JP5578779B2 - スフェロイド培養方法及びスフェロイド培養容器 - Google Patents

Description

本発明は、付着性細胞を用いてスフェロイドを培養する方法、及びスフェロイド培養に好適な培養容器に関する。

細胞培養技術において、生体内と同等な三次元組織を構築できるスフェロイド培養が着目されている。スフェロイドは、細胞塊又は細胞凝集体とも称され、主に肝細胞や癌細胞などの付着性細胞から形成される。スフェロイド培養では、細胞が三次元に集合して塊となるので、細胞が二次元に集合する単層培養法と比べて、細胞の特異的な機能を長期間維持することができる。このような特性から、スフェロイド培養は、薬剤の毒性及び薬理活性評価のシミュレータや、ハイブリッド型人工臓器、バイオリアクタなどの分野において利用されることが期待されている。

スフェロイド培養においては、集合する細胞数を制御することが望まれる。スフェロイドは、生体の毛細血管に相当する管腔構造をもたないので、中心部の細胞と外表面の細胞とでは酸素及び栄養分の補給や老廃物の除去において差が生じる。例えば、スフェロイドが大きくなると、中心部の細胞が酸素不足や栄養不足となって細胞死が起こり得る。このような中心部の細胞の状態と外表面の細胞の状態との差が、例えば薬剤の毒性及び薬理活性を評価する上での差ともなり得る。仮に、スフェロイドにおける中心部の細胞の状態と外表面の細胞の状態とを同等にすることができれば、薬剤の毒性や薬理活性の評価において、スフェロイドの生死のみならず、スフェロイド内の細胞が有する特異的な機能の向上又は低下、スフェロイドにより形成された生体類似の三次元構造に対する組織学的な検査などが実現され得る。このようなスフェロイドによる薬剤の毒性や薬理活性の評価は、動物実験の一部を代替し得る。

従来より、スフェロイド培養として、ローラボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養などが知られている。また、スフェロイド培養のための９６穴プレートが市販されている。

特許文献１には、基板表面上にアレイ状やハニカム状等に規則配列されて種細胞を凝集させて保持する細胞培養セルを備えた細胞培養チップが開示されている。この細胞培養セルに種細胞が分散された培養液を充填して細胞培養セル内に種細胞を着床させ、さらに、細胞培養チップを連続的又は間欠的に水平回転又は往復揺動させながら、細胞培養セル内の種細胞同士を凝集培養させてスフェロイドを形成させ得る。

特許文献２には、細胞接着性を示す第一領域と、その第一領域を囲み、第一領域に比べて低い細胞接着性を示す第二領域とを含む組織体形成領域を備えた細胞組織体マイクロデバイスが開示されている。細胞組織体マイクロデバイスの第一領域及び第二領域に播種された細胞は、互いに細胞間結合を形成し、この細胞間結合が維持されつつ第二領域から細胞が剥がれることにより、第一領域に細胞同士が三次元的に結合した細胞組織体が形成され得る。

特開２００５−２７５９８号公報 特開２００６−１２２０１２号公報

例えば、前述された９６穴プレートを用いたスフェロイド培養では、付着性細胞の懸濁液を９６穴にそれぞれ注入する必要があり、操作が煩雑であり、また、各穴におけるスフェロイドの大きさを制御することが難しいという問題がある。

特許文献１に記載の細胞培養チップを用いれば、各細胞培養セル内に着床させた種細胞を均一な大きさのスフェロイドに培養することができる。しかし、特許文献１によれば、細胞培養セル内において種細胞がスフェロイドに形成されるためには、細胞培養チップが連続的又は間欠的に水平回転又は往復揺動される必要がある。細胞培養チップが水平回転等されると、細胞培養セル内の種細胞が遠心力などによってセル外へ飛び出たり、さらに他のセルへ進入したりするおそれがあり、その結果、均一な大きさのスフェロイドが形成されないことがあり得る。このような問題が防止されるためには、種細胞と細胞培養セルとの親和性が考慮された上で、水平回転等の回転速度や継続時間が適切に設定されなければならないが、これら培養条件を設定するための実験が必要となり、また、商業的生産における品質管理などが煩雑になるという問題がある。

特許文献２に記載の細胞組織体マイクロデバイスでは、組織体形成領域として、細胞接着性を示す第一領域と、その第一領域を囲み、第一領域に比べて低い細胞接着性を示す第二領域とが形成される必要がある。これら領域は基板の表面加工等によって形成され得るが、第二領域に付着した細胞が第一領域に付着した細胞と細胞間結合を維持しながら第二領域から剥がれるような第二領域の細胞接着性を設定することは困難である。また、そのような第二領域の細胞接着性が複数の組織体形成領域において一定に維持されることも困難である。したがって、細胞組織体マイクロデバイスは商業的な大量生産が難しく、また、組織体形成領域においてスフェロイドが形成されたとしても、スフェロイドの大きさを均一に制御することが難しい。

本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡易な作業によって均一な大きさのスフェロイドを大量に培養するに適した手段を提供することにある。

