present invention can achieve a high yield in producing the modified peptide. Therefore, the modified peptide can be produced at a lower cost and in a larger amount. In particular, a high yield can be achieved when attempting to obtain a modified peptide by excising a part from the recombinant protein.
１．修飾ペプチド
本発明の修飾ペプチドは、Ｎ末端がチアゾリジン環であり、かつＣ末端がリジンε−ラクタム環であることを特徴とする両端が修飾されたペプチドである。より詳細には、本発明の修飾ペプチドは、（１）核となるペプチド（以下、「核ペプチド」ということがある。）、（２）核ペプチドのＮ末端側アミノ酸のＮ末端を修飾しているチアゾリジン環、及び（３）核ペプチドのＣ末端側アミノ酸のＣ末端を修飾しているリジンε−ラクタム環から構成される。
1. Modified peptide The modified peptide of the present invention is a peptide modified at both ends, characterized in that the N-terminus is a thiazolidine ring and the C-terminus is a lysine ε-lactam ring. More specifically, the modified peptide of the present invention comprises (1) a peptide serving as a nucleus (hereinafter sometimes referred to as “nuclear peptide”), and (2) a modification of the N-terminal of the N-terminal amino acid of the nuclear peptide. And (3) a lysine ε-lactam ring that modifies the C-terminal of the C-terminal amino acid of the nuclear peptide.
（１）核ペプチド
核ペプチドとしては、生理活性又は抗微生物活性をはじめとする有用活性を有するペプチド（本明細書においてそのようなペプチドのことを「機能性ペプチド」ということがある。）を使用することができる。
(1) As a nuclear peptide , a peptide having useful activity including physiological activity or antimicrobial activity (in this specification, such a peptide may be referred to as “functional peptide”) is used. can do.
本明細書において「生理活性」とは、生体の生理的機能に対して何らかの作用を示す活性をいう。例えば、神経伝達物質様活性、神経栄養因子様活性、ホルモン様活性、成長因子様活性、オータコイド様活性、サイトカイン様活性、及びフェロモン様活性等が挙げられる。 As used herein, “physiological activity” refers to an activity that exhibits some action on the physiological functions of a living body. For example, neurotransmitter-like activity, neurotrophic factor-like activity, hormone-like activity, growth factor-like activity, autocidal-like activity, cytokine-like activity, and pheromone-like activity.
抗微生物活性は任意の抗微生物活性でよく限定されない。例えば、抗細菌（バクテリア；bacteria）活性、抗菌（Fungi）活性、及び抗ウイルス活性等が挙げられる。 Antimicrobial activity is not limited to any antimicrobial activity. Examples thereof include antibacterial (bacteria) activity, antibacterial (Fungi) activity, and antiviral activity.
抗ウイルス活性としては、例えば、抗ＨＩＶ活性等が挙げられる。抗ＨＩＶ活性を有する核ペプチドとしては、例えば、ＨＩＶウイルスと標的細胞との膜融合を阻害する活性を有するペプチド等が挙げられる。そのようなペプチドとしては、例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ４１のＨＲ２領域由来のペプチド等が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるＳＣ３４ＥＫ（Ｏｔａｋａ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００２，４１，Ｎｏ．１６）、配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＣ３５ＥＫ（同）、及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＴ−２０ＥＫ（Ｏｉｓｈｉ Ａ． ｅｔ ａｌ．，２００８，５１，Ｎｏ．３）等が挙げられる。抗ＨＩＶ−１活性を有する核ペプチドとしては、さらに配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ抗ＨＩＶ−１活性を有するペプチド等も挙げられる。前記欠失等されたアミノ酸配列としては、アミノ酸配列全体の８０％以内のアミノ酸が欠失等されたアミノ酸配列が好ましく、アミノ酸配列全体の８５％以内のアミノ酸が欠失等されたアミノ酸配列がより好ましく、アミノ酸配列全体の９０％以内のアミノ酸が欠失等されたアミノ酸配列がさらに好ましい。 Examples of the antiviral activity include anti-HIV activity. Examples of the nuclear peptide having anti-HIV activity include a peptide having an activity of inhibiting membrane fusion between the HIV virus and the target cell. Examples of such peptides include peptides derived from the HR2 region of gp41 of HIV-1. Specifically, for example, SC34EK (Otaka A. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, No. 16) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 SC35EK (same as above), and T-20EK (Oishi A. et al., 2008, 51, No. 3) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are included. The nuclear peptide having anti-HIV-1 activity further comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and anti-HIV- Examples thereof include peptides having one activity. The deleted amino acid sequence is preferably an amino acid sequence in which amino acids within 80% of the entire amino acid sequence are deleted, and more preferably an amino acid sequence in which amino acids within 85% of the entire amino acid sequence are deleted. Preferably, an amino acid sequence in which amino acids within 90% of the entire amino acid sequence are deleted is more preferable.
本発明の修飾ペプチドは両端を修飾することによってもその有用活性を失うことなく維持している。これはチアゾリジン環及びリジンε−ラクタム環の環構造を伴う末端修飾基により、それぞれの末端からのペプチダーゼ等による分解を受けにくいためであると考えられる。 The modified peptide of the present invention is maintained without losing its useful activity by modifying both ends. This is considered to be because the terminal modification groups having the ring structures of thiazolidine ring and lysine ε-lactam ring are not easily decomposed by peptidases from the respective ends.
（２）チアゾリジン環
チアゾリジン環は核ペプチドのＮ末端側アミノ酸のＮ末端を修飾している。具体的には、チアゾリジン−カルボニル基、例えば２−イミノチアゾリジン−４−カルボニル基（式（Ｉ））が核ペプチドのＮ末端側アミノ酸のＮ末端アミノ基とアミド結合を形成して結合している。
(2) Thiazolidine ring The thiazolidine ring modifies the N-terminal of the N-terminal amino acid of the nuclear peptide. Specifically, a thiazolidine-carbonyl group, for example, 2-iminothiazolidine-4-carbonyl group (formula (I)) is bonded to the N-terminal amino group of the N-terminal amino acid of the nuclear peptide by forming an amide bond. .
チアゾリジン環は、本発明の効果を妨げない限り、チアゾリジン環構造を基本骨格としつつ種々の置換基を有していてもよい。 The thiazolidine ring may have various substituents with the thiazolidine ring structure as a basic skeleton, as long as the effects of the present invention are not hindered.
（３）リジンε−ラクタム環
リジンε−ラクタム環は核ペプチドのＣ末端側アミノ酸のＣ末端を修飾している。具体的には、リジンε−ラクタム環（式（ＩＩ））のアミノ基が核ペプチドのＣ末端側アミノ酸のＣ末端カルボキシル基とアミド結合を形成して結合している。
(3) Lysine ε-lactam ring The lysine ε-lactam ring modifies the C-terminal of the C-terminal amino acid of the nuclear peptide. Specifically, the amino group of the lysine ε-lactam ring (formula (II)) is bonded with the C-terminal carboxyl group of the C-terminal amino acid of the nuclear peptide by forming an amide bond.
