JP5559158B2 - 溶液から粒子を濃縮するための方法およびシステム - Google Patents
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Description
本出願は、2008年6月6日提出の米国仮出願No.61/059708、2008年10月27日提出の米国仮出願No.61/108799の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれが引用によりその全体に亘りここに組み込まれる。
本発明は、国立科学基金により認められた承認番号0740525、および疾病管理センターにより認められた承認番号200−2007−M−22794の下での政府の助成を受けてなされたものである。政府は本発明において正当な権利を有する。
結核(TB)は、世界中で最も広く蔓延する疾患の1つであり、世界の人口の3分の1が感染している。2006年において、920万の新たなTBの症例が報告され、170万人が死に関係し、その大部分が発展途上国におけるものである。2006年において、約15,000の新たなTBの症例が米国において報告された。患者が活動性であるが、未治療であるために、TBは、1年当たり平均10〜15人において感染可能であり、新規のTB患者の迅速な診断が効果的な当該疾患の制御のために必須である。
1つの側面において、粒子を濃縮するために方法であって、粒子を含む液体において高アスペクト比を有する第1の電極を浸漬することと、ここにおいて、当該第1の電極は、軸短手寸法を有する軸と遠位末端短手寸法を有する遠位末端とを含み、ここにおいて、当該遠位短手寸法は、1ナノメートルから1ミリメートルであり;当該第1の電極を使用して電界誘導力(電気的に誘導される力)を生じることにより、当該粒子を第1の電極に向かって追い込むことと;および、当該液体から第1の電極を取り除くことにより、当該第1の電極と当該液体の間に形成される毛管力により、第1の電極の表面に粒子を固定化することとを含む方法が提供される。
本発明の前述の側面および多くの付随する利点は、付随する図面と組み合わせたときに、以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に認められるようになり、同様に、よりよく理解されるようになるであろう。
1つの側面において、粒子を含む液体に、高アスペクト比を有する第1の電極を浸漬することと、ここにおいて第1の電極は、軸短手寸法を有する軸と遠位末端短手寸法を有する遠位末端とを含み、遠位短手寸法は、1ナノメートルから1ミリメートルであり;第1の電極を使用して電界誘導力を生じることにより、当該粒子を第1の電極に向かって追い込むことと;および液体から第1の電極を取り除くことにより、第1の電極と液体の間に形成される毛管力により、第1の電極の表面に粒子を固定化することとを含む粒子を濃縮するための方法が提供される。
この例示的な例において、二電子伝達および毛管力が使用され、ポリスチレンナノ球体が電極に固定化される。CNT/SiC電極(「ナノチップ」)が、第2の電極として作用するタングステンコイルに2μLの液滴として支持されたナノ球体を含む水性溶液に浸漬された。10kHzで20VppのAC電位を電極とポリスチレン球体との間に印加し、ナノチップの近傍にあるポリスチレン球体を、生じたDEP力によってナノチップに対して誘引した。8μm/sの速度で溶液からの取り出しにおいて、球体がナノチップに固定化され、これは以下に示される通りである図4A(450nm球体、525nmチップ);図5B(475nm球体;515nmチップ);および図5C(100nm球体と6ミクロン球体との混合物から600nmチップに捕獲された100nm球体)。図5Cは、本発明のサイズ選択性を示す:チップ直径よりも小さい球体が固定化された一方で、チップ直径より大きい球体は固定化されなかった。
この例示的態様において、DNAは、電極に捕獲される。TRIS EDTA(エチレンジアミン四酢酸)緩衝溶液中のλ-DNAを調製した。AC電界を有するCNT/SiCナノチップを使用して、λ-DNAを二電子伝達と毛管作用により電極に濃縮した。図6A−6Cは、捕獲されたλ-DNA分子をナノチップの原繊維として示す。
