JP5612276B2 - T1r味覚受容体及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
本願は、2001年1月3日提出の米国出願番号 60/259,227、及び2001年4月19日提出の米国出願番号 60/284,547の優先権を主張し、この両出願の全体を、本願明細書中に、引用により取り込む。
本発明は、Gタンパク共役受容体の新規ファミリー、並びにその受容体をコードする遺伝子及びcDNAに関係する。受容体は、主に甘味伝達に関与すると考えられるが、他の味覚におけるシグナル伝達にも関与することができる。
哺乳動物における既知味覚を生じさせる1またはそれ以上の分子または分子の組合せについて、哺乳動物の各nT1Rの定量的刺激を表す値X1〜Xnを定め(ここで、nは2以上である。)、この値から哺乳動物における既知の味覚を生じさせる1またはそれ以上の分子または分子の組合せについて哺乳動物における味覚の定量的表示を作製し、次いで哺乳動物における未知味覚を生じさせる1またはそれ以上の分子または分子の組合せについて、該哺乳動物の各nT1Rの定量的刺激を表す値X1からXnを定め(ここで、nは2以上である。)、この値から哺乳動物における未知味覚感覚を生じる1またはそれ以上の分子または分子の組合せに対する哺乳動物における味知覚の定量的表示を作製し、次いで哺乳動物における未知味覚を生じさせる1またはそれ以上の分子または分子の組合せについての哺乳動物における味覚の定量的表示を、哺乳動物における既知味覚を生じさせる1またはそれ以上の分子または分子の組合せについての哺乳動物における味覚の定量的表示と比較することにより哺乳動物における未知味覚を生じる1またはそれ以上の分子または分子の組合せで発生する哺乳動物における味覚感覚を予測する。
この方法に使用するT1Rは、ここに開示した味覚受容体、またはその断片若しくは変異体を含むことができる。
この様に本発明は、味覚細胞特異Gタンパク共役受容体(「GPCR」)をコードする単離された核酸分子、及びそれらがコードするポリペプチドを提供する。これらの核酸分子及びそれらがコードするポリペプチドは、味覚細胞特異GPCRのT1Rファミリーのメンバーである。味覚細胞特異GPCRのT1Rファミリーのメンバーは、Hoon et al., Cell, 96: 541-551 (1999), WO 00/06592, 及びWO 00/06593のなかで同定されている(ここに、これら文献の全体を引用により本明細書に取り込む)。より具体的には、本発明は、味覚細胞特異GPCRの新規なファミリーをコードする核酸を提供する。これら核酸及びそれらがコードする受容体は、味覚細胞特異GPCRの「T1R」ファミリーと呼ばれる。本発明の特定の態様において、T1Rファミリーのメンバーは、ヒトT1R1,T1R2及びT1R3を含む。上述したように、異なるT1Rの組合せは、おそらく、甘味及び旨味を仲介する。さらに、T1Rファミリーメンバーは、他のT1Rファミリーメンバー、他の味覚細胞特異GPCR、またはそれらの組合せと共同して化学感覚味覚伝達を行なっていると考えられている。例えば、T1R1及びT1R3は、おそらく、同じ味覚受容体細胞種の中で一緒に発現しており、この二つの受容体が物理的に相互作用して異種2量体味覚受容体を形成していると考えられている。また、T1R1及びT1R3はいずれも、独立して同じタイプのリガンドと結合することができ、それらの組み合わせによる結合が、特定の味覚を認知させることができる。
T1Rポリペプチド、その部分、すなわち、細胞外ドメイン、膜貫通領域、またはそれらの組合せ、或いはT1Rファミリーメンバーの1またはそれ以上のドメインを含むキメラタンパク;
T1Rポリペプチド、断片または融合タンパクを発現する卵母細胞または組織培養細胞;
T1Rファミリーメンバーのリン酸化及び脱リン酸化;
GPCRへのGタンパク結合;
リガンド結合検定;
電圧、膜電位及び伝導度の変化;
イオン流出検定;
cGMP、cAMP及びイノシトール三リン酸のような細胞内第2メッセンジャーの変化;
細胞内カルシウムレベルの変化;及び
神経伝達物質の放出;
を使用するリガンド結合検定を含む。
T1Rファミリー共通配列1:(SEQ ID NO: 18)
(TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)E
T1Rファミリー共通配列2:(SEQ ID NO: 19)
(LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)
本発明のT1Rタンパク及びポリペプチドのアミノ酸配列は、コードする核酸配列の理論的翻訳により同定することができる。これら各種アミノ酸配列及びコード核酸配列は、多くの方法によって互いに他の配列と比較することができる。
