JP5600061B2 - α−１−抗トリプシンおよびアポリポタンパク質Ａ−Ｉを精製する方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本明細書は、その全体を参照によって本明細書に援用する、２００７年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／９３５，５２７号の優先権の利益を主張する。

本発明は、例えばヒト血漿画分からのα−１−抗トリプシン（ＡＡＴ、またα−１プロテイナーゼ阻害剤、ＡＰＩおよびＡ₁−ＰＩとしても知られている）およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）の双方のタンパク質を分離および精製する方法に関する。特定の実施態様では、本発明は、双方のタンパク質の原料として同一の出発原料が使用できるように、精製の初期段階でＡｐｏＡ−ＩからＡＡＴを分離する方法を提供する。本方法は、医薬用途に適するＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの組成物の提供にさらに関連し、大規模精製に適する。

多数のタンパク質ベースの生物医薬品が、ヒト血漿から単離される。ある程度自発的な献血に依存する原料ヒト血漿は供給が限られており、血漿タンパク質の精製における一般に低い濃度、高い脆弱性、および限られた収率と相まって、この種の薬剤の製造は困難で費用がかかるものとなっている。したがって達成可能な最高収率で、ヒト血漿の同一サンプルから可能な限り多数の医学関連タンパク質が単離できるように、血漿タンパク質の精製方法の効率を改善する必要がある。

ヒト血漿タンパク質のタンパク質分離および精製工程は、タンパク質の多様性、各タンパク質製剤に付随する可能な汚染物質および／または不純物の様々な性質、および生物医薬品の生産に通常必要とされる大量のタンパク質のために、特有の課題を提示する。精製技術は、一般に単一タンパク質標的を単離するための一連の精製工程を伴う。

α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）は、生物医薬品に製造できるヒト血漿タンパク質の例である。専用精製工程を使用してこれらのタンパク質を精製する方法については、記述されている。例えば国際公開第０４０６０５２８号パンフレットはＡＡＴのための精製工程について記載しており、米国特許５，０８９，６０２号明細書はＡｐｏＡ−Ｉの精製について記載しており、各工程はヒト血漿画分から出発し、それぞれ単一タンパク製品をもたらす。

本出願人は、ヒト血漿の同一画分から出発して、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの精製を可能にする方法を開発した。これらの方法は大規模精製に適し、したがって工業的に適用可能な製造工程の基盤を提供する。本発明は、双方のタンパク質を精製する出発原料として同一の出発原料が使用できるように、精製初期段階でＡｐｏＡ−ＩからＡＡＴを分離する方法、および前記分離後に医薬品等級のＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを生成する方法を提供する。

ＡｐｏＡ−Ｉは高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の２８ｋＤａの主要タンパク質構成物であり、排出または再利用のための末梢から肝臓へのコレステロールの逆輸送において重要な役割を演じる。

ＡｐｏＡ−Ｉは、特に再構成ＨＤＬ様粒子中において、治療的可能性を有するとして長きにわたり記載されてきた。最近になってやっとこの可能性を強調する研究が公開された（ＪＡＭＡ（２００７）；ｖｏｌ．２９７，ｐ．１６７５−１６８２）。

ＡｐｏＡ−Ｉのための多様な精製技術が開発されている。

ＡｐｏＡ１を小規模精製する最も一般的なやり方の一つは、ＨＤＬを単離するために超遠心を使用することであり、ＨＤＬ粒子からのＡｐｏＡ−Ｉの分離がそれに続く。溶剤抽出をはじめとして、ＨＤＬからＡｐｏＡ−Ｉを精製するいくつかの異なるやり方がある。超遠心は非常に時間のかかる方法であり、大規模単離には適さない。

例えばクロマトグラフィー精製（Ｒｏｓｓ Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａ−Ｉ ａｎｄ Ａ−ＩＩ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４９，ｐ．１６６−１６８（１９８５））およびゲル濾過ＨＰＬＣを使用した精製（Ｔｒｉｃｅｒｒｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ｕｓｉｎｇ ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ＨＰＬＣ，ＩＪＢＣ，１，ｐ．１５９−１６６（１９９４））など、超遠心を含まず出発原料として血漿を使用する方法について記載されている。ヒト血漿の冷エタノール分画からの画分を出発原料として使用するその他の方法についてもまた、公開されている（Ｐｅｉｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ａｎｄ Ａ−ＩＩ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７８．ｐ．３０１−３０５（１９８９））。

Ｒｏｔｋｒｅｕｚｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｚｅｎｔｒａｌｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ ＳＲＫに付与されたEP０３２９６０５号明細書およびＬｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅ，Ｐｒｏｔｉｄｅｓ Ｂｉｏｌ．Ｆｌｕｉｄｓ，３６，ｐ．４０９−４１６（１９８９）は、リポタンパク質を含有するヒト血漿画分からのアポリポタンパク質の調製に関する。双方の公開は、ＡｐｏＡ−Ｉを生成するための出発原料として、冷エタノール分画処理の沈殿物ＢおよびＩＶが使用できることを報告する。汚染物質を沈殿させるために、任意に有機溶剤を添加した高濃度エタノールを含有する緩衝液を活用する。沈殿物はグアニジン塩酸塩中で可溶化され、それは引き続いてゲル濾過またはダイアフィルトレーションによって除去される。ＡｐｏＡ−Ｉを通過させながら汚染物質を結合する、アニオン交換クロマトグラフィー工程が含まれる。任意に第２のイオン交換樹脂への吸着によって、ＡｐｏＡ−Ｉを濃縮することが提案される。

国際公開第９８０７７５１号パンフレットはまた、ＡｐｏＡ−Ｉを単離するためのイオン交換クロマトグラフィーの使用についても報告する。

主要セリンエンドペプチダーゼ阻害剤であるΑ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）は、約１．９〜３．５ｇ／ｌの濃度でヒト血漿中に存在する。この約５３ｋＤａの糖タンパク質は肝臓中で生成され、特に肺における結合組織のタンパク質分解に関与する酵素である好中球エラスターゼを阻害する。ＡＡＴはアスパラギン残基４６、８３、および２４７に３つのＮ−グリコシル化部位を有し、それらは複合型二および三分岐グリカンの混合物によってグリコシル化される。これは４．０〜５．０の範囲の等電点を有する複数のＡＡＴアイソフォームをもたらす。ＡＡＴによるプロテアーゼ阻害は組織タンパク質分解調節の必須構成要素であり、ＡＡＴ欠乏症はいくつかの疾患の病態と関係があるとされる。ＡＡＴ欠乏症を遺伝により受け継いだ個人は、例えばヒト白血球エラスターゼにより肺組織が無制限に破壊されて、重度の早期発症型肺気腫を患うリスクが増大する。外来性ヒトＡＡＴの投与はエラスターゼを阻害することが示されており、ＡＡＴ欠乏性患者における生存率の向上および肺機能低下率の減少と関連付けられている（Ｃｒｙｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５８：４９−５９（１９９８）；概説についてはＲ．Ｍａｈａｄｅｖａ ａｎｄ Ｄ．Ｌｏｍａｓ，Ｔｈｏｒａｘ ５３：５０１−５０５（１９９８）を参照されたい）。

その治療における有用性のために、商業的なＡＡＴの生産は重要な研究対象になっている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３４６４−３４７２（１９９１））、酵母（Ｋ．Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４２：１９１−１９５（１９９５）；Ｂｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，６２９，５６７号明細書）、植物（Ｊ．Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：１２６−３３（２００１））中での、および遺伝子導入哺乳類の乳中への分泌による（Ｇ．Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８３０−８３４（１９９１）；Ａ．Ｌ．Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５１７８−５１８２（１９９０））組み換えＡＡＴ生産における大きな進展があった。しかしヒト血漿からのＡＡＴの単離が、目下、多量のＡＡＴを得るための最も効率の良い実用的な方法であり、ヒト血漿は唯一のＦＤＡ認可原料である。

沈殿、吸着、抽出、およびクロマトグラフィー工程の組み合わせを伴う、ヒト血漿画分からＡＡＴを単離し精製するための多くの方法について記載されている。ＡＡＴを単離するための公開された方法のほとんどは、例えばコーン（Ｃｏｈｎ）画分ＩＶ、またはより具体的には画分ＩＶ₁および画分ＩＶ_1-4などのコーン画分（Cohn Fraction）ＩＶ沈殿物として知られているヒト血漿の１つ以上の画分、ならびにキストラー・ニッチマン（Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎ）上清ＡまたはＡ−Ｉの沈殿物に始まり、それらは一連のエタノール沈殿およびｐＨ調節後にペーストとして血漿から得られる（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６８：４５９−４７５（１９４６）；Ｐ．Ｋｉｓｔｌｅｒ，Ｈ．Ｓ．Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，７：４１４−４２４（１９６２））。

Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５：３３３−３４８（１９７５）は、コーン画分ＩＶ₁ペーストからＡＡＴを単離する方法について述べている。ペーストは、コーン分画で用いられる５．２のｐＨによって大部分が不活性化されるＡＡＴを再活性化するために、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液中で撹拌される。透析および遠心分離後、上清にｐＨ６．０〜７．６での、およびｐＨ８．６での２回のアニオン交換クロマトグラフィーを施し、続いてｐＨ７．６での、およびｐＨ８．０でのさらなるクロマトグラフィー処理によって、ＡＡＴを約３０％の全収率で生成する。

ＬｅｂｉｎｇおよびＣｈｅｎは米国特許第５，６１０，２８５号明細書において、血漿および血漿画分からヒトＡＡＴを精製するための、最初のアニオン交換クロマトグラフィー工程と、それに続く低ｐＨおよび低イオン強度でのカチオン交換クロマトグラフィーを用いた精製方法について述べる。カチオンクロマトグラフィーは、これらの条件下で活性ＡＡＴがイオン交換カラムに結合しないのに対し、変性ＡＡＴおよびアルブミンをはじめとする夾雑タンパク質は保留されるという事実を利用する。

Ｃｏａｎは米国特許第４，６９７，００３号明細書において、ＡＡＴ含有画分からのエタノールおよび塩の除去と、それに続く、ＡＡＴがカラム上に保留される一方で望まれないタンパク質が溶出するような条件下におけるＤＥＡＥセルロースまたは類似材料上でのアニオン交換クロマトグラフィーを含んでなる、様々なコーン血漿画分からＡＡＴを単離する方法について述べている。Ｃｏａｎはまた、約６０℃以上で約１０時間にわたる「低温殺菌」についても述べており、それは肝炎ウィルスを非感染性にするのに十分であると述べている。

ＧｌａｓｅｒらはＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４：３６４−３７１（１９８２）で、およびEP０ ０６７ ２９３号明細書でも、（ａ）ペーストをｐＨ８．５の緩衝液に溶解するステップと、（ｂ）濾過するステップと、（ｃ）ＤＴＴなどのジチオールを添加するステップと、（ｄ）変性タンパク質を硫酸アンモニウムで沈殿させるステップとを含んでなる、コーン画分ＩＶ₁沈殿物からＡＡＴを単離する方法のいくつかの変法について述べている。Ｇｌａｓｅｒらは５０％飽和硫酸アンモニウムでの沈殿に先だって、２．５％ＡＥＲＯＳＩＬ^TMヒュームドシリカの存在下でＤＴＴによる処理が実施される一変法について述べている。ＡＡＴ回収率はシリカ不在下におけるのと同様に良好であり、精製係数は約７０％改善された。Ｇｌａｓｅｒは、αおよびβリポタンパク質を除去する工程でＡｅｒｏｓｉｌ ３８０を使用してもよいと述べている。

ＭａｔｔｅｓらはＶｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ８１：２９−３６（２００１）で、および国際公開第９８／５６８２１号パンフレット、米国特許第６，９７４，７９２号明細書および米国特許出願公開第２００２／００８２２１４号明細書において、エタノール沈殿、アニオン交換クロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイト上への吸着クロマトグラフィーを伴う、コーン画分ＩＶからＡＡＴを単離する方法を開示する。後者の工程は不活性ＡＡＴを除去して非常に高比活性の生成物を提供すると報告されており、それは発明者らによれば、当該技術分野で知られているその他の高純度ＡＡＴ調製品中には存在しないとされる、ｐＩ値４．３および４．４のＡＡＴアイソフォームの濃縮のためであるとされる。

Ｋｅｙらは国際公開第０４０６０５２８号パンフレットにおいて、ＡＡＴを溶解させる条件下でＡＡＴ含有タンパク質混合物を緩衝液に懸濁させるステップと、得られた懸濁液をジスルフィド還元剤と接触させて還元懸濁液を生成するステップと、還元懸濁液を不溶性タンパク質吸着材料と接触させるステップと、懸濁液から不溶性物質を除去して、さらにイオン***換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーに組み合わせるステップとを含む、ＡＡＴを含む画分、優先的にコーン画分ＩＶ_1-4から、ＡＡＴを単離する方法を開示する。

ＲａｌｓｔｏｎおよびＤｒｏｈａｎは米国特許第６，０９３，８０４号明細書において、「脂質除去剤」を通じた最初のタンパク質懸濁液からのリポタンパク質の除去と、それに続くクエン酸緩衝液によるアニオン交換媒体からの溶出を通じた「不活性ＡＡＴ」の除去を伴う方法について述べている。脂質除去剤は合成含水ケイ酸カルシウムであるＭＩＣＲＯ ＣＥＬ^TM ＥまたはＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ Ｅ^TMであると述べられている。非クエン酸緩衝液の存在下では、アニオン交換媒体は活性ＡＡＴと結合する一方、「不活性ＡＡＴ」は通過させる。クエン酸緩衝液が、引き続くアニオン交換媒体からのＡＡＴ溶出のために、そして後のカチオン交換媒体からの溶出のためにも指定されている。ＲａｌｓｔｏｎおよびＤｒｏｈａｎは、ジスルフィド還元剤の使用については述べていない。本方法は、製品純度＞９０％のＡＡＴ（そして精製されたＡＡＴの＞９０％が活性ＡＡＴである）および製造規模収率＞７０％を提供すると記載されている。ＲａｌｓｔｏｎおよびＤｒｏｈａｎは、特にコーン画分ＩＶ₁調製品が大量のＡｐｏＡ−Ｉを含有すると述べており、これが精製中にカラムの流れおよび容量を阻害する効果を有すると指摘している。彼らは前述の「脂質除去剤」によるタンパク質混合物懸濁液の処理が、ＡｐｏＡ−Ｉを除去すると報告している。

Ｂａｕｅｒは国際公開第０５０２７８２１号パンフレットにおいて、好ましくは画分ＩＶ−１である異なるコーン画分から出発するＡＡＴ精製方法、汚染物質（すなわち脂質、リポタンパク質、およびその他のタンパク質）の除去、および逐次クロマトグラフィー工程による不活性ＡＡＴからの活性ＡＡＴの分離について述べている。ＢａｕｅｒはＡｐｏＡ−Ｉを精製するのが望ましいことについては言及しておらず、反対にＢａｕｅｒはＡｐｏＡ−Ｉが精製中にカラムの流れを阻害して容量を低下させると指摘しており、汚染ＡｐｏＡ−Ｉをヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ^TM）に結合させて除去することを提案している。Ｂａｕｅｒは、ＡｐｏＡ−Ｉがヒュームドシリカから溶出できるかどうかを開示しておらず、それが望ましいことを提案してもいない。

ＡＡＴは、α−１−抗トリプシン欠乏症に起因する肺気腫に対する効果的な治療薬であるが、タンパク質の限られた供給および複雑な製造工程のために、治療は非常に高価である（目下毎年約＄２５，０００）。ＡＡＴを含有する血漿およびその他の複合タンパク質混合物からヒトＡＡＴを単離するためのより効率的で対費用効果の高い方法に対する必要性が、なおも存在する。

上で論じたほとんど全てのＡＡＴ精製方法では、ＡｐｏＡ−Ｉをはじめとするリポタンパク質は通常依然として脂質除去剤に結合する汚染物質として廃棄される。他方では、ＡｐｏＡ−Ｉの公開された精製方法では、混合物中のＡＡＴを多数のその他の血漿タンパク質と共に廃棄する。

ヒト血漿の同一画分からのＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉ双方の精製は上記の米国特許第６，０９３，８０４号明細書でのみ言及され、そこではＡｐｏＡ−Ｉが合成含水ケイ酸カルシウムへの吸着によってＡＡＴから分離でき、さらなる後処理プロセスの前に引き続いて０．５Ｎ ＮａＯＨで溶出されると記載されている。同一ヒト血漿画分から出発する精製工程から、どのようにして医薬品純度等級ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを得ることができるかについては開示されていない。事実、同一出願人（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）からの後者の出願（国際公開第０５０２７８２１号パンフレット）は、この方法が大規模調製に適さないことを指摘し、具体的には米国特許第６，０９３，８０４号明細書に記載されているような方法が、数キログラムの範囲内である小規模から中規模の原材料加工のためにのみ効率的であることを指摘する。

さらに米国特許第６，０９３，８０４号明細書で提案されるような０．５Ｎ ＮａＯＨによるＡｐｏＡ−Ｉの溶出は、ｐＨ約１３．６９の高アルカリ性環境作り出し、それはＡｐｏＡ−Ｉの部分的なまたは完全ですらある脱アミド（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８９，２６８（１）：２７６−８６参照）、そしておそらくは不可逆的変性をもたらす。生物医薬品は脱アミド化および／または変性されると、通常それらの生物学的活性を失い、一層悪いことには免疫原性反応を生じやすいので、より少ないまたは皆無の変性を引き起こすさらに別の精製方法を開発する必要性がある。

本発明は、双方のタンパク質の原料として同一の出発原料が使用できるように、精製初期段階でＡｐｏＡ−ＩからＡＡＴを分離する方法、および分離されたＡＡＴとＡｐｏＡ−Ｉを医薬品等級の純度にさらに精製する方法を開示する。換言すれば、本発明は、ｉ）ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴを含む出発原料を処理して、ＡｐｏＡ−Ｉを含有する画分とＡＡＴを含有する画分とを分離するステップと、ｉｉ）ＡｐｏＡ−Ｉを含有する画分からＡｐｏＡ−Ｉを医薬品等級の純度に精製するステップと、ｉｉｉ）ＡＡＴを含有する画分からＡＡＴを医薬品等級の純度に精製するステップとを含むＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴを精製する方法を開示する。

本発明の意味では「医薬品等級の純度」とは、７５％を超え、優先的には８５％を超え、なおもより優先的には９５％を超える純度を意味する。

本発明の方法は、脱アミドおよび変性を最小化する。これは双方のタンパク質の精製の各工程でｐＨを１３．６９未満、１３以下、１２以下、または１１以下に保つことで、または代案としては、タンパク質がｐＨ１１以上でインキュベートされる時間を最小化することで達成されてもよい。一実施態様では、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの脱アミドおよび変性は、ｐＨが７〜１２であることを確実にすることで最小化できる。別の実施態様では、ｐＨ範囲は８〜１１である。さらに別の実施態様では、ｐＨ範囲は９〜１０である。いくつかの具体的であるが非限定的な例では、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの脱アミドおよび変性を最小化するｐＨ値としては、ｐＨ８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、および１１が挙げられる。上で教示されるレベル未満に留まるｐＨに言及する明細書のあらゆる箇所でもまた、これらの範囲および特定のｐＨ点が当てはまる。

タンパク質の脱アミドを妨げることはより少ない変性をもたらし、得られる生物医薬品が免疫原性になるリスクを低下させる。

本発明は、具体的には、このＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離および精製を達成するための４つの異なる方法を教示し、それらは全て大規模精製に適する。本発明の意味では大規模精製に適するとは、精製が例えば５０キログラム以上のヒト血漿画分からの出発など、数１０キログラムのヒト血漿画分などの出発原料から出発することを意味する。

本明細書で具体的に参照される全ての公報および特許出願は、その全体を参照によって援用する。特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が所属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

「ＡＡＴ」という用語は、一般にヒト血清から単離されるヒトＡＡＴを指す。用語は薬理学的に効果的な天然変異型を包含することが意図される（例えばＢｒａｎｔｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８４（ｓｕｐ．６Ａ）：１３−３１（１９８８）を参照されたい）。

「ＡｐｏＡ−Ｉ」という用語は、一般にヒト血清から単離されるヒトＡｐｏＡ−Ｉを指す。用語は薬理学的に効果的な天然変異型を包含することが意図される。

当業者は、本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料が本発明の実施において使用でき、このような同等物が本発明の範囲内とされることを理解するであろう。後述の実施態様は例としてのみ提供され、本発明の範囲は記載されている特定の実施態様に限定されるものではない。

