JP5563563B2 - ペルオキシダーゼおよび低濃度の過酸化水素の存在下でのヒドロゲルの形成方法 - Google Patents
ペルオキシダーゼおよび低濃度の過酸化水素の存在下でのヒドロゲルの形成方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ヒドロゲルの形成、特に、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下でのヒドロゲルの形成に関する。
フェノール含有ヒドロゲル、例えば、ヒアルロン酸−チラミン(HA-Tyr)ヒドロゲルは、薬物またはタンパク質の送達および組織再生を含む、多くの適用において有用である。このようなヒドロゲルは、触媒としてのホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)および過酸化水素(H2O2)の存在下で、フェノール含有ポリマーから、例えばHA-Tyr結合体から、形成され得る。従来の技術においては、ゲル化速度およびヒドロゲル中の架橋密度は、前駆体溶液中のHRPまたはH2O2の濃度を変化させることによって調節され得る。このような変化は、一般に、ゲル化速度および架橋密度の両方に影響を与える。
[0004a]
本発明の別の局面によれば、以下の工程を含む、ヒドロゲルを形成する方法であって、架橋可能なフェノール基を含むポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、および過酸化水素(H 2 O 2 )を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、方法が提供される:HRP濃度の閾値およびH 2 O 2 モル濃度の範囲を決定する工程であって、溶液中のH 2 O 2 モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中のHRP濃度を該閾値超に限定した場合、該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H 2 O 2 モル濃度の変化によって実質的に影響されず、かつヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の変化によって実質的に影響されないように、該範囲の上限が約1 mM未満である、工程;HRPの量およびH 2 O 2 の量を選択する工程;ならびに、該ポリマー、該量のHRPおよび該量のH 2 O 2 を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、工程であって、該溶液中の該H 2 O 2 モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中の該HRP濃度を該閾値超に限定するように、該HRPおよびH 2 O 2 の量が選択される、工程。H 2 O 2 モル濃度は、前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが所定の貯蔵弾性率を有するように、選択されてもよい。前記溶液から形成される前記ヒドロゲルは、約10〜約4000 Paの貯蔵弾性率を有してもよい。前記範囲は約0.146〜約1.092 mMであってもよい。H 2 O 2 モル濃度は約0.16〜約0.728 mMであってもよい。前記閾値は約0.032単位/mlであってもよい。HRP濃度は約0.032〜約0.124単位/ml、例えば約0.062単位/mlであってもよい。前記ポリマーは、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体(HA-Tyr)であってもよい。前記溶液中のチラミンに対するH 2 O 2 のモル比は、約0.4以下であってもよい。前記溶液は、前記HA-Tyr結合体を約0.1〜約20 w/v%含んでもよい。前記溶液は、前記HA-Tyr結合体を約1.75 w/v%含んでもよい。前記ヒアルロン酸は、約90,000 Daの分子量を有してもよい。前記溶液中のチラミンは、約0.42〜約21 mMのモル濃度、例えば約2.57 mMのモル濃度を有してもよい。前記溶液は、約4〜約8のpHを有してもよい。前記溶液は、約293〜約313 Kの温度にあってもよい。前記溶液は薬物を含んでもよい。前記溶液はタンパク質を含んでもよい。前記溶液は水を含んでもよい。前記溶液はリン酸緩衝生理食塩水を含んでもよい。前記決定する工程は、以下の段階を含んでもよい:複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する段階であって、該溶液の各々が、前記ポリマー、HRP、およびH 2 O 2 を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH 2 O 2 モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH 2 O 2 モル濃度を有し、該溶液中のH 2 O 2 モル濃度が約1 mM未満である、段階;該形成する段階の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値(metric)、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する段階;該第1計測値が、前記閾値超の同一のHRP濃度を有するが前記範囲内の異なるH 2 O 2 モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および該第2計測値が、前記範囲内の同一のH 2 O 2 モル濃度を有するが前記閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であることを必要とすることで、H 2 O 2 モル濃度の前記範囲およびHRP濃度の前記閾値を決定する段階。第1計測値はゲル化点に達するのに要する時間であってもよく、第2計測値は貯蔵弾性率であってもよい。