リジンε−ラクタム環は、本発明の効果を妨げない限り、リジンε−ラクタム環構造を基本骨格としつつ種々の置換基を有していてもよい。
２．修飾ペプチドを含む組成物
本発明の修飾ペプチドを含む組成物としては、例えば、医薬品又は食品等が挙げられる。なお、本明細書において「食品」には飲料が含まれる。
The lysine ε-lactam ring may have various substituents while using the lysine ε-lactam ring structure as a basic skeleton as long as the effects of the present invention are not hindered.
2. Composition containing modified peptide Examples of the composition containing the modified peptide of the present invention include pharmaceuticals and foods. In the present specification, “food” includes beverages.
本発明の修飾ペプチドを含む医薬品又は食品には、本発明の修飾ペプチドを一種類のみ含有させてもよいし、二種類以上を併用して含有させてもよい。 The pharmaceutical or food containing the modified peptide of the present invention may contain only one type of the modified peptide of the present invention, or may contain two or more types in combination.
本発明の医薬品又は食品における本発明の修飾ペプチドの含有割合は、修飾ペプチドの有用作用が発揮される範囲内で選択できる。 The content ratio of the modified peptide of the present invention in the pharmaceutical or food of the present invention can be selected within the range in which the useful action of the modified peptide is exhibited.
本発明の医薬品又は食品のｐＨとしては、特に限定されないが、ペプチドの安定性や投与（注射）時に投与部位周辺に好ましくない影響を与えることを避けるという点ではｐＨ６〜８が好ましい。 Although it does not specifically limit as pH of the pharmaceutical or foodstuff of this invention, pH 6-8 are preferable at the point of avoiding an unfavorable influence around the administration site | part at the time of peptide stability or administration (injection).
本発明の医薬品又は食品の形態は限定されない。液状、半液状、固形状のいずれであってもよい。 The form of the pharmaceutical or food of the present invention is not limited. It may be liquid, semi-liquid, or solid.
本発明の医薬品又は食品は、本発明の効果を妨げない限り、修飾ペプチドの他に、必要に応じて種々の成分を含有することができる。 The pharmaceutical or food of the present invention can contain various components as necessary in addition to the modified peptide as long as the effects of the present invention are not hindered.
本発明の医薬品に含まれる修飾ペプチドの核ペプチドは、特定の薬理活性を示すものである。この場合、核ペプチドは好ましくは、抗ウイルス活性を有するものであり、より好ましくは抗ＨＩＶ活性を有するものである。 The modified peptide nuclear peptide contained in the pharmaceutical product of the present invention exhibits a specific pharmacological activity. In this case, the nuclear peptide is preferably one having antiviral activity, more preferably one having anti-HIV activity.
本発明の医薬品の形態は、適用対象となる患部、適用方法等に応じて適宜設定される。形態として、具体的には、錠剤、顆粒、散剤、坐剤、カプセル剤等の固形状；クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤等の半固形状；液剤、ローション剤等の液状等が例示される。 The form of the pharmaceutical product of the present invention is appropriately set according to the affected part to be applied, the application method, and the like. Specific examples of the form include solid forms such as tablets, granules, powders, suppositories and capsules; semi-solid forms such as creams, gels and ointments; liquids such as liquids and lotions. .
本発明の医薬品の投与量や投与頻度については、医薬品の使用目的、形態、対象症例の種類や症状の程度、被投与者の年齢、及び修飾ペプチドの薬理活性の程度等に応じて適宜設定される。例えば、本発明の医薬品の１日当たりの投与量の平均としては、例えばＦｕｚｅｏｎ（Ｔ−２０）の投与量（９０ｍｇ×２回 ／ １日）を参考に算出すると修飾ペプチドの量に換算して、通常２〜２００ｍｇ程度が挙げられる。 The dosage and administration frequency of the pharmaceutical product of the present invention are appropriately set according to the purpose of use of the pharmaceutical product, the form, the type of subject case, the degree of symptoms, the age of the recipient, the degree of pharmacological activity of the modified peptide, and the like. The For example, as an average of the daily dose of the pharmaceutical product of the present invention, for example, the dose (90 mg × 2 times / day) of Fuzeon (T-20) is calculated with reference to the amount of the modified peptide, Usually, about 2-200 mg is mentioned.
また、本発明の医薬品は、例えば、１日当たり１回の頻度で若しくは２又は３回程度に分割して投与してもよく、また、２日〜１週間分の投与量を一度にまとめて投与してもよい。
３．修飾ペプチドを製造する方法
本発明の修飾ペプチドを製造する方法は、
（工程１）次の式：
Ｘ１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ２
（式中、Ａは、システイン残基を含まない任意のアミノ酸配列であり、かつ
Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である）
で表されるペプチド（以下、「原料ペプチド」ということがある。）
をＳ−シアノ化する工程（以下、「Ｓ−シアノ化工程」ということがある。）；及び
（工程２）工程１により得られるＳ−シアノ化ペプチドをアルカリ処理する工程（以下、「アルカリ処理工程」ということがある。）
を含む方法である。
In addition, the pharmaceutical agent of the present invention may be administered, for example, once per day or divided into two or three times, and the doses for 2 days to 1 week are administered at a time. May be.
3. Method for producing modified peptide The method for producing the modified peptide of the present invention comprises:
(Step 1) The following formula:
X 1 -Cys-A-Lys- Cys-X 2
(In the formula, A is an arbitrary amino acid sequence not containing a cysteine residue, and X 1 and X 2 are the same or different, and are arbitrary amino acids or arbitrary amino acid sequences)
(Hereinafter sometimes referred to as “raw peptide”)
And (step 2) a step of subjecting the S-cyanated peptide obtained in step 1 to an alkali treatment (hereinafter referred to as an “alkali treatment”). Sometimes referred to as a "process".)
It is a method including.
本製造方法により、図１に示すように、原料ペプチドを出発物質として、Ａのアミノ酸配列の両端が修飾されたペプチドを最終生成物として得ることができる。具体的には、原料ペプチドからＡのアミノ酸配列部分を特異的切断反応により切り出し、かつ環化反応によりＡのアミノ酸配列の両端を環化することによって、Ａのアミノ酸配列の両端が修飾されたペプチドを得ることができる。より詳細には、次の通りである。なお、Ａについての説明は、本発明の修飾ペプチドにおける核ペプチドのアミノ酸配列についての説明と変わるところがないため省略する。 According to this production method, as shown in FIG. 1, a peptide in which both ends of the amino acid sequence of A are modified can be obtained as a final product using a starting peptide as a starting material. Specifically, a peptide in which both ends of the amino acid sequence of A are modified by excising the amino acid sequence portion of A from the raw peptide by specific cleavage reaction and cyclizing both ends of the amino acid sequence of A by cyclization reaction Can be obtained. More details are as follows. The explanation for A is omitted because there is no difference from the explanation for the amino acid sequence of the nuclear peptide in the modified peptide of the present invention.