実質的な量のＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有するタンパク質のあらゆる非精製混合物が、本発明方法に従ったＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉ精製のための出発原料として使用できる。一実施様態に従って、ＡＡＴ−およびＡｐｏＡ−Ｉ含有タンパク質混合物は、ヒト血漿画分から、特に血漿コーン画分ＩＶペーストから選択できる。「ヒト血漿画分」という用語は、血漿から１つ以上の血漿構成要素を除去することで得られる、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有するあらゆる出発原料を包含する。特定の実施態様では、コーン画分ＩＶ₁ペーストは出発原料であることができるが、同様の血漿画分の使用が本発明の範囲内であると考察される。代案の出発原料としては、その他のＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉ含有コーン画分、キストラー・ニッチマン上清ＡまたはＡ＋Ｉからの沈殿物（Ｐ．Ｋｉｓｔｌｅｒ，Ｈ．Ｓ．Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，７：４１４−４２４（１９６２））、およびＳｃｈｕｌｔｚｅらによって米国特許第３，３０１，８４２号明細書に記載されている血漿からの硫酸アンモニウム沈殿物が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の全ての方法の共通工程は、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉがどちらも可溶化されるようなやり方で、ヒト血漿画分を処理する工程である。

本発明の一実施態様では、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離および精製は、ＡｐｏＡ−Ｉが沈殿する一方でＡＡＴが溶液中に残るように、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ懸濁液のｐＨおよび低級脂肪族アルコール濃度を調節して達成できる。沈殿したＡｐｏＡ−Ｉは、ＡＡＴを含有する溶液から分離できる。本発明は、ＡｐｏＡ−Ｉを懸濁液から沈殿させる新しい有利な条件を提供する。例えばEP第０３２９６０５号明細書などの技術は、低級脂肪族アルコールによるＡｐｏＡ−Ｉの沈殿が大規模処理に適するかもしれないと示唆するが、当該技術分野で教示される条件下では、ＡｐｏＡ−ＩはＡＡＴと共に沈殿することが分かった。またＡＡＴの収率は低下し、ＡＡＴは部分的に不活性化される。本発明は５％〜２５％（ｖ／ｖ）の濃度およびｐＨ４〜８の低級脂肪族アルコールでＡｐｏＡ−Ｉを沈殿させることにより、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの双方を含んでなる溶液からＡｐｏＡ−Ｉを分離する際に、ＡＡＴの損失および不活性化を妨ぎながらＡＡＴからＡｐｏＡ１を分離する問題を解決する。

本発明の特定の実施態様は、ＡｐｏＡ−Ｉ結合剤で処理され任意にＤＴＴで処理されてもよいＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ溶液のｐＨが、ＡｐｏＡ−ＩがＡｐｏＡ−Ｉ結合剤に結合するように調節される、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを分離および精製する方法を教示する。ＡｐｏＡ−Ｉ結合剤の例としては、ヒュームドシリカ（例えばＡｅｒｏｓｉｌ^TM）、脂質除去剤（ＬＲＡ^TM）、またはＣｉｂａｃｒｏｎ ｂｌｕｅ^TM誘導体（Ｃｉｂａ）などの特異的ＡｐｏＡ−Ｉ結合リガンド、トリアジン誘導体（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ）、またはＶＨＨ抗体断片（Ｔｈｅ Ｂｉｏ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）が挙げられる。いくつかの実施態様では、ＡｐｏＡ−Ｉはヒュームドシリカに結合できる。ヒュームドシリカに結合するＡｐｏＡ−ＩはＡＡＴを含有する溶液から分離でき、次の工程でヒュームドシリカからＡｐｏＡ−Ｉを溶出できる。様々な実施態様において、ｐＨ１３．６９未満、１３以下、１２以下、または１１以下でヒュームドシリカからＡｐｏＡ−Ｉを溶出できる。

いくつかの実施態様では、本発明はＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離および精製方法を教示し、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ溶液は、どちらのタンパク質も結合しない条件でジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ ３８０）によって処理される。可溶性ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ画分は沈殿したヒュームドシリカ／夾雑タンパク質から分離され、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有する上清が生じる。ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉはイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製され、引き続く疎水性相互作用クロマトグラフィー工程中に分離される。

様々な実施態様では、本発明はＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離および精製方法を教示し、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡＡＴのどちらもイオン交換カラムに結合しない条件で、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ溶液をアニオン交換カラムに通過させ、引き続いてＡｐｏＡ−Ｉが結合できＡＡＴが可溶性を保つことができて通過物画分中でＡｐｏＡ−Ｉから分離できるような条件下で、通過物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムに接触させる。

ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離後に、タンパク質精製について当該技術分野で知られている方法のいずれかによって、特にＡＡＴまたはＡｐｏＡ−Ｉの精製に適することが既知である方法によって、それぞれのＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有する溶液をさらに処理してもよい。

特定の実施態様では、下で詳述するようなタンパク質精製工程中またはその後にウィルス低減工程を実施でき、薬学的に適切な保存緩衝液中で精製タンパク質を滅菌して調合でき、凍結乾燥させまたは液体製剤として保存できる。

その他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本発明の主旨と範囲内の様々な変更および修正は、この詳細な説明から当業者には明らかになるので、詳細な説明および特定例は例示のためにのみ提供される。さらに実施例は本発明の原理を実証するものであり、先行技術に係る技術者に明らかに有用であろう全ての実施例に対する本発明の応用を具体的に例示するものではない。

実施例２で詳述されるＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの分離の実施態様を図示する流れ図である。

本発明は、双方のタンパク質に対して同一の出発原料が使用できるように、精製初期段階でＡｐｏＡ−ＩからＡＡＴを分離する方法を提供する。本発明はまた、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉをそれぞれ大規模に医薬品等級の純度にさらに精製する方法も提供する。本発明の方法は、脱アミドおよび変性を最小化する。これは双方のタンパク質の精製の各工程において１３．６９未満、１３以下、１２以下、または１１以下のｐＨを保つ、または代案としてはタンパク質がｐＨ１１以上でインキュベートされる時間を最小化することで達成することができる。この曝露持続時間は最小化され、例えば特定の実施態様では、ｐＨ値が１１以上である時間は５時間を超えてはならない。いくつかの実施態様では、ｐＨ値が１１以上である時間は１時間を超えてはならない。別の実施態様では、ｐＨ値が１１以上である時間は、２５℃で３０分を超えてはならない。より高温では許容可能な曝露時間は一層短く、より低温では許容可能な曝露時間はより長いかもしれない。精製するタンパク質の脱アミドを妨げることは、かなりより少ない変性をもたらし、得られた生物医薬品が免疫原性になるリスクを大幅に低下させる。一実施態様では、ｐＨが７〜１２であることを確実にすることで、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの脱アミドおよび変性を最小化できる。別の実施態様では、ｐＨ範囲は８〜１１である。さらに別の実施態様では、ｐＨ範囲は９〜１０である。ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの脱アミドおよび変性を最小化する特定の、しかし非限定的なｐＨ値の例としては、ｐＨ８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、および１１が挙げられる。

本発明の方法に従ったＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉ精製の出発原料として、実質量のＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有するタンパク質のあらゆる未精製混合物を使用できる。一実施様態に従って、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有するタンパク質混合物は、ヒト血漿からの画分から、特に血漿コーン画分ＩＶペーストから選択できる。特定の実施態様では、コーン画分ＩＶ₁ペーストが出発原料であるが、同様の血漿画分の使用も本発明の範囲内であると考察される。代案の出発原料としては、その他のＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有するコーン画分、キストラー・ニッチマン上清ＡまたはＡ＋Ｉからの沈殿物（Ｋｉｓｔｌｅｒ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，７：４１４−４２４（１９６２））、およびＳｃｈｕｌｔｚｅらによって米国特許第３，３０１，８４２号明細書に記載されている血漿からの硫酸アンモニウム沈殿物が挙げられるが、これに限定されるものではない。

コーン画分ＩＶ₁ペーストは、ヒト血漿を−２℃〜２℃の温度に冷却して、それを約６．９〜７．５のｐＨに調節することで調製できる。約６〜１０％（ｖ／ｖ）の濃度に冷エタノールを添加して、温度を約−４℃〜０℃に低下させた後、画分Ｉと称される沈殿物が形成し、次に遠心分離または濾過によって除去される。次に上の手順からの濾液または上清をｐＨ約６．７〜７．１に調節でき、冷エタノールを約１８〜２２％（ｖ／ｖ）の濃度に添加できる。次に温度を約−７℃〜−３℃に低下でき、混合物を再度遠心分離または濾過する。ここで形成した画分ＩＩ＋ＩＩＩと称される沈殿物は、除去してその他のタンパク質を精製するために使用できる。次にこの第２の濾液または上清を約５．０〜５．１のｐＨに調節して、エタノール濃度を約２０．０〜２２．０％（ｖ／ｖ）に調節し、温度を約−６℃〜−３℃に調節できる。今度は画分ＩＶ₁が沈殿し、遠心分離または濾過によって除去され、必要になるまでペーストの形態で保存できる。画分ＩＶ₁のペーストは、ＡＡＴ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ならびにその他の夾雑タンパク質および脂質を含有する。

ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴを精製する本発明の方法は、大規模精製に適する。本発明の要旨において大規模精製に適するとは、例えば数十キログラムのヒト血漿画分からなど、数十キログラムの出発原料から始めた場合であっても、高収率かつ高純度のＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴ精製を意味する。いくつかの実施態様では、精製は５０ｋｇを超えるヒト血漿画分に始まる。いくつかの実施態様では、精製は５０ｋｇを超えるコーン画分ＩＶ₁に始まり、後者は約９００リットルのヒト血漿の出発容積に相当する。また３０００〜４０００リットル以上の範囲内のヒト血漿の出発容積も本発明の方法のために使用できる。本発明に従って精製されたＡＡＴは、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、およびＥＬＩＳＡなどの免疫学的アッセイ、または比濁分析による判定で＞９６％の純度を有する。典型的に精製ＡＡＴの約７９〜９９％、平均して約９０％が活性である。コーン画分ＩＶ₁の機能的に活性なＡＡＴ含量を基準にした回収率は、ヒト血漿中の正常な含量の約４０〜６０％またはおよそ２０〜４０％である。

本発明に従って精製されたＡｐｏＡ−Ｉは、少なくとも７５％の純度を有する。特定の実施態様を使用すればＡｐｏＡ−Ｉの純度は８５％よりも高い。収率は少なくとも１５％である。特定の実施態様を使用すれば、収率は血漿中のＡｐｏＡ−Ｉ含量と比較して少なくとも３０％である。

本発明のいくつかの実施態様では、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離および精製は、ＡｐｏＡ−Ｉが沈殿する一方でＡＡＴが溶液中に残留するように、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ溶液中でｐＨおよび例えばエタノールなどの低級脂肪族アルコールの濃度を調整することで達成できる。沈殿したＡｐｏＡ−Ｉは、ＡＡＴを含有する溶液から分離できる。EP第０３２９６０５号明細書は、低級脂肪族アルコールでの沈殿によって、再懸濁されたヒト血漿画分からＡｐｏＡ−Ｉが沈殿できることを報告する。