[0004b]
本発明の別の局面によれば、以下の工程を含む方法が提供される:複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する工程であって、該溶液の各々が、ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、および過酸化水素(H 2 O 2 )を含み、該ポリマーが架橋可能なフェノール基を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH 2 O 2 モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH 2 O 2 モル濃度を有し、該溶液中のH 2 O 2 モル濃度が約1 mM未満である、工程;該形成する工程の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する工程;該第1計測値が、閾値超の同一のHRP濃度を有するが範囲内の異なるH 2 O 2 モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および該第2計測値が、該範囲内の同一のH 2 O 2 モル濃度を有するが該閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であることを必要とすることで、H 2 O 2 モル濃度の範囲およびHRP濃度の閾値を決定する工程。第1計測値はゲル化点に達するのに要する時間であってもよく、第2計測値は貯蔵弾性率であってもよい。
[0004c]
本発明の別の局面によれば、以下の工程を含む、架橋可能なフェノール基を含むポリマーから異なる架橋密度を有するヒドロゲルを形成する方法が提供される:該ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、および過酸化水素(H 2 O 2 )を複数の溶液の各々において混合して、該各溶液において該ポリマーを架橋しそれぞれのヒドロゲルを形成する、工程であって、該溶液が、予め選択されたゲル化速度を達成するように選択されたHRP濃度、およびそれぞれの溶液から形成される異なるヒドロゲルにおいて異なる架橋密度を達成するように選択された異なるH 2 O 2 モル濃度を有する、工程;約1 mM未満の上限を有する所定の範囲内に該H 2 O 2 モル濃度を限定する工程;ならびに所定の閾値超に該HRP濃度を限定する工程。ここで、該溶液中のH 2 O 2 モル濃度を該所定の範囲内に限定し、かつ該溶液中のHRP濃度を該所定の閾値超に限定した場合、該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H 2 O 2 モル濃度の選択の変化によって実質的に影響されないこと、および該ヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の選択の変化によって実質的に影響されないことに基づいて、該所定の範囲および該所定の閾値が決定されている。前記ポリマーは、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体であってもよい。
[請求項1001]
以下の工程を含む、ヒドロゲルを形成する方法であって、架橋可能なフェノール基を含むポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、および過酸化水素(H 2 O 2 )を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、方法:
HRP濃度の閾値およびH 2 O 2 モル濃度の範囲を決定する工程であって、溶液中のH 2 O 2 モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中のHRP濃度を該閾値超に限定した場合、
該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H 2 O 2 モル濃度の変化によって実質的に影響されず、かつ
ヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の変化によって実質的に影響されないように、
該範囲の上限が約1 mM未満である、工程;
HRPの量およびH 2 O 2 の量を選択する工程;ならびに
該ポリマー、該量のHRPおよび該量のH 2 O 2 を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、工程であって、
該溶液中の該H 2 O 2 モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中の該HRP濃度を該閾値超に限定するように、該HRPおよびH 2 O 2 の量が選択される、工程。
[請求項1002]
前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが所定の貯蔵弾性率(storage modulus)を有するように、前記H 2 O 2 モル濃度が選択される、請求項1001記載の方法。
[請求項1003]
前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが、約10〜約4000 Paの貯蔵弾性率を有する、請求項1001または1002記載の方法。
[請求項1004]
前記範囲が約0.146〜約1.092 mMである、請求項1001〜1003のいずれか一項記載の方法。
[請求項1005]
前記H 2 O 2 モル濃度が約0.16〜約0.728 mMである、請求項1004記載の方法。