ここに使用されている以下の用語は特記しない限りその本来の意味を有している。
(1)約25アミノ酸、さらに50-100アミノ酸の枠で、SEQ ID NO:4, 10, 12, 14, 17, または21に対して、少なくとも約35-50%アミノ酸配列同等性、さらに約60,75,80,85,90,95,96,97,98,または99%アミノ酸配列同等性を持つ;
(2)SEQ ID NO:4, 10, 12, 14, 17, 21及びそれらの保存的に修飾された変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む免疫原に対して得られる抗体に特異的に結合する;
(3)SEQ ID NO:1, 2, 3, 9, 11, 13, 15, 16, 20,及びその保存的に修飾された変異体からなる群から選択される配列に厳密なハイブリッド形成条件の下に(少なくとも約100、さらに少なくとも約500-1000ヌクレオチドと)、特異的にハイブリッド形成する核酸分子によってコードされる;
(4)SEQ ID NO:4, 10, 12, 14, 17, 及び21からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約35から50%同一の配列を含む;或いは
(5)SEQ ID NO: 7,8またはそれらの保存的修飾がされた変異体をコードする縮重プライマーセットと同じ配列に厳密な条件下に特異的にハイブリッド形成するプライマーにより増幅される;
多型変異体、対立遺伝子、突然変異、及び種間同族体のことである。
調節物質には、例えば、下記化合物と受容体との相互作用を変化させる化合物が含まれる:
活性化物質または阻害物質を結合させる細胞外タンパク(例えば、エブネリン及び疎水性キャリアーファミリーのその他のメンバー);
Gタンパク;
キナーゼ類(例えば、ロドプシンキナーゼの同族体及び受容体の脱活性化及び脱感受性に必要なベータ交感神経受容体キナーゼ);及び
受容体を脱活性化及び脱感作するアレスチン。
調節物質には、T1Rファミリーメンバーの遺伝子修飾体であって、例えば、改変された作用を持つもの、並びに天然に存在するリガンド及び合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小型化学分子等が含まれる。阻害物質及び活性化物質の検定は、例えば、細胞内または細胞膜でのT1Rファミリーメンバーの発現を含んでおり、推定調節化合物を味覚刺激、例えば、甘味刺激、の存在下または非存在下で適用し、次いで上記のように、味覚伝達における機能効果を測定する。候補活性化物質、阻害物質、または調節物質で処理されたT1Rファミリーメンバーを含む検体または検定を、調節の程度を調べるために、阻害物質、活性化物質、または調節物質を加えない対照検体と比較する。対照検体(調節物質で処理しない)を相対的なT1R活性値100%とする。対照に対する相対的なT1R活性値が約80%、さらに50%または25-0%であれば、T1Rの阻害は達成される。対照に対する相対的なT1R活性値が110%、さらに150%、さらに200-500%、または1000-3000%高いならば、T1Rの活性化は達成される。
本発明のT1Rまたはその断片若しくは変異体の単離及び発現は、下記のように実施することができる。PCRプライマーを、味覚受容体リガンド結合領域をコードする核酸の増幅に使用することができ、更にこれらの核酸のライブラリーを作製することができる。次いで、個々の発現ベクターまたは発現ベクターのライブラリーを、これらの核酸またはライブラリーを機能的に発現するための宿主細胞に、感染または移入させるために使用することができる。これらの遺伝子及びベクターは、インビトロまたはインビボで作製させて発現させることができる。核酸発現を変更または調節するための所望の表現型は、本発明のベクター内の遺伝子及び核酸(例えば、プロモーター、エンハンサーなど)の発現または作用を修飾することにより得られることは、当業者によって理解されるであろう。発現または作用を増加または減少するために記述された既知方法は、いずれも使用することができる。本発明は、科学及び特許文献に記述されている、当業者既知の方法またはプロトコールのいずれも併用して実施することができる。
核酸ハイブリッド形成技術を使用するT1R遺伝子及び遺伝子発現の検出に加えて、T1Rを検出する、例えば、味覚受容体細胞、及びT1Rファミリーメンバーを同定するために、免疫検定を使用することができる。免疫検定はT1Rを定性的にまたは定量的に分析するために使用することができる。適用し得る技術の総説はHarlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)。
