JP5603823B2 - 抗原性が低下したポリマー結合体、その調製方法および使用方法 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、蛋白質生化学、薬学および医学の分野における発明である。特に、本発明は、水溶性のポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）、およびその誘導体）と生物活性成分との結合体であって、標準的なポリマー性生物活性成分の結合体と比較して、抗原性および免疫原性が低下している結合体を製造するための方法を提供する。また、本発明は、該方法によって作製された結合体、該結合体を含む組成物、該結合体および組成物を含むキット、および、さまざまな医学的および獣医学的症状の予防、診断、および治療における該結合体および組成物の使用法も提供する。

（関連技術）
循環血における半減期が通常短いこと、ならびに抗原性および免疫原性を持つ可能性があるという２つの要素によって、組換え蛋白質を治療薬として開発することが妨げられてきた。本明細書において、また、通常、当技術分野において、「抗原性」という表現は、ある分子が既存の抗体に結合しうることを意味し、一方、「免疫原性」という表現は、インビボにおいて免疫応答を誘導できることを意味し、その応答は、抗体の形成を含むもの（「液性応答」）でも、細胞性免疫応答の促進であってもよい。組換え治療用蛋白質を投与するには、循環血での活性を最大にし、生体内利用率および分解に関する問題を最小に抑えるために静脈内（ｉ．ｖ．）投与がしばしば望ましい。しかし、ｉ．ｖ．投与後の小さな蛋白質の半減期は通常非常に短い（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ８：１３５１−１３５９；Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １２：１４６６−１４６９）を参照。健康な腎臓は、一般的に、ストークス半径およそ３６Åで、分子量はおよそ６６，０００ダルトン（６６ｋＤａ）である血清アルブミンの半径を上回る流体力学的半径を有する蛋白質を血流中に保持している。しかし、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）やリボヌクレアーゼなど、より小さな蛋白質は、糸球体にろ過されて速やかに血流から除去される（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｂ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｍ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３４：Ｆ４５５−Ｆ４６０；Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ４３：３３７−３４７；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．（１９７９）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７４：４９５−５０９）。その結果、ｉ．ｖ．投与後に小さな組換え蛋白質を血流中において治療上有効な濃度で維持するには問題が多い。したがって、このような蛋白質はより高い濃度でより高い頻度で注射して投与しなければならない。用量率が高くなると治療費用がかさみ、患者の服薬遵守の可能性が低くなり、また、有害な副作用すなわち免疫応答が起こる可能性が高くなる。細胞性免疫応答も液性免疫応答も、注射された組換え蛋白質の循環濃度を下げて有効投与量となることを妨げるか、アナフィラキシーなどの治療を制約する結果に至ることがある（Ｐｕｉ，Ｃ．−Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９：６９７−７０４）。

皮下（ｓ．ｃ．）注射または筋内（ｉ．ｍ．）注射など別の投与経路であれば、より緩やかに組換え蛋白質を循環血に放出することによって、これらの問題のいくつかを克服できる。しかし、生体内利用率が極めて低くなる可能性があり、そのため薬剤の有効循環濃度を達成することが困難になる。ｓ．ｃ．またはｉ．ｍ．によって投与された薬剤の生体内利用率が低いことに関連する更なる問題として、注射部位において、治療用蛋白質が分解される可能性が高くなることがある。

ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）の誘導体が共有結合することによる組換え蛋白質の修飾が、上記の短所を解決するための手段として広範に研究されてきた（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．１５５−１６９；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｓ ５４：４５９−４７６）。ＰＥＧ誘導体の蛋白質への結合は、蛋白質を安定化させ、その生体内利用率を向上させ、および／または、インビボでの免疫原性を低下させることが分かっている。（ＰＥＧ誘導体が蛋白質またはその他の基質に共有結合することを、本明細書では、当技術分野においても知られているように「ＰＥＧ化」と呼ぶ。）また、ＰＥＧ化は、蛋白質の流体力学的半径を顕著に増加させることができる。サイトカインやポリペプチドホルモンのような小さな蛋白質を一本鎖の長いＰＥＧ（例えば分子量約１８ｋＤａ以上）に結合させると、得られる結合体は、血清アルブミンの流体力学的半径よりも大きな流体力学的半径をもち、腎糸球体によるクリアランスが大幅に遅延される。ＰＥＧ化の複合効果（蛋白質分解を低下させ、免疫認識を低下させ、また、腎クリアランス率を低下させる）は、ＰＥＧ化蛋白質に治療薬剤としての実質的な長所を付与する。

１９７０年代以来、ポリマーの共有結合を用いて、医薬品に用いるさまざまな蛋白質の安全性と有効性を向上させようとする試みが行われてきた（例えば米国特許第４，１７９，３３７号を参照）。ＰＥＧまたはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）をアデノシンデアミナーセ（ＥＣ ３．５．４．４）に結合させて、重度の免疫不全症の治療に用いるなどの例がある（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４６：６４９−６５２；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３１６：５８９−５９６）。別の例として、ＰＥＧをスーパーオキシド・ディスムターゼ（ＥＣ １．１５．１．１）に結合させて炎症症状を治療し（Ｓａｉｆｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，００６，３３３号および第５，０８０，８９１号）、尿酸酸化酵素（ＥＣ １．７．３．３）に結合させて、血液および尿から過剰な尿酸を除去する（Ｉｎａｄａ，Ｙ．，特許出願第５５−０９９１８９号；Ｋｅｌｌｙ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １２：１００１−１００９；米国特許第６，５７６，２３５号に対応するＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開ＷＯ ００／０７６２９Ａ３；Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開ＷＯ ０１／５９０７８ Ａ２）。

ＰＥＯおよびＰＥＧは、共有結合したエチレンオキシド単位から構成されるポリマーである。これらのポリマーは、以下の一般構造をもつ。

Ｒ_１−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−Ｒ_２
ここで、Ｒ_２は、ヒドロキシル基（またはその反応性誘導基）であり得、Ｒ_１は、「ＰＥＧジオール」における場合と同様に水素、モノメトキシＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）の場合と同様にメチル基、または、例えばイソ−プロポキシＰＥＧまたはｔ−ブトキシＰＥＧおけると同様に別の低級アルキル基であり得る。このＰＥＧの一般構造式におけるパラメータｎは、ポリマーにおけるエチレンオキシド単位の数を示し、本明細書および当技術分野において「重合度」と呼ばれている。ＰＥＯおよびＰＥＧは、直鎖状、分枝状（Ｆｕｋｅ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ３０：２７−３４）または星状（Ｍｅｒｒｉｌｌ，Ｅ．Ｗ．（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ ５：１−１１）でありうる。ＰＥＯおよびＰＥＧは、両親媒性、すなわち水に可溶であり、かつ一定の有機溶媒にも可溶であって、エンベロープウイルス、および動物や細菌の細胞膜などの脂質含有物質に接着することができる。一定のランダム型またはブロック型または交互型のエチレンオキシド（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）とプロピレンのコポリマーであって、以下の構造：

を有するものは、ＰＥＧに十分類似した性質を有するため、一定の応用場面においてＰＥＧの代わりとして適していると考えられている（例えば米国特許第４，６０９，５４６号および第５，２８３，３１７号を参照）。ここで「ポリアルキレンオキシド」という語および「ＰＡＯ」という略語は、ＰＥＧまたはＰＥＯおよびポリ（オキシエチレン−オキシメチレン）のコポリマー（米国特許第５，４７６，６５３号）などのコポリマーを意味する。ここで、「ポリアルキレングリコール」という語および「ＰＡＧ」という略語は、本発明に係る結合体、特にＰＥＧ、より具体的には、単一の反応基を含むＰＥＧ（「単官能性活性化ＰＥＧ」）において使用するのに適したポリマーを包括的に意味する。

一般的に、例えば、約５ｋＤａから約１０ｋＤａの分子量を有する１種類以上のｍＰＥＧなど、１種類以上のＰＡＧの何本か（例えば５本から１０本）の鎖を、アミノ基（リジン残基のイプシロンアミノ基、およびＮ−末端アミノ酸のアルファアミノ基）を介して標的蛋白質に結合させる。最近になって、例えば１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、または３０ｋＤａなど、より大きな分子量の一本鎖ｍＰＥＧを含む結合体が合成されている。結合体の血漿中における半減期と、分子量の増加および／または結合されるＰＥＧの鎖の数との間に直接的な相互関係があることが明らかになっている（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２１９６９−２１９７７）。他方、ＰＥＧの鎖の数が増加するにつれて、（特に、生物活性成分が蛋白質の場合）生物活性成分の必須領域におけるアミノ基が修飾されて、その生物学的機能（例、酵素による触媒、またはサイトカインによるレセプター結合）を損なう可能性が高まる。多数のアミノ酸基を含む、より大きな蛋白質、および、低分子量の基質をもつ酵素にとって、作用持続時間の増加と特異的活性の低下との間のこのトレードオフは、ＰＥＧ含有結合体の生物活性の正味量をインビボで増加させるため許容できるものである。しかし、ポリペプチドホルモンやサイトカインなどの小さな蛋白質にとっては、比較的高いレベルの置換を行う場合、機能活性の低下が、血流中での半減期の延長による利益を打ち消す程度に至る可能性が高い（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，前掲）。

本願発明者の特定の者は、さまざまなＰＥＧ化法を開拓しており、それらをいくつかの蛋白質に適用して、インビボで好適な薬物動態学と高い有効性との望ましい組み合わせを得ている。これらの蛋白質には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）（Ｓａｉｆｅｒ，Ｍ．Ｇ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｏｌｙｍ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ３８：５７６−５７７；Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）前掲）、および組換え哺乳動物ウリカーゼ（ＰＣＴ国際公開ＷＯ ００／０７６２９およびＷＯ ０１／５９０７８；Ｋｅｌｌｙ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，前掲；米国特許第６，５７６，２３５号を参照）などが含まれる。ＧＭ−ＣＳＦをサイトカインモデルとして用いて、本願発明者の特定の者が、インビボにおいて組換えマウスＧＭ−ＣＳＦの有効性を劇的に促進させるには、高分子量（約３６ｋＤａ）のｍＰＥＧの一本鎖または二本鎖を結合させれば十分であることを実証した（Ｓａｉｆｅｒ，Ｍ．Ｇ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）前掲；Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）前掲）。

組換え哺乳動物尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）を修飾して、難治性痛風の治療となる可能性について検討する実験が行われた（米国特許第６，５７６，２３５号に対応するＰＣＴ国際公開ＷＯ ００／０７６２９、およびＷＯ ０１／５９０７８を参照。これらは、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。ＰＥＧ−ウリカーゼを用いて、深刻な尿酸腎症を示すウリカーゼ欠損マウス（ｕｏｘ −／−）を治療する場合、忍容性が良好で、効果的であり、また、実質的に非免疫原性であった。顕微磁気共鳴画像（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）によって示されたように、治療されたマウスは、治療が続く期間中（１０週間）腎機能の改善を示し、未治療のｕｏｘ −／−マウスよりも尿酸関連の腎障害が実質的に少なかった（Ｋｅｌｌｙ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）前掲）。

ＰＡＧまたはポリペプチド分子の鎖への共有結合については、Ｄａｖｉｓ，Ｆ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第４，１７９，３３７号、およびＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８１）ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３６７−３８３に開示されている。これらの参考文献は、ｍＰＥＧによって修飾された酵素およびその他の蛋白質は、対応する非修飾蛋白質に比べ、免疫原性および抗原性が低く、血流中での半減期が短いことを開示する。これら化学修飾された結合体にもたらされる有益な特性は、さまざまな治療への応用において非常に有益である。

蛋白質へのＰＥＧまたはポリアルキレンオキシドの共有結合を生じさせるためには、まず、ポリマーのヒドロキシル末端基の少なくとも一方を反応性官能基に変換しなければならない。この処理は、しばしば「活性化」と呼ばれ、その産物は「活性化ＰＥＧ」または活性化ポリアルキレンと呼ばれる。一方の末端を非反応性で化学的に安定なメチルエーテル（「メトキシル基」）によって、他方を、蛋白質分子上のアミノ基に対して反応性の官能基によってキャップされたモノメトキシＰＥＧが、このような方法でもっとも広く用いられている。いわゆる「分枝型」ｍＰＥＧであって、活性化された単一の官能基から離れたところに２個以上のメトキシル基を含むものは、一般的には使用されない。一例としてはジ−ｍＰＥＧ−リジンがあるが、そこでは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによって、リジンのカルボキシル基がもっとも頻繁に活性化される（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，９３２，４６２号）。

活性化されたポリマーは、結合部位として使用される求核性官能基をもつ治療薬剤と反応させられる。結合部位として一般的に用いられる求核性官能基の一つは、リジンのイプシロンアミノ基である。遊離のカルボン酸基、適切に活性化されたカルボニル基、酸化された糖質部分、およびチオール基も結合部位として使用される。

ｍＰＥＧのヒドロキシル基を塩化シアヌルで活性化し、得られた化合物を蛋白質と共役させた（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２５２：３５８２−３５８６；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８１）前掲）。しかし、塩化シアヌルの毒性、および機能に必須な溶媒接触可能なシステインまたはチロシン残基のように、アミン以外の官能基をもつ蛋白質に対する非特異的反応性など、この方法の使用には不利な点もある。

これらの短所およびその他の短所を克服するために、ｍＰＥＧのコハク酸スクシンイミジル誘導体（「ＳＳ−ＰＥＧ」）など、別の活性化ＰＥＧが導入されている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ７：１７５−１８６）。穏やかな条件下で、ＳＳ−ＰＥＧは、蛋白質と速やかに（３０分以内）反応して、活性があって、さらに広範に修飾された結合体が得られる。

Ｍ．Ｓａｉｆｅｒらは、米国特許第５，４６８，４７８号において、ポリアルキレン・グリコシル−モノ−Ｎ−スクシンイミジル・カルボン酸、およびそれから生成される結合体を開示している。Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙは、米国特許第５，６１２，４６０号において、ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミジル・カルボン酸の調製法を開示している。この型のポリマー（「ＳＣ−ＰＥＧ」）は、蛋白質のアミノ基や、低分子量のペプチドおよび遊離アミノ基を含む他の物質のアミノ基と容易に反応してウレタン結合を形成する。

別のＰＥＧ−カルボン酸誘導体からできる、蛋白質のアミノ基とＰＥＧとの間のウレタン（またはカルバミン酸）結合も、当技術分野において知られている（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １３１：２５−３３；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：１４１−１５２）。反応性ｍＰＥＧの中間体、および、特に、アミド結合、エステル結合、第２級アミン、およびチオエステル結合を介して結合されている生物活性成分のＰＥＧ結合体を合成するためにそれらを利用する方法も、当技術分野において知られている。

Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉら（（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７８８：２４８−２５５）は、塩化シアヌルによって活性化されていたｍＰＥＧに免疫グロブリンＧ（「ＩｇＧ」）を共有結合した。彼らは、抗原結合活性および分子構造、サイズ排除クロマトグラフィーにおける挙動、表面活性、界面凝集性、ならびにＰＥＧ−ＩｇＧ結合体による補体の非特異的活性化を誘発する熱凝集性などの生物学的および物理化学的な性質を調べた。ＰＥＧをＩｇＧに結合させると、ＩｇＧの構造的な変性は見られなかったが、ストークス半径が外見上大きくなり、ＩｇＧ、および熱および／または界面への曝露に対して安定化されたＩｇＧの表面活性を高めた。非特異的な凝集性が抑制されたのは、主に、ＰＥＧ化されたＩｇＧ分子間の会合が立体構造的に阻害されるためである。これらの結果は、静脈注射用製剤としてのｍＰＥＧ結合ＩｇＧの有用性を示しており、また、ＰＥＧが、修飾されたＩｇＧを静脈で用いるために安定化させるための添加剤としても有用であることが示唆された。

Ｋ．Ａ．Ｓｈａｒｐら（（１９８６）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １５４：１１０−１１７）は、細胞表面抗原に基づいて、水二相ポリマー系（ａｑｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）において細胞を分離するための生物特異的なアフィニティーリガンドを生成できるかを調べた。ウサギ抗ヒト赤血球ＩｇＧを、分子量約０．２、１．９および５ｋＤａの塩化シアヌル活性化ｍＰＥＧと、ＰＥＧ対蛋白質上のリジン基のさまざまなモル比で反応させた。デキストランとＰＥＧを含む二相系における蛋白質の分配係数は、修飾の程度が高まるとともに、また、ｍＰＥＧの分子量が高いほど増加した。ヒト赤血球を凝集させる能力の喪失が同時に起きた。

Ｒ．Ｈ．Ｔｕｌｌｉｓは、米国特許第４，９０４，５８２号において、連結アームを介してオリゴヌクレオチドが、ポリオキシアルキレン基でも可能である疎水性部分に結合しているオリゴヌクレオチド結合体を開示している。生じた結合体は、膜輸送においてより効果的であるため、膜を通過して効果的に転写系を調節できると言われている。このようにして、これらの組成物は、細胞過程、哺乳動物宿主の病原体からの防御、遺伝子治療の促進などを研究するためにインビトロおよびインビボで使用することができる。

しかし、ポリマーの過剰な結合、および／または生物活性に関係する基が存在する治療効果部分の活性部位を含む結合は、活性の喪失、ひいては治療効果の喪失につながることがある。これは、生物活性に関係しない結合部位がほとんどない低分子量ペプチドにしばしば当てはまる。例えば、Ｉ．Ｂｅｎｈａｒら（（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ５：３２１−３２６）は、組換え一本鎖イムノトキシンのＰＥＧ化によって、イムノトキシンの特異的標的免疫反応性が喪失する結果になったことを観察した。このイムノトキシンの活性喪失は、イムノトキシンの抗原結合領域内にある２個のリジン残基にＰＥＧが結合した結果であった。