[請求項1006]
前記閾値が約0.032単位/mlである、請求項1001〜1005のいずれか一項記載の方法。
[請求項1007]
前記HRP濃度が約0.032〜約0.124単位/mlである、請求項1006記載の方法。
[請求項1008]
前記HRP濃度が約0.062単位/mlである、請求項1007記載の方法。
[請求項1009]
前記ポリマーが、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体(HA-Tyr)である、請求項1001〜1008のいずれか一項記載の方法。
[請求項1010]
前記溶液中のチラミンに対するH 2 O 2 のモル比が、約0.4以下である、請求項1009記載の方法。
[請求項1011]
前記溶液が、前記HA-Tyr結合体を約0.1〜約20 w/v%含む、請求項1009または請求項1010記載の方法。
[請求項1012]
前記溶液が、前記HA-Tyr結合体を約1.75 w/v%含む、請求項1011記載の方法。
[請求項1013]
前記ヒアルロン酸が、約90,000 Daの分子量を有する、請求項1009〜1012のいずれか一項記載の方法。
[請求項1014]
前記溶液中のチラミンが、約0.42〜約21 mMのモル濃度を有する、請求項1009〜1013のいずれか一項記載の方法。
[請求項1015]
前記溶液中のチラミンが、約2.57 mMのモル濃度を有する、請求項1014記載の方法。
[請求項1016]
前記溶液が、約4〜約8のpHを有する、請求項1001〜1015のいずれか一項記載の方法。
[請求項1017]
前記溶液が、約293〜約313 Kの温度にある、請求項1001〜1016のいずれか一項記載の方法。
[請求項1018]
前記溶液が薬物を含む、請求項1001〜1017のいずれか一項記載の方法。
[請求項1019]
前記溶液がタンパク質を含む、請求項1001〜1018のいずれか一項記載の方法。
[請求項1020]
前記溶液が水を含む、請求項1001〜1019のいずれか一項記載の方法。
[請求項1021]
前記溶液がリン酸緩衝生理食塩水を含む、請求項1001〜1020のいずれか一項記載の方法。
[請求項1022]
前記決定する工程が以下の段階を含む、請求項1001〜1003のいずれか一項記載の方法:
複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する段階であって、該溶液の各々が、前記ポリマー、HRP、およびH 2 O 2 を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH 2 O 2 モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH 2 O 2 モル濃度を有し、該溶液中のH 2 O 2 モル濃度が約1 mM未満である、段階;
該形成する段階の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値(metric)、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する段階;
(1)該第1計測値が、前記閾値超の同一のHRP濃度を有するが前記範囲内の異なるH 2 O 2 モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および
(2)該第2計測値が、前記範囲内の同一のH 2 O 2 モル濃度を有するが前記閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること
を必要とすることで、H 2 O 2 モル濃度の前記範囲およびHRP濃度の前記閾値を決定する段階。
[請求項1023]
前記第1計測値がゲル化点に達するのに要する時間であり、かつ前記第2計測値が貯蔵弾性率である、請求項1022記載の方法。
[請求項1024]
以下の工程を含む、方法:
複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する工程であって、該溶液の各々が、ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、および過酸化水素(H 2 O 2 )を含み、該ポリマーが架橋可能なフェノール基を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH 2 O 2 モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH 2 O 2 モル濃度を有し、該溶液中のH 2 O 2 モル濃度が約1 mM未満である、工程;
該形成する工程の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する工程;
(1)該第1計測値が、閾値超の同一のHRP濃度を有するが範囲内の異なるH 2 O 2 モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および
(2)該第2計測値が、該範囲内の同一のH 2 O 2 モル濃度を有するが該閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること
を必要とすることで、H 2 O 2 モル濃度の範囲およびHRP濃度の閾値を決定する工程。
[請求項1025]
前記第1計測値がゲル化点に達するのに要する時間であり、かつ前記第2計測値が貯蔵弾性率である、請求項1024記載の方法。
[請求項1026]
以下の工程を含む、架橋可能なフェノール基を含むポリマーから異なる架橋密度を有するヒドロゲルを形成する方法:
該ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、および過酸化水素(H 2 O 2 )を複数の溶液の各々において混合して、該各溶液において該ポリマーを架橋しそれぞれのヒドロゲルを形成する、工程であって、該溶液が、予め選択されたゲル化速度を達成するように選択されたHRP濃度、およびそれぞれの溶液から形成される異なるヒドロゲルにおいて異なる架橋密度を達成するように選択された異なるH 2 O 2 モル濃度を有する、工程;
該ゲル化速度が該溶液において実質的に一定となるように、約1 mM未満の上限を有する所定の範囲内に該H 2 O 2 モル濃度を限定する工程;ならびに
該ヒドロゲルの該架橋密度が該HRP濃度の値によって実質的に影響されないように、所定の閾値超に該HRP濃度を限定する工程。
[請求項1027]
前記ポリマーが、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体である、請求項1026記載の方法。
概略すると、驚くべきことに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)および低濃度の過酸化水素(H2O2)の存在下でのフェノール含有ヒドロゲルの形成において、H2O2の濃度を変化させることによって、ゲル化速度に実質的に影響を与えることなく、形成されるヒドロゲル中の架橋密度を都合よく変えることができることが発見された。
実施例I-A(HA-Tyr結合体の合成)
下記のようにいくつかの改変を伴って、KurisawaおよびLeeに記載の手順に従い、HA-Tyr結合体の溶液を調製した。改変は、縮合剤、および未反応チラミンをより効果的に除去するための精製工程に関連していた。
HA(1 g, 2.5 mmol)を蒸留水100 mlに溶解し、最初の溶液を作製した。チラミン塩酸塩(162 mg, 0.93 mmol)および5-アミノフルオレセイン(DMSO 1.62 ml中、81 mg, 0.23 mmol)を、この溶液へ添加した。次いで、EDC・HCl(479 mg, 2.5 mmol)およびNHS(290 mg, 2.5 mmol)を添加し、混合物のpHを0.1 M NaOHで4.7に維持した。該溶液を室温で一晩撹拌し、次いでpHを7.0にした。次に、該溶液をグレード1 Whatman(商標)セルロース濾紙で濾過し、沈殿した未結合アミノフルオレセインを除去した。該濾液を、分子カットオフ3500 Daの透析チューブ中へ回収した。次いで、実施例I-Aに記載の透析および凍結乾燥手順を行った。チラミンの置換度を1H NMRから算出し、結合したアミノフルオレセインの程度を、1 mg/ml蛍光結合HA-Tyr溶液の490 nmでの吸光度値とアミノフルオレセインの標準のセットとを比較することによって評価した。チラミンおよびアミノフルオレセインの置換度は、それぞれ、4および0.4であった。
実施例I-AおよびI-Bにおいて調製したHA-Tyrの溶液1 mlをPBSに溶解させることによって、HA-Tyr水溶液を作製した。ここで、HA-Tyrの最終濃度は1.75 w/v%であった。該水溶液は約7.4のpHを有し、これを約310 Kへ予熱した。種々の量のHRPおよびH2O2を、該溶液へ連続的に添加した。次いで、該溶液をボルテックスし、Rheoscope用の下部プレートへ直ちに適用した。該プレート上で、溶液中のHA-Tyr結合体が架橋され、HA-Tyrヒドロゲルが形成された。
膨潤率を、スラブ形状のHA-Tyrヒドロゲルについて測定した。スラブ形状のHA-Tyrヒドロゲルを形成するために、凍結乾燥されたHA-Tyrを、1.75 w/v%の濃度でPBSに溶解した。
HA-Tyrヒドロゲルサンプルを、約0.124単位/mlのHRPおよび約0.437、0.582または0.728 mMのH2O2で、ガラスバイアル中で形成した。ヒドロゲルサンプルを、24時間、MilliQ水中で膨潤させて、膨潤平衡に到達させ、その後、鋭利な手術用の刃を使用して薄いスライス(2mm x 5mm x 8mm)に切断した。該サンプルを液体窒素スラッシュへ投げ込むことによって、迅速に凍結させ、次いで、2日間凍結乾燥させた。
非肥満糖尿病/重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウスを、安楽死直後に使用した。背側を剃毛後、各マウスに、0.728 mM H2O2および異なる濃度のHRP(0、0.031および0.124単位/ml)を含む1.75 w/v%蛍光標識HA-Tyr 0.4 mlを皮下注射した。注射の2時間後、蛍光性HA-Tyrヒドロゲルの位置を、470 nm励起レーザーを備えたGEのeXplore(商標)Optix蛍光イメージング装置(Waukesha, WI)を使用して検出した。蛍光イメージング後、切開して注射部位を露出させ、デジタル写真を撮影した。
ヒドロゲルディスクを上述のように作製し、24時間PBS中で膨潤させて、膨潤平衡に到達させた。ディスクをプラスチック網の間に挟み、分解実験の間のヒドロゲルの回収を容易にした。100 rpmで回転するオービタルシェイカーにおいて、310 Kで、ヒアルロニダーゼ(0、2.5、25または125単位/ml)を含有するPBS 20 ml中にヒドロゲルを浸漬した。種々の時間で分解溶液中のウロン酸(HAの分解成分)の量および残りのヒドロゲル重量の両方を測定することによって、ヒドロゲルの分解の程度を評価した。残りの重量を測定するために、ヒドロゲルを一丁の鉗子で分解溶液から取り出し、キムワイプ(商標)で優しく拭いて乾かし、計量した。ヒドロゲルから放出されたウロン酸の量を測定するために、分解溶液0.350 mlを取り出し、分析まで約277 Kで微小遠心管中に保存した。次いで、新たに調製した分解溶液0.350 mlを添加し、総体積20 mlを維持した。目に見えるゲルの痕跡が残っていないようになるまで、分解実験を続けた。ヒアルロニダーゼの活性が2日間90パーセントのままであったことが測定された。ヒドロゲルから分解媒質中へ放出されたウロン酸の量を、カルバゾールアッセイを使用して定量した。サンプル0.3 mlを、硫酸中0.025 M四ホウ酸ナトリウム1.5 mlへ添加し、373 Kで10分間加熱した。室温へ冷却した後、カルバゾール0.1 ml(エタノール中0.125 w/w%)を添加して混合し、373 Kで15分間加熱した。室温へ冷却した後、該溶液0.2 mlを96ウェルプレートへ移し、該溶液の吸光度を530 nmで測定した。D-グルクロン酸の標準と比較することによって、各サンプル中のウロン酸の量を評価した。