この例示的態様において、サンプル溶液中の標的DNAを高周波数AC電界下での誘導双極子(DCP)モーメントを有するCNT/SiCナノチップ電極上に送達し、濃縮した。標的DNAの特異的結合が配列特異的ハイブリダイゼーションにより達成されて、プローブDNAが固定化された。ナノチップに対するDNAの最終的な固定化は、溶液からのナノチップの取り出しの間に毛管力により促進された。捕獲されたDNAは蛍光および/または電気的測定により検出された。
2mm直径の球状の液滴において標的DNAは、ナノチップ末端の1μm3の領域に濃縮され、濃縮は約1010倍である。この劇的な濃縮効果のために、DNA検出の感度は、従来の非酵素的なバイオセンサーの106〜108倍に増大する。更に、DNAハイブリダイゼーションは、高周波数AC電界により促進され、それが公知の検出法に要求された時間数または日数と比較すると10分の検出時間を達成する。
細菌の培養フリー検出のために、ミクロンスケール電極(「マイクロチップ」)を使用して、マイコバクテイルム・ツベルクロシス(MTB)の細菌細胞を固定化し濃縮した。水性溶液中の細菌をAC電界により生じた循環流(電気浸透流)で濃縮した。濃縮された細菌は、電気浸透流および静電誘引(電気泳動)によりマイクロチップ表面に対して誘引した。誘引された細菌の最終的な固定化は、液体からの電極の取り出しの中の毛管力の結果生じた。図8Aは、その表面に固定化されたMTB細胞を有するマイクロチップの光学(上)および蛍光(下)イメージング下での顕微鏡写真を示す。
上述した以前の例示的な態様は、光学および/または蛍光検出を使用する固定化された粒子の検出を含む。この例示的態様において、電気的検出は、MTB検出のために利用される。
上記の例示的態様は、2つの電極、即ち、1つのプローブ電極と参照用電極とを利用して、抗体/抗原反応において細菌を検出する。この例示的な態様において、単一電極が粒子の電気的検出のために使用される。標的粒子は、金属性粒子を含み、検出感度を改善する。
電界を電極に印加することによって、生物学的および化学的反応が電極(例えば第1の結合対)の表面における分子配向および粒子に結合される第2の結合対のそれらの誘引のために促進できる。本発明方法に用いるDNAハイブリダイゼーションの促進を以下に述べる。
この例示的な態様において、電極はウイルス(HIV−B)を固定化するために用いられる。ウイルスの固定化に引き続いて、ウイルスからのRNAが蛍光分光法を用いて検出される。
例示的な態様において、インサイチューハイブリダイゼーション(ISH)を記載する。細胞における核酸を検出するための蛍光プローブの使用は当業者に公知である。この技術は、細胞(例えば、生存可能な細菌の指標として細菌細胞におけるrRNAまたはmRNAを検出することなど)およびウイルス(例えば、ウイルス粒子におけるRNAまたはDNAを検出することなど)の研究のための直接的な強力な手段と看做されている。しかしながら、公知のISH法は、公知の方法について要求されるように、制限された感度と固体支持体上での細胞の固定の困難性の両方に苦しんでいる。
本発明の方法は、粒子(例えば、異なるサイズおよび/または組成の粒子)の不均一な溶液を精製するために使用できる。電極における粒子のサイズ選択性の固定化は、ここにおいて方法に関して行われる。仮に、例えば、固定化された粒子がDNAとタンパク質の混合物を含むとき、固定化された粒子は、第2の溶液に浸漬されて、電極から放出される。DNAとタンパク質を含む第2の溶液は、次に(例えば、濾紙やクロマトグラフィで)濾過される。第2の溶液からタンパク質が濾過されると、次にDNAが第2の溶液に残る。DNAを次に、提供された方法に従って電極に固定化されることにより捕獲できる。
本発明の方法は、分子光学のために使用できる。特に、ナノチップに固定化された分子は、生物粒子および分子設計のための他の分子の特性を操作するために使用できる。
本発明の方法は、何れの数のデバイスにおいても実行できる。例えば、1つの例示的なデバイスは光学的および電気的検出ユニット並びに当該デバイスの全ての側面のための制御ユニットを持つアレイ電極を有する完全自動デバイスを含む。