本出願人はここで、EP第０３２９６０５号明細書で開示される条件下でＡｐｏＡ−Ｉを沈殿させる４０％（ｖ／ｖ）未満の低級脂肪族アルコール濃度が、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの分離をもたらさず、ＡＡＴの同時の損失および不活性化をももたらし、したがって双方のタンパク質の精製方法に適さないことを見出した。本発明の要旨では低級脂肪族アルコールとは、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールなどのＣ１〜Ｃ４脂肪族アルコールを意味する。

ｐＨ４．５〜６．５では、ＡＡＴを溶液中に残留させてその活性を保ちながら、およそ５〜２５％（ｖ／ｖ）程度に低い濃度の例えばエタノールなどの低級脂肪族アルコールで、ＡｐｏＡ−Ｉが沈殿できることがここで意外にも判明した。いくつかの実施態様では、ｐＨは５〜６である。特定の実施態様では、低級脂肪族アルコールの濃度は約７〜１５％（ｖ／ｖ）である。特定の実施態様では、低級脂肪族アルコールの濃度は約８〜１４％（ｖ／ｖ）である。６．５などのより高いｐＨではＡｐｏＡ−Ｉの沈殿が減少するのに対し、４．５未満などのより低いｐＨではＡＡＴの沈澱もまた増加する。例えば５％（ｖ／ｖ）未満のエタノール濃度などのより低い濃度の低級脂肪族アルコールでは、ＡｐｏＡ−Ｉは沈殿しないのに対し、例えば２５％（ｖ／ｖ）よりも高いエタノール濃度などのより高い濃度の低級脂肪族アルコールでは、ＡＡＴの沈澱もまた増加する。様々な実施態様では、沈殿工程中の温度を約１０℃未満に保つことができる。

ＡｐｏＡ−ＩとＡＡＴを分離させて、ＡｐｏＡ−Ｉを沈殿させながらＡＡＴの損失と不活性化を防止するのに加えて、本発明の方法は、従来技術で提案されるのよりも経済的な、低級脂肪族アルコールでＡｐｏＡ−Ｉを沈殿させるやり方を提供する。またより低い濃度の低級脂肪族アルコールの使用によって低下する爆発の危険も、沈殿工程のための製造ユニットの構築経費をより低下させる。

沈殿工程後、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉは１つ以上の処理工程で医薬品等級の純度に別々に精製できる。ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離後、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有する溶液は、例えばＡＡＴまたはＡｐｏＡ−Ｉそれぞれの精製に適することが既知の方法など、タンパク質精製のために当該技術分野で知られている方法のいずれかによってさらに処理できる。

本発明のいくつかの実施態様では、ｐＨ約８．０〜１０．０で約５０〜１５０ｍＭのＴｒｉｓ、０〜３０ｍＭのＮａＣｌにコーン画分ＩＶ₁を再懸濁して、約０〜１０℃で少なくとも１時間撹拌できる。様々な実施態様では、ｐＨは約８．８〜９．６であることができる。特定の実施態様では、再懸濁されたコーン画分ＩＶ₁の溶液を約２〜３時間撹拌できる。１ｋｇのコーン画分ＩＶ₁あたり約６〜１８ｋｇ、または１２〜１６ｋｇの緩衝液が使用できる。ＡＡＴ収率を最大化する任意のステップとして、Ｔｒｉｓ緩衝懸濁液を約４０〜４５℃の温度に約１〜１．５時間加熱し、次に再度約０〜１０℃に冷却できる。

次にＴｒｉｓ緩衝懸濁液を約０℃〜２℃の温度に冷却できる。次にＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴ懸濁液をｐＨ約５．０〜６．０でエタノール濃度８％〜１４％（ｖ／ｖ）に調節することで、ＡｐｏＡ−Ｉを沈殿させることができる。この調節は、例えば所定量のエタノールおよび酢酸ナトリウム／酢酸溶液をＴｒｉｓ緩衝懸濁液に添加することによって達成できる。エタノール／酸性溶液は、温度を約０℃〜−７℃に冷却しながら約３０〜６０分間かけて添加でき、次にこれらの条件を約２〜４時間保つ。引き続く濾過を通じたＡｐｏＡ１の分離を促進するためにＣ１０００などの濾過助剤を添加でき、次に混合物を最低１５分間撹拌できる。可溶性ＡＡＴを含有する濾液は、圧搾濾過器を優先的に使用して不溶性のＡｐｏＡ−Ｉ材料から濾過によって分離できる。代案としては不溶性のＡｐｏＡ−Ｉ材料は遠心分離によって分離できる。

次に上述の分離方法の濾液または上清中のＡＡＴをさらに精製できる。いくつかの実施態様では、ＡＡＴ濾液は約０℃〜８℃およびｐＨ約８．８〜９．６に調節できる。ｐＨ調節後、ＤＴＴを約１５〜３０ｍＭの濃度に添加できる。次にｐＨを約８．８〜９．６に保ちながら、ＤＴＴ処理された濾液を約０〜１０℃で約２〜４時間混合できる。次に血漿を含有するペースト画分中およそ１６．７ｇ／Ｌの血漿当量の濃度で、ヒュームドシリカを溶液に添加できる。次に懸濁液を約８．８〜９．６のｐＨ範囲内において、約０〜１０℃で少なくとも３０分間撹拌できる。いくつかの実施態様では、溶液は約１〜４時間撹拌される。この段階でＡＡＴ濾液の残る不純物は、ヒュームドシリカ懸濁液に結合でき、それは次に沈殿物を形成する。ヒュームドシリカとしては、例えばＡｅｒｏｓｉｌ^TMが使用できる。溶液中に残留するＡＡＴは、任意にＣ１０００などの濾過助剤を添加した後に、圧搾濾過器を使用して沈殿したヒュームドシリカおよび夾雑タンパク質から分離でき、精製されたＡＡＴ濾液を生成する。濾過助剤を使用する場合、量は１ｋｇのヒュームドシリカあたり約３ｋｇの濾過助剤であることができる。様々な実施態様では、所望のレベルの透明度が得られるまで、懸濁液を圧搾濾過器に通して再循環できる。

後述の実施態様では、濾液は最初に、塩勾配溶出を伴うイオン交換クロマトグラフィー（「ＩＥＣ」）にかけることができる。クロマトグラフィーカラムは、それに正に帯電した基が共有結合的に付着する多孔性樹脂支持マトリックスからなる、アニオン交換樹脂を含有できる。これらの正に帯電した基は、ＡＡＴなどのアニオン基があるタンパク質をはじめとするアニオンに可逆的に結合する。

溶出緩衝液のｐＨで正味の負電荷を有するＡＡＴ、およびその他のタンパク質は、ＩＥＣカラムに結合できる。わずかなまたは皆無の負電荷を有する夾雑タンパク質は、結合することなくアニオン交換樹脂カラムを通過して、カラム溶出物と共に流出できる。次にカラムと結合するこれらの夾雑タンパク質は、勾配溶出によってＡＡＴから分離される。塩濃度は、樹脂に結合する様々なタンパク質を逐次放出するためにカラムが溶出されるに従って、徐々に増大できる。

ＡＡＴ最終濾液は、ＩＥＣ平衡緩衝液（およそ５０ｍＭのＴｒｉｓおよびｐＨ約８．６〜８．９）で平衡化されたアニオン交換樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムに直接注入できる。カラムには所定のタンパク質容量のおよそ５０〜７０％までＡＡＴ最終濾液を装填できる。次にＩＥＣ洗浄緩衝液（例えばおよそ５０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５〜６５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約７．１〜７．７）でカラムを洗浄してカラムから汚染物質を除去でき、引き続いてＩＥＣ溶出緩衝液（例えばおよそ５０ｍＭのＴｒｉｓ、約７０〜１２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約７．１〜７．７）を使用して、ＡＡＴを溶出できる。

後述の特定の実施態様では、ＩＥＣカラムからのＡＡＴ含有溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）にかけることができる。このタイプのクロマトグラフィーは、それに成分が共有結合的に付着する支持マトリックスを用いる。水性環境では、これらの疎水性部分は、ＩＥＣ溶出液中に残留する夾雑タンパク質などの疎水性分子と可逆的に結合できる。ＡＡＴは比較的非疎水性である。したがってＡＡＴの大部分が緩衝液によるカラムの溶出中にカラムを通過できるのに対し、より疎水性の夾雑タンパク質はカラムに結合したままである。したがってカラム溶出物は精製されたＡＡＴを含有する。実際にはＡＡＴは特定のＨＩＣカラム媒体に対してわずかな親和性を有することが分かっており、このような場合は、最初に装填されたサンプル中の実質的に全てのＡＡＴを回収するために、大量の洗浄緩衝液によるさらなる溶出が望ましいかもしれない。

ＩＥＣカラムからの溶出液は、硫酸アンモニウムをおよそ０．９〜１．１Ｍの最終濃度に添加することにより、ＨＩＣに対応できるように準備できる。次に溶液を濾過して、ＨＩＣ洗浄緩衝液（例えばおよそ５０ｍＭのＴｒｉｓ、約１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ約７．３〜７．５）で平衡化された疎水性相互作用カラムに装填できる。次に１Ｌの重力沈降樹脂あたり約２５〜７５グラムのタンパク質の範囲内で、カラムを装填できる。装填中、ＡＡＴは疎水性カラムマトリックスに結合せずカラムを通過する。装填完了時に充填カラム内に残留する非結合ＡＡＴは、ＨＩＣ洗浄緩衝液を使用してカラムから洗い出すことができる。合わせたカラム通過物および引き続く洗浄液は限界濾過によって濃縮でき、リン酸緩衝液（約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ約７．２〜７．６）中に透析濾過できる。最終ＡＡＴ濃度は、好ましくは７％タンパク質以下である。

所望の純度および活性レベルに達するのに必要とされる追加的精製工程後、次にＡＡＴ溶液を濃縮および滅菌できる。様々な実施態様では、ＡＡＴは疎水性相互作用クロマトグラフィー後に、薬学的に許容できる純度および活性レベルであることができ、追加工程は必要でないかもしれない。いくつかの実施態様では、濃縮は、限外濾過とそれに続く透析濾過（ダイアフィルトレーション）によって達成できる。これらの技術では、溶剤および溶解塩および小型分子が濾過膜を通過して、より濃縮されたタンパク質溶液を後に残す。次に溶液を連続的に同一膜に通過させることで一定の生成物容積を保ちながら、生成物に大量の新しい緩衝液を連続して添加することで、タンパク質溶液中の残る塩および小型分子を異なる緩衝液で交換できる。

次にＡＡＴを薬学的に許容できる緩衝液と共に提供でき、液体形態で、または当該技術分野で知られている方法によって、例えばＡＡＴ治療製剤を調製するのに適することが知られている方法によって、凍結乾燥して保存できる。