ＰＡＧおよびＰＡＯ（例えばＰＥＧやＰＥＯなど）の治療用蛋白質への共有結合によって免疫反応性を除去することが意図されているが、ＰＥＧ化された蛋白質は、僅かに免疫原性を保っている。この免疫原性は、少なくとも部分的に、ＰＥＧおよびＰＡＯのポリマーそれら自体が幾分か抗原性および免疫原性をもつという事実によるものと考えられる。例えば、ＰＥＧが免疫原性担持体蛋白質に結合した結合体を注射して、ウサギをさまざまなＰＥＧで免疫している（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７０：１２４−１３１）。さらに、β−グルクロニダーゼのｍＰＥＧ結合体をマウスに注射し、抗ＰＥＧ抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選抜して、ＰＥＧのポリエーテル骨格と反応するモノクローナル抗体が開発されている（Ｃｈｅｎｇ，Ｔ−Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １０：５２０−５２８；Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．−Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １１：２５８−２６６；Ｔｓａｉ，Ｎ．−Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０：３９６−４０２；Ｒｏｆｆｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５９６，８４９号および第６，６１７，１１８号。これらの開示内容はすべて、その全文が参照として本明細書に組み込まれる）。ＰＥＧのポリエーテル骨格と反応する別のモノクローナル抗体が、最近、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．らによって、米国特許出願第２００３／００１７０４Ａ１号において開示されている。

多くの研究者が、直鎖状または分枝状の「非抗原性」ＰＥＧポリマーおよびその誘導体または結合体の調製法を開示している（例えば米国特許第５，４２８，１２８号、第５，６２１，０３９号、第５，６２２，９８６号、第５，６４３，５７５号、第５，７２８，５６０号、第５，７３０，９９０号、第５，７３８，８４６号、第５，８１１，０７６号、第５，８２４，７０１号、第５，８４０，９００号、第５，８８０，１３１号、第５，９００，４０２号、第５，９０２，５８８号、第５，９１９，４５５号、第５，９５１，９７４号、第５，９６５，１１９号、第５，９６５，５６６号、第５，９６９，０４０号、第５，９８１，７０９号、第６，０１１，０４２号、第６，０４２，８２２号、第６，１１３，９０６号、第６，１２７，３５５号、第６，１３２，７１３号、第６，１７７，０８７号および第６，１８０，０９５号を参照。また、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９５／１３０９０、および公開米国特許出願第２００２／００５２４４３号、第２００２／００６１３０７号および第２００２／００９８１９２号を参照）。上記特許および特許出願における実施例の大部分は、１本以上のｍＰＥＧ鎖、例えばジ−ｍＰＥＧ−リジンなどを含むポリマーを用いている。しかしながら、今までのところ、このようなポリマーまたは結合体のＰＥＧを非抗原性にするメカニズムは開示されていない。

したがって、ＰＡＯ含有（例えばＰＥＧ−および／またはＰＥＯ−含有）結合体、特に、このような水溶性ポリマーと治療用蛋白質の結合体であって、抗原性が低下、実質的に低下、または全く検出されない結合体を作出する方法を確認する必要がある。このような結合体は、ポリマー成分によってもたらされるインビボにおける安定性および生体内利用率の増加という利点をもちつつ、治療目的または診断目的で結合体を導入した動物において、実質的に免疫応答を誘導しない。

（発明の簡単な要旨）
本発明は、上記で示したような必要性を解決しようとするものであり、水溶性ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体）と、蛋白質などの生物活性成分、特に治療的生物活性成分との結合体の調製法を提供する。また、本発明は、該方法によって作出されたポリマーおよび結合体であって、例えばｍＰＥＧなどのアルコキシＰＥＧによって調製された同じ生物活性成分とのアルコキシル含有ポリマーおよび結合体に比べて、低い抗原性および免疫原性を有するもポリマーおよび結合体を提供する。また、本発明は、該結合体を含む組成物、該結合体および組成物を含むキット、および、さまざまな治療用および診断用の投薬計画において該結合体および組成物を使用する方法も提供する。

一つの態様において、本発明は、１種類以上の直鎖状または分枝状の単官能性の活性化されたポリアルキレングリコールに共有結合した１種類以上の生物活性成分を含む結合体であって、単官能性の活性化されたポリアルキレングリコールが、メトキシル基、別のアルコキシル基またはアリールオキシル基を末端に含まない結合体を提供する。一定の前記実施態様において、結合体は、例えばｍＰＥＧのようなアルコキシポリ（エチレングリコール）またはジ−ｍＰＥＧ−リジンなどのｍＰＥＧを含む分枝状ポリマーを用いて調製した結合体に比べて、低い、または実質的に低い抗原性を有する。

本発明に係る結合体を合成する際に使用するのに特に適しているポリアルキレングリコールには、ポリ（エチレングリコール）、および、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマーなどがあり、これらに限定されるものではないが、特に好適なものはＰＥＧであり、より好適なものとしては、単官能性の活性化ＰＥＧ（例えば、一方の末端が活性化されたＰＥＧであって、ヒドロキシＰＥＧ−モノアルデヒド、ヒドロキシＰＥＧ−モノビニルスルホン、ヒドロキシＰＥＧ−モノカルボン酸の反応性エステル、およびヒドロキシＰＥＧ−モノフェニルカーボネート誘導体などである）。反応性のポリマー誘導体の合成に利用することができる他の中間体には、この他のヒドロキシＰＥＧ−一酸類およびヒドロキシＰＥＧ−モノアセタールなどがある。

一定の前記実施態様において、ポリアルキレングリコールの分子量は約１，０００ダルトンから約１００ｋＤａ、好ましくは約２ｋＤａから約６０ｋＤａ、約２ｋＤａから約３０ｋＤａ、約５ｋＤａから約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約３０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約２０ｋＤａであり；２本の分枝のそれぞれの分子量は、約２ｋＤａから約３０ｋＤａであり、２本の分枝のそれぞれの分子量は、より好ましくは、約１８ｋＤａから約２２ｋＤａである。本発明のこの態様による結合体は、高分子量の酵素蛋白質の１サブユニット当たり一本以上のポリアルキレングリコール鎖を含むことができ、一定の実施態様において、好ましくは約１本から約１０本の鎖、約１本から約５本の鎖、より好ましくは約１本から約３本の鎖、最も好ましくは約１本から約２本の鎖を含むことができ、別の実施態様において、好ましくは約５本から約１００本の鎖、約１０本から約５０本の鎖、そしてより好ましくは６本から約２０本の鎖を含むことができる。特に好適な前記実施態様において、結合体において使用されるポリアルキレングリコールは、分子量約１８ｋＤａから約２２ｋＤａ、または約２７ｋＤａから約３３ｋＤａである、一本鎖以上の単官能性の活性化ポリ（エチレングリコール）（例えば、ヒドロキシＰＥＧ−一酸の反応性エステル、ヒドロキシＰＥＧ−モノアルデヒド、ヒドロキシＰＥＧ−モノビニルスルホン、またはヒドロキシＰＥＧ−モノフェニルカーボネート誘導体）を含む。

本発明に係る結合体または組成物において使用するのに適した生物活性成分には、さまざまなペプチド、蛋白質、糖蛋白質、有機化合物、アミン含有化合物、カルボキシル基含有化合物、ヒドロキシル基含有化合物、およびチオール基含有化合物などがあるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明は、生物活性化合物と単官能性の活性化ポリアルキレングリコールとの結合体を作製する方法であって、例えば、（ａ）１個以上のトリフェニルメチル基（「トリチル基」）など、その後に取り除かれ得る少なくとも１個の非反応性のブロッキング基を含む、直鎖状または分枝状のポリアルキレングリコールを取得または調製する工程、（ｂ）ポリアルキレングリコールが、ブロッキング基を持たない末端において、１個の誘導体化基（１個のカルボキシル基など）によって誘導体化されるような条件下で、ポリアルキレングリコールを１種類以上の誘導体化化合物と反応させることによって、ポリアルキレングリコールの誘導体を作り出す工程、（ｃ）一つ以上のステップで誘導体化基を除去することなくブロッキング基を除去して、単官能性の活性化ポリアルキレングリコールを作製する工程、および（ｄ）生物活性成分が単官能性の活性化ポリアルキレングリコールに共有結合するのに有利な条件下で、単官能性の活性化ポリアルキレングリコールを１種類以上の生物活性成分と接触させる工程を含む方法を提供する。好ましくは、該方法で生成される結合体は、同様の大きさ、構造、および生物活性成分との結合を有するｍＰＥＧによって同一程度に誘導体化された結合体に比べると、低い、実質的に低い、または検出不可能な抗原性および免疫原性をもつものである。本発明はまた、このような方法によって生成される結合体を提供する。

また、本発明は、本発明に係る結合体、および薬学上または獣医学上の使用に許容されうる１種類以上の賦形剤または担体を含む薬学的または動物用の組成物を提供する。

さらなる実施態様において、本発明は、本発明に係る結合体または組成物を用いて、動物（ヒトを含む哺乳動物など）の身体疾患を防止、診断、または治療する方法も提供する。該方法の一つは、例えば、ある身体疾患（貧血、関節炎、癌、アルツハイマー病、酵素欠乏症、心疾患、高血圧、感染症、代謝疾患、神経疾患、好中球減少症、高尿酸血およびその徴候（例えば痛風）、遺伝的欠損症もしくは障害など）を患っているか、その傾向にある動物に、有効量の本発明に係る結合体または組成物を１種類以上、動物、特に哺乳動物、最も特別にはヒトに、経口、局所的、または非経口的に、例えば静脈内、筋内または皮下に投与することを含む。

さらなる実施態様において、本発明は、１種類以上の本発明に係る低抗原性結合体を含む組成物であって、１種類以上の緩衝用塩類、１種類以上の糖質賦形剤、１種類以上の担体蛋白質、１種類以上の酵素、１種類以上の界面活性剤、１種類以上の核酸分子、ＰＥＧなど１種類以上のポリマーなど、１種類以上のさらなる組成物または試薬をさらに含み得る組成物を提供する。本発明はまた、低抗原性の結合体および／または本発明の組成物を含むキットを提供する。

さらなる実施態様において、本発明は、単官能性の活性化ｍＰＥＧではなく、メトキシル基またはその他のアルコキシル基をもたない単官能性の活性化ポリアルキレングリコールを用いて調製される低免疫原性のＰＥＧ−リポソームを提供する。本発明の他の好ましい実施態様は、本発明および請求項に関して次に示す図面や説明に照らして、当業者には明白である。

図１は、競合的酵素免疫測定（「ＥＬＩＳＡ」）解析法による結果を示している。本アッセイ法では、ある蛋白質のｍＰＥＧ結合体を９６−ウェルのアッセイプレートに結合させて、ｍＰＥＧまたはｔ−ブトキシＰＥＧによる、別の蛋白質のｍＰＥＧ結合体へのウサギ抗体の結合阻害を測定した。 図２ａは、１個または２個のメトキシル基を含む、さまざまなサイズおよび構造のＰＥＧを用いて、図１の説明にしたがって行われた競合的ＥＬＩＳＡの結果を示している。抗体結合に関する結果を、各試料についてメトキシル基のモル濃度の関数としてグラフに示す。 図２ｂは、メトキシル基のモル濃度ではなく、ＰＥＧの重量濃度（マイクログラム／ｍＬ）の関数としてグラフにした、図２ａと同じデータを示す。 図３は、図１、２ａおよび２ｂからのいくつかのデータを、ＰＥＧ１分子当たりのメトキシル基の個数に対する抗原性の直接的な依存性を示す形式にしたものを示している。これらの試料は、１０−ｋＤａのＰＥＧであって、そのうちの一つにはメトキシル基がなく（ｔ−ブトキシＰＥＧ）、一つはメトキシル基を含み（ｍＰＥＧ）、一つは、２個のメトキシル基を含む（ジ−（５−ＫＤａ）ｍＰＥＧ−リジン）。 図４は、図１に記載された競合的ＥＬＩＳＡを図示したもので、４．８−ｋＤａのｍＰＥＧを、直鎖状ポリマーの末端にメトキシル基を持たない３種類の本発明に係るＰＥＧ（「ＰｈａｒｍａＰＥＧ」と標示）と比較したものである。曲線間の横軸方向への変化は、抗ｍＰＥＧ抗体のアッセイにおいて、本発明の３つのＰＥＧの抗原性がすべて、ｍＰＥＧより１００倍低いことを示している。 図５ａは、炭酸脱水酵素（「ＣＡ ＩＩ」）の異性体、および３〜４本の５−ｋＤａ ｍＰＥＧ鎖に結合した同じ炭酸脱水酵素の試料を、ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した実験結果を示している。ゲルのレーン１および２は、登録商標ＳＹＰＲＯブランドのＲｕｂｙ染色を用いて蛋白質を染色し、暗所にて３０２ｎｍの照明下で撮影して得られた結果を示す。レーン３および４は、それぞれ、ｍＰＥＧ結合体および非ＰＥＧ化酵素の、ウサギ抗ｍＰＥＧポリクローナル抗体を一次抗体に用いたウエスタンブロットの結果を示している。レーン５は、染色済みの蛋白質標準の位置を示す。 図５ｂは、Ｋｏｄａｋカメラとデジタル画像ソフトウエアによって得られた、図５ａに示したゲルおよびウエスタンブロットにおけるバンドの強度の定量結果を示している。横軸は、染色最前部に対する相対的な移動距離を表し、縦軸は、蛋白質染色または抗ｍＰＥＧ染色の相対的強度を表す。一番下のトレース線は、染色済みの蛋白質標準液のバンドで、外見上の分子量が、左から右へそれぞれ、２０３．８、１１０．９、６８．８、５１．５、４０．２、２８．９、２０．７および１４．９ｋＤａのバンドを示す。下から２番目のトレース線は、ＰＥＧ化炭酸脱水酵素を抗ｍＰＥＧ抗体染色したものである。下から３番目のトレース線は、炭酸脱水酵素を蛋白質染色したバンドを表し、一番上のトレース線は、炭酸脱水酵素のｍＰＥＧ結合体を蛋白質染色したバンドを表している。 図６ａおよび６ｂは、ウリカーゼサブユニット当たり平均約２本のｍＰＥＧ鎖またはヒドロキシＰＥＧ鎖（「ＰｈａｒｍａＰＥＧ」）のいずれかを含むブタウリカーゼの結合体で免疫した３匹のウサギからなるグループから採取した血清をＥＬＩＳＡ分析した結果を示す。ブタウリカーゼをコートしたアッセイプレートを用いて、ウリカーゼに対する抗体を測定した。ｍＰＥＧに結合した無関係の蛋白質の結合体をコートしたプレートを用いて、ＰＥＧに対する抗体を測定した。図６ａは、フロイント不完全アジュバントに入れたＰＥＧ−ウリカーゼを４回注射したウサギの２回目の採血から得られたデータを示す。図６ｂは、同じウサギに、フロイント不完全アジュバントに入れたＰＥＧ−ウリカーゼを５回注射した後、３回目の採血から得られたデータを示す。 図６ａおよび６ｂは、ウリカーゼサブユニット当たり平均約２本のｍＰＥＧ鎖またはヒドロキシＰＥＧ鎖（「ＰｈａｒｍａＰＥＧ」）のいずれかを含むブタウリカーゼの結合体で免疫した３匹のウサギからなるグループから採取した血清をＥＬＩＳＡ分析した結果を示す。ブタウリカーゼをコートしたアッセイプレートを用いて、ウリカーゼに対する抗体を測定した。ｍＰＥＧに結合した無関係の蛋白質の結合体をコートしたプレートを用いて、ＰＥＧに対する抗体を測定した。図６ａは、フロイント不完全アジュバントに入れたＰＥＧ−ウリカーゼを４回注射したウサギの２回目の採血から得られたデータを示す。図６ｂは、同じウサギに、フロイント不完全アジュバントに入れたＰＥＧ−ウリカーゼを５回注射した後、３回目の採血から得られたデータを示す。

（発明の詳細な説明）
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明の分野に属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味をもつ。本発明を実施または試験する際に、本明細書に記載されている方法および材料に類似または同等のいかなる方法および材料を使用することもできるが、好適な方法および材料を以下に説明する。

（定義）
約：本明細書において、いかなる数値に関するときも、「約」という語は、記載された数値の±１０％の数値を意味する（例えば、「約５０℃」は、４５℃以上５５℃以下の温度範囲を包含する。同様に、「約１００ｍＭ」は、９０ｍＭ以上１１０ｍＭ以下の濃度範囲を包含する）。

生物活性成分：本明細書において、「生物活性成分」という語は、細胞、組織、器官または生物に対しインビボ、インビトロ、またはエクスビボにおいて特定の生物学的活性をもち、１個以上のポリアルキレングリコールに結合して本発明に係る結合体を形成することができる化合物、分子、部分または複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を意味する。好適な生物活性成分を以下で詳しく説明する。

結合した：本明細書において、「結合した」という語は、例えば化学的共役による共有結合的に、または、例えばイオン相互作用、疎水的相互作用、水素結合など非共有結合的に結合または連結していることを意味する。共有結合には、例えばエステル結合、エーテル結合、ホスホエステル結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、アミド結合、ペプチド結合、イミド結合、炭素−硫黄結合、炭素−リン結合などありうる。「結合した」という表現は、「共役した」「連結した」および「接着した」などという表現よりも広義で、これらの表現を含む。

「共役した」：本明細書において、「共役した」という語は、共有結合または強い非共有結合的相互作用による接着を意味し、典型的および好適には、共有結合による接着を意味する。生物学的に活性のある物質を共役させるために当業者によって通常用いられる方法はすべて、本発明においても用いることができる。

病気、疾患、状態：本明細書において、「病気」または「疾患」という語は、腫瘍、癌、アレルギー、依存症、自己免疫、被毒、または最善の精神または身体の機能の欠陥など、ヒトまたは動物の悪い状態を意味する。本明細書において、「状態」は、病気と疾患を含むが、生理的状態も意味する。例えば、受胎能力があるということは生理的状態ではあるが、病気または疾患ではない。したがって、受胎能力を低下させて避妊するのに適した本発明に係る組成物は、状態（受胎可能な状態）の治療と説明されるだろうが、疾患または病気の治療とはいわない。その他の状態は、当業者に理解されている。