図14は、AC電界および毛管作用に用いる粒子固定化方法を図示する。粒子を捕獲するために、ナノチップ電極は、そのナノチップ電極および溶液に接触する第2の電極を横切って印加されるAC電界を持つ溶液に浸漬される。電極によって生じる不均質電界は、DEPによる粒子の分極および粒子の誘引を結果としてもたらす。チップが溶液から引き出されると、誘引された粒子は組み合わされた毛管作用の影響とDEP力とに基づいてチップ上で捕獲されるか、または放出される。DEP力は、毛管力が粒子をチップ上で捕獲または放出する間に、粒子をチップに誘引する。粒子の捕獲方法を予測するために、毛管作用のための捕獲および放出力を以下で試験する。
Claims (37)
- 複数の粒子を濃縮する方法であって、
(a) 複数の粒子を含む液体に、高アスペクト比を有する第1の電極を浸漬することと、ここにおいて、当該第1の電極は、軸短手寸法を有する軸と遠位末端短手寸法を有する遠位末端とを含み、ここにおいて、当該遠位短手寸法は、1ナノメートルから1ミリメートルであり;
(b) 当該第1の電極を使用して電界誘導力を生じることにより、当該複数の粒子を第1の電極に向かって追い込むことと;
(c) 当該液体から当該第1の電極を取り除くことにより、当該第1の電極と当該液体の間に形成される毛管力により、当該第1の電極の軸と遠位末端の両方に当該複数の粒子を固定化することを含み、
ここで、電界誘導力は、当該液体から当該第1の電極を取り除くことにより、当該第1の電極と当該液体の間に形成される毛管力により、当該第1の電極の軸と遠位末端の両方に当該複数の粒子を固定化する工程を通じて維持される電場により生み出される、方法。 - 更に、当該第1の電極の表面に固定化された複数の粒子を分析することを含む請求項1の方法。
- 当該粒子を分析することが、電気学的、機械学的、光学的、表面イメージング技術およびその組み合わせからなる群より選択される方法を含む請求項2の方法。
- 当該光学的分析が、当該複数の粒子に対して発光化合物を結合させて、発光粒子を提供することと、当該発光粒子からの発光を検出することとを含む請求項3の方法。
- 電気学的検出が、キャパシタンス、抵抗、コンダクタンス、インピーダンスおよびその組み合わせからなる群より選択される特性を測定するための技術を含む請求項3の方法。
- 当該第1の電極が、金属、ドープされた半導体および伝導性ポリマーからなる群より選択される物質を含む請求項1の方法。
- 当該第1の電極の短手寸法が、1ナノメーターから1ミリメートルである請求項1の方法。
- 当該第1の電極の短手寸法が複数の粒子の長手寸法よりも大きい請求項1の方法。
- 当該第1の電極が少なくとも部分的に表面コーティングで被覆されている請求項1の方法。
- 当該表面コーティングが、単分子層またはポリマー層からなる群より選択される請求項9の方法。
- 当該表面コーティングが、当該第1の電極における複数の粒子の固相化を増強する請求項9の方法。
- 当該表面コーティングが、第1の結合対を含み、当該粒子が当該第1の結合対に対して結合することが可能な第2の結合対を含む請求項11の方法。
- 当該第1の結合対が抗体またはそのフラグメントであり、当該第2の結合対が抗原である請求項12の方法。
- 前記第1の結合対が抗原であり、当該第2の結合対が抗体またはそのフラグメントである請求項12の方法。
- 当該第1の結合対が第1の核酸であり、当該第2の結合対が第2の核酸である請求項12の方法。
- 当該第1の結合対が酵素であり、当該第2の結合対が基質である請求項11の方法。
- 当該第1の結合対がレセプターであり、当該第2の結合対が当該レセプターのリガンドである請求項12の方法。
- 当該第1の結合対が核酸であり、当該第2の結合対がタンパク質である請求項12の方法。
- 当該第1の結合対が細胞、細胞膜またはオルガネラであり、当該第2の結合対が当該細胞、細胞膜またはオルガネラのためのリガンドである請求項12の方法。
- 当該電界誘導力が、電気浸透である請求項1の方法。
- 当該電界誘導力が、液体と接触している第1の電極と第2の電極との間で生じる請求項1の方法。