哺乳類原料から単離されたタンパク質は、病原性ウィルス汚染物質を含むかもしれず、医薬組成物中のこのような汚染を低下させまたは排除することが望ましくあることができる。ウィルス低減方法については、当業者に知られている。本発明に適用可能と考察される方法としては、低温殺菌、照射、溶剤／洗剤処理、消毒、濾過、および超臨界流体処理が挙げられるがこれに限定されるものではない。溶剤／洗剤処理は、例えばタンパク質溶液とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびリン酸トリブチルとを接触させることで実施できる（米国特許第４，８２０，８０５号明細書参照；方法のＡＡＴ組成物への応用については国際公開第９５／３５３０６号パンフレットもまた参照されたい）。タンパク質溶液の消毒は、例えば米国特許第６，１０６，７７３号明細書、同第６，３６９，０４８号明細書、および同第６，４３６，３４４号明細書で開示されるように、溶液を可溶性病原体不活性化剤に曝すことで、または例えば米国特許第６，０９６，２１６号明細書とその中の参考文献で開示されるように、不溶性病原体不活性化マトリックスに接触させることで実施できる。濾過は、１５〜７０ｎｍの限外濾過膜（例えばＶｉｒＡＧａｒｄ^TMｆｉｌｔｅｒｓ、Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．；Ｐｌａｎｏｖａ^TMｆｉｌｔｅｒｓ、旭化成株式会社；Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ^TMｆｉｌｔｅｒｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．；ＤＶ ａｎｄ Ｏｍｅｇａ^TMｆｉｌｔｅｒｓ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ、並びにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからの中空繊維）の通過であることができる。照射は紫外線またはγ放射線であることができ、例えば米国特許第６，１８７，５７２号明細書とその中の参考文献を参照されたい。超臨界流体での処置によるウィルスの不活性化については、米国特許第６，４６５，１６８号明細書に記載されている。タンパク質溶液の低温殺菌は、処理するタンパク質の熱安定性によって決まる限度内で加熱することにより達成できる。ＡＡＴの場合、低温殺菌は、通常約６０〜７０℃に加熱することによって達成できる。後述のいくつかの実施態様では、ＡＡＴ濃縮物のウィルス低減は、低温殺菌および限外濾過によって実施できる。例えば米国特許第４，８７６，２４１号明細書で開示されるように、安定化添加剤を添加して低温殺菌工程中にＡＡＴを熱分解から保護できる。スクロースおよび酢酸カリウムを安定剤として添加でき、次に安定化ＡＡＴ溶液を約６０℃で低温殺菌してウィルス汚染を低下できる。スクロースの量は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または約６０重量％であることができる。４０％未満のスクロースの使用は、望ましくないレベルのＡＡＴ凝集をもたらすことが分かっている。酢酸カリウムの量は、少なくとも４％、少なくとも５％、または約６重量％であることができる。

ウィルス低減後、ＡＡＴ溶液は任意に希釈して限界濾過でき、次に再度濃縮して、例えば濾過によって滅菌する。次に滅菌されたＡＡＴ含有濃縮物を凍結乾燥して、治療薬を形成できる。いくつかの実施態様では、凍結乾燥ＡＡＴ粉末は２０ｍＭリン酸ナトリウム、４５ｍＭのＮａＣｌ、３％マンニトール中で調製できる。この組成物はそれ自体が注射に適切であるが、後で滅菌水で戻すために凍結乾燥してガラスバイアル内に保存できる。
ＡＡＴ最終濾液は、ＩＥＣ平衡緩衝液（およそ５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ約８．６〜８．９）で平衡化されたアニオン交換樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムに直接装填できる。カラムには所定のタンパク質容量のおよそ５０〜７０％までＡＡＴ最終濾液を装填できる。次にＩＥＣ洗浄緩衝液（およそ５０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５〜６５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約７．１〜７．７）でカラムを洗浄して、カラムから汚染物質を除去し、引き続いてＩＥＣ溶出緩衝液（およそ５０ｍＭのＴｒｉｓ、約７０〜１２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約７．１〜７．７）を使用して、ＡＡＴを溶出する。

最終製剤形態は、選択されるウィルス不活性化工程、および意図される投与様式に左右される。ＡＡＴが注射によって、エアロゾルとして、または局所的に投与されるかどうか次第で、ＡＡＴは、凍結乾燥粉末、液体、または懸濁液として保存できる。吸入用乾燥粉末製剤の組成物は、例えば用量あたり７．４４ｍｇのＡＡＴ、０．０５９ｍｇクエン酸ナトリウム、および０．００１ｍｇクエン酸の名目上含量であることができる。このような製剤形態は、米国特許第６，１３８，６６８号明細書で開示されるような定量吸入器または肺送達装置のどちらかを用いた、米国特許第５，７８０，０１４号明細書に記載されているような吸入投与に適する。

本発明に従って精製されたＡＡＴは、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、およびＥＬＩＳＡなどの免疫学的アッセイ、または比濁分析による判定で＞９６％の純度を有する。典型的に精製ＡＡＴの約７９〜９９％、平均して約９０％が活性である。コーン画分ＩＶ₁の機能的に活性なＡＡＴ含量を基準にした回収率は約４０〜６０％またはヒト血漿中の最初の含量と比較しておよそ２０〜４０％である。

この方法またはあらゆる後述の方法によって精製されたＡＡＴは、例えばＵＳ 米国特許第６，９７４，７９２号明細書に記載のように、ｐＩが４．３〜４．４の異性体が濃縮されていない。

本発明で記載されているように精製されたＡＡＴは、治療用医薬品に調合できる。精製されたタンパク質は、任意に製薬賦形剤が添加されてもよい従来の生理学的適合性水性緩衝溶液に溶解して、医薬品を提供してもよい。

このような薬学的キャリアおよび賦形剤ならびに適切な医薬製剤については、当該技術分野で良く知られている（例えば「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｆｒｏｋｊａｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）または「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，３^rd ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照されたい）。特に本発明のポリペプチド変異型を含む医薬組成物は、凍結乾燥または安定した液体形態に調合できる。ＡＡＴは、当該技術分野で知られている多様な手順によって凍結乾燥できる。凍結乾燥製剤は、例えば無菌の注射用水または無菌の生理学的食塩溶液などの１つ以上の薬学的に許容できる希釈剤の添加によって、使用前に戻すことができる。

組成物の製剤は、あらゆる薬学的に適切な投与手段によって個人に送達できる。様々な送達系が知られており、あらゆる都合の良い経路によって組成物を投与するのに使用できる。本発明の組成物は全身性に投与できる。全身性用途のためには、本発明のタンパク質を従来の方法に従って非経口的（例えば静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内、鼻腔内、または経皮）または経腸的（例えば経口、膣内、または直腸）送達のために調合できる。特定の実施態様では、投与経路は静脈内、皮下、または肺内である。製剤は輸液によって連続的に、またはボーラス投与によって投与できる。いくつかの製剤形態は、徐放システムを包含する。

本発明に従ったＡＡＴは、許容できない有害副作用をもたらす用量に達することなく、所望の効果をもたらし、治療される病状または適応症の重篤性または拡大を予防しまたは低下させるのに十分な用量を意味する、治療的に効果的な用量で患者に投与できる。正確な用量は、例えば適応症、製剤形態、投与様式などの多数の要因に左右され、適応症毎に臨床前および臨床試験で判定されなくてはならない。

本発明はまた、家族性ＡＡＴ欠乏症を患っている個人、ならびに例えば肺気腫および嚢胞性線維症などのＡＡＴの治療的使用が有益かもしれないその他の適応症を治療する方法も提供する。本方法は、前記個人に治療的に有効量のＡＡＴを投与するステップを含む。本発明の医薬組成物は、単独でまたはその他の治療薬と併せて投与できる。これらの薬剤は同一医薬品の一部として組み込むことができる。

本発明の特定の実施態様では、上述の方法によって得られた沈殿したＡｐｏＡ−Ｉは、後述するようにさらに精製できる。

ＡｐｏＡ−Ｉは、ヒト血漿タンパク質画分の懸濁液を約０〜−２℃、ｐＨ約５〜６で、約８〜１４％の例えばエタノールなどの低級脂肪族アルコール濃度においてインキュベートして得られた沈殿物から、ｐＨ６〜１０で約２０ｍＭのＴｒｉｓを含んでなる緩衝液中で約２時間から最長２４時間にわたり０℃〜５０℃の温度で抽出できる。いくつかの実施態様では、緩衝液のｐＨは約８．０であることができる。任意に水溶性塩を約０〜１Ｍの濃度で添加できる。

ＡｐｏＡ−Ｉの可溶化を改善するために、非イオン性洗剤（例えばポリソルベート、ブリッジ（Ｂｒｉｊ）、オクチル−グリコシド）、イオン性洗剤（例えば胆汁酸）、または両性イオン性洗剤（例えばＣＨＡＰＳ^TM、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ^TM）を添加できる。続くステップ次第で、洗剤は、例えばダイアフィルトレーションまたは適切な樹脂（ＢｉｏＢｅａｄｓ^TM）への吸収によって除去でき、または部分的に除去できる。

緩衝懸濁液は、撹拌して約１〜４時間インキュベートし、次に濾過または遠心分離することができる。濾液または上清に含有されるＡｐｏＡ−Ｉは、後述の方法によってさらに精製できる。

濾液または上清のｐＨは適切に調節して、ＡｐｏＡ−Ｉが溶液中に残留したまま高分子量汚染物質の大部分が沈殿するまで、エタノールを添加できる。特定の実施態様では、ＡｐｏＡ−Ｉは、約４５％（３５〜５５％）（ｖ／ｖ）のエタノール、ｐＨ３．５（ｐＨ３〜５）、１０〜２００ｍＭのＮａＣｌで沈殿できる。ＡｐｏＡ−Ｉはまた、ｐＨを５（ｐＨ４〜６）に、エタノール濃度を＞５０％（５０〜６０％）（ｖ／ｖ）に増大させることによっても沈殿できる。

本発明に従ったさらに別の方法では、例えば硫酸アンモニウムでの沈殿によってＡｐｏＡ−Ｉを濾液または上清から単離できる。硫酸アンモニウムは、最終濃度約０．６〜１．４Ｍ、ｐＨ範囲６〜９で、固体としてまたは濃縮原液としてＡｐｏＡ−Ｉ抽出物に添加できる。懸濁液は約０℃〜３０℃で約２〜２４時間にわたりインキュベートでき、沈殿したＡｐｏＡ−Ｉ画分は濾過または遠心分離によって収集できる。