有効量：本明細書において、「有効量」という語は、一定の結合体または組成物が、所望の生物学的効果を実現するのに必要または十分な量を意味する。本発明に係る一定の結合体または組成物の有効量は、この選択された結果を達成する量であり、そのような量は、当業者によって通常の事項として決定しうるものである。例えば、免疫系不全を治療するための有効量は、免疫系を活性化させて、抗原に曝露したときに抗原特異的な免疫応答を生じさせるのに必要な量であり得る。また、この語は、「十分な量」と同義語である。特定の用途にとって有効量は、治療すべき病気や状態、投与すべき具体的な組成物、対象者の大きさ、および／または病気または状態の重度などの要素によって変動しうる。当業者は、過度の実験を要することなく、本発明に係る結合体または組成物の有効量を経験的に決定することができる。

免疫応答：本明細書において、「免疫応答」という語は、液性免疫応答（すなわち抗体形成）、および／または、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球および／または抗原提示細胞などの活性化または増殖をもたらす細胞性免疫応答を意味する。しかし、場合によっては、免疫応答は、低度のもので、本発明に従って１種類以上の物質を用いたときにだけ検出可能なものであってもよい。「免疫原性」は、生体の免疫系を刺激して、免疫系の一つ以上の機能を高めて、免疫原性物質に向かわせることができる作用物質を意味する。

一つ：本開示において、「一つ」、または「ある一つ」という語が使用されるとき、別段の記載がない限り、「少なくとも一つ」または「一つ以上」を意味する。

ポリペプチド：本明細書において、「ポリペプチド」という語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）からなる分子を意味する。それは、アミノ酸の分子鎖を意味し、特定の長さの生成物を意味しない。したがって、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、不特定の長さのペプチド、および蛋白質も、ポリペプチドの定義に含まれる。また、この語は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの発現後修飾による生成物も意味するものである。ポリペプチドは、組換え体でも、天然の生物源に由来するものでもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるものではない。化学合成によるなど、いかなる方法で生成されてもよい。

蛋白質および糖蛋白質：本明細書において、「蛋白質」という語は、通常、約５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上または２，０００個以上のアミノ酸というサイズのものを意味する。蛋白質は、大抵は一定の三次元構造をもたないペプチドおよびポリペプチドとは対照的に、多数の異なった立体構造をとることができ、折り畳まれていないと呼ばれる状態ではなく、必ずしもその必要はないが、通常、一定の三次元構造をもち、折り畳まれていると言われる。しかし、ペプチドも、一定の三次元構造をもつことができる。本明細書において、糖蛋白質という語は、例えばセリンまたはアスパラギンなどの酸素含有または窒素含有アミノ酸側鎖を介して蛋白質に接着している一つ以上の糖部分を含む蛋白質を意味する。

精製された：本明細書において、分子に関して「精製された」という語が用いられる場合、精製されている分子の本来の環境中、またはそれが産生、発見、または合成された環境の中で一緒に存在した分子の濃度に比較して、精製されている分子の濃度が上昇していることを意味する。自然界で一緒に存在する分子には、蛋白質、核酸、脂質、および糖類などがあるが、一般的には、精製すべき分子の完全な状態を維持したり、その精製を容易にしたりするために加えられる水、バッファー、および試薬は含まない。例えば、粗抽出物中の所定の蛋白質を、カラムクロマトグラフィーの際に水性溶媒で希釈したとしても、対象となっている蛋白質分子から、天然には一緒に存在する核酸、所望でない蛋白質、およびその他の生物学的分子が分離された場合は、蛋白質分子はこのカラムクロマトグラフィーによって精製されていると見なされる。この定義によれば、物質は、その混入物に対して考えた場合に、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の純度がありうる。

残基：本明細書において、「残基」という語は、ポリペプチド骨格または側鎖中の特定のアミノ酸であって、通常、１個以上のペプチド結合に含まれる結果として脱水されているものを意味する。

治療：本明細書において、「治療」、「治療する」「治療された」または「治療している」という語は、予防および／または治療を意味する。例えば、感染症について用いられる場合、この語は、対象者が感染した後に、例えば、感染症を軽減または排除したり、それが悪化するのを防止したりして、その感染症と格闘するための治療だけでなく、病原体による感染に対する対象者の抵抗性を高める予防的治療を意味することも可能で、言い換えれば、対象者が病原体に感染するか、感染が原因で生じる病気の兆候を示す可能性を低下させる予防的治療を意味することも可能である。

（概観）
数多くの以前の研究者たちが、直鎖状または分枝状の非抗原性ＰＥＧポリマーまたはその結合体の調製法を開示している（例えば米国特許第５，４２８，１２８号、第５，６２１，０３９号、第５，６２２，９８６号、第５，６４３，５７５号、第５，７２８，５６０号、第５，７３０，９９０号、第５，７３８，８４６号、第５，８１１，０７６号、第５，８２４，７０１号、第５，８４０，９００号、第５，８８０，１３１号、第５，９００，４０２号、第５，９０２，５８８号、第５，９１９，４５５号、第５，９５１，９７４号、第５，９６５，１１９号、第５，９６５，５６６号、第５，９６９，０４０号、第５，９８１，７０９号、第６，０１１，０４２号、第６，０４２，８２２号、第６，１１３，９０６号、第６，１２７，３５５号、第６，１３２，７１３号、第６，１７７，０８７号および第６，１８０，０９５号を参照。また、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９５／１３０９０、および公開米国特許出願第２００２／００５２４４３号、第２００２／００６１３０７号および第２００２／００９８１９２号を参照。これらすべての開示内容は、その全文が参照として本明細書に組み込まれる）。しかし、これら以前の報告に記載されたＰＥＧおよび結合体は、少なくとも僅かに免疫原性が残っているため、結合体を予防、診断または治療という目的で動物に導入したとき、結合体のＰＥＧ成分に対する抗体の発生という望ましくない結果をもたらす可能性がある。そのような抗体は、ＰＥＧ含有生物活性結合体の速やかな除去をもたらして、その治療用組成物の生体内利用率を低下させる可能性があり（Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．−Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）前掲）、また、免疫結合体による疾患を誘発する可能性もある。さらに、請求の対象となったＰＥＧまたはその結合体に実質的な非抗原性または非免疫原性を付与するメカニズムの開示は存在していない。

本発明は、当技術分野におけるこれらの限界を克服したものである。一般的に、本発明は、さまざまな身体疾患を予防、診断および治療する上で有用な安定した組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、抗原性が低下した反応性ポリマー、および蛋白質、特に治療用蛋白質の安定化されたポリマー結合体であって、抗原性が低下または実質的に低下しているか、または全く検出されない結合体を生成する方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、本発明に係るこれらの方法によって生成された結合体、および、その結合体を含む組成物、特に薬学的組成物を提供する。更なる実施態様において、本発明は、さまざまな身体疾患の予防、診断および治療における該結合体および組成物の使用法を提供する。また、本発明は、本発明に係る結合体および／または組成物を１種類以上含むキットも提供する。

（抗原性が低下した結合体の調製）
一つの態様において、本発明は、水溶性ポリマーを、１種類以上の蛋白質および具体的には１種類以上の治療用蛋白質など、１種類以上の生物活性化合物または成分に共有結合させることによって、抗原性が低下した、抗原性が実質的に低下した、または抗原性が検出できない結合体の調製法を提供する。該結合体において、選ばれるポリマーは、蛋白質−ポリマー結合体を調製するために一般的に使用される標準的なポリマーに比べると、それ自体が低抗原性、実質的に低抗原性、または検出不能な抗原性のものである。本明細書において、「低抗原性」という語は、ポリマー（例えばＰＡＯまたはＰＡＧ、特にＰＥＧ、および最も具体的には単官能性の活性化ＰＥＧ）、または該ポリマーを含むか、それを用いて合成された結合体または組成物であって、該ポリマーが、より抗原性の高いポリマー（例えばｍＰＥＧ）に対して形成された抗体と反応する能力がある程度低くなっているものを意味する。該抗原性は、より抗原性の高いポリマーに比べて、好ましくは約３０％以上低下しており、より好ましくは約５０％以上低下しており、最も好ましくは約７５％以上低下している。次に、これを拡大すると、ポリマー（または、該ポリマーを含むか、それを用いて合成された結合体または組成物）が、対応する抗原性ポリマー（例えばｍＰＥＧ）の抗原性の約２０％以下、より好ましくは約１５％以下、さらにより好ましくは約１０％以下、そして最も好ましくは約１％以下の抗原性をもつ場合には、そのポリマー（または結合体もしくは組成物）は「実質的に低抗原性」のものと言われる。最後に、当技術分野において既知の方法（例えばＥＬＩＳＡ、またはその他の抗原性検出法であって、当技術分野において既知の方法および本明細書の実施例に記載されているものなど）で測定したときに、ポリマー（または、該ポリマーを含むか、それを用いて合成された結合体または組成物）が検出可能な抗原性をもたないとき、そのポリマー、結合体または組成物は「検出不能な抗原性」をもつと言われる。

（ポリマー）
本発明に係る結合体の調製に使用するのに特に適したポリアルキレングリコールには、ポリ（エチレングリコール）、およびエチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマーがあるがこれらに限定されず、特に好適なものはＰＥＧであり、より好適なのは、単官能性の活性化ヒドロキシＰＥＧである（例えば、一方の末端が活性化されたヒドロキシＰＥＧであって、ヒドロキシＰＥＧ−モノカルボン酸、ヒドロキシＰＥＧ−モノアルデヒド、ヒドロキシＰＥＧ−モノアミン、ヒドロキシＰＥＧ−モノヒドラジド、ヒドロキシＰＥＧ−モノカルバゼート、ヒドロキシＰＥＧ−モノヨードアセトアミド、ヒドロキシＰＥＧ−モノマレイミド、ヒドロキシＰＥＧ−モノオルトピリジルジスルフィド、ヒドロキシＰＥＧ−モノオキシム、ヒドロキシＰＥＧ−モノフェニルカーボネート、ヒドロキシＰＥＧ−モノフェニルグリオキサール、ヒドロキシＰＥＧ−モノチアゾリジン−２−チオン、ヒドロキシＰＥＧ−モノチオエステル、ヒドロキシＰＥＧ−モノチオール、ヒドロキシＰＥＧ−モノトリアジン、およびヒドロキシＰＥＧ−モノビニルスルホン等の反応性エステルを含む）。

本発明に係る結合体の調製に使用される特に好適なポリマーであって、低抗原性、実質的に低抗原性、または検出不能な抗原性をもつポリマーは、メトキシル基も、その他のアルコキシル基も、アリールオキシル基も含まない単官能性の活性化ＰＥＧである。該単官能性の活性化ＰＥＧを、本発明に係る結合体の合成において単官能性の活性化ｍＰＥＧの代わりに用いると、得られた結合体に予想外に低い抗原性を付与し、すなわち同じ生物活性成分のｍＰＥＧ結合体に対して生じる抗体と相互作用する能力を低下させることができる。得られる結合体は免疫原性も低い。すなわち免疫応答を誘発する能力も低い。

本発明の一態様において、単官能性の活性化ＰＥＧは、活性化基を可逆的にブロックした適当な誘導体をエチレンオキシドの重合開始剤として用いて合成できる（Ａｋｉｙａｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１１：９４７−９５０）。Ａｋｉｙａｍａらは、３，３−ジエトキシプロパノレート・カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ３，３−ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｌａｔｅ）をエチレンオキシドの重合開始剤として用いてＰＥＧのモノヒドロキシル、モノアセタール誘導体を合成する条件を提示している。Ａｋｉｙａｍａらは、この中間体の最も望ましい低抗原性または低免疫原性を認識していなかったため、塩化メタンスルホニルを付加して重合を終止させることによって末端のヒドロキシル基をチオール基に変換することによって、本発明のＰＥＧ誘導体ではなく、ヘテロ二官能性のＰＥＧを生成した。この研究者グループが、ヒドロキシル基を末端にもつ単官能性の活性化ＰＥＧの有用性を認識していなかったことの更なる証拠として、彼らは、モノヒドロキシル基をもつ単官能性の活性化されたＰＥＧから、場合によっては、ヒドロキシＰＥＧをメトキシル基で「末端キャップ」さえ行って、別のヘテロ二官能性ＰＥＧを合成する方法を発表して特許を得ていることが挙げられる。同様に、Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．らは、公開米国特許出願第２００２／００７２５７３Ａ１号において、ヒドロキシル末端をもつ単官能性の活性化されたポリマーの免疫学的有用性を認識していなかったことを反映するポリマー組成物と方法を開示しており、該ポリマーの末端ヒドロキシル基はメトキシル基に変換することが望ましいと述べている。

本発明の別の態様において、単官能性活性化ＰＥＧは、ビス−活性化ＰＥＧの量を許容できるほど低レベル、例えば５％未満、好ましくは２％未満、またはより好ましくは１％未満に制限するために、実施例５に示した方法に代わるものとして、両端にヒドロキシル基を含む直鎖状ＰＥＧ（「ＰＥＧジオール」）の活性化の程度を調節することによって合成できる。特に好適な態様において、ＰＥＧを誘導体化した後、誘導体化基を除去することなしに非反応性ブロッキング基を取り除くことができる単官能性ＰＥＧから、単官能性活性化ＰＥＧを合成することができる。誘導体化ＰＥＧの一例はＰＥＧ−カルボン酸であり、誘導体化の後に除去することができる非反応性ブロッキング基の例は、アリールオキシル基（Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開ＷＯ ０１／２６６９２ Ａ１）、トリチル基（Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｐ．Ｊ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ｐｐ．５４−５８）、およびｔ−ブトキシル基である。ｔ−ブトキシルＰＥＧ−カルボン酸は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化することができる。最後に、ｔ−ブトキシル基を無水酸分解によって除去して、ポリマーの遠位末端にメトキシル基ではなくヒドロキシル基をもつ活性化ＰＥＧ−カルボン酸誘導体を生成することができる。より好適な実施態様において、ｔ−ブトキシＰＥＧ−カルボン酸は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでカルボキシル基を活性化する前に、酸分解によってヒドロキシＰＥＧ−カルボン酸に変換することができる。本願発明の別の実施態様において、ｔ−ブトキシＰＥＧをハロアセタールと接触させてから、ｔ−ブトキシル基を除去するために選択的に無水酸分解することにより、この産物をヒドロキシＰＥＧ−アセタールまたはヒドロキシＰＥＧ−アルデヒドに変換することによってｔ−ブトキシＰＥＧ−アセタールが合成される。このアセタールは、還元的アルキル化によってアミン含有化合物に共役させる準備としてアルデヒド（またはアルデヒド水和物）に変換することができる（Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，９９０，２３７号）。別の実施態様において、ポリマーの反応性末端から遠位にあるアリールオキシル保護基を触媒による水素添加分解によって除去して、本願発明に係るモノ活性化（ｍｏｎｏａｃｔｉｖａｔｅｄ）ヒドロキシＰＡＧを生成することができる。あるいは、単官能性活性化ヒドロキシＰＡＧを合成する際に、実施例６に記載したように、末端ヒドロキシル基１個以外の基すべての可逆的ブロッキングを利用することができる。

本発明に係る結合体の調製において使用するＰＡＧポリマーは、直鎖状ポリマーでもよいし、ポリマー分子の中の１箇所以上で分枝していてもよい。また、本発明に係る結合体を形成させるために使用するポリマーは、ポリ（エチレングリコール）のように、単一のモノマー型が複数単位連結してポリマーを形成しているホモポリマーでもよいし、ヘテロポリマーまたはコポリマー（エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマーのように、２種類以上の構造体のモノマー単位が連結してポリマーを形成している）でもよい。コポリマーはまた、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、あるいはその他のコポリマーであってもよい。

本発明にしたがって使用されるポリマーは、非反応性ポリマーでも反応性ポリマーでもよい。本明細書において、「非反応性ポリマー」とは、蛋白質に共有結合しないポリマーである。該「非反応性ポリマー」の例は、一方の末端にヒドロキシル基をもち他方の末端にメトキシル基をもつエチレンオキシドユニットの直鎖状ポリマーであるｍＰＥＧ、および、両末端にヒドロキシル基をもつエチレンオキシドユニットの直鎖状ポリマーであるＰＥＧジオールなどであるが、これらに限定されるものではない。本明細書において、「反応性ポリマー」とは、例えば生物活性成分（蛋白質など）のチオール基または、リジン残基のアルファアミノ基またはイプシロンアミノ基であるがこれらに限定されないアミノ基などの溶媒接触可能な求核基と反応することができるポリマーである。「反応性ポリマー」の例は、ヒドロキシル末端基が、スクシンイミジルプロピオン酸（「ＳＰＡ−ＰＥＧ」のものなど）もしくはｐ−ニトロフェニルカーボネート（「ＮＰＣ−ＰＥＧ」のものなど）、またはＰＥＧ−アルデヒドにおけるようなアルデヒドなどの求電子基に変換されているか、求電子基によって置換されているＰＥＧなどであるが、これらに限定されるものではない。ポリアルキレンオキシド以外に、適当なポリマーとしては、ポリビニルアルコール、ポリ（オキシエチレン−オキシメチレン）コポリマー、ポリアミド（例えばＲｏｓｅ，Ｋ．，ＰＣＴ国際公開ＷＯ ００／１２５８７）、ポリカルボキシレート、ポリ（ビニールピロリドン）（ｖｏｎ Ｓｐｅｃｈｔ，Ｂ．−Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３５４：１６５９−１６６０）、ポリＤ−アミノ酸および／またはポリＬ−アミノ酸、ポリアクリロイルモルフォリン（Ｒｏｃｃａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ Ｊ Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ １９：７３０−７３４）、および デキストラン（Ｉａｋｕｎｉｔｓｋａｙａ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８０）．Ｐｒｉｋｌ Ｂｉｏｋｈｉｍ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ １６：２３２−２３７）などでもよい。標的生物活性成分上のさまざまな部位と多少なりとも選択的に反応するＰＥＧ、ＰＥＯおよびその他のＰＡＯの誘導体は、当技術分野においてよく知られており、Ｆｌｕｋａ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの子会社（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＳｕｎＢｉｏ，Ｉｎｃ（Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）などの販売元から購入することができる。