（１）原料ペプチド
原料ペプチドは、例えばそれをコードする塩基配列を含むＤＮＡを培養微生物等において発現させること等によって得ることができる。具体的には、そのＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを用意し、これを大腸菌に導入して原料ペプチドを含むポリペプチドを発現させ、これを精製すること等によって得ることができる。また、この際には、発現したポリペプチドの精製をより効率よく行うために、精製用のタグ配列を付加した形でポリペプチドを発現させてもよい。この場合、精製用のタグ配列としては、例えば、ヒスチジンタグ、グルタチオンタグ、ビオチンタグ、ＦＬＡＧタグ等を用いることができる。
(1) Raw material peptide The raw material peptide can be obtained, for example, by expressing DNA containing a base sequence encoding it in a cultured microorganism or the like. Specifically, it can be obtained by preparing an expression vector incorporating the DNA, introducing it into Escherichia coli, expressing a polypeptide containing the starting peptide, and purifying it. In this case, in order to purify the expressed polypeptide more efficiently, the polypeptide may be expressed with a tag sequence for purification added. In this case, as a tag sequence for purification, for example, a histidine tag, a glutathione tag, a biotin tag, a FLAG tag, or the like can be used.
原料ペプチドは、その他にもペプチド合成等によって得ることもできる。 In addition, the starting peptide can be obtained by peptide synthesis or the like.
（２）Ｓ−シアノ化工程
Ｓ−シアノ化工程は、システイン基をＳ−シアノ化する工程である。これにより引き続いて行われるアルカリ処理工程において特異的に切断される部位が決定されることになる。具体的には、Ｓ−シアノ化されたシステイン基のＮ末端側アミド結合が特異的に切断されることになる。
(2) S-Cyanation Step The S-cyanation step is a step of S-cyanating a cysteine group. Thereby, the site | part specifically cut | disconnected in the alkali treatment process performed subsequently is determined. Specifically, the N-terminal amide bond of the S-cyanoated cysteine group is specifically cleaved.
本製造方法は、Ａのアミノ酸配列の両端が修飾されたペプチドを最終生成物として得ることを最終目的としている。したがって、もしＡにシステイン残基が含まれていると、このＡ中のシステイン残基もＳ−シアノ化されてそのＮ末端側アミド結合が切断されてしまう。そうすると、Ａのアミノ酸配列の両端が修飾されたペプチドを得ることができなくなってしまうため、Ａはシステイン残基を含まないアミノ酸配列である必要がある。 The final purpose of this production method is to obtain a peptide in which both ends of the amino acid sequence of A are modified as a final product. Therefore, if A contains a cysteine residue, the cysteine residue in A is also S-cyanated and its N-terminal amide bond is cleaved. If it does so, since it will become impossible to obtain the peptide by which the both ends of the amino acid sequence of A were modified, A needs to be an amino acid sequence which does not contain a cysteine residue.
Ｓ−シアノ化反応は、限定されないが、例えば、０．５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、及びＣＤＡＰを含む酢酸溶液中で処理すること等により行うことができる。Ｓ−シアノ化反応は、この他にも例えばｐＨ７〜９の緩衝液中で２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（２−ｎｉｔｒｏ−５−ｔｈｉｏｃｙａｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ （ＮＴＣＢ））を反応させること等によっても行うことができる。 The S-cyanation reaction is not limited, but can be performed by, for example, treating in an acetic acid solution containing 0.5 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine and CDAP. In addition to this, the S-cyanation reaction is also performed by, for example, reacting 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid (NTCB) in a pH 7-9 buffer solution. be able to.
温度は例えば、０〜５０℃で行うことができる。反応効率の点では、２０〜５０℃で行うことが好ましい。 The temperature can be performed at 0 to 50 ° C., for example. In view of reaction efficiency, the reaction is preferably performed at 20 to 50 ° C.
反応時間は例えば、１０〜３００分間行うことができる。収率の点では３０分以上行うことが好ましい。 For example, the reaction time can be 10 to 300 minutes. It is preferable to carry out for 30 minutes or more in terms of yield.
（３）アルカリ処理工程
アルカリ処理工程は、Ｓ−シアノ化システイン残基のＮ末端側アミド結合を切断し、かつ所定の切断箇所を環化する工程である。
(3) Alkali treatment step The alkali treatment step is a step of cleaving the N-terminal amide bond of the S-cyanoated cysteine residue and cyclizing a predetermined cleavage site.
アルカリ処理により、Ａのアミノ酸配列のＮ末端側のＳ−シアノ化工程でＳ−シアノ化されたシステイン残基が環化してチアゾリジン環となる。この際、同時にＮ末端側アミド結合が特異的に切断され、Ａの部分が切り出される。 By the alkali treatment, the cysteine residue S-cyanated in the S-cyanation step on the N-terminal side of the amino acid sequence of A is cyclized to a thiazolidine ring. At the same time, the N-terminal amide bond is specifically cleaved, and the portion A is cut out.
ところで原料ペプチドのＸ１は、任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である。Ｘ１はＳ−シアノ化されるシステイン残基を介して、Ａと結合している。このＳ−シアノ化されるシステイン基とＸ１の間のアミド結合がアルカリ処理工程により切断される。このようにＸ１は切断部位に隣接している。したがって、Ｘ１がアミノ酸であるときはその種類が、又はＸ１がペプチドであるときはＣ末端のアミノ酸（切断部位に隣接するアミノ酸）の種類が、アルカリ処理工程による切断反応の反応性に影響を与える。どのアミノ酸であったとしても切断反応は問題なく行われるが、アスパラギン若しくはリジンであれば、これらの残基の側鎖官能基の特性に基づく環化反応の進行（アスパルチミド若しくはリジンε−ラクタム形成）により、上述のチアゾリジン環形成反応を促進し、反応効率が高くなるため好ましい。反応効率の点ではその中でもリジンがより好ましい。 Meanwhile X 1 of the raw material peptide is any amino acid or any amino acid sequence. X 1 is linked to A via a cysteine residue that is S-cyanated. The amide bond between the cysteine group and X 1 is S- cyanation is cleaved by alkaline treatment step. Thus X 1 is adjacent to the cleavage site. Therefore, when X 1 is an amino acid, the type thereof, or when X 1 is a peptide, the type of C-terminal amino acid (amino acid adjacent to the cleavage site) affects the reactivity of the cleavage reaction by the alkali treatment step. give. The cleavage reaction can be carried out without any problem with any amino acid, but if it is asparagine or lysine, the progress of the cyclization reaction based on the properties of the side chain functional groups of these residues (formation of aspartimide or lysine ε-lactam) Is preferable because it promotes the above thiazolidine ring formation reaction and increases the reaction efficiency. Among them, lysine is more preferable in terms of reaction efficiency.
原料ペプチドのＸ２も、任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である。Ｘ２はリジン基及びＳ−シアノ化されるシステイン基を介して、Ａと結合している。Ｘ２はＸ１とは異なり切断部位には隣接していないため、アルカリ処理工程による切断反応の反応性に影響を与えることはない。 X 2 of the raw peptides, any amino acid or any amino acid sequence. X 2 is bonded to A via a lysine group and a cysteine group to be S-cyanoated. Since X 2 is not adjacent to the cleavage site unlike X 1 , it does not affect the reactivity of the cleavage reaction by the alkali treatment step.