次に例えば当業者が判定できるような適切な条件下における、カチオンまたはアニオン交換樹脂、疎水性相互作用マトリックス、および混合モード樹脂（例えばイオン性および疎水性部位と反応できる特性を有する樹脂）からのＡｐｏＡ−Ｉの結合および溶出をはじめとする、当該技術分野で知られている方法によって、ＡｐｏＡ−Ｉのさらなる精製が達成できる。本発明のいくつかの実施態様では、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、疎水性相互作用マトリックス、および／または混合モード樹脂中において、ＡｐｏＡ−Ｉの状態が通過物画分にあり、汚染物質の大部分が樹脂に結合したままであるように条件を選択できる。

場合によりＡｐｏＡ−Ｉは、ヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ^TM）および／または脂質除去剤（ＬＲＡ^TM；Ｗｏｒｌｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）への結合によって、または例えばＣｉｂａｃｒｏｎ^TMｂｌｕｅ誘導体（Ｃｉｂａ）、トリアジン誘導体（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ）、またはＶＨＨ抗体断片（Ｔｈｅ Ｂｉｏ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）への特異的リガンド吸着によって、さらに精製できる。これらの結合剤からのＡｐｏＡ−Ｉの溶出は、例えば洗剤、エタノール、カオトロピック試薬、高ｐＨ、特定の実施態様では１３．６９未満、または１３以下、１２以下、または１１以下のｐＨ、またはそれらの組み合わせによって実施できる。

本発明に従って精製されたＡｐｏＡ−Ｉは少なくとも７５％、典型的には８５％よりも高い純度を有する。いくつかの実施態様では、収率は血漿中のＡｐｏＡ−Ｉ含量と比較して少なくとも１５％である。特定の実施態様では、収率は血漿中のＡｐｏＡ−Ｉ含量と比較して少なくとも３０％である。

様々な実施態様では、ＡＡＴについて上述されたような少なくとも１つのウィルス低減工程をＡｐｏＡ−Ｉに施すことができる。

本発明で記載されているような精製されたＡｐｏＡ−Ｉは、治療用医薬品に調合することができる。精製タンパク質は、任意に製薬賦形剤を添加できる従来の生理学的に適合性の水性緩衝溶液に溶解して医薬品を提供できる。このような薬学的キャリアおよび賦形剤ならびに適切な医薬製剤については、当該技術分野で良く知られている（例えば「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｆｒｏｋｊａｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）または「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，３^rd ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照されたい）。特に本発明のポリペプチド変異型を含む医薬組成物は、凍結乾燥形態または安定した液体形態に調合できる。ＡｐｏＡ−Ｉは当該技術分野で知られている多様な手順によって凍結乾燥できる。凍結乾燥製剤は、例えば無菌注射用水または無菌生理学的食塩溶液などの１つ以上の薬学的に許容できる希釈剤の添加によって、使用前に戻すことができる。いくつかの実施態様では、Ｌｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ １９９６；７１：１５５−１６４に記載のように、精製されたＡｐｏＡ−Ｉが再構成ＨＤＬ様粒子（ｒＨＤＬ）の形態で治療的に使用できる。

ＡｐｏＡ−Ｉを含んでなる製剤は、あらゆる薬学的に適切な投与手段によって個人に送達できる。様々な送達系が知られており、あらゆる都合の良い経路によって組成物を投与するのに使用できる。特定の実施態様では、本発明の組成物は全身性に投与できる。全身性用途のためには、本発明のタンパク質を従来の方法に従って非経口的（例えば静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内、鼻腔内、経皮）または経腸的（例えば経口、膣内、直腸）送達のために調合できる。いくつかの実施態様では、ＡｐｏＡ−Ｉまたは再構成ＡｐｏＡ−Ｉは静脈内投与できる。製剤は輸液によって連続的に、またはボーラス投与によって投与できる。いくつかの製剤形態は、徐放システムを包含する。本発明に従ったＡｐｏＡ−Ｉは、許容できない有害副作用をもたらす用量に達することなく、所望の効果をもたらし、治療される病状または適応症の重篤性または拡大を予防しまたは低下させるのに十分な用量を意味する、治療的に効果的な用量で患者に投与できる。正確な用量は、例えば適応症、製剤形態、および投与様式などの多数の要因に左右され、それぞれの適応症毎に臨床前および臨床試験で判定されなくてはならない。

本発明はまた、家族性ＡｐｏＡ−Ｉ欠乏症を患っている個人、ならびに例えばアテローム動脈硬化、心血管疾患、脳血管疾患（例えば脳卒中）、虚血再灌流傷害、末梢血管疾患、糖尿病ならびに慢性および急性炎症疾患に付随する血管疾患、および過剰な凝固の抑制などのＡｐｏＡ−Ｉの治療的使用が有益かもしれないその他の適応症を治療する方法も提供する。本方法は、前記個人に治療的に有効量のＡｐｏＡ−ＩまたはｒＨＤＬを投与するステップを含む。

本発明の医薬組成物は、単独でまたはその他の治療薬と併せて投与できる。これらの薬剤は同一医薬品の一部として組み込むことができる。

特定の実施態様では、本発明はＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを分離および精製する方法を提供し、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ溶液のｐＨは、ＡｐｏＡ−Ｉが、例えばヒュームドシリカ（例えばＡｅｒｏｓｉｌ^TM）、脂質除去剤（ＬＲＡ^TM）またはＣｉｂａｃｒｏｎ ｂｌｕｅ^TM誘導体（Ｃｉｂａ）などの特異的ＡｐｏＡ−Ｉ結合リガンド；トリアジン誘導体（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ）またはＶＨＨ抗体断片（Ｔｈｅ Ｂｉｏ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）などの添加されたＡｐｏＡ−Ｉ結合剤に結合できるように調節される。いくつかの実施態様では、ヒュームドシリカがＡｐｏＡ−Ｉ結合剤である。ヒュームドシリカに結合するＡｐｏＡ−ＩはＡＡＴ含有溶液から分離でき、次にＡｐｏＡ−Ｉは１３．６９未満、または１３以下、１２以下、または１１以下のｐＨでヒュームドシリカから溶出できる。一実施態様では、ＡｐｏＡ−Ｉは７〜１２のｐＨで溶出できる。別の実施態様では、ｐＨは８〜１１であることができる。さらに別の実施態様では、ｐＨ範囲は９〜１０であることができる。ＡｐｏＡ−Ｉを溶出できるいくつかの具体的なしかし非限定的なｐＨ値の例としては、ｐＨ８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、および１１が挙げられる。ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離後、例えばＡＡＴまたはＡｐｏＡ−Ｉの精製に適することが知られている方法など、タンパク質精製のために当該技術分野で知られている方法のいずれかによって、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有する溶液をさらに処理できる。

本発明の特定の実施態様では、コーン画分ＩＶ₁ペーストを例えば約５０〜１５０ｍＭのＴｒｉｓ、０〜３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約８．０〜約１０．０の懸濁緩衝液に懸濁して、約０〜１０℃で最低１時間撹拌できる。いくつかの実施態様では、ｐＨは約９．０〜９．６であることができる。様々な実施態様では、懸濁液は２〜３時間撹拌できる。緩衝液の量は、１ｋｇの血漿含有画分（画分ＩＶ₁）あたり６ｋｇ〜１８ｋｇ（または１２ｋｇ〜１６ｋｇ）の範囲であることができる。ＡＡＴ収率を最大化する任意の工程として、Ｔｒｉｓ緩衝懸濁液を約４０〜４５℃の温度で約１〜１．５時間加熱して、次に約０〜１０℃に冷却できる。

次にＴｒｉｓ緩衝懸濁液をジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびヒュームドシリカで処理できる。ＤＴＴは約１５〜５０ｍＭの範囲内の濃度でＴｒｉｓ緩衝懸濁液に添加できる。次に溶液を約０〜１０℃、ｐＨ約９．０〜９．６で最低約３０分間撹拌できる。特定の実施態様では、溶液は約２〜４時間撹拌される。次にＤＴＴ処理抽出物は、例えば希釈塩酸溶液を使用して、ｐＨ約７．５〜７．８に調節できる。次にヒュームドシリカ（例えばＡｅｒｏｓｉｌ^TM３８０）をおよそ１６．７グラム／リットル血漿当量で、血漿を含有する画分に添加できる。次に懸濁液を低温でｐＨ約７．５〜８．０で少なくとも３０分間撹拌できる。いくつかの実施態様では、懸濁液を約１〜４時間撹拌できる。Ｃ１０００などの濾過助剤を１部のシリカに対して約３部の濾過助剤の重量比で添加でき、混合物は最低約１５分間撹拌できる。次に圧搾濾過器を使用して、沈殿したヒュームドシリカ／ＡｐｏＡ−Ｉおよび夾雑タンパク質から可溶性ＡＡＴ画分を分離でき、最終ＡＡＴ濾液が生じる。ＡＡＴ濾液がさらに処理できる一方で、ヒュームドシリカＡｐｏＡ−Ｉ沈殿物はさらなる精製のために収集できる。代案としてはヒュームドシリカに結合するＡｐｏＡ−Ｉを遠心分離によって分離できる。ヒュームドシリカからのＡｐｏＡ−Ｉの溶出は、ｐＨ９〜１０、好ましくはｐＨ約９．５での５０〜１００ｍＭのＴｒｉｓ中におけるインキュベーションによって達成される。ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離後、例えば上述の方法によって双方のタンパク質をさらに精製できる。

いくつかの実施態様では、本発明はＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離および精製方法を提供し、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ溶液は、どちらのタンパク質も結合しない条件下で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ^TM）で処理される。可溶性ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ画分は沈殿したヒュームドシリカ／夾雑タンパク質から分離でき、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉ含有上清が生じる。ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉはイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製でき、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程中に分離される。

本発明の様々な実施態様では、画分ＩＶ₁ペーストを懸濁緩衝液（例えば５０〜１５０ｍＭのＴｒｉｓ、０〜３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０〜約１０．０）に懸濁して、０〜１０℃で最低１時間撹拌できる。いくつかの実施態様では、懸濁緩衝液のｐＨは９．０〜９．６であることができる。特定の実施態様では、懸濁液は２〜３時間撹拌できる。使用される緩衝液の量は、１ｋｇの血漿含有画分（画分ＩＶ₁）あたり６〜１８ｋｇ（または１２〜１６ｋｇ）の範囲であることができる。次にＴｒｉｓ緩衝懸濁液を４０〜４５℃の温度に１〜１．５時間加熱して、次に０〜１０℃に冷却できる。