本発明に係る方法および組成物において使用するのに適した活性化型ポリマーには、当技術分野において知られている、ヒドロキシル基末端をもつ単官能性活性型ポリマーなどがありうる。例えば、（活性化基の質量を除いて）約１ｋＤａから約１００ｋＤａの範囲の分子量など、さまざまなサイズの直鎖状または分枝状のＰＡＯが適している。適当な分子量範囲は、約２ｋＤａから約６０ｋＤａ、約２ｋＤａから約３０ｋＤａ、約５ｋＤａから約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約２０ｋＤａ、および約１８ｋＤａから約６０ｋＤａ、約２０ｋＤａから約３０ｋＤａであるが、これらに限定されるものではない。直鎖状ＰＥＧの場合、約２０ｋＤａから約３０ｋＤａの分子量範囲が、エチレンオキシドの４５０個から６８０個のモノマー単位の範囲内での重合度（ｎ）に相当する。治療用蛋白質を、この後者の比較的高い分子量の範囲（すなわち２０〜３０ｋＤａを超える）のポリマーに共役させることの有益さは、ｍＰＥＧの免疫原性が認識されるよりもずっと前から認識されていたことに留意されたい（１９８９年２月９日に公開された、Ｓａｉｆｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開ＷＯ ８９／０１０３３、これは、その全文が参照として本明細書に組み込まれている）。

必要に応じて、直鎖状ポリマーは、一方の末端または両端に反応性基をもち、それによって「反応性ポリマー」を創出することができる。本発明の一定の実施態様において、Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．らは、その全文を参照として本明細書に組み込んでいる米国特許第５，６７２，６６２号において開示しているＰＥＧのモノプロピオン酸誘導体のスクシンイミジルエステル、またはその他のスクシンイミド活性化ＰＥＧ−カルボン酸を使用することが望ましいことがある。一定の別の実施態様において、Ｓａｉｆｅｒ，Ｍ．ら、米国特許第５，００６，３３３号、第５，０８０，８９１号、第５，２８３，３１７号および第５，４６８，４７８号に記載されている、ＰＥＧのスクシンイミジルカーボネート誘導体（「ＳＣ−ＰＥＧ」）、または、Ｋｅｌｌｙ，Ｓ．Ｊ．ら（２００１）前掲；ＰＣＴ国際公開ＷＯ ００／０７６２９ Ａ２、前掲、およびこれに対応する米国特許第６，５７６，２３５号、およびＰＣＴ国際公開ＷＯ ０１／５９０７８ Ａ２、前掲に記載されている、ＰＥＧのｐ−ニトロフェニルカーボネート誘導体のいずれかを使用することが望ましいことがある。さらに、別のタイプの反応性基を用いて、蛋白質のポリマー結合体を合成することができる。これらの誘導体は、ＰＥＧのアルデヒド誘導体（Ｒｏｙｅｒ，Ｇ．Ｐ．，米国特許第４，００２，５３１号；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２５２，７１４号）、ＰＥＧのアミン、ブロモフェニルーボネート、カルボニルイミダゾール、クロロフェニルカーボネート、フルオロフェニルカーボネート、ヒドラジド、カルバゼート、ヨードアセトアミド、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、オキシム、フェニルグリオキサール、チアゾリジン−２−チオン、チオエステル、チオール、トリアジン、およびビニルスルホンの各誘導体などであるが、これらに限定されるものではない。

本発明の一定の実施態様において、ＰＥＧのようなポリマーが生物活性成分に結合して本発明に係る結合体を産生する反応において分子内および分子間での架橋形成を最小限にすることが望ましい。これは、一方の末端だけが活性化されているポリマー（本明細書では「単官能性活性化ＰＥＧ」または「単官能性活性化ＰＡＧ」と呼ばれている）、または二官能性活性化ポリマー（直鎖状ＰＥＧの場合、「ビス−活性化ＰＥＧジオール」と呼ばれる）の割合が３０％未満、または好ましくは１０％未満または最も好ましくは２％未満（ｗ／ｗ）のポリマーを用いて達成することができる。主に単官能性である活性化ポリマーの使用によって、以下に示すものの形成を最小限に抑えることができる：各蛋白質分子内における分子内架橋、ポリマーの一本鎖が２個の蛋白質分子を結合している「ダンベル」構造、およびより大きな凝集体またはゲル。アミノ基と反応する活性化ポリマーが使用されると、蛋白質の１分子に結合できるポリマー鎖の理論上の最大数は、アミノ基の総数と一致する。ポリマー共役の具体的な条件下で蛋白質の表面上にあって結合可能なアミノ基の実際数は、理論的な最大値よりも少ない可能性がある。

本発明に係る結合体は、１本以上のポリアルキレングリコール鎖、好ましくは約１本から約１００本の鎖、治療用酵素のサブユニット当たり約１本から約２０本の鎖、レセプター結合サイトカイン、成長因子、蛋白質ホルモンおよびコロニー刺激因子のサブユニット当たり約１本から約３本の鎖、より好ましくは約１本から約２本の鎖を含むことが可能である。特定の好適な実施態様において、結合体を調製する際に使用されるポリアルキレングリコールは、１本または２本のポリ（エチレングリコール）鎖（具体的には、カルボキシＰＥＧ、ヒドロキシＰＥＧ、ジヒドロキシＰＥＧ、またはＰＥＧアセタール）である。一定の前記実施態様において、直鎖状または分枝状のポリアルキレングリコールは、直鎖状の場合、約１ｋＤａから約１００ｋＤａ、好ましくは約２ｋＤａから約６０ｋＤａ、約５ｋＤａから約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約２０ｋＤａ、約１８ｋＤａから約６０ｋＤａ、そして最も好ましくは約１８ｋＤａから約２２ｋＤａ、または約２７ｋＤａから約３３ｋＤａの分子量を有し、該ポリマーが、同じ質量の２本鎖分枝を持つ場合には、全部で約３６ｋＤａから約４４ｋＤａの分子量を有する。

（生物活性成分）
上記した通り、本発明に係る結合体は、１種類以上の生物活性成分に共有結合している１種類以上のＰＡＧまたはＰＡＯを含み、特に１種類以上のＰＥＧ鎖を含む。１種類以上のポリマー（またはその鎖）が結合している生物活性成分は、本明細書では、さまざまかつ同等のものとして「結合した生物活性成分」または「修飾された生物活性成分」などと呼ばれる。これらの語は、本明細書においては、共有結合している１種類以上のポリマーを持っていない生物活性成分をすべて意味する「非結合生物活性成分」、「初期生物活性成分」または「非修飾生物活性成分」と区別されるべき語である。別の態様において、本発明は、ポリマーを混合することによって、生物活性成分の溶液を安定化させる方法および組成物を提供する。しかし、当然ながら、「非結合」、「非修飾」または「初期」の生物活性成分は、野生型または天然型の分子と比べると、別の非ポリマー結合体または修飾を含んでいる場合があるが、それでも、本発明によれば、生物活性成分は、「非結合」、「非修飾」または「初期」であると見なされる。それは、生物活性成分が、ポリマーの結合に関して「非結合」、「非修飾」または「初期」の状態であるからである。
生物活性成分を「安定化させる」（または「安定化法」または「安定化した生物活性成分」）という語は、生物活性成分が、本発明に係る方法によって安定化されていること（すなわち、ポリマーが共有結合しているか、本発明に係る方法によって混合されている生物活性成分）を意味する。該安定化された生物活性成分は、安定化されていない生物活性成分（すなわち、ポリマーが共有結合または混合されていない生物活性成分）に比べて、一定の変化した生化学的および生物物理学的性質を示すはずである。特に酵素などの蛋白質に関する、このような改変された生化学的および生物物理学的パラメータには、自己分解の低下、および具体的には、一定の過酷な環境または実験条件下でインキュベートする際に酵素活性が維持されるということが含まれうる。本発明の一定の実施態様において、改変された生化学的および生物物理学的なパラメータは、例えばインビボにおける循環液中の半減期の延長、生体内利用率の増加などであろう。

本発明において、生物学的（すなわち生理学的、生化学的または薬学的）活性を有する成分（一般的には分子または高分子の結合体）を初期成分として適宜使用することができる。該生物活性成分は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、治療用ウイルス、有機化合物などであるが、これらに限定されるものではない。また、生物活性成分は、該蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、治療用ウイルス、有機化合物などの断片、変異体、および誘導体を含み、特に生物学的（すなわち生理学的、生化学的または薬学的）活性を有する断片、変異体、および誘導体も含む。

本発明において生物活性成分として有用な有機化合物で適当なものは、タキサンなどの部分、アントラサイクリン、ダウノルビシンを含む化合物、ドキソルビシン、ｐ−アミノアニリンマスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）、メルファラン、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、およびその他、例えばゲムシタビンなどの代謝拮抗化合物などがあるが、これらに限定されるものではない。あるいは、生物活性成分は、心血管作動薬、抗腫瘍薬、抗感染薬、ナイスタチンおよびアンフォテリシンＢなどの抗菌薬、抗不安薬、胃腸薬、中枢神経系で活性をもつ薬剤、鎮痛剤、不妊治療剤、避妊剤、抗炎症剤、ステロイド剤、抗尿酸血症剤、血管拡張剤、血管収縮剤などである。

本発明において生物活性成分として有用なペプチド、ポリペプチド、酵素、および糖蛋白質など、その他の蛋白質は、利用可能なアミノ基、チオール基、または、その他ポリマーが結合できる基を一つ以上有するペプチド、ポリペプチド、酵素、およびその他の蛋白質などである。該成分は、有機溶媒中で反応を触媒できるという活性だけでなく、生理学的または薬理学的な活性を有する物質などを含む。対象となるペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質は、ヘモグロビン、例えば第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子などの血液凝固因子のような血清蛋白質、免疫グロブリン、インシュリン、例えばＩＬ−１からＩＬ−１８までのインターロイキンなどのサイトカイン、インターフェロン（例えばＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、およびコンセンサスＩＦＮ）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、血小板増加因子、巨核球成長発育因子、エリスロポエチン、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化蛋白質（「ＰＬＡＰ」）、白血病抑制因子（当技術分野において「スチール因子（Ｓｔｅｅｌ Ｆａｃｔｏｒ）」としても知られる「ＬＩＦ」）、神経栄養因子、および幹細胞因子、ならびにそれらのペプチド模倣剤などであるが、これらに限定されるものではない。生物活性成分のレセプター結合アンタゴニストは、それ自体が、本発明の生物活性成分として使用するのに適している。一般的な生物学的または治療学的に興味のあるその他の蛋白質は、インシュリン、レクチンやリシンなどの植物蛋白質、腫瘍壊死因子およびその関連蛋白質、例えばＴＧＦ−アルファまたはＴＧＦ−ベータなどのトランスフォーミング増殖因子、線維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロアクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、プロラクチン、組織プラスミノゲン活性化因子、これらのレセプター結合蛋白質アンタゴニストなどである。これらの蛋白質の多くは、グリコシル化型および非グリコシル化型で存在する。非グリコシル化型は、原核生物において組換え技術を使用してそれらを産生させることができる。該非グリコシル化型産物は、本発明の適当な生物活性成分であるペプチドおよび蛋白質に含まれる。

対象となる酵素は、糖質特異的酵素、蛋白質分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼなどである。特定の酵素に限定されることなく、対象となる酵素の例は、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デイミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシド・ディスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシン・ジホスファターゼ、チロシナーゼ、およびビリルビン・オキシダーゼなどである。対象となる糖特異的酵素は、グルコース・オキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼなどである。

また、本発明に係る結合体における生物活性成分として使用するのに適しているのは、インビボで生物活性を示す化合物である。該化合物は、アミノ酸配列、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、抗体断片、一本鎖結合蛋白質（例えばＬａｄｎｅｒ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号を参照。この開示内容は、参照として本明細書に組み込まれる）、可溶性レセプターを含む結合分子、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、触媒性抗体、および抗体またはその断片の融合産物などであるが、これらに限定されるものではない。

蛋白質またはその一部は、化学合成、細胞、組織または器官の培養、動物源からの抽出など当業者に既知の技術を用いて、または組換えＤＮＡ法によって調製または単離することができる。アミノ酸配列、ポリペプチド、および蛋白質など組換え遺伝子源も考慮されている。前記材料は、例えばマウス、ウサギ、ブタ、ヤギおよびウシなどの遺伝子組換え動物から得ることができるが、蛋白質は、ミルク、血液または組織で蛋白質が発現され、または、遺伝子組換え鳥類の卵で発現される。遺伝子組換え昆虫、真菌類、またはバキュロウイルスの発現系も材料源として考えられる。さらに、蛋白質の変異型も本発明の範囲に含まれる。

対象となる他の蛋白質は、ブタクサ、抗原Ｅ、ミツバチ毒、ダニアレルギー源などのアレルギー性蛋白質である。上記したものは、本発明に適した蛋白質を例示したものである。当然ながら、本明細書に具体的に記載されていないが、本発明に係る１種類以上のポリマーと結合するのに適した１種類以上の利用可能なアミノ基またはチオール基をもつ他のペプチド、ポリペプチドもしくは蛋白質またはその断片も意図されており、本発明の範囲内に含まれる。

本発明の好適な態様において、ポリマー結合できる化合物は、例えばヒトを含む哺乳動物などの動物の、治療が望ましい状態に対する治療において医薬品または診断に用いるのに適した生物活性型化合物である。上記リストは例示的なものであって、修飾しうる化合物を限定するためのものではない。当業者は、過度な実験を行うことなく、他の同様の化合物を同様に修飾できることを理解している。当然のことながら、具体的に記載されていないが、本発明に係る１種類以上のポリマーと結合するために接触可能なアミノ基またはチオール基など、１種類以上の利用可能な求核基をもつ生物活性物質も目的とされており、本発明の範囲内に含まれる。

本発明に係る結合体に取り込まれるのに適した生物活性成分は、結合体になっている間、または結合体から加水分解によって遊離した直後にはそれ自体の活性がなくても、さらに化学的プロセシングまたは反応を受けた後活性型になる物質または化合物でもよいことが知られている。例えば、本発明の結合体の形で血流に運搬される抗癌剤は、癌細胞または腫瘍細胞に入り込んで、例えばその細胞にユニークなまたは特別に有効な酵素反応によって癌細胞または腫瘍細胞の中で起こる化学的プロセスによって活性化されるまでは不活性のままである。

本発明に係る結合体および組成物において生物活性化合物として使用されるのに適した他の化合物は、カンプトテシンおよびそれに関連するトポイソメラーゼＩのインヒビターのような、ヒドロキシル基含有化合物などである。カンプトテシンは、中国原産の木カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｃｕｍｉｎａｔａ）、およびインド原産の木クサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ ｆｏｅｔｉｄａ）から産生される水に対して不溶性の細胞毒性アルカロイドである。カンプトテシンおよびそれに関連する化合物、ならびにそのアナログも抗癌剤または抗腫瘍剤の可能性があることが知られており、これらの活性をインビトロおよびインビボで示すことが明らかになっている（例えば米国特許第４，９４３，５７９号および第５，００４，７５８号、および再発行第３２，５１８号を参照。これらの内容は、参照として本明細書に組み込まれる）。該化合物およびそれらの誘導体は、過度な実験を行うことなく、既知の合成法を用いて生成することができる。ここで使用しうる好適なカンプトテシン誘導体は、本発明に係る単官能性の活性化ＰＥＧなどの活性化型ポリマーと直接反応することができる２０−ＯＨ基または別のヒドロキシル基を含む。

本発明の結合体において生物活性化合物として使用されるのに適したさらに別のヒドロキシル基含有部分には、タキサンおよびパクリタキセル誘導体などがある。本発明の目的にとって、「タキサン」という語は、テルペン類のタキサンファミリーに含まれるすべての化合物を包含する。したがって、タキソール（パクリタキセル）、３’−置換型ｔ−ブトキシカルボニル−アミン誘導体（タキソテール）など、および、通常の有機技術を用いて容易に合成でき、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの販売元から調達可能なその他のアナログが本発明の範囲に含まれる。これらの化合物およびそれらの誘導体は、有効な抗癌剤であることが分かっている。数多くの研究が、これらの薬剤にはさまざまな悪性腫瘍およびその他の癌に対する活性があることを指摘している。

当業者には理解できるように、当技術分野において既知であり容易に利用できる生物活性成分は、本発明にしたがって、低抗原性、実質的に低抗原性、または検出不能な抗原性を有する単官能性ポリマーと複合するのに適している。本発明の一定の態様によれば、これらの初期生物活性成分を用いて、１個以上のＰＡＧまたはＰＡＯが生物活性分子に共有結合している結合体を産生する。ポリマーが結合しうる初期生物活性成分の分子上の部位は、有利にもペプチド分子上にリジン残基を含み、この残基はそれぞれ２個のアミノ基を有する。これらのアミノ基の一方（アルファアミノ基）は、（リジンが蛋白質のアミノ末端残基でないときは）ペプチド結合形成に関与するが、残りの残基（イプシロンアミノ基）はポリメラーゼ結合に利用可能なままである。ポリマーが有利に結合できる、蛋白質またはペプチド分子上のこの他の部位は、とりわけ、ポリペプチドのアミノ末端残基にあるアルファアミノ基、蛋白質またはペプチド上にあるシステイン残基のスルフヒドリル基（Ｂｒａｘｔｏｎ，Ｓ．Ｍ．，米国特許第５，７６６，８９７号）であって、これには、ビニルスルホン、マレイミド、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、または、当技術分野において知られているチオール反応性基の中ではとりわけオルトピリジルジスルフィドによって活性化されたポリマーが結合できるスルフヒドリル基、フェニルグリオキサールによって活性化されたポリマーが結合できる、蛋白質またはペプチド上のアルギニン残基のグアニド基（Ｓａｎｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０９３，５３１号）、Ｃ−末端残基のアルファカルボキシル基、蛋白質またはペプチド上のアスパラギン酸残基のベータ・カルボキシル基、および蛋白質またはペプチド上のグルタミン酸残基のガンマ・カルボキシル基（Ｓａｋａｎｅ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １４：１０８５−１０９１）であって、ポリマーのアミノ誘導体またはヒドラジン誘導体が結合できるカルボキシル基などである。もちろん、１種類以上のポリアルキレンオキシドが有利に結合できる、蛋白質またはペプチド分子上にある別の適当な部位も、特に、ペプチドの一次構造および三次構造ならびに本明細書の開示内容を考慮すれば、当業者には容易に明らかであろう。