アルカリ処理反応は、限定されないが、例えば、種々の塩基で処理すること等により行うことができる。種々の塩基としては、限定されないが、例えば、アンモニア、アミン、及び弱酸塩、金属水酸化物等を用いることができる。これらを単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。アミンとしては、例えば、トリエチルアミン、及びイソプロピルエタノールアミン等を用いることができる。弱酸塩としては、例えば、酢酸塩、炭酸水素塩、及び炭酸塩等を用いることができる。金属水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム等を用いることができる。塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等を用いることができる。反応効率の点では、炭酸塩の水溶液が好ましく、炭酸塩の中でもＫ２ＣＯ３の水溶液がより好ましい。 Although alkali treatment reaction is not limited, For example, it can carry out by processing with various bases. Examples of various bases include, but are not limited to, ammonia, amines, weak acid salts, metal hydroxides, and the like. These may be used alone or in combination of two or more. Examples of amines that can be used include triethylamine and isopropylethanolamine. As the weak acid salt, for example, acetate, bicarbonate, carbonate and the like can be used. As the metal hydroxide, sodium hydroxide, lithium hydroxide, or the like can be used. As the salt, for example, sodium, potassium and the like can be used. From the viewpoint of reaction efficiency, an aqueous solution of carbonate is preferable, and an aqueous solution of K 2 CO 3 is more preferable among the carbonates.
塩基濃度は、塩基の種類にもよるが、例えば、０．１〜５Ｍの塩基を用いることができる。炭酸塩の水溶液の場合は、例えば、０．１〜２Ｍの炭酸塩を用いることができる。 Although the base concentration depends on the type of base, for example, a base of 0.1 to 5M can be used. In the case of an aqueous carbonate solution, for example, 0.1 to 2M carbonate can be used.
温度は例えば、０〜５０℃で行うことができる。反応効率の点では、２０〜５０℃で行うことが好ましい。 The temperature can be performed at 0 to 50 ° C., for example. In view of reaction efficiency, the reaction is preferably performed at 20 to 50 ° C.
反応時間は例えば、１０〜３００分間行うことができる。収率の点では３０分以上行うことが好ましい。 For example, the reaction time can be 10 to 300 minutes. It is preferable to carry out for 30 minutes or more in terms of yield.
以下、本発明を試験例及び実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on test examples and examples. However, the present invention is not limited to these specific examples.
試験例１．核ペプチド両端の同時切断反応に関する検討
（１）モデルペプチドの合成
次の式（ＩＩＩ）：
Test Example 1 Study on simultaneous cleavage reaction at both ends of nuclear peptide (1) Synthesis of model peptide The following formula (III):
［Ａｃは、アセチル基であり、かつＸは任意のアミノ酸残基である（ただし、システイン残基を除く）。なお、Ｎ末端のチロシンのＮ末端側はアセチル化されており、かつＣ末端のリジンのＣ末端側はアミド化されている。Ｙはチロシン、Ｅはグルタミン酸、Ｑはグルタミン、Ｋはリジン、Ｃはシステイン、Ｆはフェニルアラニンをそれぞれ示している。］
で表されるペプチドをモデルペプチドとして用いた。
[Ac is an acetyl group, and X is any amino acid residue (except for a cysteine residue). The N-terminal side of the N-terminal tyrosine is acetylated, and the C-terminal side of the C-terminal lysine is amidated. Y represents tyrosine, E represents glutamic acid, Q represents glutamine, K represents lysine, C represents cysteine, and F represents phenylalanine. ]
Was used as a model peptide.
モデルペプチドは次のようにして合成した。ペプチド固相合成法により標準的なＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）合成法にて合成した。固相としてＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂（Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）を８３ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ用いた。アミノ酸側鎖の保護には、チロシン、セリン及びスレオニンに関してはｔ−Ｂｕを；アスパラギン酸及びグルタミン酸に関してはｔ−Ｂｕエステルを、リジンに関してはＢｏｃを、システイン、ヒスチジン、アスパラギン及びグルタミンに関してはＴｒｔを；アルギニンに関しては２，２，４，６，７−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｙｌ（ｐｂｆ）を、それぞれ用いた。 The model peptide was synthesized as follows. The peptide was synthesized by the standard Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) synthesis method by a peptide solid phase synthesis method. As a solid phase, 83 mg and 0.05 mmol of Rink Amide resin (manufactured by Navabiochem) were used. For amino acid side chain protection, t-Bu for tyrosine, serine and threonine; t-Bu ester for aspartic acid and glutamic acid; Boc for lysine; Trt for cysteine, histidine, asparagine and glutamine; As for arginine, 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (pbf) was used, respectively.
保護ペプチド樹脂の構築は、Ｆｍｏｃアミノ酸を５当量の試薬（Ｆｍｏｃアミノ酸、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ）を用いて縮合させた後、２０％ピペリジン含有ＤＭＦ中で１分間×２回、２０分間×１回ずつ処理してＦｍｏｃ基を除去することを、各アミノ酸ごとに繰り返すことにより行った。 The construction of the protected peptide resin was carried out by condensing Fmoc amino acid with 5 equivalents of a reagent (Fmoc amino acid, N, N′-diisopropylcarbodiimide, HOBt · H 2 O) and then in DMF containing 20% piperidine for 1 minute × The removal of the Fmoc group by treating twice for 20 minutes × one time was performed by repeating each amino acid.
最終的に得られた保護ペプチド樹脂をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ｍ−クレゾール／チオアニソール／１，２−エタンジチオール（８０：５：５：５：５）中で２時間室温にて処理した後、樹脂を濾去した。次いで氷冷した乾燥ジエチルエーテル３０ｍＬを濾液に加えた。生成した粉末を遠心分離により回収し、氷冷した乾燥ジエチルエーテル１５ｍＬで３回洗浄した。分取ＨＰＬＣにより生成物の精製を行い、無色の粉末状のモデルペプチドを得た。 After treating the finally obtained protected peptide resin in TFA / H 2 O / m-cresol / thioanisole / 1,2-ethanedithiol (80: 5: 5: 5: 5) for 2 hours at room temperature The resin was filtered off. Next, 30 mL of ice-cooled dry diethyl ether was added to the filtrate. The produced powder was collected by centrifugation and washed three times with 15 mL of ice-cooled dry diethyl ether. The product was purified by preparative HPLC to obtain a colorless powdery model peptide.
モデルペプチドのシステインを次のようにしてＳ−シアノ化した。まず、モデルペプチド（例えば、Ｘがリジン残基である場合は５．８ｍｇ）を含む０．１Ｎ酢酸溶液０．５８ｍｌを、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート［１−ｃｙａｎｏ−４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（ＣＤＡＰ）；入手先ＳＩＧＭＡ；品番Ｃ２７７６］を含む０．１Ｎ酢酸溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）０．１８２ｍＬに添加した。室温で３０分間撹拌した後、分取ＨＰＬＣにより精製してＳ−シアノ化ペプチドの凍結乾燥物を得た。分取ＨＰＬＣによる精製は次の通り行った。Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ分取用カラム（２０×２５０ｍｍ、流速１０ｍＬ／分、ナカライテスク製）を使用した。Ｘがリジン残基である場合、Ｓ−シアノ化ペプチドは５．７ｍｇであり、収率は９７％であった。 The model peptide cysteine was S-cyanated as follows. First, 0.58 ml of a 0.1N acetic acid solution containing a model peptide (for example, 5.8 mg when X is a lysine residue) was added to 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate [1-cyano-4. -Dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP); source SIGMA; product number C2776] was added to 0.182 mL of 0.1 N acetic acid solution (10 mg / mL). After stirring at room temperature for 30 minutes, purification by preparative HPLC yielded a lyophilized product of S-cyanated peptide. Purification by preparative HPLC was performed as follows. Cosmosil 5C18-ARII preparative column (20 × 250 mm, flow rate 10 mL / min, manufactured by Nacalai Tesque) was used. When X is a lysine residue, the S-cyanated peptide was 5.7 mg and the yield was 97%.