T1Rファミリーメンバーと特異的に反応するポリクロナール及びモノクロナール抗体を作製する方法は当業者に既知である(例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane,前出;Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice (2nd ed. 1986); and Kohler & Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)参照)。その技術は、ファージまたはベクター中の組換え抗体のライブラリーから抗体の選別によって調製された抗体、並びにウサギまたはマウスを免疫してポリクロナール及びモノクロナール抗体を調製することを含んでいる(例えば、Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)参照)。
T1Rタンパク、断片、及び変異体は熟知されている多数の免疫学的結合検定のいずれかにより検出及び/または定量することが可能である(例えば、U.S. Patents 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; and 4,837,168を参照)。一般的な免疫検定の総説については、Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology ( Stites & Terr, eds., 7thed. 1991)も参照。免疫学的結合検定(または免疫検定)は典型的に目的のタンパクまたは抗原(この場合にはT1Rファミリーメンバーまたはその抗原配列)に特異的に結合する抗体を使用する。抗体(例えば、抗-T1R)は当業者既知の多数の方法のいずれかにより上記のように作製することができる。
検体中のT1Rポリペプチドを検出する免疫検定は競合か非競合かのいずれかである。非競合免疫検定は抗原の量が直接的に測定される検定である。例えば、一つの望ましい方法である「サンドイッチ」検定では、抗-T1R抗体を固定する固相基質に直接結合することができる。この固定化抗体は次いで検体中に存在するT1Rポリペプチドを捕捉する。こうして固定化されたT1Rポリペプチドは、標識された第二T1R抗体のような標識試薬と結合する。その他には、第二抗体は標識されていないが、逆に第二抗体が由来した動物種の抗体に特異的な標識第三抗体と結合する。第二または第三抗体は典型的に、例えばストレプトアビジンが特異的に結合することができるビオチンのような検出分子で修飾され、検出基を提供する。
競合検定においては、検体中に存在する未知T1Rポリペプチドによって抗-T1R抗体から置換された(追い出された)(外部から)添加した既知T1Rポリペプチドの量を測定して、検体中に存在するT1Rポリペプチドの量を間接的に測定する。一競合検定において、T1Rポリペプチドの既知量を検体に加え、次いで検体をT1Rに特異的に結合する抗体と接触させる。抗体と結合した外部から加えたT1Rポリペプチドの量は検体中に存在するT1Rポリペプチドの濃度と反比例する。特に望ましい態様においては、抗体は固相に固定化されている。抗体に結合したT1Rポリペプチドの量は、T1R/抗体複合体に存在するT1Rポリペプチドの量を測定するか、あるいは複合体形成せずに残っているタンパクの量を測定することにより測定することができる。T1Rポリペプチドの量は標識T1R分子を用意することにより検出することができる。
競合結合方式の免疫検定は、交差反応性分析にも使用することができる。例えば、ここに開示した核酸配列により少なくとも部分的にコードされているタンパクを固相に固定化することができる。固定化抗原に対する抗血清の結合に競合するタンパク(例えば、T1Rポリペプチド及び同族体)を検定に加える。固定化タンパクに対する抗血清の結合に競合する添加タンパクの能力を、ここに開示した核酸配列によってコードされるT1Rポリペプチドの自身との競合能力と比較する。上記タンパクに対する交差反応性を標準的計算式を使用して計算する。上記の添加したタンパクのそれぞれとの交差反応性10%以下の抗血清を選別して、保存する。交差反応性抗体をさらに保存抗血清から考慮タンパク、例えば、関係の薄い同族体、を加えた免疫吸着により除去する。さらに、T1Rファミリーのメンバーであることを同定するために使用される保存モチーフを示すアミノ酸配列を含むペプチドは交差反応性分析に使用することができる。