次にＴｒｉｓ緩衝懸濁液をジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ^TM）で処理できる。ＤＴＴは約１５〜５０ｍＭの範囲内の濃度でＴｒｉｓ緩衝懸濁液に添加できる。次に溶液を温度約０〜１０℃、ｐＨ約９．０〜９．６で、少なくとも約３０分間撹拌できる。いくつかの実施態様では、溶液は約２〜４時間撹拌できる。次にヒュームドシリカ（例えばＡｅｒｏｓｉｌ^TM）をおよそ１６．７グラム／リットル血漿当量で、血漿を含有する画分に添加できる。次に約９．０〜９．６のｐＨを保ちながら、懸濁液を約０〜１０℃で少なくとも約３０分間撹拌できる。いくつかの実施態様では、溶液は約１〜４時間撹拌できる。Ｃ１０００などの濾過助剤を１部のヒュームドシリカに対して約３部の濾過助剤の重量比で添加でき、混合物は最低約１５分間撹拌できる。可溶性ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ画分は、例えば圧搾濾過器を使用して、沈殿したヒュームドシリカ／夾雑タンパク質から分離でき、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ濾液が生じる。代案としては例えば遠心分離など、ヒュームドシリカを分離するその他の様式を用いることができる。

ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程中に、５０ｍＭのＴｒｉｓ、７．５Ｍ硫酸アンモニウムを含んでなるｐＨ約７．３〜７．５の洗浄緩衝液でＡＡＴが洗い流された後に、ＡｐｏＡ−Ｉが水と共に最終的に溶出されること以外は、上述のようにイオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用してさらに精製できる。ＡＡＴの合わせたカラム通過物と引き続く洗浄液を限外濾過によって濃縮し、リン酸緩衝液（約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ約７．２〜７．６）中にダイアフィルター処理する。最終ＡＡＴ濃度は好ましくは７％タンパク質以下である。ＡＡＴはＨＩＣカラムから医薬品等級の純度で溶出される。

次に上述のように、ヒュームドシリカから溶出されるＡｐｏＡ−Ｉをさらに精製できる。

いくつかの実施態様では、本発明はＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを分離および精製する方法を提供し、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ溶液をＤＴＴおよびヒュームドシリカで処理して、次にＡｐｏＡ−ＩまたはＡＡＴのどちらもイオン交換カラムに付着しない条件下でアニオン交換カラムに通過させ、ＡｐｏＡ−Ｉが結合してＡＡＴが可溶性のままであるような条件下で、通過物をＨＩＣカラムに接触させて通過物画分中でＡｐｏＡ−Ｉから分離する。ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉの分離後、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉを含有する溶液は、タンパク質精製について当該技術分野で知られている方法のいずれかによって、例えばＡＡＴまたはＡｐｏＡ−Ｉの精製に適することが知られている方法によって、さらに処理できる。

特定の実施態様では、上述のように緩衝液によってコーン画分ＩＶ₁ペーストを懸濁して、ＤＴＴおよびＡｅｒｏｓｉｌ^TMで処理して濾過できる。ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ濾液のｐＨは、例えば希釈塩酸溶液の添加によって、約７．１〜７．７に調節できる。次にＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ濾液の導電率を例えば２ＭのＮａＣｌ溶液の添加によって、２２．０℃でおよそ１５ｍＳ／ｃｍに調節できる。次にｐＨ／導電率が調節されたＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ濾液を平衡緩衝液（例えば約５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ約７．４、約１５ｍＳ／ｃｍ導電率）で平衡化されたアニオン交換樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムに、直接に装填できる。夾雑タンパク質がカラムに結合できる一方、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉは通過する。

次に硫酸アンモニウムを約０．９Ｍ〜１．１Ｍの最終濃度に添加することで、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ通過物をＨＩＣのために準備できる。溶液は濾過して、ＨＩＣ洗浄緩衝液で平衡化されたＨＩＣカラムに装填できる。装填中の最初の溶出はＡＡＴ含有溶出物を提供でき、追加的洗浄緩衝液による溶出は、カラム中に保留されるあらゆるＡＡＴを除去できる。合わせた溶出物および洗浄液は例えば限外濾過によって濃縮でき、リン酸緩衝液中にダイアフィルター処理される。いくつかの実施態様では、最終ＡＡＴ濃度は７％タンパク質以下である。ひとたびＡＡＴ画分が除去されたら、０．１〜０．２Ｍの硫酸アンモニウム溶液によって追加的不純物をカラムから洗い流すことができ、次に水を使用してＡｐｏＡ−Ｉをカラムから溶出できる。ＡＡＴはＨＩＣカラムから医薬品等級の純度で溶出される。ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴは、例えば上述の方法を使用してさらに精製できる。

実施例１：コーン画分ＩＶ₁沈殿物の調製
ヒト血漿を約０℃に冷却し、ｐＨ約７．２に調節した。冷エタノールを約８％（ｖ／ｖ）濃度に添加し、温度をおよそ−２℃に低下させた。形成した沈殿物（画分Ｉ）を遠心分離または濾過により除去した。

上の手順からの濾液または上清を約ｐＨ６．９に調節し、冷エタノールをおよそ２０％（ｖ／ｖ）濃度に添加した。次に温度を５℃に低下させ、混合物に再度、遠心分離または濾過のどちらかを施す。形成した沈殿物（画分ＩＩ＋ＩＩＩ）は、他の目的のために保留した。

上の手順からの濾液または上清をｐＨ約５．０５に調節し、エタノール濃度を２１％（ｖ／ｖ）に調節した。温度を−５℃に調節した。形成した沈殿物（画分ＩＶ₁）を遠心分離または濾過によって除去し、ペーストの形態で必要になるまで保存した。この画分ＩＶ₁ペーストは、ＡＡＴ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ならびに夾雑タンパク質および脂質を含有した。

実施例２：ＡｐｏＡ−Ｉの沈殿を伴うＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの精製
２．１ ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの分離：
２．１．１ 画分ＩＶ₁の抽出およびＡｐｏＡ−Ｉ画分の沈殿
画分ＩＶ₁材料を懸濁緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．６）に懸濁し、２〜８℃で２時間撹拌した。使用された緩衝液の量は、１ｋｇの血漿含有画分あたり１５ｋｇの緩衝液であった。次に懸濁液をおよそ０℃に冷却し、一定量のエタノールおよび酢酸ナトリウム／酢酸溶液をＴｒｉｓ緩衝懸濁液に添加して、ｐＨ５．４およびエタノール濃度１２％（ｖ／ｖ）を有する懸濁液を生成した。温度をおよそ−４℃に冷却させながらエタノール／酸性溶液を３０分間かけて添加した。次にｐＨ／エタノール条件を２時間保った。１ｋｇの画分ＩＶ₁沈殿物あたり１００グラムの濾過助剤で、濾過助剤Ｃ１０００を添加した。次に混合物を約１５分間撹拌した。圧搾濾過器での濾過によって可溶性ＡＡＴ材料（ＡＡＴ濾液）を不溶性のＡｐｏＡ−Ｉ材料（ＡｐｏＡ−Ｉ沈殿物）から分離した。

２．２ ＡＡＴのさらなる精製
２．２．１ ＤＴＴおよびシリカによる精製
ＡＡＴ濾液の温度をおよそ５℃に調節しながら、１ＭのＮａＯＨを使用して濾液のｐＨを９．４前後に調節した。ｐＨ調節後、ＤＴＴを３０ｍＭの濃度に添加した。次にｐＨ９．４前後を保ちながら、ＤＴＴ処理濾液をおよそ５℃で２時間混合した。次にヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ^TM３８０）をおよそ１６．７グラム／リットル血漿当量で、血漿を含有するペースト画分に添加した。次に懸濁液を５℃前後の温度、ｐＨ約９．４でおよそ１時間撹拌した。１ｋｇのヒュームドシリカあたり３ｋｇの比率で濾過助剤Ｃ１０００を添加し、混合物をおよそ１５分間撹拌した。圧搾濾過器を使用して、沈殿したヒュームドシリカおよび夾雑タンパク質から可溶性ＡＡＴ生成物を分離し、ＡＡＴ最終濾液を生成した。所望の透明度レベルが得られるまで、懸濁液を圧搾濾過器に再循環させた。

２．２．２ イオン交換クロマトグラフィー
ＩＥＣ平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．８）で平衡化されたＴＭＡＥフラクトゲルを含有するクロマトグラフィーカラムに、ＡＡＴ最終濾液を直接装填した。カラムにはタンパク質容量のおよそ６５％までＡＡＴ最終濾液を装填した。ＩＥＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、約４５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約７．４）での洗浄によってカラムから汚染物質を除去し、ＩＥＣ溶出緩衝液（およそ５０ｍＭのＴｒｉｓ、約９５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約７．４）を用いて、ＡＡＴを引き続いて溶出した。

２．２．３ 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
硫酸アンモニウムをおよそ１Ｍの最終濃度に添加することで、ＩＥＣカラムからの溶出液をＨＩＣのために準備した。次に溶液を濾過して、ＨＩＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ約７．４）で平衡化された疎水性相互作用カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｈｉｇｈ ｓｕｂ）に装填した。カラムに１Ｌの重力沈降樹脂あたり、およそ４０グラムのタンパク質を装填した。装填中にＡＡＴは疎水性カラムマトリックスに結合せず、カラムを通過した。装填完了時に、非結合ＡＡＴは充填カラム内に残留し、ＨＩＣ洗浄緩衝液を使用してカラムから洗い流された。合わせたカラム通過物および引き続く洗浄液を限外濾過によって濃縮し、リン酸緩衝液（４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ約７．４）中に、ダイアフィルター処理した。

生成物はＳＤＳ−Ｐａｇｅと、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的アッセイまたは比濁分析の双方による判定で、≧９６％純粋なＡＡＴであり、サイズ排除ＨＰＬＣによって≧９３％モノマーであることが分かった。コーン画分ＩＶペーストの機能的に活性なＡＡＴ含量に基づく回収率は４０〜６０％であり、または通常の血漿含量のおよそ２０〜４０％であった。平均して８９％の精製されたＡＡＴが活性であり、７９〜９９％の範囲が典型的に観察された。

２．３ ＡｐｏＡ−Ｉのさらなる精製
２．１に記載されているようにして得られたおよそ５０ｇのＡｐｏＡ−Ｉ沈殿物をｐＨ８．０の７倍量のＴｒｉｓ−ＨＣｌに懸濁し、室温でおよそ２時間撹拌した。次に懸濁液を濾過助剤（Ｃｅｌｉｔｅ^TM５７４）で被覆されたセルロースフィルターに通して、濾過した。

ＡｐｏＡ−Ｉを含有する濾液に、固体硫酸アンモニウムを０．８、０．９、１．０、１．２、および１．４Ｍの最終濃度で添加した。各懸濁液のｐＨを７．０〜７．５に調節した。次に沈殿物を最後にＣｅｌｉｔｅ^TM５７４濾過助剤で被覆されたセルロースフィルターを通じた濾過によって分離する前に、懸濁液を室温で少なくとも２時間インキュベートした。