(1) 本発明に係るスフェロイド培養方法は、細胞非接着性の底面から重力方向における最下位置へ連続する斜面を有する細胞非接着性の凹陥部を複数有する培養容器に、付着性細胞の懸濁液を注入する第１ステップと、上記懸濁液が注入された培養容器を静置して、当該培養容器の凹陥部においてスフェロイドを形成させる第２ステップと、を含む。

培養容器は、例えばシャーレのような皿形状であり、細胞懸濁液や培地などの液体を保持可能なものである。この培養容器の底面は細胞非接着性である。細胞非接着性とは、付着性細胞が付着し得ない表面性能をいう。ここで、付着性細胞が付着し得ないとは、付着性細胞がまったく付着しないことをいう趣旨ではなく、本発明が目的とするスフェロイドが形成されることを阻害しない程度に、付着性細胞が付着し得なければよいとの主旨である。このような細胞非接着性は、例えば、水接触角によって定義されてもよい。水接触角として好ましくは３０度以下であり、さらに好ましくは１０度以下である。

前述された細胞非接着性は、例えば、細胞培養容器が、ポリエチレングリコールやポリヒドロキシエチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体などの親水性の高い物質の成形品として実現されたり、細胞培養容器の底面が、界面活性剤やリン脂質などの表面性能を親水性にし得る物質でコーティングされたり、プラズマ処理などの表面処理によって親水性が付与されたりすることによって実現され得る。

培養容器の底面には複数の凹陥部が設けられている。この凹陥部は、底面から重力方向へ凹む有底孔である。凹陥部の表面も底面と同様に細胞非接着性である。各凹陥部は、最下位置へ連続する斜面を有する。このような凹陥部は、例えば、底面及び凹陥部がプラスチックなどによって一体に成形されたり、底面に凹陥部が切削加工されたり、複数の孔が形成された平板形状の基材に薄膜が積層され、その薄膜が孔内に陥没するように変形されたりすることによって形成され得る。

第１ステップにおいて、付着性細胞の懸濁液が培養容器に注入される。付着性細胞として、例えば、ヒト骨肉腫細胞などのガン細胞や肝細胞などがあげられる。この付着性細胞が液体の培地に均一に拡散されて懸濁液が調整される。培地は、付着性細胞の培養に適した公知のものが用いられる。付着性細胞の個数は、培養容器の容量や凹陥部の大きさ、目的とするスフェロイドの大きさなどを考慮して適宜設定されるが、例えば、１ｍＬ当たり数万個〜数百万個程度の範囲で調整される。この懸濁液は、培養容器に対して１回のみ展開される。つまり、培養容器の底面が全て浸される量の懸濁液が培養容器に注入される。

第２ステップにおいて、懸濁液が注入された培養容器が静置される。このとき培養容器はインキュベータなどによって所望の温度範囲や湿度範囲に保持されてもよい。静置される時間は、付着性細胞の種類や目的とするスフェロイドの大きさなどを考慮して適宜設定されるが、例えば、数時間から数日間程度である。この静置によって、懸濁液中の付着性細胞が重力により沈降して、培養容器の底面又は凹陥部へ到達する。

培養容器の凹陥部へ到達した付着性細胞は、斜面に沿って沈降して凹陥部の最下位置へ到達する。凹陥部の各面は細胞非接着性なので、付着性細胞は凹陥部内において壁面に付着することなく重力によって斜面に沿って沈降する。これにより、凹陥部へ到達した付着性細胞が最下位置へ集合され、その最下位置において付着性細胞同士が結合し、スフェロイドが形成される。静置された培養容器において、凹陥部へ到達する付着性細胞の数は、凹陥部の開口面積に比例するので、均等な凹陥部が複数設けられることによって、各凹陥部において均等な大きさのスフェロイドがそれぞれ形成される。

(2) 上記培養容器に、当該培養容器内へ培地を流入させるための流入口と、当該培養容器内から培地を流出させるための流出口とが設けられ、上記懸濁液が注入されて静置されている培養容器に対して、上記流入口を通じて新たな培地を当該培養容器内へ注入し、かつ上記流出口を通じて当該培養容器内の培地を排出させる第３ステップをさらに含むものであってもよい。

前述されたような皿形状の培養容器に、培地の流入口及び流出口が設けられる。流入口を通じて外部から培養容器内に培地が流入され得る。流出口を通じて培養容器内から外部へ培地が流出され得る。

第３ステップでは、前述された第２ステップにおいて培養容器が静置されて、懸濁液中の付着性細胞が凹陥部へ到達した後に、流入口を通じて新たな培地が外部から培養容器内へ流入され、かつ流出口を通じて培養容器内の培地が外部へ流出される。これにより、付着性細胞が凹陥部においてスフェロイドを形成している際に、培養容器内の培地交換が行われる。

(3) 本発明は、細胞非接着性の底面と、当該底面を囲んで設けられた壁とを具備するスフェロイド培養容器であって、上記底面に細胞非接着性の表面で構成された複数の凹陥部が設けられ、上記各凹陥部が、重力方向における最下位置へ連続する斜面を有するものであるスフェロイド培養容器として捉えられてもよい。

(4) また、上記各凹陥部は、上記底面に規則的に配置されてもよい。これにより、懸濁液中を沈降して凹陥部へ到達する付着性細胞が、各凹陥部に対して均等となる。

(5) 上記斜面として、上記最下位置の周囲に配置された半球形状又は円錐形状のものがあげられる。

本発明によれば、付着性細胞の懸濁液が培養容器に一回展開されて培養容器が静置されると、懸濁液中の付着性細胞が重力により沈降して培養容器の凹陥部へ到達し、凹陥部内においては、斜面に沿って付着性細胞が沈降して最下位置へ集合され、その最下位置において付着性細胞同士が結合し、スフェロイドが形成される。これにより、簡易な作業によって均一な大きさのスフェロイドが大量に培養される。

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。

［図面の説明］
図１は、本発明の第１実施形態にかかるスフェロイド培養容器１０の正面図である。なお、スフェロイド培養容器１０の右側面図、左側面図及び背面図は、正面図と同じなのでここでは省略されている。図２は、スフェロイド培養容器１０の平面図である。図３は、スフェロイド培養容器１０の底面図である。なお、図３において、スフェロイド培養容器１０が透明な素材からなるものであれば、図２と同様に底１２に凹陥部２０が透けて現れる。図４は、図１におけるIV−IV切断線における断面を示す断面図である。図５は、図２における領域Vを示す拡大平面図である。図６は、図４における領域VIを示す拡大断面図である。図７は、スフェロイド培養容器１０を用いたスフェロイド培養方法の第１ステップを示す断面図である。図８は、スフェロイド培養容器１０を用いたスフェロイド培養方法の第２ステップを示す拡大断面図である。図９は、第２実施形態に係るスフェロイド培養方法の第３ステップを示す断面図である。図１０は、第３実施形態に係るスフェロイド培養容器１０を示す平面図である。図１１は、図１０におけるXI−XI切断線における断面を示す断面図である。図１２は、図１０における領域XIIを示す拡大平面図である。図１３は、図１１における領域XIIIを示す拡大断面図である。図１４は、第４実施形態に係るスフェロイド培養容器１０を示す断面図である。図１５は、図１４における領域XVを示す拡大断面図である。図１６は、第５実施形態に係るスフェロイド培養容器１０を示す断面図である。図１７は、図１６における領域XVIIを示す拡大断面図である。図１８は、スフェロイド培養容器１０の製造方法を示す模式図である。図１９及び図２０は、第１実施例の観察結果を示すものである。図２１は、第２実施例に係るスフェロイド培養容器１０を示す断面図である。図２２は、第２実施例の観察結果を示すものである。なお、図１９，図２０及び図２２において示されるスケールバーは、いずれも１００μｍである。

［第１実施形態］
以下に、本発明の第１実施形態が説明される。

［スフェロイド培養容器１０］
図１から図４に示されるように、スフェロイド培養容器１０は、シャーレの如き皿形状であり、側壁１１が円筒形状となって円盤形状の底１２を囲み、かつ底１２からほぼ垂直方向の上向きに起立されている。この側壁１１及び底１２によって囲まれるスフェロイド培養容器１０の内部空間に、細胞懸濁液や培地などの液体が保持される。

側壁１１において容器内側となる内面１３、及び底１２において容器内側となる底面１４は、細胞非接着性である。この細胞非接着性は、疎水性のプラスチックからなる内面１３及び底面１４に対して、両親媒性の高分子がコーティングされることにより付与されている。両新媒性の高分子のうち、疎水性の部分が内面１２及び底面１４に吸着し、親水性の部分が容器内側へ露出される。これにより内面１３及び底面１４に親水性のコーティングが施され、付着性細胞が内面１３及び底面１４に付着しない。

［凹陥部２０］
図２及び図４に示されるように、底面１４には、重力方向（図４において下向き）へ凹む複数の凹陥部２０が設けられている。凹陥部２０は、後述されるように半球形状をなした有底孔である。図２に示されるように、各凹陥部２０は、平面視において、底面１４との境界２１が円形をなしている。複数の凹陥部２０は、底面１４の全領域において、規則的且つ密に配置されている。

図５に示されるように、平面視において、各凹陥部２０の中心Ｏと、隣り合う凹陥部２０の中心Ｏとの距離Ｌは、各々の凹陥部２０において一定である。また、距離Ｌは、平面視において、各凹陥部２０の中心Ｏから底面１４との境界２１までの距離Ｒ（平面視において円形の境界２１の半径に相当する。）の３倍以下である。つまり、各凹陥部２０は、隣り合う凹陥部２０と距離Ｒより接近して配置されている。

各凹陥部２０は、底面１４から半球形状に陥没しており、図６に示されるように、縦断面視において、各凹陥部２０は半円形状の輪郭をなす。この半円形状の輪郭における最下位置２２が各凹陥部２０において最も深い位置である。各凹陥部２０における最下位置２２までの深さは、前述された距離Ｒと同等である。

各凹陥部２０において、境界２１から最下位置２２までは、球面状に傾斜する斜面２３である。この斜面２３は、境界２１から最下位置２２へ連続する滑らかな面であり、最下位置２２を中心として境界２１まで点対称な形状をなしている。最下位置２２及び斜面２３も、前述された内面１３及び底面１４と同様のコーティングがなされた細胞非接着性である。