標的生物活性成分（例えば蛋白質）にポリマーを結合させる前に、不純物を取り除くために成分を精製するのが有利なことがあり、そうでない場合、本来の成分の修飾程度を解析しても、成分の断片と別の不純物がポリマー結合体を形成することによって複雑な状態になる可能性がある。生物活性成分の精製は、複合すべき蛋白質が、天然のものから得られたか、組換え法によって生成されたかに関係なく有益である。なぜなら、どちらに由来するものであっても、調製物には不純物が存在すると考えられるからである。一定の生物活性成分の精製には、電気泳動、透析、塩抽出法（硫酸アンモニウム沈殿法）、クロマトグラフィー（アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、中高圧液体クロマトグラフィー（「ＦＰＬＣ」など）、またはこれらを併用したもの等があるが、これらに限定されない、当業者によく知られた、当技術分野において公知の方法によって行うことができる。しかし、当然のことながら、粗調製物中の生物活性成分（特には蛋白質）も、本発明に係る方法によって、有利にポリマーと結合させることができるため、一定の生物活性成分の精製は、本発明に係るポリマー−生物活性成分結合体の調製にとって必須ではない。

（ポリマーの生物活性成分への結合）
上記したように、好ましくは、共役基との反応によって活性化されている、本発明を実施するときに使用されるＰＡＧは、生物活性成分分子上に存在しうるいくつかの基、例えば、ペプチド結合に関与しないカルボキシル基またはアミノ基、チオール基、およびフェノールヒドロキシル（ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙｌ）基のいずれかに結合することができる。一定のペプチドまたは蛋白質にとって、活性化されたＰＡＧが、Ｎ−末端アルファアミノ基に、および／またはリジン残基のアミノ基に、および／またはシステイン残基のスルフヒドリル基に結合するのが好適である。

粗精製または精製済みの生物活性成分（例えば蛋白質）は、アルカリ性による蛋白質の不活性化を逆転させることができるｐＨ約１１または最高のｐＨから、酸性による蛋白質の不活性化を逆転させることができるｐＨ５または最低のｐＨまでの範囲内のｐＨをもつバッファーの中で、活性化されたポリマーとインキュベートすることができる（Ａｒａｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２９：１０６５−１０６８）。当技術分野において知られているように、また、当業者であれば容易に認識できるように、ポリマーを蛋白質に結合させるのに低いｐＨを用いることは、一定の蛋白質または結合化学法にとっては望ましいことがある。しかし、高いｐＨの利用は、蛋白質の可溶性および安定性に対するｐＨの効果、および、当技術分野において公知の方法によってポリマーが標的蛋白質に結合する速度に対する活性化ポリマーの（自然に、または蛋白質自身による触媒による）不活性化速度によっては、一定の別の蛋白質または一定の結合化学法にとって有利なことがある。

ＰＡＧと生物活性成分の間の反応は、通常、溶液中、好ましくは、約５から約１１の範囲内のｐＨを提供できる水性バッファー溶液中で行われる。ＰＡＧを蛋白質性の生物活性成分（例えばポリペプチド、ペプチド、蛋白質、またはそれらの断片）に結合させるのに特に好適なのは、約７から約９のｐＨ値であり、最も好ましくは約７から約８である。別の実施態様において、約４．５から約６．５のｐＨ値が好適である。２５℃でこれらの範囲のｐＨ値を提供できるバッファー溶液の例には以下のものがあるが、これらに限定されるものではない。
５０ｍＬの０．１モル濃度のリン酸二水素カリウム＋５．６から４６．１ｍＬの０．１モル濃度ＮａＯＨを１００ｍＬに希釈したもの。
５０ｍＬの０．０２５モル濃度ホウ酸＋２．０から２０．５ｍＬの０．１モル濃度ＨＣｌを１００ｍＬに希釈したもの。
５０ｍＬの０．０２５モル濃度ホウ酸＋０．９から１８．３ｍＬの０．１モル濃度ＮａＯＨを１００ｍＬに希釈したもの。
５０ｍＬの０．０５モル濃度重炭酸ナトリウム＋５．０から１０．７ｍＬの０．１モル濃度ＮａＯＨを１００ｍＬに希釈したもの。
５０ｍＬの０．０５モル濃度酢酸＋５．０から３０ｍＬの０．１モル濃度ＮａＯＨを１００ｍＬに希釈したもの。
５０ｍＬの０．０５モル濃度Ｔｒｉｓ ＨＣｌ＋１０から５０ｍＬの０．１モル濃度トリス塩基を１００ｍＬに希釈したもの。
特定の所望のｐＨを提供するのに使用すべき酸または塩基の量の正確な調整は、当業者によって容易に決定しうることである。

もし、所定の場合に、生物学的バッファーの使用が必要になったら、以下のもののうちの一つを使用することができる。

ヒドロキシエチルピペリジン−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）
３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）
３−（Ｎ−モルフォリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳＯ」）
ピペルジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（「ＰＯＰＳＯ」
）
ＰＡＧと生物活性成分の間の反応は、通常、不活性化または変性を生じさせることのない条件下で、例えば、生物活性成分が実質的な生物活性を維持する温度で、また、反応物の適切な混合を確実に行うのに必要な程度以上の攪拌は行わないで行われる。ＰＡＧと生物活性成分の間の反応は、好ましくは約４℃から約４０℃の範囲内の温度で行われる。より好ましくは、約４℃から約８℃、または室温、すなわち約２０℃から約２５℃で行われる。ＰＡＧと、例えばペプチドおよび生物活性有機化学物質などの非蛋白質性生物活性成分との間の反応は、ＰＡＧに結合される特定の生物活性有機化学物質の安定性に適合する場合より高いまたはより低い温度で行うことができる。

生物活性成分の量に対する使用ポリマーの量が、生物活性成分に対するポリマー結合の所望の程度に依存することは、当業者には容易に理解できよう。例えば、ＰＡＧを、特定の割合の溶媒接触可能なリジン残基（生物活性成分がポリペプチドの場合）と反応させることが望ましい場合には、結合すべきリジンのモル濃度以上のＰＡＧのモル濃度が必要であろう。生物活性成分の分子上の溶媒接触可能部位のすべてよりは少ない部位を誘導体化する場合には、明らかにそれに応じて、より少ないＰＡＧが必要となる。しかし、一般的には、過剰なモル濃度のＰＡＧを使用する場合には、本発明者らは、２から１０までの次数でモル濃度が過剰であることが好適であると判断している。

反応に必要な時間は、反応温度、反応物の濃度、および所望の誘導体化の程度など、いくつかのファクターによって変わる。サイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動によって時間を置いて試料を分析するなど、常法によって反応の経過を監視することができる。過剰なアミン反応性ＰＡＧを取り除くため、反応性基を有する低分子化合物、例えばグリシンを加えることによって、またはクロマトグラフィーによる分画によって、所望であれば、反応を適宜終わらせることができる。室温では、ＰＡＧを生物活性成分のほとんどの結合基（例えば、ポリペプチド鎖のリジン基）と反応させるには約１５分間から２４時間という反応時間が一般的には必要とされよう。温度が低くなると、より長い反応時間が必要となる場合がある。当業者は、ＰＡＧの量とタイプだけでなく、結合させる時間も、使用される生物活性成分を不活性化させるようなものであってはならない。すなわち、生物活性成分の生物学的活性を実質的に喪失させてはならない。「生物活性成分の生物学的活性を実質的に喪失させない」とは、ＰＡＧ複合生物活性成分が、ＰＡＧと複合していない同じ生物活性成分によってインビトロまたはインビボで示される生物活性（例えば酵素活性、レセプター結合能力、抗腫瘍活性など）のレベルの約１０％以上、好ましくは約２０％、３５％、５０％、７５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高いレベルの生物活性を示すことを意味する。

ポリマー結合生物活性成分の精製は、当業者が広く用いる手段、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、透析などによって行うことができる。反応生成物の溶液は、必要に応じて、ロータリー・エバポレータを用いて濃縮することができ、生成物を凍結乾燥によって乾燥状態にして得ることもできる。

使用される特定の生物活性成分、およびそれがＰＡＧと反応させられる程度によっては、生じる付加体は、反応させていない生物活性成分と比べて、生物学的活性の有効レベルを維持しつつ、低い抗原性および免疫原性、高い循環寿命、および高い安定性を示して、診断上または治療上有効であると期待される。

求核試薬および活性化ポリマーのｐＨ要求に応じて緩衝することができる水性反応媒体の中で、生物活性成分を、上記した単官能性の活性化分枝状ポリ（エチレングリコール）ポリマー（特に１種類以上の単官能性に活性化された分枝状ヒドロキシＰＥＧ、例えばジヒドロキシＰＥＧ）と反応させることができる。反応のための最適なｐＨは、通常、ほとんどのポリペプチドの可溶性と安定性を維持するための約６．５から約８．５であり、好ましくは約７．４である。活性化ＰＡＧ、例えばＮＰＣ−ＰＥＧを哺乳動物ウリカーゼに結合させるのに最適なｐＨは、およそｐＨ １０であり、一方、一定の活性化ＰＡＧを、蛋白質またはペプチドのＮ−末端アルファアミノ基に選択的に結合させるのに最適なｐＨは、約４から約７の範囲にある。生物活性成分の安定性、反応効率などを維持するのに必要な最適な反応条件は、当業者が決めうることである。好適な温度範囲は、約４℃から約４０℃である。反応温度は、求核試薬が変性または分解する温度を超えてはならない。求核試薬は、過剰量の活性化分枝状ポリマーと反応させることが好適である。反応後、結合体は、ダイアフィルトレーション、カラムクロマトグラフィー、それらを併用したものなどにより回収・精製される。

分子モデリングを使用することによって、蛋白質へのポリマーの結合を最適化する方法が容易になる。例えば、Ｘ線結晶データを用いて、蛋白質の接触可能な表面のコンピュータ画像を生成することができる（Ｓａｙｌｅ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２０：３７４−３７６）。また、核磁気共鳴測定法に基づく構造解析もこの点で有益である。特定の活性化ポリマーが反応しうる接触可能部位の分画、およびさまざまな部位の間でのポリマー鎖の分布は、適当な活性化基、蛋白質に対するポリマーのモル比、および結合反応の適当な条件（例えばｐＨ、温度、反応物の濃度、インキュベート時間）を選択することによって調節することができる。一定の環境において、生物活性への悪影響を最小限に抑えるのに十分な程度酵素の活性部位から離れた残基にポリマーを結合させる方が有利なこともある。例えば、プロテイナーゼＫの表面は、さまざまな化学法により活性化されたポリマーが結合できる部位を多く含んでいる。しかし、プロテイナーゼＫの溶媒接触が可能なリジン残基のほとんどが、触媒部位から比較的遠く離れた酵素領域に専ら位置しているという本発明者らの数名による以前の発見によって、この具体的な酵素については、アミン反応性ポリマーの使用が特に望ましいものとなる（２００２年６月２８日に出願された共同所有の同時係属米国特許出願第１０／１８３，６０７号を参照。これは、その全文が参照として本明細書に組み込まれる）。

一定の実施態様において（例えば、触媒部位が、活性化ポリマーが反応できるアミノ基（上記したものなど）を含む酵素の場合）、活性部位を活性化ポリマーが接触しないよう保護するのが望ましい場合がある。その場合、活性部位の中またはその近傍にある反応性残基に活性化ポリマーが接触することを立体構造的に妨害できるほどに大きな基質アナログまたは競合的インヒビターをしっかりと、しかし可逆的に結合させることができる（例えばＮａｈｒｉ，Ｌ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ １０：３８５−３８９）。あるいは、そのようなアナログまたはインヒビターを、後で蛋白質を吸着できる固体基質に結合させることもできる。その結果できる「アフィニティーマトリックス」に結合している間に、蛋白質は、活性化ポリマーと反応することができる。この方法は、反応性ポリマーが、触媒を阻害するような部位に結合するのを最小限に抑えることができる。そして、選択的に修飾された蛋白質は、その後当業者に既知の方法によって、アフィニティーマトリックスから遊離させることができる（Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １０４：３−５５を参照）。出来上がった結合体は、該蛋白質の生物活性を損なわない部位にポリマーが選択的に結合している蛋白質分子を含むことができる。

結合反応の後、さまざまな程度に誘導体化された結合体を、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）前掲に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーを用いて、互いに分離することができる。例えば、登録商標名Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５のＨＲ １０／３０カラムまたは登録商標名Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００のＨＲ １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、残留している遊離のＰＥＧおよび共役反応の副生成物からの分離だけでなく、さまざまな程度にＰＥＧ化された蛋白質分子を分離することが可能である（共同所有の同時係属米国特許出願第１０／１８３，６０７号、前掲を参照）。

（組成物）
本発明は、本発明の方法によって生成される低抗原性のＰＥＧ化された生物活性成分の安定化された結合体を提供する。関連する態様において、本発明は、該結合体を１種類以上含む組成物も提供する。本発明のこの態様に係る組成物は、上記した本発明の結合体を１種類以上（例えば、１、２、３、４、５、１０種類など）含む。一定の前記態様において、組成物は、１種類以上の緩衝塩、１種類以上のカオトロピック剤、１種類以上の界面活性剤、１種類以上の蛋白質（例えば１種類以上の酵素）、１種類以上のポリマーなど、１種類以上の補助成分を含むことも可能である。本発明のこの態様の組成物は、固体（例えば乾燥粉末）または溶液（特に、１種類以上の本発明の結合体を含む、生理学的に適合する緩衝塩溶液）など、どのような形態であってもよい。

（薬学的組成物）
本発明の一定の組成物は、具体的には、予防、診断または治療という用途に使用するための薬学的組成物として用いるために製剤される。該組成物は、典型的には、１種類以上の本発明に係る結合体および１種類以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。本明細書において「薬学的に許容される担体または賦形剤」という語は、あらゆるタイプの非毒性の固体、半固体または液体の増量剤、希釈剤、カプセル用素材、または製剤用の補助剤など、それを添加することによって生じる副作用なしに、該薬学的組成物を取り込むヒト、その他の哺乳動物などのレシピエント動物によって忍容され得るものを意味する。

本発明の薬学的組成物は、経口的、経直腸的、非経口的、全身内、経膣的、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、点滴剤、または経皮貼付などによって）、口腔粘膜内、口腔内もしくは鼻腔内スプレー、または吸入によるなど、あらゆる適切な投与形態によって、レシピエントに投与することができる。本明細書において「非経口的」という語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、槽内、皮下、および関節内への注射および注入を含む投与形態を意味する。

本発明によって提供される非経口の注射用薬学的組成物は、薬学的に許容される滅菌された水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液、または乳液、および、使用直前に注射液または分散液に再構成される滅菌された粉末を含むことが可能である。適当な水性または非水性の担体、希釈剤、溶媒または媒体の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール）など）、カルボキシメチルセルロース、およびこれらの適当な混合物、植物油（オリーブオイルなど）、ならびにオレイン酸エチルなどの有機エステル類などである。例えば、レシチンなどのコート剤を使用して、分散液の場合には、必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用して、適切な流動性を維持することができる。

また、前記本発明の薬学的組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含むことも可能である。例えばパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤を含ませることによって、さまざまな微生物の作用を確実に防止することができる。また、糖類、塩化ナトリウムなどの浸透物質を含むことが望ましいこともある。モノステアリン酸アルミニウム、ヒドロゲル、およびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を包含することにより、注射用薬剤形を長時間にわたって吸収させることが可能になる。

場合によっては、薬剤の効果を長期化させるために、皮下または筋内に注射してゆっくりと吸収させることが望ましい。これは、可溶性の低い結晶物質またはアモルファス物質の懸濁液を水性の体液内で使用することで達成できる。そして、薬剤の吸収速度は、その溶解速度によって決まり、それは、その物理的形状に依存することがある。あるいは、非経口投与される剤形の遅延吸収は、薬剤を油性媒体に溶解または懸濁して達成される。

注射用の持続性剤形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生物分解性ポリマーの中でマイクロカプセルに入った薬剤のマトリックスを形成させて作製することができる。担体ポリマーに対する薬剤の割合、および使用する具体的な担体ポリマーの性質に応じて、薬剤放出速度を調節できる。別の生物分解性ポリマーの例は、生物適合性ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）などである。持続性の注射用製剤も、生体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬剤をトラップさせて調製することができる。

注射用製剤は、例えば、細菌保持濾紙による濾過によって、または使用前に滅菌水またはその他の滅菌注射媒体に溶解または分散させることができる滅菌された固体組成物の形をした滅菌剤を取り込むことによって滅菌することができる。

経口投与用の固体剤形には、カプセル、タブレット、ピル、粉末、および顆粒などがある。該固体剤形では、活性化合物は、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなど、薬学的に許容される賦形剤または担体、および／またはａ）スターチ、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などの充てん剤または増量剤、ｂ）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアラビアゴムなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、一定のケイ酸、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶液制動剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、ｆ）第４アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイトクレイなどの吸着剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリ（エチレングリコール）、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物などの潤滑剤と混合される。カプセル、タブレットおよびピルの場合、剤形は、緩衝剤を含むことも可能である。

ラクトース（乳糖）および高分子量ＰＥＧなどを賦形剤として用いたソフトゼラチンカプセルまたはハードゼラチンカプセルの充てん剤として、同様のタイプの固体組成物を用いることも可能である。

タブレット、糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒の固体剤形は、腸溶コーティングまたは時間調節コーティング（ｃｈｒｏｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｃｏａｔｉｎｇ）、および医薬製剤分野において公知の他のコーティングまたは外衣を用いて調製することができる。それらは、混濁剤を選択的に含むことができ、また、胃腸管の一定の部分のみで、またはそこで選択的に、有効成分を、選択的には遅延するように放出するような組成物にすることも可能である。使用することができる包埋用組成物の例は、ポリマー物質または蝋などである。活性化合物は、適当であれば、上記賦形剤の１種類以上によるマイクロカプセルの形であってもよい。

経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容される乳液、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル液などである。活性化合物以外に、液体剤形は、例えば水、その他の溶剤など、当技術分野において一般的に使用されている不活性希釈剤、安定化剤、およびエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ＰＥＧならびにソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物などの乳化剤を含むことができる。