（２）切断反応に関する検討
続いてＳ−シアノ化モデルペプチド１ｍｇを３Ｍ ＮＨ３溶液０．１ｍＬ中において２０℃で２０分間処理することにより、Ｓ−シアノ化されたＸのＣ末端側アミド結合を特異的に切断した。
(2) Study on cleavage reaction Subsequently, 1 mg of the S-cyanated model peptide was treated in 0.1 mL of 3M NH 3 solution at 20 ° C. for 20 minutes to thereby remove the C-terminal amide bond of S-cyanated X. Cleaved specifically.
この切断反応の産物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で分析することにより、次の式（ＩＶ）〜式（ＶＩＩＩ）で表されるペプチドが得られた。ＲＰ−ＨＰＬＣは次の通り行った。Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ分析用カラム（４．６×２５０ｍｍ、流速 １ｍＬ／分、ナカライテスク製）を用いた。溶出された生成物をＵＶ（２２０ｎｍ）で検出した。溶媒系としては、０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ（溶媒Ａ）及び０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ含有ＭｅＣＮ（溶媒Ｂ）を用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ ｐｌｕｓ、島津製作所）、又はＱｑＴｏｆ（ＱＳＴＡＲ ｐｕｌｓａｒ ｉ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析を行った。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ５００を用いて測定した。 By analyzing the product of this cleavage reaction by reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), peptides represented by the following formulas (IV) to (VIII) were obtained. RP-HPLC was performed as follows. Cosmosil 5C18-ARII analytical column (4.6 × 250 mm, flow rate 1 mL / min, manufactured by Nacalai Tesque) was used. The eluted product was detected by UV (220 nm). As the solvent system, 0.1 v / v% TFA (solvent A) and 0.1 v / v% TFA-containing MeCN (solvent B) were used. Analysis was performed using MALDI-TOF-MS (AXIMA-CFR plus, Shimadzu Corp.) or QqTof (QSTAR pulsar i, Applied Biosystems). NMR spectra were measured using a Bruker AVANCE500.
式（ＩＶ）及び式（Ｖ）で表されるペプチドは、Ｘがアスパラギンでもリジンでもないアミノ酸であるときに得られるＮ末端側の断片である。式（ＩＶ）で表されるペプチドはＣ末端側がカルボキサミド基となっており、式（Ｖ）で表されるペプチドはＣ末端側がカルボン酸となっている。 The peptides represented by the formulas (IV) and (V) are N-terminal fragments obtained when X is an amino acid that is neither asparagine nor lysine. The peptide represented by the formula (IV) has a carboxamide group on the C-terminal side, and the peptide represented by the formula (V) has a carboxylic acid on the C-terminal side.
式（ＶＩ）で表されるペプチドは、Ｃ末端側の断片である。そのＮ末端側は２−チアゾリジン環となっている。具体的には、２−イミノチアゾリジン−４−カルボニル基となっている。 The peptide represented by the formula (VI) is a C-terminal fragment. The N-terminal side is a 2-thiazolidine ring. Specifically, it is a 2-iminothiazolidine-4-carbonyl group.
式（ＶＩＩ）で表されるペプチドは、Ｘがアスパラギンであるときにのみ得られるＮ末端側の断片である。そのＣ末端側は分子内環化反応により環状のアスパルチミド基となっている。 The peptide represented by the formula (VII) is an N-terminal fragment obtained only when X is asparagine. The C-terminal side becomes a cyclic aspartimide group by an intramolecular cyclization reaction.
式（ＶＩＩＩ）で表されるペプチドは、Ｘがリジンであるときにのみ得られるＮ末端側の断片である。そのＣ末端側は分子内環化反応によりリジンε−ラクタム環となっている。 The peptide represented by the formula (VIII) is an N-terminal fragment obtained only when X is lysine. The C-terminal side becomes a lysine ε-lactam ring by an intramolecular cyclization reaction.
これらのペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで解析することにより、式（ＩＩＩ）で表されるペプチドの切断率（％）を算出した。 By analyzing these peptides by RP-HPLC, the cleavage rate (%) of the peptide represented by the formula (III) was calculated.
切断率は、具体的には次のようにして算出した。まずＲＰ−ＨＰＬＣで全ての産物についてピーク面積を測定した。次に、式（ＩＶ）又は式（Ｖ）、式（ＶＩ）、並びに式（ＶＩＩ）又は式（ＶＩＩＩ）で表されるそれぞれのペプチドのピーク面積の合計に基づいて切断率（％）を算出した。 Specifically, the cutting rate was calculated as follows. First, peak areas were measured for all products by RP-HPLC. Next, the cleavage rate (%) is calculated based on the sum of the peak areas of the respective peptides represented by formula (IV) or formula (V), formula (VI), and formula (VII) or formula (VIII). did.
１９種類のアミノ酸残基のうちいずれのアミノ酸残基をＸとした場合により高い切断率が得られるか検討した。Ｘがアスパラギンである場合に切断率７９％、またＸがリジンであるときには切断率８２％であり、この二つの場合に最も高い切断率が得られることが分かった。なお、Ｘがアスパラギンである場合、式（ＩＶ）で表されるペプチドと式（ＶＩＩ）で表されるペプチドの比率は５３：４７であった。また、Ｘがリジンである場合、式（ＩＶ）で表されるペプチドと式（ＶＩＩＩ）で表されるペプチドの比率は２２：７８であった。 It was examined whether a higher cleavage rate could be obtained when any of the 19 types of amino acid residues was X. When X is asparagine, the cleavage rate is 79%, and when X is lysine, the cleavage rate is 82%. It was found that the highest cleavage rate was obtained in these two cases. When X is asparagine, the ratio of the peptide represented by formula (IV) to the peptide represented by formula (VII) was 53:47. When X is lysine, the ratio of the peptide represented by formula (IV) to the peptide represented by formula (VIII) was 22:78.
末端が環化されたペプチドを効率的に得るという点では、Ｘがリジンである場合が特に有利であることが分かった。 It has been found that it is particularly advantageous when X is lysine in terms of efficiently obtaining a terminally cyclized peptide.
（２）核ペプチド両端の同時切断反応に関する検討
（１）の検討結果から、次の式：
Ｘ１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｃｙｓ−Ｘ２
（式中、Ａは、任意のアミノ酸配列からなる核ペプチドであり、かつ
Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である）
で表されるそれぞれのペプチドをまずＳ−シアノ化し、その後にそのＳ−シアノ化ペプチドをアルカリ処理することによって、ペプチドＸ１のＣ末端側アミド結合、及び核ペプチドのＣ末端側アミド結合が同時に切断される結果、核ペプチドを高効率で切り出せることが期待された。
(2) Examination on simultaneous cleavage reaction at both ends of nuclear peptide From the examination result of (1), the following formula:
X 1 -Cys-A-Cys- X 2
(In the formula, A is a nuclear peptide consisting of an arbitrary amino acid sequence, and X 1 and X 2 are the same or different and are arbitrary amino acids or arbitrary amino acid sequences)
First S- cyanation each peptide represented in, followed by the S- cyanation peptide alkali treatment, C-terminal amide bond of the peptide X 1, and nuclear peptide C-terminal amide bond at the same time As a result of the cleavage, it was expected that the nuclear peptide could be cleaved with high efficiency.