［スフェロイド培養方法］
以下に、前述されたスフェロイド培養容器１０を用いたスフェロイド培養方法が説明される。

本実施形態におけるスフェロイド培養方法は、主として以下の２つのステップに大別される。
（１）スフェロイド培養容器１０に、付着性細胞の懸濁液を注入する第１ステップ。
（２）懸濁液が注入されたスフェロイド培養容器１０を静置して、各凹陥部２０においてスフェロイドを形成させる第２ステップ。

図７に示されるように、第１ステップにおいて、付着性細胞の懸濁液３０がスフェロイド培養容器１０に注入される。付着性細胞としては、例えば、ヒト骨肉腫細胞などのガン細胞や肝細胞などが目的に応じて用いられる。この付着性細胞が液体の培地に均一に拡散されて懸濁液３０が調整される。付着性細胞の個数は、例えば、培地１ｍＬ当たり数万個〜数百万個程度の範囲で調整される。懸濁液３０は、スフェロイド培養容器１０に対して１回のみ展開される。

第２ステップにおいて、懸濁液３０が注入されたスフェロイド培養容器１０が静置される。このとき、スフェロイド培養容器１０はインキュベータなどによって所望の温度範囲や湿度範囲に保持される。静置される時間は、例えば、１日間から数日間程度である。

図８（Ａ）に示されるように、静置されたスフェロイド培養容器１０において、懸濁液３０中の付着性細胞３１が重力により沈降して、スフェロイド培養容器１０の底面１４又は凹陥部２０へ到達する。なお、図８において下向きが重力方向である。前述されたように、複数の凹陥部２０が底面１４の全領域に密に配置されているので、付着性細胞３１の大半が凹陥部２０へ到達する。また、付着性細胞３１は、懸濁液３０において均一に分散されており、また、平面視における各凹陥部２０の境界２１により囲まれる面積（凹陥部２０の垂直投影面積に相当する。）は同じなので、各凹陥部２０へ到達する付着性細胞の個数は均等になる。

各凹陥部２０へ到達した付着性細胞３１は、重力によって各凹陥部２０の斜面２３に沿って沈降して最下位置２２へ向かう。各凹陥部２０の最下位置２２及び斜面２３は細胞非接着性なので、付着性細胞３１は各凹陥部２０内において斜面２３に付着することなく、重力によって斜面２３に沿って沈降する。これにより、図８（Ｂ）に示されるように、各凹陥部２０へ到達した付着性細胞３１が最下位置２２へ集合され、最下位置２２において付着性細胞３１同士が結合し、スフェロイド３２が形成される。静置されたスフェロイド培養容器１０において、各凹陥部２０へ均等な数の付着性細胞が到達することによって、各凹陥部２０において均等な大きさのスフェロイド３２がそれぞれ形成される。

［第１実施形態の作用効果］
前述されたように、付着性細胞３１の懸濁液３０がスフェロイド培養容器１０に一回展開されてスフェロイド培養容器１０が静置されると、懸濁液３０中の付着性細胞３１が重力により沈降して各凹陥部２０へ到達し、各凹陥部２０内においては、斜面２３に沿って付着性細胞３１が沈降して最下位置２２へ集合され、最下位置２２において付着性細胞３１同士が結合し、スフェロイド３２が形成される。これにより、簡易な作業によって均一な大きさのスフェロイド３２が大量に培養される。

［第２実施形態］
以下に、本発明の第２実施形態が説明される。第２実施形態では、培地交換のための流入口１５及び流出口１６がスフェロイド培養容器１０に設けられ、前述された第２ステップにおいて、スフェロイド培養容器１０内の培地交換（第３ステップ）が行われる点において第１実施形態と異なる他は、第１実施形態と同様のスフェロイド培養容器１０が用いられてスフェロイド培養が行われる。以下には、第１実施形態と異なる点についてのみ詳細な説明がなされ、第１実施形態と同様の点については詳細な説明が省略される。なお、各図において第１実施形態と同様の参照符号が付された部材などは、第１実施形態と同様のものである。

図９に示されるように、第２実施形態に係るスフェロイド培養容器１０には、側壁１１を厚み方向（水平方向）へ貫通する孔が設けられて、流入口１５及び流出口１６が形成されている。流入口１５及び流出口１６は、側壁１１をそれぞれ貫通してスフェロイド培養容器１０の内外に通ずる流路を形成している。なお、同図には、一対の流入口１５及び流出口１６のみが示されているが、１つのスフェロイド培養容器１０に対して、複数の流入口１５及び流出口１６が設けられてもよい。また、流入口１５と流出口１６とは、スフェロイド培養容器１０の中央に対して対称位置に設けられていることが好ましい。

図９には現れていないが、流入口１５には、側壁１１の外側においてチューブなどが連結されて、新たな培地が流入口１５を通じてスフェロイド培養容器１０内部へ流入する流路が形成される。流出口１６には、側壁１１の外側においてチューブなどが連結されて、スフェロイド培養容器１０内の培地が流出口１６を通じて外部へ流出する流路が形成される。また、必要に応じて、流入口１５側又は流出口１６側に培地を流動させるためのポンプが設けられてもよい。