経口用組成物は、不活性希釈剤以外に、湿潤剤、乳化ならびに懸濁剤、甘味剤、風味剤、および香料を含むことができる。

懸濁剤は、活性化合物以外に、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールならびにソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、およびこれらの混合物などの懸濁剤を含むことができる。

局所投与は、肺や眼の表面など、皮膚または粘膜への投与を含む。吸入用組成物などの局所投与用組成物は、加圧されたまたは無加圧の乾燥粉末として調製することができる。無加圧粉末組成物では、細かく分割された形状の有効成分を、例えば直径１００マイクロメータまでの大きさをもつ粒子を含む、より大きな薬学的に許容される不活性担体と混合して用いることができる。適当な不活性担体は、ラクトースおよびスクロースなどの糖類などである。望ましくは、有効成分粒子の少なくとも重量の９５％以上が、０．０１から１０マイクロメータの範囲の有効粒子サイズを有する。

あるいは、薬学的組成物は加圧することが可能で、窒素または液化ガス推進剤などの圧縮ガスを含むことが可能である。液化ガス推進剤媒体、および実際には全組成物を、好ましくは、有効成分がその中では実質的な程度にまで溶解しないようにすることができる。加圧組成物には界面活性剤を含むこともできる。界面活性剤は、液体または固体の非イオン性界面活性剤でもよいし、固体の陰イオン性界面活性剤でもよい。ナトリウム塩状になった固体の陰イオン性界面活性剤を使用するのが好適である。

局所投与の別の形態は眼への投与である。この投薬の方式では、本発明の結合体または組成物は、薬学的に許容される眼科用媒体に入れて、活性化合物が、結膜または角膜および眼の内部領域、例えば前眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／睫毛、レンズ体、脈絡膜／網膜および強膜を通過するのに十分な時間眼の表面と接触し続けるように運搬される。薬学的に許容される眼科用媒体は、例えば軟膏、植物油またはカプセル入りの物質であろう。

直腸または膣に投与するための組成物は、好ましくは、本発明の結合体または組成物を、ココアバター、ＰＥＧまたは坐薬用ワックスなど、室温では固体であるが、体温で液体になり腸や膣の中で溶けて薬剤を放出する適当な非刺激性の賦形剤または担体と混合して調製できる坐剤である。

本発明の治療法で使用される薬学的組成物は、リポソームの形で投与することも可能である。当技術分野において知られているように、リポソームは、一般的に、リン脂質またはその他の脂質物質から得られる。リポソームは、水性媒体中に分散している一層または多層の水和脂質によって形成される。非毒性で生理学的に許容され代謝可能な脂質であって、リポソームを形成できるものが使用されうる。１種類以上の本発明の結合体または組成物以外に、リポソームの形になった本発明の薬学的組成物は、１種類以上の安定化剤、防腐剤、賦形剤などを含むことができる。好適な脂質は、リン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）で、天然のものでも合成されたものでもよい。リポソームを形成する方法は当技術分野において知られている（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．米国特許第５，３９５，６１９号を参照）。ＰＥＧと結合したリン脂質、もっとも一般的にはｍＰＥＧに結合したホスファチジル・エタノアミンを含むリポソームは、哺乳動物の循環血液中での半減期が長いことなど、有利な特性をもつ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．，米国特許第６，１３２，７６３号）。より有利なことには、本発明のヒドロキシＰＥＧは、このようなＰＥＧ−リポソームにおいてｍＰＥＧの代わりとされ得る。一番有利なことは、ＰＥＧ−リポソームの中に取り込まれるＰＥＧ−ジアシルグリセロールを合成する場合に、活性化ｍＰＥＧの代わりに本発明に係る単官能性活性化ヒドロキシＰＥＧを使用できることである。

（用法）
本発明の結合体または組成物は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に投与して、活性化合物に対する免疫応答を促進することができる。当業者は、所定の活性化合物、結合体または組成物の有効用量を経験的に決定できること、および精製された形で、または、薬学的に許容される製剤またはプロドラッグという形でも、もしそのような形態が存在するのであれば使用できることを理解できよう。本発明の化合物、結合体または組成物は、獣医学的または薬学的な組成物として、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、それを必要としている動物またはヒト患者に投与することが可能である。当然のことながら、ヒト患者に投与するときには、本発明の結合体または組成物の一日、一週または一月当たりの総使用量を、健全な医学的判断の範囲内で主治医が決定することになる。各患者にとって治療上有効な用量レベルは、目的とする細胞応答のタイプと程度、使用する具体的な化合物、結合体または組成物の実体および／または活性；患者の年齢、体重、体表面積、総合的な健康状態、性別、食事内容、および活動量；投与時間、投与経路、および活性化合物の排出率；具体的な化合物、結合体または組成物と併用または同時に使用される他の薬剤；ならびに薬学および医学分野において当業者に公知のその他の要素など、さまざまな要素によって異なる。例えば、所定の本発明の化合物、結合体または組成物の用量を、所望の治療効果を達成する場合に必要なレベルよりも低いレベルから開始して、徐々に所望の効果が達成されるレベルまで増やして行くことも、当業者が適宜行いうることである。

また、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣなど当技術分野において許容され、日常的になっている技術によって決定された、所定の活性化合物の所定の血中濃度を提供できるように、患者に特異的な方法で用法を設定することも可能である。このようにして、医学、薬学および／または薬理学の各分野において当業者に日常的かつ周知の方法に従って、ＨＰＬＣによって測定しながら、比較的一定の血中濃度が達成されるように、患者の投薬計画を調整することも可能である。

（診断および治療用途）
本発明の結合体の診断への使用は、本発明のポリマー結合抗体であって、該結合体の蛋白質成分またはポリマー成分のいずれを標識して、例えば、以下で論じるような光学的検出法、放射分析検出法、蛍光検出法または共鳴検出法による検出を可能にする結合体を投与して、動物、特にヒトの体内にある、例えば癌などの抗原性部分の位置を決めるために行われる場合がある。

本発明に係るＰＡＧ生物活性化合物結合体（好ましくは、この結合体を含む組成物として投与される）は、非常に長い循環半減期を有し、インビボで低い抗原性および免疫原性を有すると予測されている。これらの特性は、多くの治療用化合物（特に、本発明の結合体において成分として使用されているような生物活性化合物）を治療目的で、動物、特にヒトまたは他の哺乳動物に取り込ませたときに見られる血液循環からの速やかなクリアランスを緩和または軽減させる。また、本発明に係る結合体および組成物の使用は、これら以外のものでは患者の免疫応答を誘発する可能性があるという、特定の生物活性化合物または成分を繰り返し投与することに関する生物活性化合物の循環血からのクリアランス速度を高める（それによって、診断または治療の有効性が低下する）こと、および患者に対して副作用を引き起こすことなどである。

したがって、本発明の別の態様において、例えば、さまざまな身体疾患の診断、治療または予防を、そのような疾患に罹りやすいか、疾患に罹っている動物、特に、ヒトなどの哺乳動物において行うときに、本発明に係る結合体および組成物を診断法または治療法に使用することができる。該方法において、治療目標は、疾患の発症を遅延または予防し、および／または疾患の治癒または鎮静を誘発し、および／または他の治療法の副作用を低下または最小限に抑えることである。したがって、本発明に係るＰＡＧ−生物活性成分の結合体および組成物は、感染症または病気などの身体疾患の防御、抑制または治療に用いることができる。本明細書において、身体疾患からの「防御」という語は、「阻止」、「抑制」および「治療」を包含する。「阻止」とは、疾患や身体的異常が誘発される前に、本発明に係る結合体または組成物を投与することを意味し、一方「抑制」とは、疾患が臨床的に確認される前に、本発明に係る結合体または組成物を投与することを意味する。したがって、身体疾患の「阻止」および「抑制」は、典型的には、該疾患に対して素因か感受性を有しているが、まだ罹患していない動物において行われる。しかし、身体疾患の「治療」は、病気が現れた後、治療用の結合体または組成物を投与することを意味する。当然のことながら、ヒトでの医学または獣医学において、身体疾患を「阻止」しているのか、「抑制」しているのかを区別することは必ずしも可能でない。多くの場合において、最終的にもたらされる結果は不明であるか表面に出ないため、患者も医師も、それが起きたずっと後になるまでもたらされる結果に気づかない場合がある。したがって、「治療」とは異なり、ここで定義した「阻止」および「抑制」の両方を含む「予防」という用語を使用するのが一般的である。したがって、本発明の方法によって使用される「防御」という語は、「予防」を含む意味である。

本発明の本態様による方法は、臨床家が上記の治療目標を達成できるように一つ以上のステップを含むことが可能である。前記本発明の方法の一つは、例えば、以下のステップを含む。
（ａ）身体疾患に罹患したか、その素因をもつ動物（好ましくは、ヒトなどの哺乳動物）を同定するステップ；および
（ｂ）有効量の１種類以上の、本明細書に記載したような本発明に係る化合物または組成物、特に１種類以上の生物活性成分のＰＡＧ結合体（または該結合体を含む１種類以上の薬学的組成物）を該動物に投与して、該化合物または組成物の投与によって、動物における身体疾患の発生を阻止、遅延、または診断し、またはそれを治癒または寛解を誘発するステップ。

本明細書において、身体疾患に対して「素因をもつ」動物とは、その疾患のはっきりした身体的症状を複数示すわけではないが、遺伝的、生理学的、あるいはそうでない場合、その疾患を発症するリスクをもつ動物と定義される。本方法において、一定の身体疾患に対して素因のある、リスクをもつ、またはそれに罹患している動物（ヒトなどの哺乳動物）の同定は、例えば、放射線アッセイ法、生化学的アッセイ法（例えば、動物から得た試料中の特定のペプチド、蛋白質、電解質などの相対的レベルのアッセイ法など）、外科的方法、遺伝子スクリーニング、家族歴、身体の触診、病理学または組織学的な検査（例えば、組織試料もしくは体液試料または塗抹標本の顕微鏡による評価、免疫学的アッセイ法など）、体液検査（例えば血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、***など）、画像化（例えば放射線、蛍光、光学、共鳴（例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）など）など、臨床家に公知の常法にしたがって行うことができる。１種類以上の上記の方法によって動物が同定されたら、該動物を挑戦的および／または積極的に治療して、身体疾患を阻止、抑制、遅延または治癒することができる。

本発明に係る結合体、組成物および方法で予防、診断、または治療できる身体疾患は、結合体の生物活性成分を予防、診断、または治療に使用できる身体疾患をすべて含む。該疾患は、さまざまな癌（例：乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、白血病、リンパ腫、肺癌、神経系の癌、皮膚癌、頭部および頸部の癌、骨癌、結腸およびその他の消化管の癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌およびその他の腫瘍、肉腫、腺腫、および骨髄腫）；感染症（例：細菌病、真菌病、ウイルス病（肝炎およびＨＩＶ／ＡＩＤＳなど）、寄生生物病など）；遺伝的疾患（例：嚢胞性線維症、筋委縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、ゴーシェ病、ポンペ病、重症複合型免疫不全症など）；貧血、好中球減少症、血友病、およびその他の血液病；神経系疾患（例：多発性硬化症およびアルツハイマー病）；酵素疾患（例：痛風、高尿酸血症、高コレステロール血症など）；病因不明の疾患（例：循環器疾患、高血圧など）、およびその他、当業者に公知であって医学的に重要な疾患などであるが、これらに限定されるものではない。また、本発明に係る組成物および方法を、前癌病変から癌病変に進行する過程を化学的に予防するなど、病気の進行を阻止する場合に使用することも可能である。

このように、本発明に係る治療法は、１種類以上の本発明に係る結合体、または１種類以上の本発明に係る組成物であって、それを必要とする動物に、経口的、経直腸的、非経口的（静脈内、筋肉内、腹腔内、槽内、皮下、および関節内への注射および注入）、全身内、経膣的、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、点滴剤、または経皮貼付などによる）、口腔粘膜内、口腔内もしくは鼻腔内スプレー、または吸入によるなどして、さまざまな経路によって投与することができるものを使用する。本発明によって、有効量の結合体または組成物を、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に投与することが可能で、また、特定の疾患に罹患しているか、それに対する素因をもつ動物に投与して、該動物における疾患を予防、遅延、診断または治療することができる。本明細書において、「有効量の結合体（組成物）」とは、結合体が、該結合体の生物活性成分の生物活性を実行することによって、本発明の結合体が投与されている動物の身体疾患を予防、遅延、診断、治療または治癒することを意味する。当業者は、薬学および医学分野における当業者にとって公知の常法にしたがって、本発明に係る結合体または組成物の有効量を実験的に決定することができる。例えばＢｅｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９９）Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ；Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹ；Ｓｐｅｉｇｈｔ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９７）Ａｖｅｒｙ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ；Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．Ｇ．（２０００）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴを参照。これらの文献およびそこに引用されている文献は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

当然のことながら、ヒト患者に投与するときには、本発明の結合体または組成物の一日、一週または一月当たりの総用量を、健全な医学的判断の範囲内で主治医が決定することになる。例えば、本発明の結合体または組成物の一定のものを、使用する具体的な生物活性化合物に応じた適当な投薬量を投与することによって満足のゆく結果が得られるが、これらの投薬量は、当業者に容易に分かるか、日常的な実験を用いて容易に実験的に決定することができる。本発明のこの態様によれば、結合体または組成物は、一度に、または、例えば一日、一週または一月に２回というように、分割量にして投与することも可能である。さまざまな投与形態（例：非経口、皮下、筋肉内、眼内、鼻腔内など）にとって適当な投薬計画は、生物活性成分の実体に応じて、日常的な実験を用いて容易に実験的に決定することができるか、または当業者には容易に分かる。

さらなる応用において、本発明の結合体または組成物を用いて、該結合体の生物活性成分に対するレセプターを発現するか、それに結合するか、それを取り込みまたは吸収する細胞、組織、器官または生物に対して、診断または治療用薬剤の特異的な標的とすることができる。本発明のこの態様による方法は、例えば、細胞、組織、器官または生物を１種類以上の本発明に係る結合体であって、さらに１種類以上の診断または治療用の薬剤（好ましくは、結合体のＰＡＯまたはＰＥＧ成分に共有結合している）を含む結合体と接触させて、何らかのメカニズム（例：レセプターによるエンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、拡散など）によって、該結合体が細胞、組織、器官または生物に吸収されて、診断または治療用の薬剤が細胞、組織、器官または生物に運搬されるようにすることを含むことができる。本発明のこの態様に従って使用される診断または治療用の薬剤は、核酸、有機化合物、蛋白質、抗体、酵素、糖蛋白質、リポ蛋白質、元素、脂質、糖類、同位元素、糖質、造影剤、検出可能プローブ、またはこれらを組み合わせたものなどであるが、これらに限定されるものではなく、本明細書に記載されているように、これらを検出できるよう標識することも可能である。本発明のこの態様において使用される診断または治療用の薬剤は、標的細胞（または組織、器官または生物）に対して以下から選択される治療効果をもつが、治療効果は、これらに限定されるものではない：欠陥遺伝子または蛋白質の修正、薬物効果、毒性効果、増殖刺激効果、増殖阻害効果、代謝効果、触媒効果、同化効果、抗ウイルス効果、抗菌効果、抗細菌効果、ホルモン効果、神経液性効果、細胞分化促進効果、細胞分化阻害効果、神経修飾効果、抗新生物効果、抗腫瘍効果、インシュリン刺激または阻害効果、骨髄刺激効果、多能性幹細胞刺激効果、免疫系刺激効果、およびその他既知の治療効果であって、本発明の本態様による運搬システムによって細胞（または組織、器官または生物）に運搬された治療用薬剤によって提供されうる効果。

このさらなる治療薬剤であって、本発明に係る生物活性結合体または組成物をさらに含む薬剤は、以下から選択されるが、これらに限定されるものではない。抗生物質、ステロイド、細胞毒性因子、血管作用薬、抗体、およびその他の治療剤などの既知および新規の化合物および組成物。該薬剤の非限定的な例は、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ナフシリン、非経口性セファロスポリンなど、細菌性ショックの治療に用いられる抗生物質およびその他の薬剤；エンドトキシンによって生じる細胞傷害を軽減するデキサメタゾンなどの副腎皮質コルチコステロイドおよびそのアナログ；アルファ−アドレナリン作動性受容体遮断薬（例：フェノキシベンザミン）、ベータ−アドレナリン作動性受容体遮断薬（例：イソプロテレノール）、およびドーパミンなどの血管作用薬などの薬剤である。

また、本発明に係る結合体および組成物は、病気の診断のため、また、治療反応を観察するためにも使用することができる。該方法の一定のものにおいて、検出用に標識された本発明の結合体は、１種類以上の検出可能な標識（本明細書の別項に記載されたものなど）を含むことができる。該方法の具体的なものにおいて、このように検出用に標識された本発明の結合体を用いて、該結合体の生物活性成分に対するレセプターを発現しているか、そうでなければそれを吸収する細胞、組織、器官または生物を検出することができる。該方法の一例において、細胞、組織、器官または生物を、（例えば、結合体を細胞表面レセプターに結合させて、または結合体の細胞内へのピノサイトーシスもしくは拡散によって）細胞、組織または生物が結合体を吸収するのに有利な条件下で１種類以上の検出可能な標識をもつ本発明の結合体に接触させて、その後、使用した標識に特異的な検出手段（例えば、蛍光標識された結合体には蛍光検出法、磁気標識された結合体には磁気共鳴画像、放射性標識された結合体には放射線造影など）を用いて、結合体が結合したか、あるいはまたはそれを取り込んだ細胞を検出する。該検出用に標識された結合体のこの他の用途は、例えば、本発明の１種類以上の結合体を標識したものを有効量投与し、細胞、組織、器官もしくは生物（または動物）に結合した検出可能な放射線を測定して、細胞、組織、器官もしくは生物、または動物（ヒトなど）の内部構造を画像化することである。さまざまなタイプの標識を検出する方法と、診断および治療用造影におけるそれらの用途については、当業者が知るところであり、本明細書の別項で説明されている。