ウエスタンブロット(イムノブロット)分析は検体中のT1Rポリペプチドの存在を検出及び定量するために使用される。この技術は一般的に、分子量に基づいてゲル電気泳動により検体タンパクを分離し、分離したタンパクを適当な固体支持体(例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または改良ナイロンフィルター)に転移し、そして検体をT1Rポリペプチドと特異的に結合する抗体とインキュベートすることを含んでいる。抗-T1Rポリペプチド抗体は固相上のT1Rポリペプチドに特異的に結合する。この抗体は直接標識することができるし、あるいは次いで抗-T1R抗体に特異的に結合する標識抗体(例えば、標識ヒツジ抗-マウス抗体)を使用して検出する。
免疫検定において非特異的結合を減少させるのは望ましいことであることは当業者は理解しているであろう。特に、検定が固相基質に固定化した抗原または抗体を必要とする場合には、基質への非特異的結合の量を減らすことは望ましいことである。その非特異的結合を減らす方法は当業者には既知である。典型的に、この技術は、タンパク性成分で基質をコーティングすることを含んでいる。特に、ウシ血清アルブミン(BSA)、脱脂粉乳、及びゼラチンのようなタンパク成分は最も望ましい粉乳と共に広く使用されている。
検定に使用される個別の標識または検出基は、この検定に使用する抗体の特異的結合を著しく妨害しない限り、本発明の重要な態様ではない。検出基は検出し得る物理学的または化学的性質を持ついずれかの物質である。そのような検出標識は免疫検定の分野では充分に開発されており、そして一般的に、そのような方法に有用な標識はほとんどどれでも本発明に適用することができる。このように、標識は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出し得るいずれかの成分である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ(例えば、DYNABEADSTM)、蛍光色素(例えば、蛍光イソチオシアネート、テキサス赤、ローダミン、など)、放射標識(例えば、3H,125I,35S,14C,または32P)、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、及びその他一般的にELISAに使用されるもの)、及びコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、など)のような比色分析標識が含まれる。
被検化合物が、インビトロ及びインビボにいずれにおいても本発明の化学感覚受容体に特異的に結合するか否かを決定するための構成と方法を以下に記述する。細胞生理学の多くの局面を本発明のT1Rポリペプチドに対するリガンド結合の影響を評価するために監視することができる。これらの検定は化学感覚受容体を発現する完全細胞において、透過性細胞において、または標準的方法により作製された膜フラクションにおいて実施することができる。
味覚伝達は、本発明のT1Rポリペプチドを使用して、インビトロにおいて溶液または固相反応により試験することができる。特別な態様において、T1Rリガンド結合ドメインをインビトロにおいてリガンド結合を検定するための溶液または固相反応に使用することができる。
その他の態様において、蛍光偏光(「FP」)に基づく検定をリガンド結合を検出及び監視するために使用することができる。蛍光偏光は結合平衡、核酸ハイブリッド形成、及び酵素活性を測定するための多様な実験技術の一つである。蛍光偏光は、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、沈殿、または電気泳動のような分離ステップを必要としない均質系である。この検定は溶液中でリアルタイムに直接行われ、固相を必要としない。偏光の測定は迅速でありそして検体を分解しないので、偏光値は試薬の添加後繰り返し測定することができる。一般的に、この技術はピコモルからマイクロモルの低レベルの蛍光発色団の偏光値を測定するために使用することができる。このセクションでは、本発明のT1Rポリペプチドに対するリガンドの結合を測定する簡単でしかも定量的な方法に蛍光偏光がどのように使用されか記述する。
式中Πは励起光面に平行な放射光の強さ、及びInt⊥は励起光面に直交する放射光の強さである。P、光の強さの比、は次元のない数値である。例えば、BeaconTM及びBeacon 2000TMシステムをこの検定に関して使用することができる。このシステムは典型的にミリ偏光単位(1偏光単位=1000 mP単位)で偏光を示す。