第２実施形態では、第１実施形態における第２ステップにおいて、流入口１５を通じて新たな培地をスフェロイド培養容器１０内へ注入し、かつ流出口１６を通じてスフェロイド培養容器１０内の培地を排出させる第３ステップが行われる。

第３ステップでは、前述された第２ステップにおいてスフェロイド培養容器１０にが静置されて、懸濁液３０中の付着性細胞３１が各凹陥部２０へ到達してスフェロイドを形成した後に、流入口１５を通じて新たな培地が外部からスフェロイド培養容器１０内へ流入され、かつ流出口１６を通じてスフェロイド培養容器１０内の培地が外部へ流出される。これにより、付着性細胞３１が凹陥部２０においてスフェロイド３２を形成している際に、スフェロイド培養容器１０内の培地交換が行われる。

前述された培地交換において、スフェロイド培養容器１０内において培地の流れが生じるが、スフェロイド３２が凹陥部２０から飛び出さない程度に培地の流れを制御することにより、培地と共にスフェロイド３２が流出することが防止される。

前述された培地交換によって、比較的長い培養期間を要する大きなスフェロイド３２を形成したり、形成されたスフェロイド３２を長期間保存することが可能となる。

［第３実施形態］
以下に、本発明の第３実施形態が説明される。第３実施形態では、凹陥部４０の形状が第１実施形態の凹陥部２０と異なる他は、第１実施形態と同様である。また、凹陥部４０が異なってもスフェロイド培養方法は第１実施形態及び第２実施形態と同様に行われる。以下には、第１実施形態と異なる凹陥部４０についてのみ詳細な説明がなされ、第１実施形態と同様の点については詳細な説明が省略される。なお、各図において第１実施形態と同様の参照符号が付された部材などは、第１実施形態と同様のものである。

［凹陥部４０］
図１０及び図１１に示されるように、底面１４には、重力方向（図１１において下向き）へ凹む複数の凹陥部４０が設けられている。凹陥部４０は、後述されるように概ね逆円錐形状をなした有底孔である。図１０及び図１２に示されるように、各凹陥部４０は、平面視において、底面１４との境界４１が円形をなしている。複数の凹陥部４０は、底面１４の全領域において、規則的且つ密に配置されている。

図１２に示されるように、平面視において、各凹陥部４０の中心Ｏと、隣り合う凹陥部４０の中心Ｏとの距離Ｌは、各々の凹陥部４０において一定である。また、距離Ｌは、平面視において、各凹陥部４０の中心Ｏから底面１４との境界４１までの距離Ｒ（平面視が円形の境界４１の半径に相当する。）の３倍以下である。つまり、各凹陥部４０は、隣り合う凹陥部４０と距離Ｒより接近して配置されている。

各凹陥部４０は、底面１４から概ね逆円錐形状に陥没しており、図１３に示されるように、縦断面視において、各凹陥部４０は底辺側が短い台形状の輪郭をなす。この台形状の輪郭における最下位置４２が各凹陥部４０において最も深い位置である。各凹陥部４０における最下位置４２までの深さは、前述された距離Ｒと同等である。

各凹陥部４０において、境界４１から最下位置４２までは、縦断面視において直線状に傾斜する斜面４３である。最下位置４２は、平面視において円形状であり、斜面４３は、最下位置４２を囲む曲面として境界４１から最下位置４２へ連続する滑らかな面であり、最下位置４２を中心として境界４１まで点対称な形状をなしている。最下位置４２及び斜面４３も、前述された内面１３及び底面１４と同様のコーティングがなされた細胞非接着性である。

本実施形態においても、前述された第１実施形態と同様のスフェロイド培養方法が行われる。第１ステップにおいて、付着性細胞の懸濁液３０が、スフェロイド培養容器１０に対して１回のみ展開され、第２ステップにおいて、懸濁液３０が注入されたスフェロイド培養容器１０が静置される。

図８（Ａ）で示されたようにして、静置されたスフェロイド培養容器１０において、懸濁液３０中の付着性細胞３１が重力により沈降して、スフェロイド培養容器１０の底面１４又は凹陥部４０へ到達する。前述されたように、複数の凹陥部４０が底面１４の全領域に密に配置されているので、付着性細胞３１の大半が凹陥部４０へ到達する。また、付着性細胞３１は、懸濁液３０において均一に分散されており、また、平面視における各凹陥部４０の境界４１により囲まれる面積（凹陥部４０の垂直投影面積に相当する。）は同じなので、各凹陥部４０へ到達する付着性細胞の個数は均等になる。

図８（Ｂ）に示されたようにして、各凹陥部４０へ到達した付着性細胞３１は、重力により各凹陥部４０の斜面４３に沿って沈降して最下位置４２へ向かう。各凹陥部４０の最下位置４２及び斜面４３は細胞非接着性なので、付着性細胞３１は各凹陥部４０内において斜面４３に付着することなく、重力によって斜面４３に沿って沈降する。これにより、各凹陥部４０へ到達した付着性細胞３１が最下位置４２へ集合され、最下位置４２において付着性細胞３１同士が結合し、スフェロイド３２が形成される。静置されたスフェロイド培養容器１０において、各凹陥部４０へ均等な数の付着性細胞が到達することによって、各凹陥部４０において均等な大きさのスフェロイド３２がそれぞれ形成される。