別の態様において、本発明の結合体および組成物は、結合体の生物活性成分に対する特異的なレセプターの濃度または活性を、該レセプターを発現する細胞の表面上で調節するための方法において使用することができる。所定のレセプターの活性を「調節する」とは、レセプターに結合すると、結合体が、そのレセプターを介してもたらされる生理学的活性（例えば、細胞内シグナル伝達カスケード）を活性化するか阻害することを意味する。本発明に係る結合体の調節活性に関する特定の仕組みの説明のみに制約されるものではないが、該結合体は、結合体の生物活性成分を介してレセプターに結合して、細胞レセプターの生理学的活性に拮抗し、それによって、レセプターそのものの生理学的活性を実質的に活性化することなく、本来のアゴニスト（例えば、結合体になっていない生物活性成分）の結合を遮断して、本来のアゴニストによるレセプターの活性化を阻害することができる。本発明の本態様による方法は、例えば、結合体（すなわち、結合体の生物活性成分部位）が、細胞表面上にある、生物活性成分に対するレセプターに結合するが、実質的にはレセプターを活性化しない条件下で、細胞を１種類以上の本発明の結合体と接触させる（これはインビトロでもインビボでも可能）１つ以上のステップを含むことができる。該方法は、当業者も容易に理解できるように、さまざまな診断、および治療への応用において有用であろう。

（キット）
本発明は、本発明に係る結合体および／または組成物を含むキットも提供する。該キットは、その中にバイアル、チューブ、アンプル、瓶などの容器であって、第一の容器は、典型的には、本発明に係る結合体および／または組成物を１種類以上含む容器を１個以上密封している、箱、カートン、チューブなどの運搬装置を含む。本発明の本態様に含まれる、このキットは、さらに、具体的な病気または身体疾患を診断、治療または予防するための１種類以上の成分（１種類以上の補助的な治療用化合物または組成物、１種類以上の診断用試薬、１種類以上の担体または賦形剤など）、１種類以上の本発明に係る結合体および組成物など、本発明に係る結合体および組成物の具体的な１種類以上の用途を実施するのに必要な１種類以上の補助的成分（例えば、試薬および化合物）を含むことが可能である。

関連技術分野における当業者は、本発明またはその実施態様の範囲内で、本明細書に記載した方法および用途に対して別の適当な変更または改変を行うことができることを容易に理解できよう。以上に本発明を詳しく説明したが、以下の実施例を参照することによって、さらに明確に本発明を理解できるはずである。以下の実施例は、ただ例示的な目的のために本明細書に含まれるのであり、本発明を制限するものではない。

（実施例１：モノメトキシＰＥＧに対する抗体の調製および試験）
ＰＥＧが免疫原性担持体蛋白質に結合している結合体で動物を免疫することによって、さまざまなＰＥＧに対してウサギに免疫性を与えることが以前報告されている（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７０：１２４−１３１）。マウスにβ−グルクロニダーゼのｍＰＥＧ結合体を注射し、ＰＥＧに対する抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択して、ＰＥＧのポリエーテル骨格と反応するモノクローナル抗体が開発されている（Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．−Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）、前掲；Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．−Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）前掲；Ｔｓａｉ，Ｎ．−Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１）前掲；Ｒｏｆｆｌｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，公開米国特許出願第２００１／００２８８８１ Ａ１号ならびに米国特許第６，５９６，８４９号および第６，６１７，１１８号；これらすべての開示内容は、それらの全文が参照として本明細書に組み込まれる）。ＰＥＧのポリエーテル骨格と反応する別のモノクローナル抗体が最近Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．らによって、米国特許出願第２００３／００１７０４ Ａ１号で開示されている。

ＰＥＧ−蛋白質結合体のＰＥＧを検出するための感度の高い方法を開発するために、ＰＥＧに対するポリクローナル抗体を下記のとおりに調製した。当技術分野において記載されている治療用蛋白質のＰＥＧ結合体のほとんどすべてがｍＰＥＧを用いて合成されているため、本発明者らは、ｍＰＥＧを含む結合体の免疫反応性におけるメトキシル基の役割を調べた。１０−ｋＤａのｍＰＥＧのｐ−ニトロフェニル・カーボネート誘導体は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）の子会社であるＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）によって合成された。生理学的ｐＨで蛋白質を可溶化させるのに必要な、この１０−ｋＤａ ｍＰＥＧの最低限の鎖数（３５−ｋＤＡのウリカーゼサブユニット当たりおよそ２本のＰＥＧ鎖またはｍＰＥＧ鎖）を含んだ、組換え哺乳動物ウリカーゼのウレタン結合ｍＰＥＧ結合体を調製した。このＰＥＧ量は、ウリカーゼの異常に高い免疫原性を抑制するのに十分ではなかった（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ，ＰＣＴ国際公開ＷＯ ０１／５９０７８ Ａ２、およびＫｅｌｌｙ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）前掲を参照。この開示内容は、その全文が参照として本明細書に組み込まれる）。このＰＥＧ−ウリカーゼ調製物を、フロイントのアジュバントに入れて３匹のウサギに繰り返し注射した。そして、ウリカーゼ、ＰＥＧ−ウリカーゼ結合体、およびＰＥＧに対するポリクローナル抗体を含む血清を調製するためにウサギから採血した。

フロイント完全アジュバントで一度、１〜４週間の間隔をおきながら、ＰＥＧ−ウリカーゼ調製物をフロイント不完全アジュバントで５回、各ウサギに注射した。最後から３回の注射の約２週間後にそれぞれのウサギから血液を採取した。９個の血液試料のそれぞれから血清を調製し、構造的にウリカーゼとは無関係な蛋白質のｍＰＥＧ結合体でコートされた９６−ウェルプレートを用いて酵素免疫測定法（「ＥＬＩＳＡ」）により、ＰＥＧに対する抗体について少量の血清を検査した。

各試験血液は、ＥＬＩＳＡ分析では、ＰＥＧと反応する抗血清を産生した。競合的ＥＬＩＳＡ法で測定したところ、この３匹のウサギはそれぞれ、量的に同じような反応速度で、また、ｍＰＥＧのメトキシル末端基に対して同じように特異的で、ＰＥＧによる免疫に応答した。まず、ウサギの血清中の抗ＰＥＧ抗体の感度を測定するためにドットブロット解析を行った。さまざまなサイズおよび構造のＰＥＧの溶液と、ウサギに免疫性を与えるために用いられたＰＥＧ−ウリカーゼ溶液を、ポリビニリデン・ジフルオライドのブロッティング膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ｃａｔａｌｏｇ ＃ＬＳ２００２）上にスポッティングした。この膜を２％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳でブロックした後、上記の方法で調製した、ＰＥＧ−ウリカーゼに対するウサギ抗血清の希釈液とインキュベートした。そして、ヤギで産生され、アルカリホスファターゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ｃａｔａｌｏｇ ＃４０１３７１）に結合した抗ウサギＩｇＧ抗体の希釈液を二次抗体として適用した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸とニトロブルーテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｂ−１９１１）を合わせたものを用いて、既述したように（Ｂｌａｋｅ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １３６：１７５−１９０、この開示内容は、その全文が参照として本明細書に組み込まれる）、ブロット上のアルカリホスファターゼ活性を検出した。ウサギ抗ＰＥＧ抗体は、高い感度と特異性をもって、調べたＰＥＧ溶液およびｍＰＥＧ−蛋白質結合体を検出した。

（実施例２：ｍＰＥＧの抗原性におけるメトキシル基の役割の実証）
予想に反して、本発明者らは、実施例１に記載したように調製した抗ＰＥＧ抗体が、主に、抗原のｍＰＥＧ成分のメトキシル基に対するものであったことを確認した。図１は、９６−ウェルプレートを構造的にウリカーゼとは無関係な蛋白質のｍＰＥＧ結合体でコートした競合ＥＬＩＳＡアッセイ法から得られた結果を示している。プレートを２％ヤギ血清でブロックした後、４．８−ｋＤａ ｍＰＥＧ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔａｌｏｇ ＃６５７０−５０１０）、１０−ｋＤａ ｍＰＥＧ（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ，ｃａｔａｌｏｇ ＃ ＭＰＥＧ−１０，０００）、または１０−ｋＤａ ｔ−ブトキシＰＥＧ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔａｌｏｇ ＃２９９９９９９７）を、濃度を上げながら加え、ｍＰＥＧ−ウリカーゼ結合体に対して形成されたウサギ抗血清の１：１，０００希釈液とインキュベートした。溶液を取り除いた後、ペルオキシダーゼ結合二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｃａｔａｌｏｇ ＃４０１３９３）を用い、その後ペルオキシダーゼの基質であるｏ−フェニレンジアミン・ジヒドロクロライド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｐ−９７８１）を加えて、プレート上でｍＰＥＧ−蛋白質結合体に対する抗ＰＥＧ抗体の結合程度を分光光度法で測定した。各試料について、競合物質が存在しないときに観察された初期反応速度（１分当たりのミリ吸着ユニット数）を１００％とした。ｍＰＥＧの２つの溶液の曲線が重なるのは、ＰＥＧ骨格の長さが抗原性の主要な決定因子でないことを示唆している。ｔ−ブトキシＰＥＧに関する曲線は、右方向に約２対数（ｌｏｇ）単位ずれており、ｔ−ブトキシＰＥＧが、ｍＰＥＧ−蛋白質結合体に対して生成した抗体に対し、ｍＰＥＧよりも約１００倍低い親和性をもつことを示している。しかし、本発明者らの一部による以前の未発表の実験では、ｔ−ブトキシＰＥＧは、免疫原性蛋白質と結合体になると、顕著な免疫原性を示すことが分かっている。したがって、図１は、ｍＰＥＧに対する抗体とは非常に低い交差反応性を示すが、ＰＥＧ化治療用蛋白質の産生において、ｍＰＥＧの代わりにｔ−ブトキシＰＥＧを使用しても、ＰＥＧ成分の免疫原性の問題を解決できないことになる。

図１に示した結果は、ｍＰＥＧ上のメトキシル基が、ポリマー分子上の主要な抗原基であることを示唆している。この推論を確認するために、実施例１に記載したように生成した抗体に対して、１つまたは２つのメトキシル基を含む様々なサイズおよび構造のＰＥＧを用いて、図１に示す方法により競合的ＥＬＩＳＡ解析を行った。図２ａは、各試料について、メトキシル基のモル濃度の関数としてグラフに表された、抗体結合に関する結果を示している。５変数シグモイド曲線に関する等式とＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）プログラム（ＳＰＳＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて、５０％結合阻害する結果をもたらす競合物質濃度（「ＩＣ_５０」）を計算した。

図２ａに示されているように、以下のＰＥＧはすべて、モル換算すると同じような抗原性をもっていた。ｍＰＥＧ−ＮＰＣ（ＰＥＧ−Ｓｈｏｐ）の加水分解によって生成された、メトキシル基をもつ直鎖状ＰＥＧ（「１０−ｋＤａ ｍＰＥＧ」）、および２０ｋＤａ ＮＰＣ−ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ，ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｍ−ＮＰＣ−２０，０００）にリジンを結合させて合成した「モノ−２０−ｋＤａ ｍＰＥＧ−リジン」；２個のメトキシル基をもつ直鎖状ＰＥＧ（「ビス−（２−ｋＤａ）ｍＰＥＧ」（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔａｌｏｇ ＃８１３１４）、および２個のメトキシル基をもつ大きい方の「分枝状」ＰＥＧ（「ジ−（２０−ｋＤａ）ｍＰＥＧ−リジン」（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ，ｃａｔａｌｏｇ ＃ＰＥＧ２−ＮＨＳ−４０Ｋ））。これに対し、２個のメトキシル基をもつ小さい方の「分枝状」ＰＥＧ（「ジ−（５−ｋＤａ）ｍＰＥＧ−リジン」（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ，ｃａｔａｌｏｇ ＃２Ｚ３Ｘ０Ｌ０１））は、他の試料についての結果の平均より０．５から０．６対数単位左にシフトし、この「分枝状」ｍＰＥＧが、本実験で調べた他の試料より３倍から４倍抗原性が高いことを示した。図２ｂは、図２ａのデータをメトキシル基のモル濃度ではなく、ｍＰＥＧの重量濃度（マイクログラム／ｍＬ）の関数としてグラフにしたものを示しており、ｍＰＥＧが抗ｍＰＥＧ抗体と相互作用するのに重要なのはメトキシル基であるとの結論を裏付けている。

図３は、図１、２ａおよび２ｂの一部のデータを、ＰＥＧ１分子当たりのメトキシル基の個数に対する抗原性の直接的な依存性を示す形式にして示している。これらの試料は、１０−ｋＤａ ＰＥＧであって、メトキシル基をもたないもの（「１０−ｋＤａ ｔ−ブトキシＰＥＧ」）、１個のメトキシル基をもつもの（「１０−ｋＤａ ｍＰＥＧ」）、２個のメトキシル基をもつもの（「ジ−（５−ｋＤａ）ｍＰＥＧ−リジン」）を表している。その結果、所定のポリマーの抗原性、したがってこのポリマーから生成される本発明に係る結合体の抗原性は、ＰＥＧポリマー分子上に含まれているメトキシル基の数に直接依存することが示された。メトキシル基の数が多くなるほど、ｍＰＥＧ−蛋白質結合体に対してできた抗体に対するポリマーのアフィニティーは高くなる。

まとめると、これらの結果は、ＰＥＧ溶液、特にｍＰＥＧ溶液と競合させることによって、ウサギ抗体のｍＰＥＧ結合体に対する結合が完全に阻害されることを示している。さらに、ｍＰＥＧ溶液が、無関係な蛋白質のｍＰＥＧ結合体へのウサギ抗ＰＥＧ抗体の結合を阻害できる能力は、それらの成分のメトキシル基の数に正比例している。重量濃度を基準にすると、図２ｂに示すように、低分子量のｍＰＥＧの方が、高分子量のｍＰＥＧよりもより強力な競合物質となった。この結論は、ポリマーの全質量に対するメトキシル基の質量比が、ポリマーの分子量が大きくなるにつれて減少するという事実と整合する。試験したＰＥＧの中で、（モル濃度基準で）もっとも強力な抗原は、時に、傘状または「Ｕ−ＰＥＧ」と呼ばれる（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６４３，５７５号）、または「Ｙ−ＰＥＧ」と呼ばれる（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．、米国特許出願第２００２／００５２４４３号）２個のメトキシル基を含む「分枝状」ＰＥＧであった。

（実施例３：メトキシル基をもたないＰＥＧを用いた抗ＰＥＧ抗体試験）
本明細書において、「ＰｈａｒｍａＰＥＧ」という語は、活性化されるまたは活性化されうる末端から遠位にある末端に抗原基をもたない直鎖状または分枝状のＰＥＧを意味する。以前の実施例から、ポリマーの抗原性、したがって生物活性物質のポリマー結合体の抗原性は、ポリマー中のメトキシル基の含有量の関数であると推論できた。この推論をさらに調べるために、図１について記載したようにして、競合的ＥＬＩＳＡアッセイを行って、抗ｍＰＥＧ抗体による結合について、ｍＰＥＧ（「４．８−ｋＤａ ｍＰＥＧ」）、ならびに直鎖状ポリマーの末端にメトキシル基または他のアルコキシル基をもたない、１２−ｋＤａ、２０−ｋＤａ、および３５−ｋＤａのＰｈａｒｍａＰＥＧの能力を比較した。結果を図４に示す。図４に示された３本のＰｈａｒｍａＰＥＧの曲線が、ｍＰＥＧの曲線からずれているのは、抗ｍＰＥＧ抗体で測定した場合、ＰｈａｒｍａＰＥＧの抗原性が、ｍＰＥＧの抗原性よりも約１００倍低いことを示している。したがって、メトキシル基をもたないポリマー（例えばＰｈａｒｍａＰＥＧ）は、従前医薬の生物学的結合に使用されているポリマー、例えばｍＰＥＧに比べて抗原性が低下または実質的に低下している。

上記したとおり、重量を基準にすると、ｍＰＥＧの競合能力は、その分子量に反比例している。しかし、メトキシル基をもたないＰＥＧは、分子量に関係なく、ｍＰＥＧの競合能力の僅か約１％であった。これらの結果は、メトキシル基をもたない単官能性反応性ポリマーは、ｍＰＥＧ、特に、ジ−ｍＰＥＧ−リジンのような「分枝状」ｍＰＥＧを用いて生成される結合体に比べて、抗原性が低下、実質的に低下、または全く検出されない、生物活性物質のポリマー結合体の調製において使用するのに特によく適しているとの結論を裏付けている。

（実施例４：抗ｍＰＥＧ抗体を用いたウエスタンブロットによるＰＥＧ化蛋白質結合体の検出）
抗ｍＰＥＧ抗体が、ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動をした後のＰＥＧ化蛋白質結合体を検出できるかという試験において、炭酸脱水酵素（ＥＣ ４．２．１．１；「ＣＡＩＩ」）のモノメトキシＰＥＧ結合体をモデルとして用いた。ゲルをポリビニリデン・ジフルオライド膜にエレクトロ・ブロットし、そのブロットをウサギ抗ｍＰＥＧ抗体（希釈率１：２００）とインキュベートし、その後、アルカリホスファターゼに結合し、発色沈殿物を形成する基質に曝露した二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ）とインキュベートした。電気泳動ゲルから膜に移された蛋白質またはポリマー−蛋白質を免疫学的に検出するこの方法は、通常「ウエスタンブロット」と呼ばれる（Ｔｓａｎｇ，Ｖ．Ｃ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １４３：３０４−３０７）。検出手順と試薬は、実施例１のブロットについて記載したところと同じであった。結果を図５ａに示す。レーン１および２は、ＳＹＰＲＯ（登録商標）のＲｕｂｙ染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｓ−１２０００）を用いて蛋白質を染色し、暗所にて３０２ｎｍの照明下で橙赤色可視光フィルター（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｓ−６６５５）を用いて、Ｋｏｄａｋデジタルカメラで撮影したゲルを示す。レーン３および４は、同一の試料をウエスタンブロットしたものである。抗ｍＰＥＧ抗体が、ＰＥＧ化した分子種のすべてで見られるが（レーン３）、非修飾の炭酸脱水酵素では見られない（レーン４）。