実施例II-A(HA-Tyrヒドロゲルの合成)
HA-Tyr結合体を、実施例Iに記載されるように合成した。1H NMRによって測定されたように、置換度は6であった。
BSAまたはリゾチームをPBSに溶解し、異なる濃度を有するタンパク質溶液を作製した。各タンパク質溶液0.065 mlを、HA-Tyr結合体溶液0.175 ml(2.5 w/v %)へ添加した。混合された溶液を、穏やかに混合した。次に、HRP 5μlおよびH2O2 5μlを、混合された溶液へ添加した。得られた溶液中のHA-Tyr結合体の最終濃度は約1.75 w/v%であり、タンパク質付加濃度はそれぞれ、0.15、1.5または15 mg/mlであった。
DMSO 50μlに溶解したアミン反応性Alexa Fluor 680カルボン酸スクシンイミジルエステル0.5 mgを、PBS 1.5 mlに溶解したリゾチーム12.34 mgへ添加した。該混合物を、暗所において室温で5時間、穏やかに撹拌した。該反応混合物を、PBS(1カラム当たり0.5 ml)で予め平衡化したPD-10脱塩カラム(GE Healthcare)に通過させ、未結合の色素を除去した。標識されたタンパク質を含有する第1蛍光バンドを回収し、溶出液中のタンパク質の濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ(BCA, Pierce(商標))によって評価した。次いで、タンパク質結合体を40μg/mlに希釈し、679 nmでのAlexa Fluor 680の吸光度を、UV-VIS分光計(Hitachi(商標))を使用して測定した。蛍光色素対タンパク質(F/P)のモル比は、製造業者の指示に従って、0.39であると算出された。
蛍光標識HA-Tyrを、Leeに記載されるように合成した。アミノフルオレセインまたはチラミンの結合の程度(置換度)は、それぞれ、0.5または5であった。CO2による安楽死の直後に、各成体雌性Balb/cヌードマウスの背部に、Alexa 680結合BSAまたはAlexa 680結合リゾチームのいずれか80μgを含有する1.75 w/v%蛍光標識HA-Tyr溶液0.3 mlを皮下注射した。
0.25 mg/mlのα-アミラーゼまたはリゾチームが付加されたHA-Tyrヒドロゲルを、HA-Tyr 0.5 ml(3.5 w/v %)とタンパク質溶液0.5 ml(0.5 mg/ml)とを混合することによって作製した。HRP溶液5μlおよびH2O2溶液5μlを添加し、混合物を作製した。該混合物中のHRP最終濃度は約0.124単位/mlであり、該混合物中のH2O2最終モル濃度は約0.437、0.582または0.728 mMであった。該混合物を穏やかにボルテックスし、その後、1 mm間隔で合わせて固定された2つの平行なガラスプレートの間に置いた(注入した)。
リゾチームを0.25 mg/ml含有するヒドロゲルディスク(厚み=1 mm、重量=57 mg)を、100 rpmのオービタルシェイカーにおいて、310 Kで、NaCl溶液1 ml(0、0.05、0.15、0.5または1 M)に浸漬した。4時間のインキュベーション後、放出媒質0.1 mlを回収し、サンプル中に含有されたタンパク質の量を、製造業者のプロトコルに従って微量ビシンコニン酸タンパク質アッセイ(microBCA, Pierce)を使用して測定した。
α-アミラーゼまたはリゾチームを5 mg/ml含有するヒドロゲルディスク(厚み=1 mm、重量=57 mg)を、150 rpmのオービタルシェイカーにおいて、310 Kで、PBS(0.05%NaN3を追加)中200単位/mlのヒアルロニダーゼ5 ml中で分解させた。24時間後、目に見えるヒドロゲルの痕跡は観察されなかった。α-アミラーゼの活性を、EnzChek(商標)Ultra Amylase Assay Kit(Invitrogen(商標))によって測定した。
Claims (9)
- 以下の工程を含む、ヒドロゲルを形成する方法であって、
架橋可能なフェノール基を含むポリマーであってヒアルロン酸およびチラミンの結合体(HA-Tyr)であるポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、および過酸化水素(H2O2)を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、方法:
HRP濃度の閾値およびH2O2モル濃度の範囲を決定する工程であって、溶液中のH2O2モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中のHRP濃度を該閾値超に限定した場合、
該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H2O2モル濃度の変化によって実質的に影響されず、かつ
ヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の変化によって実質的に影響されないように、
該範囲の上限が1.092 mM未満である、工程;
HRPの量およびH2O2の量を選択する工程;ならびに
該ポリマー、該量のHRPおよび該量のH2O2を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、工程であって、