さらに他の態様において、本発明はT1Rポリペプチド;またはT1Rポリペプチドを発現する細胞または組織を使用する溶液検定を提供する。他の態様において、本発明は高速処理方式の固相インビトロ検定を提供する、この方式ではT1Rポリペプチド、またはT1Rポリぺプチドを発現する細胞または組織が固相基質に接着している。
T1Rポリペプチドを調節する化合物のその他の検定にはコンピュータ支援化合物設計が含まれ、その方法ではアミノ酸配列により規定される構造情報に基づいてT1Rポリペプチドの3次元構造を作製するためにコンピューターシステムを使用する。入力したアミノ酸配列はコンピュータープログラム中に予め確立したアルゴリズムで直接活発に処理され、タンパクの2次、3次及び4次構造モデルを生じる。次いでこのタンパクの構造モデルを、例えば、リガンドと結合する能力を有する構造の領域との相同性を調べる。この領域を次いでタンパクに結合するリガンドを同定するために使用する。
一態様において、T1Rタンパクまたはポリペプチドは、分泌経路を介して成熟及びターゲティングを促進する異種シャペロン配列として、真核細胞中に発現する。そのキメラT1RポリペプチドはHEK-293のような真核細胞のいずれにも発現し得る。望ましくは、細胞は、キメラ受容体が細胞内シグナル伝達経路またはホスフォリパーゼCのようなシグナル伝達タンパクと共役することができる機能的Gタンパク、例えば、Gα15、を含んでいる。そのような細胞内におけるそのキメラ受容体の活性化は標準的方法のいずれかを使用して検出することができる、例えば、細胞内におけるFURA-2を検出することにより細胞内カルシウムの変化を検出する。
本発明の1またはそれ以上の化学感覚受容体配列を発現する非ヒト動物も受容体検定に使用することができる。その発現を、化学感覚受容体またはそのリガンド結合領域をコードする核酸を安定的にまたは一過性に遺伝子導入した非ヒト動物を被検化合物と接触させ、そして受容体ポリペプチドに特異的に結合することにより被検化合物に動物が反応するか否かを調べることにより、インビボにおいて被検化合物が哺乳動物味覚膜貫通受容体ポリペプチドに特異的に結合するか否かを調べるために使用することができる。
T1Rファミリーメンバーの調節化合物として試験される化合物は、小化合物またはタンパク、糖、核酸または脂質のような生物学的実体であり得る。その他、調節物質はT1R遺伝子の遺伝子を改変したものであり得る。典型的に被検化合物は小化学分子及びタンパクであろう。ほとんどの化合物は水に溶解することができ、あるいは有機溶液(特にDMSO)が使用されるが、本質的に全ての化合物を本発明の検定において潜在的な調節物質またはリガンドとして使用し得る。検定は検定操作を自動化することにより大きな化学ライブラリーをスクリーニングするように設計され、典型的に平行して実施する(例えば、ロボット検定におけるマイクロタイタープレートを上で行なう方式の)検定に適した資源の化合物を準備する。Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO),Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland)などを含めて多くの化合物供給業者が存在することは承知しているであろう。
本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物における味の感覚を表現する方法及び/または味の感覚を予測する方法を提供する。望ましくは、その方法はここに開示した受容体及び該T1Rポリペプチドをコードする遺伝子を使用することにより実施される。
T1R遺伝子及びその同族体は、化学感覚受容体細胞の同定、法医学および父子確認、及び味覚伝達試験のために有用な道具である。T1Rプローブ及びプライマーのようなT1Rと特異的にハイブリッド形成するT1Rファミリーメンバー特異的試薬、及びT1Rポリペプチドに特異的に結合するT1R特異的試薬、例えば、T1R抗体は味覚細胞発現及び味覚伝達調節を調べるために使用される。
hT1R3ゲノムDNAは、太字で示される推定コード配列(cds)を持つSEQ ID NO 1及びSEQ ID NO 2として以下示す。5'及び3'コンティグの間の空白は、点線(………)として示した。hT1R3推定cdsは、SEQ ID NO 3に記述されている。最後に、望ましい、推定hT1R3アミノ酸配列は、アミノ酸に対する一文字コードを使用して、SEQ ID NO 4として与えられている。