前述されたように、第３実施形態にかかる凹陥部４０においても、第１実施形態と同様の作用効果が奏される。また、第３実施形態においても、第２実施形態と同様に、スフェロイド培養容器１０に流入口１５及び流出口１６が設けられて、前述された第３ステップのように、スフェロイド培養容器１０の培地交換が行われてもよい。

［第４実施形態］
以下に、本発明の第４実施形態が説明される。第４実施形態では、凹陥部５０の形状が第１実施形態の凹陥部２０と異なる他は、第１実施形態と同様である。また、凹陥部２０が異なってもスフェロイド培養方法は第１実施形態及び第２実施形態と同様に行われる。以下には、第１実施形態と異なる凹陥部５０についてのみ詳細な説明がなされ、第１実施形態と同様の点については詳細な説明が省略される。なお、各図において第１実施形態と同様の参照符号が付された部材などは、第１実施形態と同様のものである。

［凹陥部５０］
図１４及び図１５に示されるように、底面１４には、重力方向（図１４における下向き）へ凹む複数の凹陥部５０が設けられている。凹陥部５０は、後述されるように逆円錐形状をなした有底孔である。図２に示された凹陥部２０と同様に、各凹陥部５０は、平面視において、底面１４との境界５１が円形をなしている。複数の凹陥部５０は、底面１４の全領域において、規則的且つ密に配置されている。

なお、各凹陥部５０の中心Ｏと、隣り合う凹陥部５０の中心Ｏとの距離Ｌが、各凹陥部５０の中心Ｏから底面１４との境界５１までの距離Ｒ（平面視が円形の凹陥部５０の半径に相当する。）の３倍以下であることなど、底面１４における各凹陥部５０の配列は、第１実施形態と同様であるので、ここでは詳細な説明が省略される。

各凹陥部５０は、底面１４から逆円錐形状に陥没しており、図１５に示されるように、縦断面視において、各凹陥部５０は逆三角形状の輪郭をなす。この逆三角形状の輪郭における最下位置５２が各凹陥部５０において最も深い位置である。各凹陥部５０における最下位置５２までの深さは、前述された距離Ｒと同等である。

各凹陥部５０において、境界５１から最下位置５２までは、縦断面視において直線状に傾斜する斜面５３である。斜面５３は、最下位置５２を囲む曲面として境界５１から最下位置５２へ連続する滑らかな面であり、最下位置５２を中心として境界５１まで点対称な形状をなしている。最下位置５２及び斜面５３も、前述された内面１３及び底面１４と同様のコーティングがなされた細胞非接着性である。

本実施形態においても、前述された第１実施形態と同様のスフェロイド培養方法が行われる。第１ステップにおいて、付着性細胞の懸濁液３０が、スフェロイド培養容器１０に対して１回のみ展開され、第２ステップにおいて、懸濁液３０が注入されたスフェロイド培養容器１０が静置される。

図８（Ａ）で示されたようにして、静置されたスフェロイド培養容器１０において、懸濁液３０中の付着性細胞３１が重力により沈降して、スフェロイド培養容器１０の底面１４又は凹陥部５０へ到達する。前述されたように、複数の凹陥部５０が底面１４の全領域に密に配置されているので、付着性細胞３１の大半が凹陥部５０へ到達する。また、付着性細胞３１は、懸濁液３０において均一に分散されており、また、平面視における各凹陥部５０の境界５１により囲まれる面積（凹陥部５０の垂直投影面積に相当する。）は同じなので、各凹陥部５０へ到達する付着性細胞の個数は均等になる。

図８（Ｂ）に示されたようにして、各凹陥部５０へ到達した付着性細胞３１は、重力により各凹陥部５０の斜面５３に沿って沈降して最下位置５２へ向かう。各凹陥部５０の最下位置５２及び斜面５３は細胞非接着性なので、付着性細胞３１は各凹陥部５０内において斜面５３に付着することなく、重力によって斜面５３に沿って沈降する。これにより、各凹陥部５０へ到達した付着性細胞３１が最下位置５２へ集合され、最下位置５２において付着性細胞３１同士が結合し、スフェロイド３２が形成される。静置されたスフェロイド培養容器１０において、各凹陥部５０へ均等な数の付着性細胞が到達することによって、各凹陥部５０において均等な大きさのスフェロイド３２がそれぞれ形成される。

前述されたように、第４実施形態にかかる凹陥部５０においても、第１実施形態と同様の作用効果が奏される。また、第４実施形態においても、第２実施形態と同様に、スフェロイド培養容器１０に流入口１５及び流出口１６が設けられて、前述された第３ステップのように、スフェロイド培養容器１０の培地交換が行われてもよい。