さらに、次の式：
Ｘ１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ２；又は
Ｘ１−Ｃｙｓ−Ａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｘ２
（式中、Ａは、任意のアミノ酸配列からなる核ペプチドであり、かつ
Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である）
で表されるそれぞれのペプチドを同様に処理すれば、両端が環状構造となった状態で核ペプチドを切り出せることが期待された。
And the following formula:
X 1 -Cys-A-Lys- Cys-X 2; or X 1 -Cys-A-Asn- Cys-X 2
(In the formula, A is a nuclear peptide consisting of an arbitrary amino acid sequence, and X 1 and X 2 are the same or different and are arbitrary amino acids or arbitrary amino acid sequences)
It was expected that the nuclear peptide could be excised with both ends in a cyclic structure by treating each peptide represented by
なお、両端が環状構造となった状態とは、（１）の検討結果が示すように、Ｎ末端側が２−イミノチアゾリジン環であり、かつＣ末端側がアスパルチミド基、又はリジンε−ラクタム環となった状態である。 The state in which both ends have a cyclic structure means that the N-terminal side is a 2-iminothiazolidine ring and the C-terminal side is an aspartimide group or a lysine ε-lactam ring, as shown in the examination result of (1). It is in the state.
そこで、両端が環状構造となった状態で核ペプチドを切り出す反応を実際に行うことができるか否かを、上のモデルペプチド（のうちＸがアスパラギン又はリジンであるモデルペプチド）をそれぞれ用いて検証した。 Therefore, it is verified whether the reaction of cleaving the nuclear peptide can be actually performed with both ends in a cyclic structure, using the above model peptides (of which X is asparagine or lysine). did.
検証は具体的には次の通り行った。まずＳ−シアノ化反応は前述の通り行った。次にアルカリ処理反応を種々の塩基を用いて行い、いずれの塩基を用いた場合に両端が環状構造となった状態で核ペプチドを切り出すことができるか検討した。種々の塩基としては、３Ｍ ＮＨ３、０．５Ｍ ＮＨ３、１Ｍ Ｅｔ３Ｎ、１Ｍ （ｉ−Ｐｒ）２ＥｔＮ、１Ｍ ＡｃＯＮａ、１Ｍ ＮａＨＣＯ３、１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、０．３Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、１Ｍ Ｋ２ＣＯ３、及び０．３Ｍ Ｋ２ＣＯ３の計１０種類を検討した。アルカリ処理は全て２０℃で２０分間行った。 Specifically, the verification was performed as follows. First, the S-cyanation reaction was performed as described above. Next, the alkali treatment reaction was carried out using various bases, and it was examined which nuclear peptide could be excised with both ends in a cyclic structure when any base was used. Various bases include 3M NH 3 , 0.5M NH 3 , 1M Et 3 N, 1M (i-Pr) 2 EtN, 1M AcONa, 1M NaHCO 3 , 1M Na 2 CO 3 , 0.3M Na 2 CO 3 A total of 10 types of 1M K 2 CO 3 and 0.3M K 2 CO 3 were examined. All alkali treatments were performed at 20 ° C. for 20 minutes.
検証の結果、炭酸塩の水溶液を用いた場合に、末端が環化された式（ＶＩＩ）又は式（ＶＩＩＩ）のペプチドを特に高効率で得られることが明らかになった。炭酸塩の中でもＫ２ＣＯ３の水溶液を用いた場合に、これらのペプチドをさらに高効率で得られることも明らかになった。 As a result of the verification, it was revealed that when an aqueous carbonate solution was used, a peptide of formula (VII) or formula (VIII) having a cyclized terminal can be obtained with particularly high efficiency. It was also revealed that these peptides can be obtained with higher efficiency when using an aqueous solution of K 2 CO 3 among carbonates.
以上の通り、両端が環状構造となった状態で核ペプチドを切り出す反応に関して、それを実現するための処理方法を確立した。 As described above, with respect to the reaction of cutting out the nuclear peptide in a state where both ends have a cyclic structure, a processing method for realizing it was established.
実施例１．本発明の修飾ペプチドの製造
試験例１で確立した処理方法に基づいて、実際に修飾された核ペプチドを切り出すことができるか検証した。
（１）モデルペプチドの設定
核ペプチドのモデルペプチドとして、抗ＨＩＶ活性ペプチド（ＨＩＶ融合阻害剤）であるＳＣ３４ＥＫを用いた。ＳＣ３４ＥＫは、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである。このペプチドは、ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ４１のＣ末端側のα−へリックス構造を基にして設計されたものである。ＨＩＶ感染の膜融合過程では、ｇｐ４１のＮＨＲ及びＣＨＲによる逆平行型６−ｈｅｌｉｃａｌ ｂｕｎｄｌｅ構造形成が必要であることが知られており、ＳＣ３４ＥＫはこの過程を阻害することにより野生型のみならずエンフュービルタイド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ、Ｔ−２０）耐性を示すようなＨＩＶ−１株に対しても抗ウイルス活性を発揮する。
Example 1. Production of modified peptide of the present invention Based on the treatment method established in Test Example 1, it was verified whether the actually modified nuclear peptide could be cut out.
(1) Setting of model peptide SC34EK which is an anti-HIV active peptide (HIV fusion inhibitor) was used as a model peptide of the nuclear peptide. SC34EK is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. This peptide was designed based on the α-helix structure on the C-terminal side of gp41, which is an envelope glycoprotein of HIV. In the membrane fusion process of HIV infection, it is known that antiparallel 6-helical bundle structure formation by NGP and CHR of gp41 is necessary, and SC34EK inhibits not only the wild type but also the enfu. It also exhibits antiviral activity against HIV-1 strains exhibiting resistance to biltide (T-20).
（２）モデルペプチドのチオレドキシン融合タンパク質の発現
まず、ＳＣ３４ＥＫをチオレドキシンと融合させた融合タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株）において発現させた。なお、図２に示す通り、Ｎ末端側からアスパラギン又はリジン、そしてシステインの順番になるように、これら２つのアミノ酸残基をそれぞれＳＣ３４ＥＫの両端側に配置させた（図２中、Ｘは同一又は異なってアスパラギン又はリジンである。）。このようにすることで、Ｓ−シアノ化及びそれに続くアルカリ処理によってＳＣ３４ＥＫが切り出されることが期待される。
(2) Expression of model peptide thioredoxin fusion protein First, a fusion protein in which SC34EK was fused with thioredoxin was expressed in E. coli (E. coli BL21 strain). As shown in FIG. 2, these two amino acid residues were arranged at both ends of SC34EK so that asparagine or lysine and cysteine were in this order from the N-terminal side (in FIG. 2, X was the same or Differently asparagine or lysine). By doing in this way, it is expected that SC34EK is cut out by S-cyanation and subsequent alkali treatment.