ラット及びマウスT1R3遺伝子の部分は、ヒトT1R3配列に基づく縮重プライマーを使用してPCR増幅によりゲノムDNAから単離した。縮重プライマーSAP077(5'-CGNTTYYTNGCNTGGGGNGARCC-3'; SEQ ID NO 5)及びSAP079 (5'-CGNGCNCGRTTRTARCANCCNGG-3'; SEQ ID NO 6)は、ヒトT1R3残基RFLAWGEPA (SEQ ID NO 7に対応)及びPGCYNRAR (SEQ ID NO 8に対応)に対してそれぞれ相補性であった。PCR産物はクローン化し、配列分析した。プラスミドSAV115は、マウスT1R3遺伝子のクローン化部分を持ち、SAV118は、ラットT1R3遺伝子のクローン化部分を持っていた。マウスのクローン化部分は、対応するヒトT1R3の部分と74%相同であり、ラットのクローン化部分は、対応するヒトT1R3の部分と80%相同であるので、以下に示すこれらの配列は、ヒトT1R3に相当する受容体のげっ歯類遺伝子を明らかに示している。マウスとラットの部分は、88%相同である。データベース配列でこれらのT1R3配列と40%以上の相同性を持つものはなかった。
上記SEQ ID NO 9及び11として同定されたmT1R3及びrT1R3遺伝子の断片を、ラット味覚組織由来cDNAライブラリーをスクリーニングするために使用した。一つの陽性クローンを配列分析し、下記にSEQ ID NO 13として示す全長rT1R3を含むことが判明した。mT1R3及びrT1R3部分配列及び全長hT1R3配列との配列比較によりこのcDNAはhT1R3のラット同族体であることが確認された。例えば、rT1R3及びhT1R3間のアミノ酸同一性は約72%であり、一方公共DNA配列データバンク中でもっとも関係があるとされた配列はrT1R3に対してわずかに約33%同一であった。
SAV115に含まれる上記マウスT1R3断片をM13前進及びM13逆プライマーを使用してPCR増幅し、次いでゲル精製した。T1R3 DNA鋳型をジゴキシゲニン標識UTPがアンチセンスcRNAプローブ中に組込まれる、インビトロ転写標識反応にかけた。このプローブで輪郭乳頭を含む成長マウス味覚組織とハイブリッド形成した。T1R3インザイツハイブリッド形成及び検出はSchaeren-Wiemers et al., Histochemistry, 100: 431-400 (1993)のプロトコールに従って実施した。簡単に記すと、新鮮凍結マウス舌を14μmに細切し、ハイブリッド形成用に調製した。アンチセンスジゴキシゲニンT1R3プローブの200 ng/mLと14時間72℃でハイブリッド形成処理した。ハイブリッド形成処理後72℃で0.2xSSC洗浄した。ジゴキシゲニン検出は抗-DIGアルカリ性ホスファターゼ抗体の1:5000希釈で培養し次いでNBT/BCIP中でホスファターゼ反応を12時間行なうことにより実施した。
ラット味覚受容体、rT1R1と命名、のヒトオルソログ(データベース登録番号AL159177)をSEQ ID NO 15として下記に示す。推定cdsを太字で示し、一部のイントロン配列間隔をNの連続として示す。ヌクレオチド及び理論的翻訳hT1R1配列もSEQ ID NO 16及び17としてそれぞれここに記述する。
ラット味覚受容体、rT1R2と命名、のヒトオルソログの推定cdsをSEQ ID NO 23として下記に示す。理論的に翻訳したhT1R2配列もここにSEQ ID NO 21としてここに記述する。本発明に従って、hT1R2の最初の2個のコードエクソンはサザンブロットによりPAC内に同定された。エクソン1はBamHI/BgIII断片内に単離され、サザン実験で同定され、そしてエクソン2はエクソン1からエクソン3にわたるPCR産物内に単離された。2個のコードエクソンをrT1R2配列と比較して、この2個のエクソンはrT1R2のヒト対応遺伝子のN-末端をコードすることを確認した。例えば、2個のエクソンによりコードされているhT1R2 N-末端配列及びrT1R2の対応する領域間のアミノ酸同一性は約72%であり、一方公共DNA配列データベース中の最も関連するとされる配列はhT1R2に対してわずか約48%の同一性であった。
異種細胞におけるT1Rの異種発現の方法
Gα15を安定的に発現するHEK-293誘導体(Chandrashekar et al., Cell 100(6): 703-11 (2000))を増殖し、そして10% FBS, MEM非必須アミノ酸(Gibco BRL),及び3μg/mlブラスチシジンを添加したダルベッコ改良イーグル培地(DMEM, Gibco BRL)中37℃に維持した。カルシウム画像実験の場合には、最初24ウエル組織培養プレート上に接種し(約ウエル当たり10万細胞)、Mirus Transit-293 (PanVera)でのリポフェクションによりトランスフェクションした。グルタミン酸誘導及びグルコース誘導脱感作を最小限にするために、トランスフェクション後約24時間添加DMEMを低グルコースDMEM/GlutaMAX(Gibco BRL)に置換した。