［第５実施形態］
以下に、本発明の第５実施形態が説明される。第５実施形態では、凹陥部６０の形状が第１実施形態の凹陥部２０と異なる他は、第１実施形態と同様である。また、凹陥部２０が異なってもスフェロイド培養方法は第１実施形態及び第２実施形態と同様に行われる。以下には、第１実施形態と異なる凹陥部６０についてのみ詳細な説明がなされ、第１実施形態と同様の点については詳細な説明が省略される。なお、各図において第１実施形態と同様の参照符号が付された部材などは、第１実施形態と同様のものである。

［凹陥部６０］
図１６及び図１７に示されるように、凹陥部６０は、最下位置６２までの深さが距離Ｒより大きい点で第１実施形態の凹陥部２０と異なる。底面１４に設けられた複数の凹陥部６０の配置は、第１実施形態の凹陥部２０と同様であるので、ここでは詳細な説明が省略される。

各凹陥部６０は、底面１４から概ね半球形状に陥没しており、図１７に示されるように、縦断面視において、各凹陥部６０はドーム形状の輪郭をなす。このドーム形状の輪郭における最下位置６２が各凹陥部６０において最も深い位置である。各凹陥部６０における最下位置６２までの深さは、底面１４と凹陥部６０との境界６１が平面視においてなす円形の半径、つまり距離Ｒより大きい。

各凹陥部６０において、境界２１から重力方向（図１７における下向き）へ垂直壁６３が形成されており、その垂直壁６３から最下位置６２までは、球面状に傾斜する斜面６４が形成されている。この垂直壁６３及び斜面６４は、境界６１から最下位置６２へ連続する滑らかな面であり、最下位置６２を中心として境界６１まで点対称な形状をなしている。最下位置６２、垂直壁６３及び斜面６４も、前述された内面１３及び底面１４と同様のコーティングがなされた細胞非接着性である。

本実施形態においても、前述された第１実施形態と同様のスフェロイド培養方法が行われることにより、各凹陥部６０へ到達した付着性細胞３１が、重力により斜面６４に沿って沈降して最下位置６２へ集合され、最下位置６２において付着性細胞３１同士が結合し、スフェロイド３２が形成される。静置されたスフェロイド培養容器１０において、各凹陥部６０へ均等な数の付着性細胞が到達することによって、各凹陥部６０において均等な大きさのスフェロイド３２がそれぞれ形成される。

前述されたように、第５実施形態にかかる凹陥部６０においても、第１実施形態と同様の作用効果が奏される。また、第５実施形態においても、第２実施形態と同様に、スフェロイド培養容器１０に流入口１５及び流出口１６が設けられて、前述された第３ステップのように、スフェロイド培養容器１０の培地交換が行われてもよい。凹陥部６０の深さが深くなることにより、培地交換においてスフェロイド３２が凹陥部６０から流出することが抑制される。

［スフェロイド培養容器１０の製造方法］
以下に、前述されたスフェロイド培養容器１０の製造方法の一例が示される。

図１８（Ａ）に示されるように、アクリルなどから型枠８０を作製する。この型枠８０は、その内部空間８１がスフェロイド培養容器１０の内面に対応した形状に加工されている。型枠８０の内部空間８１にポリジメチルシロキサン溶液（以下、「ＰＤＭＳ溶液」とも称される。）を充填して固化させる。

ＰＤＭＳ溶液の固化によって型枠８０内に鋳型８２が形成される。図１８（Ｂ）に示されるように、この鋳型８２を型枠８０から取り外す。そして、鋳型８２の表面をプラズマ処理する。

図１８（Ｃ）に示されるように、鋳型８２をシャーレ形状の容器８３の中央に配置して、鋳型８２が浸るまで容器８３にＰＤＭＳ溶液８４を注入する。そして、容器８３内においてＰＤＭＳ溶液８４を固化させる。

ＰＤＭＳ溶液８４の固化によって容器８３内にスフェロイド培養容器１０が形成される。図１８（Ｄ）に示されるように、このスフェロイド培養容器１０を容器８３から取り出し、さらに鋳型８２を取り外す。これにより、スフェロイド容器１０の量産が可能となる。

以下に、本発明の実施例が説明される。

（第１実施例）
［スフェロイド培養容器］
前述された第１実施形態に係るスフェロイド培養容器１０を作製した。詳細には、ポリエチレンを用いて凹陥部２０が形成されたスフェロイド培養容器１０を成形し、そのスフェロイド培養容器１０を７０％エタノールに１時間浸漬して滅菌した。滅菌されたスフェロイド培養容器１０をクリーンベンチ内で乾燥した後、４％プルロニックＦ−１２７水溶液２ｍＬを注入して、３７℃に保持されたＣＯ_２インキュベータ内で一晩放置した。その後、スフェロイド培養容器１０をリン酸緩衝液で２回洗浄した。

［付着性細胞の懸濁液］
付着性細胞としてヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３を用いて、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地を用いて１００万個／２ｍＬとなるように懸濁液を調整した。