まずＰＣＲ増幅の鋳型として、配列番号２で表されるｃＤＮＡ塩基配列を有する核酸（ＫＫＣ−ＳＣ３４ＥＫ−ＫＣＷ）、及び配列番号３で表されるｃＤＮＡ塩基配列を有する核酸（ＫＮＣ−ＳＣ３４ＥＫ−ＮＣＷ）を化学合成した。これらは２箇所ずつＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩによる制限酵素認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）と（ＣＴＣＧＡＧ）を有している。大腸菌における使用頻度が高いコドンに置き換えられている。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより切断した各断片をｐＥＴ３２ａベクターに挿入した。これらのプラスミド（ｐＥＴ３２ａ−ＫＫＣ−ＳＣ３４ＥＫ−ＫＣＷ、及びｐＥＴ３２ａ−ＫＮＣ−ＳＣ３４ＥＫ−ＮＣＷ）を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ株を強制発現のため形質転換した。単離されたコロニーを拾い出し、１０ｍＬの５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地中で３０℃で振とうしながら一晩培養した。この培養液を５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培養液（１Ｌ）に移した。ＯＤ６００が３０℃で０．６〜０．８に達した時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによりタンパク質発現を開始させた。その後２５℃で６時間さらに培養を続けた後、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより細胞を回収した。細胞をＢ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ）溶液に懸濁し、ソニケーションにより破砕した。３０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清に０．５ｍＭ ＴＣＥＰを添加してＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移した。カラムを洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸、ｐＨ６．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）で洗浄した。１０〜２００ｍＭイミダゾールを含む０．５ｍＭ ＴＣＥＰ含有リン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いてタンパク質を溶出した。融合タンパク質の発現及び精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％勾配ゲル）を用いて解析した。融合タンパク質の収量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。 First, as a template for PCR amplification, a nucleic acid having a cDNA base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (KKC-SC34EK-KCW) and a nucleic acid having a cDNA base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (KNC-SC34EK-NCW) are used. Chemically synthesized. Each of these has a restriction enzyme recognition site (GGATCC) and (CTCGAG) by BamHI and XhoI. It has been replaced with a codon that is frequently used in E. coli. Each fragment cleaved with BamHI and XhoI was inserted into the pET32a vector. Using these plasmids (pET32a-KKC-SC34EK-KCW and pET32a-KNC-SC34EK-NCW) E. coli BL21 (DE3) -RIL strain was transformed for forced expression. The isolated colony was picked up and cultured overnight in 10 mL of LB medium containing 50 μg / ml ampicillin at 30 ° C. with shaking. This culture solution was transferred to an LB culture solution (1 L) containing 50 μg / ml ampicillin. When OD 600 reached 0.6-0.8 at 30 ° C., protein expression was initiated by adding 1 mM IPTG. Thereafter, the culture was further continued at 25 ° C. for 6 hours, and the cells were collected by centrifugation at 4,000 rpm for 20 minutes. The cells were suspended in B-PER (PIERCE) solution and disrupted by sonication. Centrifugation was performed at 12,000 rpm for 30 minutes, 0.5 mM TCEP was added to the supernatant, and the mixture was transferred to a Ni-NTA agarose column (QIAGEN). The column was washed with wash buffer (20 mM phosphate, pH 6.0, 0.5 M NaCl, 0.5 mM TCEP). Protein was eluted using 0.5 mM TCEP-containing phosphate buffer (pH 6.0) containing 10-200 mM imidazole. The expression and purification of the fusion protein was analyzed using SDS-PAGE (10-20% gradient gel). The yield of the fusion protein was measured using Protein Assay Kit (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA).
（３）修飾された核ペプチドの切り出し
融合タンパク質を、０．５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン［ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ）；入手先ＳＩＧＭＡ、品番Ｃ４７０６］、及び１０ｍＭＣＤＡＰを含む０．１Ｎ酢酸溶液中で３０分間処理することにより、Ｓ−シアノ化した。この処理の間、システイン残基は還元状態に保たれることになる。
(3) Excision of the modified nuclear peptide The fusion protein was extracted with 0.5 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine [tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP); source SIGMA, product number C4706], and S-cyanation was performed by treatment in 0.1N acetic acid solution containing 10 mM CDAP for 30 minutes. During this process, cysteine residues will remain in a reduced state.
得られたＳ−シアノ化融合タンパク質を０．３Ｍ Ｋ２ＣＯ３で３０分間アルカリ処理することにより、両端が環状構造となった状態でＳＣ３４ＥＫを切り出した。ＬＣ−ＭＳにより生成物を解析した。また、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。 The obtained S-cyanated fusion protein was alkali-treated with 0.3M K 2 CO 3 for 30 minutes to cut out SC34EK with both ends in a cyclic structure. The product was analyzed by LC-MS. The product was also purified by preparative HPLC.
切り出されたＳＣ３４ＥＫのＮ末端側は２−イミノチアゾリジン−４−カルボニル基となっている。これに対して、ＳＣ３４ＥＫの両端側にシステインとともにアスパラギンを配置させた場合Ｃ末端側は２−アスパルチミド基となっている。一方、ＳＣ３４ＥＫの両端側にシステインとともにリジンを配置させた場合Ｃ末端側はリジンε−ラクタム環となっている。 The N-terminal side of the cut out SC34EK is a 2-iminothiazolidine-4-carbonyl group. On the other hand, when asparagine is arranged together with cysteine on both ends of SC34EK, the C-terminal side is a 2-aspartimide group. On the other hand, when lysine is arranged together with cysteine at both ends of SC34EK, the C-terminal side is a lysine ε-lactam ring.
収率についてみると、ＳＣ３４ＥＫの両端側にシステインとともにアスパラギンを配置させた場合は修飾されたＳＣ３４ＥＫを２４％得ることができた。ＳＣ３４ＥＫの両端側にシステインとともにリジンを配置させた場合は修飾されたＳＣ３４ＥＫを２１％得ることができた。 As for the yield, when asparagine was placed together with cysteine on both ends of SC34EK, 24% of modified SC34EK could be obtained. When lysine was placed together with cysteine at both ends of SC34EK, 21% of modified SC34EK could be obtained.
（４）修飾された核ペプチドの評価
これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、次に示す通り、（ｉ）抗ＨＩＶ活性、（ｉｉ）物理化学的特性、及び（ｉｉｉ）生物学的安定性をそれぞれ評価した。対照のために、ＳＣ３４ＥＫ、及びＳＣ３４ＥＫの両末端の無修飾体（Ｎ末端無保護、かつＣ末端カルボン酸）についても活性を同様に評価した。
(4) Evaluation of modified nuclear peptides For these modified SC34EK, (i) anti-HIV activity, (ii) physicochemical properties, and (iii) biological stability, respectively, were evaluated as follows: did. For control, the activity was similarly evaluated for SC34EK and the unmodified form of both ends of SC34EK (N-terminal unprotected and C-terminal carboxylic acid).