24時間後、ダルベッコPBS緩衝液(DPBS, GibcoBRL)中細胞にカルシウム色素Fluo-4(Molecular Probes)3μMを室温で1.5時間負荷した。250μl DPBSで置換し、味覚刺激を添加した200μl DPBSを室温で加えることにより刺激を行なった。カルシウム移動をImaging Workbench 4.0ソフトウエア(Axon)を使用してAxiovert S100 TV顕微鏡(Zeiss)で監視した。T1R1/T1R3及びT1R2/T1R3は極めて一過性に反応し−カルシウム増加は15秒以上は持続しなかった−そして非同期性であった。多数の反応細胞は経時的に比較的一定していた;したがって、細胞反応は一定時間において、典型的には刺激を加えた後30秒で反応細胞の数を数えて定量化した。
甘味味覚受容体としてのヒトT1R2/T1R3
Gα15を安定的に発現するHEK細胞を一過性にヒトT1R2、T1R3及びT1R2/T1R3でトランスフェクションし、そして増加するスクロースの濃度に反応する細胞内カルシウムの増加を検定した(図1A)。また、T1R2/T1R3用量反応をいくつかの甘味刺激について測定した(図1B)。反応細胞の最大パーセントは異なる甘味剤に対して異なり、10−30%の範囲であった。明瞭にするために、用量反応は反応細胞の最大パーセントに対して正規化した。図1の値は4独立試験の平均±s.e.を示す。X軸の丸印は味覚検査により測定された精神生理学的検出閾値である。グルマリン(10g/l Gymnema sylvestre水抽出液濾液の50−全希釈)は250 mMスクロースに対するT1R2/T1R3の反応を阻害したが、20μMイソプロテレノールに対する内在性β2−交感神経受容体の反応は阻害しなかった(図1B)。図1Cは異なる甘味剤(スクロース、アスパルテーム、トリプトファン及びサッカリン)に対するT1R2/T1R3共発現細胞系の正規化した反応を含む。
ラットT1R2/T1R3も甘味味覚受容体として機能する
Gα15を安定的に発現するHEK細胞をhT1R2/hT1R3,rT1R2/rT1R3,hT1R2/rT1R3,及びrT1R2/hT1R3で一過性にトランスフェクションした。これらの遺伝子導入細胞を350 mMスクロース、25 mMトリプトファン、15 mMアスパルテーム、及びモネリンの0.05に対する細胞内カルシウムの増加を検定した。スクロース及びアスパルテームの結果は図2に含まれており、そしてrT1R2/rT1R3も甘味味覚受容体として機能することを示している。また、これらの結果はT1R2がT1R2/T1R3リガンド特異性を支配していることを示唆している。
ヒトT1R1/T1R3は旨味味覚受容体として機能する
Gα15を安定的に発現するHEK細胞をT1R1,T1R3及びT1R1/T1R3で一過性にトランスフェクションし、増加する濃度のグルタメート(図3A及び0.5mMグルタメート)、0.2mM IMP、及び0.5mMグルタメートプラス0.2mM IMP(図3B)に反応して増加する細胞内カルシウムを検定した。ヒトT1R1/T1R3用量反応を0.2mM IMPの存在下及び非存在下にグルタメートに対して測定した(図3C)。反応細胞の最大パーセントはグルタメートに対して約5%そしてグルタメートプラスIMPに対しては約10%であった。明瞭にするために、用量反応は反応細胞の最大パーセントに対して正規化した。値は4独立試験の平均±s.e.を示す。X軸の丸印は味覚検査により測定された検出閾値である。
エクスポート配列としてのPDZIP
6残基PDZIP配列(SVSTVV(SEQ ID NO: 22))をhT1R2のC-末端に融合した、そしてこのキメラ受容体(すなわち、hT1R2-PDZIP)をHEK-293宿主細胞に遺伝子導入した。次いでhT1R2の表面発現を免疫蛍光及びFACSスキャンニングデータを使用して監視した。図6A及び6Bに示すように、PDZIP配列の導入によりhT1R2-PDZIPの表面発現はhT1R2に比較して増加した。
PKZIP配列
SVSTVV(SEQ ID NO: 22)
T1R1/T1R3またはT1R2/T1R3を安定的に共発現する細胞系の作製