図５ｂは、Ｋｏｄａｋの１Ｄ画像解析ソフトウエア（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）によって得られた図５ａに示したゲルおよびウエスタンブロットにおけるバンド強度の定量結果を示している。横軸は、染色最前部に対する相対的な移動距離を表し、縦軸は、蛋白質染色または抗ｍＰＥＧ染色の相対的強度を表す。一番下のトレース線は、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標）で染色済みの蛋白質標準液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ｃａｔａｌｏｇ ＃ＬＣ５６２５）のバンドで、１から８まで番号を付けられたピークは、外見上の分子量が以下の分子量（ｋＤａ）の蛋白質を同定したものである。それぞれ、２０４、１１１、６８．８、５１．５、４０．２、２８．９、２０．７および１４．９ｋＤａ。下から２番目のトレース線は、ＰＥＧ化炭酸脱水酵素を抗ｍＰＥＧ抗体染色したものである。下から３番目のトレース線は、炭酸脱水酵素を蛋白質染色したバンドを表し、一番上のトレース線は、炭酸脱水酵素のｍＰＥＧ結合体を蛋白質染色したバンドを表している。図５ｂの各ピークの上の数字は、そのピークで結合体中の炭酸脱水酵素に結合したｍＰＥＧ鎖の数を示している。ＰＥＧ_０は、ＰＥＧが結合していない炭酸脱水酵素の位置を示している。

まとめると、これらの結果は、抗ｍＰＥＧ抗体が、反応性型のｍＰＥＧを用いて調製されたＰＥＧ化蛋白質と容易に結合体を形成し、それらを高感度かつ選択的に検出できることを示している。このような結合体を、診断、予防または治療目的で動物に導入すれば、抗ｍＰＥＧ抗体を誘発することによって、該薬剤の血流からのクリアランス速度を加速して、それらの結合体の有効性を制限し、場合によっては免疫結合体の形成によって副作用をもたらす可能性がある。

（実施例５：ＰｈａｒｍａＰＥＧ−モノニトロフェニルカーボネートの合成）
ＰＥＧジオールから単官能性活性化ＰｈａｒｍａＰＥＧを調製するための条件は以下のとおりである。合成のある段階で、ＰＥＧの一つの末端基が、その末端基を異なった数含むＰＥＧを分離できるような性質を持っていなければならない。そのような基は、ＰＥＧまたは活性化ＰＥＧのどちらよりも疎水性が高い可能性があるので、逆相クロマトグラフィー（「ＲＰクロマトグラフィー」）によって分離することが可能である。あるいは、そのような基は、荷電している可能性もあり、イオン交換クロマトグラフィーによって分離することが可能である。そのような基は、固相の一部である可能性もあり、非結合ＰＥＧが可溶な液体から分離することが可能である。本実施例５に記載したＮＰＣ−ＰＥＧの場合にように、活性化基を分離ベースとして使用できれば、活性化基の結合だけが合成反応に必要となる。除去可能なブロッキング基、例えばｔ−ブチル基またはトリフェニルメチル（「トリチル」）基が、分離の基準を提供する場合には、実施例６に記載したように、活性化されたか活性化可能な基の結合前か後にブロッキング基を加えることができる。理論上は、所望の数のブロッキング基を含むＰＥＧを単離するために用いられる精製工程は、ブロッキング基が結合した後であれば何時でも行うことができるが、実際には、ポリマー骨格とブロッキング基の間の結合、およびポリマー骨格と活性化（または活性化可能な）基との間の結合の相対的な反応活性度によって、最適な工程の流れが指示され得る。

ジヒドロキシＰＥＧからの単官能性活性化ＮＰＣ−ＰＥＧ合成法を以下の概略図にまとめたが、ここで、Ｐｈはフェニル基を表し、ｎは、ポリマー中のエチレンオキシドユニットの数を表し、１０−ｋＤａ ＰＥＧでは約２２７である。

いくつかの供給業者からのＰＥＧジオールは、すべて１０ｋＤａの分子量になるよう標識されていたが、それらを純度と均質性についてテストした。約１０ｋＤａの分子量をもつＰＥＧを９０％以上含んでいるものはなかった。したがって、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＭＤ−Ｐ ＣＧ−３００ＳＤカラム（７．５ｍｍ×１５ｃｍ，ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）上で逆相クロマトグラフィーを行って、低分子量の混雑物から１０−ｋＤａ ＰＥＧジオール（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ｃａｔａｌｏｇ ＃ ８１２８０）を分画した。ＰＥＧを水中５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液にしてカラムにのせ、水中５％から３５％の直線的なアセトニトリル勾配により溶出を行った。画分は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．６を含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００のＨＲ１０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によるサイズ排除クロマトグラフィーで解析した。ＰＥＧによる屈折率（「ＲＩ」）シグナルの９８％よりも高い部分が、約１０−ｋＤａのＰＥＧに相当するピークに存在した、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍカラムからの画分を集めて凍結乾燥した。

精製して乾燥したＰＥＧジオール（５３０ｍｇ）を６１．４ｍｇのｐ−ニトロフェニルクロロ蟻酸（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ｃａｔａｌｏｇ ＃１６，０２１−０）と混合し、１３×１００ｍｍのねじ蓋式ガラス管に入れた４ｍＬのアセトニトリルに溶かして、最終濃度が、ＰＥＧジオールで約１２．５ｍＭ、ｐ−ニトロフェニルクロロ蟻酸で約７５ｍＭになるようにした。ピリジン（０．２５ｇ）を加えてから、反応混合液を３６℃で一晩インキュベートした。この混合液を、３３ｍＬの氷冷した０．１Ｍ塩酸に加えてから撹拌して反応を急いで停止させた。溶液を濾過してｐ−ニトロフェノールの微量の沈殿を取り除き、１−Ｌの冷水を４回換えたものに対して透析を１日行った。透析溶液にアセトニトリルを加え、濃度を５％（ｖ／ｖ）にした。工程１で生成された混合液の半分（２４ｍＬ）で、約２６５ｍｇの精製１０−ｋＤａ ＰＥＧジオールを含んでいたが、これを、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍカラムに流して、結合ＰＥＧ分子種を、水中５％から６５％のアセトニトリル勾配により溶出を行った。画分は、上記のとおり、サイズ排除クロマトグラフィーで解析し、屈折率と、２８０ｎｍでの吸光を観察した。２８０ｎｍでの吸光を示さないジヒドロキシＰＥＧをまず溶出してから、１個のｐ−ニトロフェニル基（「モノ−ＮＰＣ ＰＥＧ」）、次にジ−ＮＰＣ ＰＥＧによってＰＥＧを誘導体化したが、これに対する、屈折率に対する２８０ｎｍでの吸光度の割合は、モノ−ＮＰＣ−ＰＥＧについてのこの割合の２倍であった。モノ−ＮＰＣ−ＰＥＧ溶出範囲の中央にある２つの画分を合わせて、約１１０ｍｇのモノ−ＮＰＣ−ＰＥＧとしたが、これは、約４２％の収率である。工程２の生成物は、保存のために乾燥装置および／または冷蔵庫で乾燥するか、または、アミン含有生物活性化合物に結合させるか、または分枝状のＰＥＧ、例えばジ−ＰＥＧ−リジンであってアルコキシル基を含まないものを調製するために２個以上のアミノ基を含むリンカーに結合させるために直接使用することもできる。

（実施例６：ＰＥＧジオールからのＰｈａｒｍａＰＥＧ−モノアルデヒドの合成）
ＰｈａｒｍａＰＥＧからのモノプロピオンアルデヒド誘導体の合成法を、以下の概略図にまとめたが、ここで、ＫＯｔＢｕはカリウムｔ−ブトキシドを表し、ＤＥＰは３，３−ジエトキシプロピル基を表す。

好ましくは、工程１の出発物質として使用されるジヒドロキシＰＥＧは、その外見上の分子量の１０％以内の分子量をもち、多分散度が１．０５よりも小さい。多分散度は、数量平均分子量（「Ｍ_ｎ」）に対する重量平均分子量（「Ｍ_ｗ」）の割合と定義されている。Ｍ_ｗおよびＭ_ｎというこれらの変数はどちらも、分子量が正確に知られているＰＥＧを基準とし、また、ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅクライアント／サーバー用ソフトウェア、バージョン２．８．３（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）などのゲル透過クロマトグラフィー用ソフトウェアサイズ排除クロマトグラフィーによって測定することができる。あるいは、ＰＥＧの多分散度は、Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などのソフトウェアを用いて、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ」）質量分析法（Ｍａｒｉｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７２：５１０６−５１１４）によって測定することができる。共有結合したＰＥＧを含む薬学的産物を調製するには、ＰＥＧ出発物質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で測定する場合には、好ましくは１．０２よりも小さく、より好ましくは１．０１よりも小さい多分散度をもつ。この出発物質は、当業者に知られた他の供給業者の中でもとりわけ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｃａｌ Ｃｏ．、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入可能である。出発物質が十分に均質でない場合には、実施例５に記載した方法を適合させて分画することができる。

Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ら（（１９８４）Ｊ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ ２２：３４１−３５２）に記載されているようにして（工程１参照）、３−クロロプロピオンアルデヒド・ジエチルアセタール（Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｃ６，９００−４）を用いて、ＰＥＧジオールのモノプロピオンアルデヒドとジプロピオンアルデヒドのジエチルアセタール誘導体の混合物を合成することができる。同様の方法が、Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．ら（（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８７：１４４６−１４４９）にも記載されており、その後Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．らに特許付与されている（米国特許第５，９９０，２３７号）。

ピリジンに溶かした十分量の塩化トリフェニルメチル（クロロトリフェニルメタンまたは塩化トリチルＰｈ_３ＣＣｌ、例えばＡｌｄｒｉｃｈ ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｔ８，３８０−１）を、工程１で生成した混合液に加えて、反応条件下で、Ｐｈ_３ＣＣｌが、プロピオンアルデヒド・ジエチルアセタールに結合していないＰＥＧ出発物質のヒドロキシル基のすべてと反応させる（Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｐ．Ｊ．、前掲）。工程２を完了させるために、ＰＥＧに対する貧溶媒（例えばエーテル）を加えるか、または、溶媒を蒸発させるか、または、当技術分野において既知の他の方法によって、この混合物を回収する。

５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを加える前か後に、工程２で回収された混合物を水に溶かし、当技術分野において既知の原則から、ＰＥＧのトリチル化誘導体に結合できると予想される逆相カラムに流す。このカラムは、シリカまたはポリマー基質のアルキル誘導体またはアリール誘導体を含むか、または、実施例５のように、スチレンポリマー（例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＭＤ−Ｐ ＣＧ−３００）でもよい。ＰＥＧジオールおよびトリチル誘導体は、実施例５のように、有機溶媒の漸増勾配をもつ逆相モードで、または、所望の分子種の少なくとも一部が溶出されるまでカラムを泳動し続けることによる試料置換モードで（Ａｇｎｅｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開ＷＯ ００／２３７９８ Ａ１）、または、置換モードで（Ｃｒａｍｅｒ，Ｓ．Ｍ．，米国特許第６，２３９，２６２号）、または、これらのモードを組み合わせたもので溶出することができる。一般的には、トリチル基をもたないＰＥＧ誘導体がまず溶出し、モノトリチル誘導体が次に溶出し、その次にジトリチル誘導体が次に溶出する。これら３種類の分子種の割合が１：２：１のときに、所望の生成物の最適な収率が得られる。所望のモノトリチルＰＥＧ生成物の收率および／または精製度を向上させるためには、クロマトグラフィー分野においてよく知られているように、カラム溶出液の一部を再度クロマトグラフィーにかけることが望ましいことがある。工程３を完了させるために、当技術分野において既知の方法によって、モノトリチル誘導体の少なくとも一部を含む溶出液部分を分離、濃縮および乾燥させる。

穏やかな酸性条件および低温下で、ＰＥＧの遠位末端のトリチル結合のほとんどを保存しつつ、アセタールをアルデヒドに変換することができる。本実施例の応用例によっては、トリチル基を除去する前に、モノトリチルＰＥＧモノアルデヒドを標的部分と反応させることが有利なことがある。このような実施態様も本発明によって想定され、本発明に包含される。

（実施例７：メトキシＰＥＧを用いる場合に比べて、ヒドロキシＰＥＧを用いて調製される結合体の免疫原性が低下することの証明）
実施例１のように、ウリカーゼのｍＰＥＧ結合体による免疫について記載されているような手順で、ブタウリカーゼの同一調製物のｍＰＥＧ結合体またはヒドロキシＰＥＧ結合体であって、それぞれ、ウリカーゼ１単位当たり平均約２本の１０−ｋＤａ ＰＥＧ鎖を含む結合体によって、３匹のウサギからなるグループを免疫した。結合体の各調製物に結合したポリマーの平均鎖数を、サイズ排除ＨＰＬＣ解析と、ゲルを、蛋白質については実施例４におけるように、ＰＥＧについては、２００２年６月２８日に出願された共同所有の同時係属米国特許出願第１０／１８３，６０７号であって、その全文が参照として本明細書に組み込まれる文献に記載されている方法を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。それぞれのウサギに、フロイント完全アジュバントで一度、１〜４週間の間隔をおきながら、フロイント不完全アジュバントで５回、ＰＥＧ−ウリカーゼ調製物の一つを注射した。フロイント不完全アジュバントで４回目と５回目に注射してから２週間後に血液を採取した。実施例２のように、これらのウサギの血清の４倍連続希釈液をＥＬＩＳＡ解析法で試験したところ、ヒドロキシＰＥＧを用いて調製した結合体によって誘発された抗ＰＥＧ抗体の濃度は、ｍＰＥＧを用いて調製した結合体によって誘発された抗ＰＥＧ抗体の濃度の５％よりも低かった（図６ａおよび６ｂ参照）。これに対し、この２つのタイプのＰＥＧから調製された結合体による抗ウリカーゼ抗体の誘発量は、２つのウサギグループで同様だった。これらのウサギの免疫前の血清は、検出可能な抗ＰＥＧ抗体を含んでいなかった。

（考察および結論）
メトキシル基を末端にもつＰＥＧ（ｍＰＥＧ）とヒドロキシル基を末端にもつＰＥＧ（ビス−ヒドロキシＰＥＧまたはＰＥＧジオール）は、バイオコンジュゲーションにおける用途については同等であり、あるいは、しばしば、ｍＰＥＧおよびその他の低級アルコキシルＰＥＧの方がＰＥＧジオールよりも優れていると報告されてきた。さらに、ビス−活性化ジオールは、架橋因子として作用して、可溶性で長期間作用して、低抗原性かつ低免疫原性の生体分子結合体（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を生成するのに望ましくない可能性がある。驚いたことに、本研究の結果は、ｍＰＥＧが顕著に抗原性が高く、ｍＰＥＧのメトキシル基に対して誘発された抗体が、ｍＰＥＧを用いて調製されたＰＥＧ化蛋白質結合体に結合することを示している。このため、予想外かつ以前の報告に反して、ｍＰＥＧはヒドロキシＰＥＧと同等ではなく、高い生体内利用率、循環血中での安定性、および最小限の免疫原性をもつよう意図された、生物活性成分（蛋白質など）のポリマー結合体を調製するのに、ｍＰＥＧは好適ではない。

今回の結果に基づくと、メトキシル基または別のアルコキシル基を含まない単官能性活性化ＰＥＧを蛋白質結合体の合成に使用すれば、低い免疫活性が得られることが明らかである。得られた結合体は、低い抗原性、すなわち、同じ蛋白質のｍＰＥＧ結合体に対して生じた抗体と相互作用する能力が低く、また、低い免疫原性、すなわち、ＰＥＧ成分に対する免疫応答を誘発する能力が低いことが実証された。当然の結果、２個以上のメトキシル基を含む分枝状のＰＥＧを用いて調製された結合体は、アルコキシル基をもたない分枝状ＰＥＧから調製された結合体よりも免疫原性が高いと考えらる。

最後に、今回の発見によれば、単官能性活性化ｍＰＥＧではなく、メトキシル基または別のアルコキシル基を含まない単官能性活性化ＰＥＧをＰＥＧ−リポソームの合成に用いれば、得られるＰＥＧ−リポソームに、血液中において補体の活性化を誘発する傾向の低下、および急性呼吸器病、アナフィラキシー様反応、および仮性アレルギー反応を誘発する傾向の低下など、低い免疫原性をもたらすことが期待される。

本発明は、一定の実施態様に関して説明されている。本発明に係る方法は、別のタイプの蛋白質、別の生物活性物質、および別の複合用試薬に対しても同じように適用可能である。したがって、本発明の範囲は、記載されている実施態様に制約されるものではないが、請求の範囲および／またはそれと同等のものによってのみ制約される。当業者は、本発明の範囲内で他の態様も実施しうることを容易に理解できる。そのような変更も本発明の一部である。

本明細書に記載されている刊行物、特許および特許出願はすべて、本発明の属する当業者の技術レベルを示すものであって、各刊行物、特許、および特許出願が、具体的かつ個別に参照として組み込まれると記載されているのと全く同等に、本明細書において参照として組み込まれる。

Claims (4)

1. 脂質分子とＰＥＧ分子の結合体を含むＰＥＧ−リポソーム組成物であって、
   ＰＥＧ成分が直鎖状の場合は、脂質分子と結合していない末端（「遠位端」）にヒドロキシル基を有し、
   ＰＥＧ成分が分岐状の場合は、すべての遠位体にヒドロキシル基を有し、
   各ＰＥＧ分子は、脂質分子上及びＰＥＧ分子上における単一の部位で、１個の脂質分子に結合し、
   前記結合体の純度が９５％以上である、ＰＥＧ−リポソーム組成物。
2. 前記結合部位が、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基である、請求項１に記載のＰＥＧ−リポソーム組成物。
3. 前記結合部位が、ジアシルグリセロールのヒドロキシル基である、請求項１に記載のＰＥＧ−リポソーム組成物。
4. 前記組成物は、前記結合体と同一の脂質分子と同一のサイズの直鎖状又は分枝状ＰＥＧとが同一の部位で結合した第２の結合体であって、前記ＰＥＧは、すべての遠位端にアルコキシル基を有する結合体、を含むＰＥＧ−リポソーム組成物に比較して、免疫反応性が低下している、又は実質的に低下している、請求項１に記載のＰＥＧ−リポソーム組成物。