該溶液中の該H2O2モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中の該HRP濃度を該閾値超に限定するように、該HRPおよびH2O2の量が選択される、工程。 - 前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが所定の貯蔵弾性率(storage modulus)を有するように、前記H2O2モル濃度が選択される、請求項1記載の方法。
- 前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが、10〜4000 Paの貯蔵弾性率を有する、請求項1または2記載の方法。
- 前記範囲が0.146〜1.092 mMである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記決定する工程が以下の段階を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法:
複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する段階であって、該溶液の各々が、前記ポリマー、HRP、およびH2O2を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH2O2モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH2O2モル濃度を有し、該溶液中のH2O2モル濃度が1.092 mM未満である、段階;
該形成する段階の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値(metric)、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する段階;
(1)該第1計測値が、前記閾値超の同一のHRP濃度を有するが前記範囲内の異なるH2O2モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および
(2)該第2計測値が、前記範囲内の同一のH2O2モル濃度を有するが前記閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること
を必要とすることで、H2O2モル濃度の前記範囲およびHRP濃度の前記閾値を決定する段階。 - 前記第1計測値がゲル化点に達するのに要する時間であり、かつ前記第2計測値が貯蔵弾性率である、請求項5記載の方法。
- 以下の工程を含む、方法:
複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する工程であって、該溶液の各々が、ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、および過酸化水素(H2O2)を含み、該ポリマーが架橋可能なフェノール基を含み、かつヒアルロン酸およびチラミンの結合体(HA-Tyr)であり、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH2O2モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH2O2モル濃度を有し、該溶液中のH2O2モル濃度が1.092 mM未満である、工程;
該形成する工程の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する工程;
(1)該第1計測値が、閾値超の同一のHRP濃度を有するが範囲内の異なるH2O2モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および
(2)該第2計測値が、該範囲内の同一のH2O2モル濃度を有するが該閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること
を必要とすることで、H2O2モル濃度の範囲およびHRP濃度の閾値を決定する工程。 - 前記第1計測値がゲル化点に達するのに要する時間であり、かつ前記第2計測値が貯蔵弾性率である、請求項7記載の方法。
- 架橋可能なフェノール基を含むポリマーであってヒアルロン酸およびチラミンの結合体(HA-Tyr)であるポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、および過酸化水素(H2O2)を複数の溶液の各々において混合して、該各溶液において該ポリマーを架橋しそれぞれのヒドロゲルを形成する、工程であって、該溶液が、予め選択されたゲル化速度を達成するように選択されたHRP濃度、およびそれぞれの溶液から形成される異なるヒドロゲルにおいて異なる架橋密度を達成するように選択された異なるH2O2モル濃度を有する、工程;
1.092mM未満の上限を有する所定の範囲内に該H2O2モル濃度を限定する工程;ならびに
所定の閾値超に該HRP濃度を限定する工程
を含む、架橋可能なフェノール基を含むポリマーから異なる架橋密度を有するヒドロゲルを形成する方法であって、
該溶液中のH2O2モル濃度を該所定の範囲内に限定し、かつ該溶液中のHRP濃度を該所定の閾値超に限定した場合、
該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H2O2モル濃度の選択の変化によって実質的に影響されないこと、および
該ヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の選択の変化によって実質的に影響されないこと
に基づいて、該所定の範囲および該所定の閾値が決定されている、方法。
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