この方法を使用して純度８９％に至るＡｐｏＡ−Ｉ製剤が得られ、それは医薬品等級の純度に相当する。

実施例３：ＡｐｏＡ−Ｉのヒュームドシリカへの吸着を使用したＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの精製
３．１ ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの分離：ヒュームドシリカへの結合
画分ＩＶ₁ペーストを懸濁緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約９．６）に懸濁して、およそ５℃でおよそ２時間撹拌した。使用された緩衝液の量は、１ｋｇの血漿含有画分（画分ＩＶ₁）あたりおよそ１２ｋｇであった。ＡＡＴ収率を最大化するために、Ｔｒｉｓ緩衝懸濁液をおよそ１．５時間にわたっておよそ４３℃に加熱し、次におよそ５℃に冷却した。

次にＴｒｉｓ緩衝懸濁液をＤＴＴおよびヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ^TM３８０）で処理した。ＤＴＴをＴｒｉｓ緩衝懸濁液に約３０ｍＭの濃度で添加した。溶液を約５℃、ｐＨ９．４前後でおよそ２時間撹拌した。次に希釈塩酸溶液を使用して、ＤＴＴ処理抽出物のｐＨを約７．８に調節した。次にヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ^TM３８０）をおよそ１６．７グラム／リットル血漿当量で、血漿を含有するペースト画分に添加した。懸濁液を約５℃、ｐＨ７．５〜８．０でおよそ１時間撹拌した。１部のシリカに対して３部の濾過助剤の重量比で、Ｃｅｌｐｕｒｅ^TMＣ１０００濾過助剤を添加し、混合物を１５分間撹拌した。圧搾濾過器を使用して、沈殿したヒュームドシリカ／ＡｐｏＡ−Ｉおよび夾雑タンパク質から可溶性ＡＡＴ画分を分離し、ＡＡＴ最終濾液を生成した。ＡＡＴ濾液をさらに処理する一方、ヒュームドシリカＡＰＯＡ−１沈殿物をさらなる精製のために収集した。

３．２ ＡＡＴのさらなる精製：
２．２．２および２．２．３に記載されているようにして、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、ＡＡＴをさらに精製した。

生成物は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよび免疫学的アッセイ双方による判定で≧９６％純粋なＡＡＴであり、サイズ排除ＨＰＬＣによれば≧９３％モノマーであった。コーン画分ＩＶペーストの機能的に活性なＡＡＴ含量に基づいた回収率は４０〜６０％または通常の血漿含量のおよそ２０〜４０％であった。平均して８９％の精製されたＡＡＴが活性であり、７９〜９９％の範囲が典型的に観察された。

３．３ ＡｐｏＡ−Ｉのさらなる精製
ステップ３．１の工程においてＡＡＴから分離されたヒュームドシリカをｐＨ９．５の５０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に再懸濁することで、ＡｐｏＡ−Ｉをヒュームドシリカから放出した。引き続く遠心分離または濾過によるヒュームドシリカからの分離後、２．３に記載されているようにしてＡｐｏＡ−Ｉをさらに精製してもよい。

実施例４：イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの精製
４．１ ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの分離
画分ＩＶ₁ペーストを懸濁緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約９．６）に懸濁し、およそ５℃で２時間撹拌した。使用された緩衝液の量は、１ｋｇの血漿含有画分（画分ＩＶ₁）あたりおよそ１２ｋｇであった。Ｔｒｉｓ緩衝懸濁液をおよそ４３℃で１．５時間前後加熱し、次におよそ５℃に冷却した。

次にＴｒｉｓ緩衝懸濁液をＤＴＴおよびヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ^TM３８０）で処理した。ＤＴＴをＴｒｉｓ緩衝懸濁液に３０ｍＭの濃度で添加した。溶液をおよそ５℃、ｐＨおよそ９．４で２時間撹拌した。次にヒュームドシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ^TM３８０）をおよそ１６．７グラム／リットル血漿当量で、血漿を含有するペースト画分に添加した。ｐＨをおよそ９．４に保ちながら、懸濁液を５℃前後でおよそ１時間撹拌した。１部のヒュームドシリカに対して３部の濾過助剤の重量比で、Ｃｅｌｐｕｒｅ^TMＣ１０００濾過助剤を添加し、混合物を約１５分間撹拌した。圧搾濾過器を使用して、沈殿したヒュームドシリカ／夾雑タンパク質から可溶性ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ画分を分離し、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ最終濾液を生成した。

疎水性相互作用クロマトグラフィー工程中、水でのＡＡＴ洗浄工程後にＡｐｏＡ−Ｉを溶出したこと以外は、２．３．２および２．３．３に記載されているようにして、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉをさらに精製した。

ＡＡＴの合わせたカラム通過物および洗浄液を限外濾過によって濃縮し、リン酸緩衝液（４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ約７．４）中にダイアフィルター処理した。生成物は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよび免疫学的アッセイ双方による判定で≧９６％純粋なＡＡＴであり、サイズ排除ＨＰＬＣによれば≧９３％モノマーであった。コーン画分ＩＶペーストの機能的に活性なＡＡＴ含量に基づいた回収率は４０〜６０％または、通常の血漿含量のおよそ２０〜４０％であった。平均して８９％の精製されたＡＡＴが活性であり、７９〜９９％の範囲が典型的に観察された。

４．２ ＡＡＴのさらなる処理

実施例５：陰イオン交換クロマトグラフィーとそれに続く疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの精製
５．１ ＤＴＴおよびシリカによる精製
実施例４．１に記載されているようにして、画分ＩＶ−１の抽出とＤＴＴおよびシリカによる精製を実施した。

５．２．イオン交換クロマトグラフィー
ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ最終濾液を希塩酸溶液の添加によって約７．４のｐＨ範囲に調節した。ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ濾液の導電率を２Ｍ ＮａＣｌ溶液の添加によって、２２．０℃でおよそ１５ｍＳ／ｃｍに調節した。平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５ｍＳ／ｃｍ導電率）で平衡化されたアニオン交換樹脂ＥＭＤ^TMＡＥフラクトゲル６５０（ｍ）を含有するクロマトグラフィーカラムに、ｐＨ／導電率調節済みＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ最終濾液を直接装填した。夾雑タンパク質がカラムに結合する一方、ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉは装填中に通過した。ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉを含有するイオン***換カラム通過物画分を指示されるようにさらに処理した。

５．３．ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの分離：疎水性相互作用クロマトグラフィー
硫酸アンモニウムを１Ｍの最終濃度に添加することで、ＡＡＴ／ＡｐｏＡ−Ｉ ＩＥＣ通過物をＨＩＣのために準備した。次にこの溶液を濾過して、ＨＩＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１Ｍ硫酸アンモニウム）で平衡化された疎水性相互作用カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｈｉｇｈ ｓｕｂ）に装填した。装填中の最初の溶出はＡＡＴ含有溶出物を提供し、追加的な洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１Ｍ硫酸アンモニウム）よる溶出は、カラム内に残留するあらゆるＡＡＴを除去した。合わせた通過物および洗浄液を限外濾過によって濃縮し、リン酸緩衝液中にダイアフィルター処理した。ひとたびＡＡＴ画分を除去したら、０．１〜０．２Ｍ硫酸アンモニウム溶液によってカラムから追加的な不純物を洗い流し、次に水を使用してカラムからＡｐｏＡ−Ｉを溶出した。

生成物は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよび免疫学的アッセイ双方による判定で≧９６％純粋なＡＡＴであり、サイズ排除ＨＰＬＣによれば≧９３％モノマーであった。コーン画分ＩＶペーストの機能的に活性なＡＡＴ含量に基づいた回収率は４０〜６０％または通常の血漿含量のおよそ２０〜４０％であった。平均して８９％の精製されたＡＡＴが活性であったのに対し、６回の試行中では７９〜９９％の範囲が典型的に観察された。

本明細書の全体を通じて、「含む」という用語、または「含んでなる」などのバリエーションは、述べられた整数またはステップ、または要素、整数またはステップの群の包含を意味するが、あらゆるその他の整数またはステップ、または要素、整数またはステップの群の排除は意味しないものと理解される。

本発明の主旨または範囲を逸脱することなく、既述された部分には、様々な変更または追加ができるものと理解される。

Claims (13)

1. アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）およびΑ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を、双方のタンパク質を含有する単一の出発ヒト血漿画分から精製する方法であって、
   ｉ）ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴを含む出発ヒト血漿画分を処理して、ＡＡＴを含有する画分とＡｐｏＡ−Ｉを含有する画分とを分離するステップであって、
   ａ）出発原料として使用される出発ヒト血漿画分を、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴの双方が可溶化されるように処理するステップと、
   ｂ）10℃以下の温度にて８〜１４％（v/v）の濃度にエタノールを添加することでＡｐｏＡ−Ｉを溶液から沈殿させ、かつ、ＡｐｏＡ−Ｉが沈殿してＡＡＴが溶液中に留まるように溶液のｐＨを約５〜６に調整するステップと、
   ｃ）沈殿したＡｐｏＡ−Ｉを、ＡＡＴを含有する溶液から分離するステップ、
   とを含む前記ステップと、
   ｉｉ）ＡｐｏＡ−ＩおよびＡＡＴを、１つ以上の加工工程において医薬品等級の純度に別々に精製するステップ、と
   を含む方法。
2. 出発ヒト血漿画分が、コーン画分ＩＶ、キストラー・ニッチマン上清ＡおよびＡ＋Ｉからの沈殿物、および硫酸アンモニウム沈殿物の１つ以上から選択される、請求項１に記載の方法。
3. １つ以上のコーン画分ＩＶがコーン画分ＩＶ_１である、請求項２に記載の方法。
4. ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉが１３．６９以上のｐＨに曝されない、請求項１に記載の方法。
5. ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉが１３以上のｐＨに曝されない、請求項１に記載の方法。
6. ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉが１２以上のｐＨに曝されない、請求項１に記載の方法。
7. ＡＡＴおよびＡｐｏＡ−Ｉが１１以上のｐＨに曝されない、請求項１に記載の方法。
8. ステップａ）で出発ヒト血漿画分が、約５０〜１５０ｍＭのＴｒｉｓおよび約０〜２０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ約８．０〜１０．０の緩衝液中に可溶化される、請求項１に記載の方法。
9. ＡｐｏＡ−Ｉが１０℃以下の温度で沈殿される、請求項１に記載の方法。
10. ウィルス低減ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. ウィルス低減ステップが約６０℃での低温殺菌を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 低温殺菌ステップが、少なくとも４０％ｗ／ｗのスクロースおよび少なくとも４％ｗ／ｗの酢酸カリウムを含む溶液に対して実施される、請求項１１に記載の方法。
13. ウィルス低減ステップが、ウィルス粒子を除去できるフィルターを通して濾過することを含む、請求項１０に記載の方法。