［スフェロイド培養］
スフェロイド培養容器１０にヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３の懸濁液を２ｍＬ注入し、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ_２）にて、３日間培養した。培養後に、スフェロイド培養容器１０の凹陥部２０に形成されたスフェロイドを光学顕微鏡（Leica DM14000）を用いて観察した。スフェロイド培養容器１０の凹陥部２０における観察結果（（Ａ）５０倍、（Ｂ）１００倍）が図１９に示され、スフェロイド培養容器１０から回収されたスフェロイドの観察結果（（Ａ）５０倍、（Ｂ）１００倍）が図２０に示される。

図１９に示されるように、１つの凹陥部２０に対して１つのスフェロイドが形成されていることが観察された。また、図２０に示されるように、ほぼ均一な大きさのスフェロイドが多量に形成されていることが観察された。なお、回収されたスフェロイドの平均直径（Ｎ＝３５）は２３１．３±７．９μｍであった。

（第２実施例）
［スフェロイド培養容器］
前述された第１実施形態に係るスフェロイド培養容器１０を作製した。詳細には、図２１に示されるように、円孔７１が複数形成されたアクリル板７０にポリジメチルシロキサンの薄膜７２を積層した。薄膜７２を、アクリル板７０と、ポリジメチルシロキサンからなる円筒形状の培養槽７３とで挟み込み、薄膜７２と培養槽７３とで囲まれる空間に細胞懸濁液が保持されるようにした。アクリル板７０に形成された流路７４を通じて各円孔７１の内部を減圧することによって、薄膜７２を各円孔７１内へ吸い込んで変形させ、変形された薄膜７２を凹陥部２０とした。薄膜７２及び培養槽７３の表面を、前述された第１実施形態と同様にして、４％プルロニックＦ−１２７水溶液でコーティングした。

［付着性細胞の懸濁液］
付着性細胞としてヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３及びヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２をそれぞれ用い、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地を用いて、スフェロイド培養容器１０に対して１展開当たり４００万個，２００万個，１００万個，５０万個，２５万個，１２．５万個となるように懸濁液をそれぞれ調整した。

［スフェロイド培養］
第１実施例と同様にしてスフェロイド培養を行い、スフェロイド培養容器１０の凹陥部２０に形成されたスフェロイドを光学顕微鏡（２００倍）を用いて観察した。各細胞数におけるヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３の結果が図２２（Ａ）に示され、各細胞数におけるヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２の結果が図２２（Ｂ）に示される。

図２２に示されるように、懸濁液におけるヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３又はヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２の個数に応じた大きさのスフェロイドが、各凹陥部２０においてそれぞれ形成されることが観察された。

図１は、本発明の第１実施形態にかかるスフェロイド培養容器１０の正面図である。 図２は、スフェロイド培養容器１０の平面図である。 図３は、スフェロイド培養容器１０の底面図である。 図４は、図１におけるIV−IV切断線における断面を示す断面図である。 図５は、図２における領域Vを示す拡大平面図である。 図６は、図４における領域VIを示す拡大断面図である。 図７は、スフェロイド培養容器１０を用いたスフェロイド培養方法の第１ステップを示す断面図である。 図８は、スフェロイド培養容器１０を用いたスフェロイド培養方法の第２ステップを示す拡大断面図である。 図９は、第２実施形態に係るスフェロイド培養方法の第３ステップを示す断面図である。 図１０は、第３実施形態に係るスフェロイド培養容器１０を示す平面図である。 図１１は、図１０におけるXI−XI切断線における断面を示す断面図である。 図１２は、図１０における領域XIIを示す拡大平面図である。 図１３は、図１１における領域XIIIを示す拡大断面図である。 図１４は、第４実施形態に係るスフェロイド培養容器１０を示す断面図である。 図１５は、図１４における領域XVを示す拡大断面図である。 図１６は、第５実施形態に係るスフェロイド培養容器１０を示す断面図である。 図１７は、図１６における領域XVIIを示す拡大断面図である。 図１８は、スフェロイド培養容器１０の製造方法を示す模式図である。 図１９は、第１実施例の観察結果を示すものである。 図２０は、第１実施例の観察結果を示すものである。 図２１は、第２実施例に係るスフェロイド培養容器１０を示す断面図である。 図２２は、第２実施例の観察結果を示すものである。

符号の説明

１０・・・培養容器
１１・・・側壁（壁）
１４・・・底面
１５・・・流入口
１６・・・流出口
２０，４０，５０，６０・・・凹陥部
２２，４２，５２，６２・・・最下位置
２３，４３，５３，６４・・・斜面
３０・・・懸濁液
３１・・・付着性細胞
３２・・・スフェロイド

Claims (1)

1. 細胞非接着性の底面から重力方向における最下位置の周囲へ連続する半球形状又は円錐形状の斜面を有する細胞非接着性の複数の凹陥部と、上記底面から上向きへ起立する側壁を厚み方向へ貫通する流入口及び流出口と、を有する培養容器に、付着性細胞の懸濁液を注入する第１ステップと、
   上記懸濁液が注入された培養容器を静置して、当該培養容器の凹陥部においてスフェロイドを形成させる第２ステップと、
   上記懸濁液が注入されて静置されている培養容器に対して、上記流入口を通じて新たな培地を当該培養容器内へ注入し、かつ上記流出口を通じて当該培養容器内の培地を排出させる第３ステップと、を含むスフェロイド培養方法。