まず、これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、抗ＨＩＶ活性をそれぞれ評価した。評価は次の通り改良されたＭＡＧＩ ａｓｓａｙにより行った（Ｋｏｄａｍａ，Ｅ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２００１，４５，１５３９−１５４６；Ｍａｅｄａ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．，１９９８，１７７，１２０７−１２１３）。標的細胞（Ｈｅｌａ−ＣＤ４−ＬＴＲ−β−ｇａｌ）１０４ ｃｅｌｌｓ／ウェルを９６ウェルのフラットマイクロタイター培養プレートに播種した。翌日、ＨＩＶ−１クローンＮＬ４−３を６０ＭＡＧＩ Ｕ／ウェル、６０の青い細胞が４８時間後に出現するように播種した。その後、被検体を添加して培養した。４８時間後にＸ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）により染色される細胞数を数えた。被検体の活性は、ＨＩＶ−１の複製を５０％阻止する濃度（ＥＣ５０）で評価した。その結果、表１に示すように、これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫは、ＳＣ３４ＥＫと同等の活性を示すことが明らかになった。環状構造を導入すると活性が損なわれることが予測されたが、この結果はそれに反するものであった。 First, anti-HIV activity was evaluated for each of these modified SC34EK. Evaluation was performed by the improved MAGI assay as follows (Kodama, EI et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2001, 45, 1539-1546; Madea Y. et al., J. Infec. Dis. 1998, 177, 1207-1213). Target cells (Hela-CD4-LTR-β-gal) 104 cells / well were seeded in 96-well flat microtiter culture plates. The next day, HIV-1 clone NL4-3 was seeded so that 60 MAGI U / well, 60 blue cells appeared after 48 hours. Thereafter, the specimen was added and cultured. After 48 hours, the number of cells stained with X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoleyl-β-d-galactopyranoside) was counted. The activity of the analytes was evaluated at a concentration (EC 50 ) that inhibits HIV-1 replication by 50%. As a result, as shown in Table 1, it was revealed that these modified SC34EKs showed the same activity as SC34EK. The introduction of a cyclic structure was expected to impair the activity, but this result was contrary.
また、これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、α−へリックス構造に基づく物理化学的な特徴が損なわれていないかについても検証した。この物理化学的な特徴は、抗ＨＩＶ活性に関連する重要な特徴である。解析は円二色性スペクトルより次の通り行った。ペプチド１０μＭを５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中において３７℃で３０分間処理した。ＣＤスペクトルを円二色性分光光度計（日本分光製Ｊ−７１０）を用いて２５℃で平均８スキャンにて測定した。０．２５分の平衡化の後、１．０秒間のインテグレーションタイムを経てから、０．５℃毎の熱変性を測定した。 In addition, these modified SC34EK were also examined for whether the physicochemical characteristics based on the α-helix structure were not impaired. This physicochemical feature is an important feature associated with anti-HIV activity. The analysis was performed as follows from the circular dichroism spectrum. 10 μM of the peptide was treated in 5 mM HEPES buffer (pH 7.2) at 37 ° C. for 30 minutes. The CD spectrum was measured with an average of 8 scans at 25 ° C. using a circular dichroism spectrophotometer (J-710 manufactured by JASCO Corporation). After equilibration for 0.25 minutes, after a 1.0 second integration time, thermal denaturation was measured every 0.5 ° C.
その結果、図３に示すように、α−へリックス構造に基づく物理化学的な特徴が損なわれていないことが明らかになった。 As a result, as shown in FIG. 3, it became clear that the physicochemical characteristics based on the α-helix structure were not impaired.
さらに、これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、熱安定性が損なわれていないかについても検証した。円二色性スペクトル解析により、熱変性の中間点（融点Ｔｍ）を、［θ］２２２値に基づいて算出した。 Furthermore, these modified SC34EKs were also verified to see whether the thermal stability was impaired. A midpoint of thermal denaturation (melting point Tm) was calculated based on [θ] 222 value by circular dichroism spectrum analysis.
その結果、図４に示すように、熱安定性が損なわれていないことが明らかになった。 As a result, as shown in FIG. 4, it became clear that the thermal stability was not impaired.
最後に、エキソペプチダーゼにより惹き起こされる分解に対する耐性を検証した。マウス血清中にてそれぞれのペプチドを３７℃にて２４時間インキュベートし、その間に経時的にサンプリングしてＲＰ−ＨＰＬＣ解析を行った。その結果、図５に示すように、両端が修飾されていないＳＣ３４ＥＫはすぐに分解してしまうことが明らかになった。また、Ｎ末端側がチアゾリジン環、Ｃ末端側が２−アスパルチミド基となっている修飾されたＳＣ３４ＥＫも徐々に分解することが明らかになった。これに対して、驚くべきことに、Ｎ末端側がチアゾリジン環、Ｃ末端側がリジンε−ラクタム環となっている修飾された骨格ペプチドは生分解耐性が著しく改善されており、両端がアミド化又はアシル化されているＳＣ３４ＥＫと同等の生分解耐性を示すことが明らかになった。この修飾された骨格ペプチドは２４時間インキュベートした後においても安定であった。 Finally, the resistance to degradation caused by exopeptidase was verified. Each peptide was incubated in mouse serum at 37 ° C. for 24 hours, during which time sampling was performed for RP-HPLC analysis. As a result, as shown in FIG. 5, it was revealed that SC34EK that is not modified at both ends is immediately decomposed. It was also revealed that the modified SC34EK having a thiazolidine ring on the N-terminal side and a 2-aspartimide group on the C-terminal side gradually decomposes. On the other hand, surprisingly, a modified backbone peptide having a thiazolidine ring on the N-terminal side and a lysine ε-lactam ring on the C-terminal side has significantly improved biodegradation resistance, and both ends are amidated or acylated. It became clear that biodegradation resistance equivalent to that of the modified SC34EK was exhibited. This modified backbone peptide was stable after 24 hours of incubation.
Claims (10)
（ａ）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
を有するものである、請求項４記載の修飾されたペプチド。 The peptide is
(A) an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3; or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3. The modified peptide according to claim 4, which has a peptide.
（１）次の式：
Ｘ１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ２
（式中、Ａは、システイン残基を含まない請求項１〜５のいずれか記載のペプチドのアミノ酸配列であり、かつ
Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基若しくは任意のアミノ酸配列である）
で表されるペプチド
をＳ−シアノ化する工程；及び
（２）工程（１）により得られるＳ−シアノ化ペプチドをアルカリ処理する工程
を含む方法。 A method for producing the peptide according to claim 1,
(1) The following formula:
X 1 -Cys-A-Lys- Cys-X 2
(In the formula, A is an amino acid sequence of the peptide according to any one of claims 1 to 5 which does not contain a cysteine residue, and X 1 and X 2 are the same or different, and any amino acid residue or any (It is an amino acid sequence)
And (2) a step of subjecting the S-cyanated peptide obtained by the step (1) to an alkali treatment.
前記Ｘ１がアミノ酸配列である場合にはそのアミノ酸配列のＣ末端がアスパラギン残基若しくはリジン残基である、請求項８に記載の方法。 When X 1 is an amino acid residue, the amino acid residue is an asparagine residue or a lysine residue;
The C-terminus of its amino acid sequence when X 1 is an amino acid sequence is an asparagine residue or a lysine residue The method of claim 8.
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