ヒトT1R2/T1R3またはヒトT1R1/T1R3を安定的に共発現するヒト細胞系はそれぞれhT1R1またはhT1R2発現構築(T1R1に対するプラスミドSAV2485、T1R2に対するSAV2486)及びhT1R3(T1R3に対するプラスミドSXV550)を含むpCDNA 3.1/ZEO由来(Invitrogen)ベクターを含む線状化PEAK 10由来(Edge Biosystems)ベクターをGα15発現細胞系にトランスフェクションすることによって作製した。特に、T1R2/T1R3安定細胞系はGα15を安定的に発現するAurora BioscienceのHEK-293細胞系に線状化SAV2486及びSXV550を共トランスフェクションして作製した。T1R1/T1R3安定細胞系はGα15を安定的に発現するHEK-293細胞系に線状化SAV2485及びSXV550を共トランスフェクションして作製した。SAV2485/SCV550及び SAV2486/SXV550のトランスフェクションに続いて、ピューロマイシン耐性及びゼオシン耐性のコロニーを選別し、増殖し、そしてカルシウム画像により甘味または旨味味覚刺激に対する反応を試験した。細胞を0.0005 mg/mlピューロマイシン(CALBIOCHEM)及び0.1 mg/mlゼオシン(Invitrogen)でGlutaMAX、10%透析FBS、及び0.003 mg/mlブラスチシジンを添加した低グルコースDMEM中37℃で選別した。耐性コロニーを増殖し、甘味味覚刺激に対する反応を蛍光顕微鏡により評価した。VIPR-II装置(Aurora Biosciences)による自動化蛍光画像用に、T1R2/T1R3安定細胞を最初96ウエルプレート上に接種した(ウエル当たり約15,000細胞)。24時間後、細胞にPBS中室温1時間0.005 mMのカルシウム色素fluo-3-AM (Molecular Probes)を負荷した。70 ml PBSで置換した後、味覚刺激を添加した70 ml PBSを室温で加えることにより刺激を行なった。化合物添加後20から30秒の蛍光(480 nm励起及び535 nm発光)反応を平均し、化合物添加前に測定したバックグランド蛍光で補正し、そして0.001 mMイオノマイシン(CALBIOCHEM)、カルシウムイオノフォア、の反応に対して正規化した。
Claims (18)
- SEQ ID NO: 21の完全ヒトT1R2ポリペプチドに対して少なくとも95%の配列同一性(sequence identity)を持つヒトT1R2ポリペプチド配列を含み、甘味受容体を構成することができる、単離ポリペプチド。
- 前記ヒトT1R2ポリペプチド配列が、SEQ ID NO: 21の完全ヒトT1R2ポリペプチド配列に対して少なくとも96%の配列同一性を持つ、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ヒトT1R2ポリペプチド配列が、SEQ ID NO: 21の完全ヒトT1R2ポリペプチド配列に対して少なくとも97%の配列同一性を持つ、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ヒトT1R2ポリペプチド配列が、SEQ ID NO: 21の完全ヒトT1R2ポリペプチド配列に対して少なくとも98%の配列同一性を持つ、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ヒトT1R2ポリペプチド配列が、SEQ ID NO: 21の完全ヒトT1R2ポリペプチド配列に対して少なくとも99%の配列同一性を持つ、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ヒトT1R2ポリペプチド配列が、SEQ ID NO: 21の完全ヒトT1R2ポリペプチド配列に対して少なくとも100%の配列同一性を持つ、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 検出可能な標識に結合している、請求項1から6の何れか1項に記載の単離ポリペプチド。
- 請求項1から7の何れか1項に記載の単離ポリペプチドをコードする核酸。
- 検出標識をコードする配列をさらに含む、請求項8に記載の核酸。
- 前記検出標識が、酵素又は緑色蛍光ペプチドである、請求項9に記載の核酸。
- 請求項8、9又は10に記載の核酸を含む、ベクター。
- プラスミドである、請求項11に記載のベクター。
- 請求項10、11又は12に記載の核酸又はベクターを含む、組換え細胞。
- 細菌、酵母、哺乳動物、昆虫又はアフリカツメガエルの細胞である、請求項13に記載の組換え細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項14に記載の組換え細胞。
- HEK、CHO、COS及びBHK細胞からなる群から選択される、請求項15に記載の組換え細胞。
- Gタンパクも発現する請求項13から16の何れか1項に記載の組換え細胞。
- 前記Gタンパクが、Galpha15又はGalpha16である、請求項17に記載の組換え細胞。
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