- 当該液体が溶液および懸濁液からなる群より選択される請求項1の方法。
- 当該液体が、血液、痰、粘液および唾液からなる群より選択される生物学的流体である請求項1の方法。
- 当該複数の粒子が、粒子、ウイルス、細菌、核酸、細胞およびタンパク質からなる群より選択される請求項1の方法。
- 当該ウイルスが、コクサッキーウイルス、A型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、エプスタイン-バーウイルス、疱疹ウイルス1型、疱疹ウイルス2型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、8型、水痘帯状疱疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、フラビウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス (HIV)、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)、エボラ、マールブルク、ハンタ、レオウイルス
、トリインフルエンザウイルスおよび西ナイルウイルスからなる群より選択される請求項24の方法。 - 当該細菌が、結核菌、E.coli、ブドウ球菌、メチシンリン耐性ブドウ球菌(MRSA)、サルモネラおよび緑膿菌からなる群より選択される請求項24の方法。
- 当該細胞がショウジョウバエ細胞である請求項24の方法。
- 更に、当該固定化された複数の粒子を貯蔵することを含む請求項1の方法。
- 貯蔵が、低温凍結を含む請求項28の方法。
- 当該第1の電極の表面が連続性の外部表面である請求項1の方法。
- 電界誘導力を生じることが、当該表面コーティングを電気的に配向すること含む請求項1の方法。
- 更に、当該複数の固定化された粒子が放出されることを具備する請求項1の方法。
- 当該固定化された複数の粒子が遊離されることが、当該固定化された複数の粒子が、細胞、ウイルスおよび細菌からなる群より選択される生体内に放出されることを含む請求項32の方法。
- 更に、
(d) 高アスペクト比を有する第3の電極を当該複数の粒子を含む当該液体に浸漬することと、ここにおいて、当該第3の電極が、軸短手寸法を有する軸と、遠位短手寸法を有する遠位末端とを含み、当該遠位短手寸法は、1ナノメートルから1ミリメートルであり;
(e) 当該液体において当該複数の粒子が優先的に当該第3の電極に向かって追い込まれるように、当該第3の電極を使用して電界誘導力を生じることと、
(f) 当該取り除かれている第3の電極と当該液との間に形成される毛管力が、当該第3の電極の表面に当該複数の粒子を固定化するように、当該第3の電極を当該液体から取り除くことと、を含む請求項1の方法。 - 当該複数の粒子が、第1の粒子と第2の粒子とを含み、当該第1の粒子が優先的に第1の電極の方に追い込まれ、当該第2の粒子が優先的に第3の電極の方に追い込まれる請求項34の方法。
- 粒子濃縮システムであって、
(a) 高アスペクト比を有する第1の電極と、ここにおいて、当該第1の電極は、軸短手寸法を有する軸と遠位短手寸法を有する遠位末端とを含み、ここにおいて、当該遠位短手寸法は、1ナノメートルから1ミリメートルであり;
(b) 複数の粒子を含む第1の液体と;
(c) 取り除かれている当該第1の電極と当該第1の液体との間で形成される毛管力が当該第1の電極の軸と遠位末端の両方に当該複数の粒子を固定化するように、当該第1の液体に当該第1の電極を浸漬し、且つ当該第1の液体から当該第1の電極を取り除くような大きさで、構成されたアクチュエーターと;
(d) 当該第1の液体に当該第1の電極が浸漬されたときに、当該複数の粒子が、当該第1の電極の方へ優先的に追い込まれるように、第1の電極により電気誘導力が生じるような大きさで、構成された電気信号発生器と;を含む粒子濃縮システム。 - 複数の粒子を濃縮する方法であって、
(a) 粒子を含む液体に、高アスペクト比を有する第1の電極を浸漬することと、ここにおいて、当該第1の電極は、軸短手寸法を有する軸と、遠位短手寸法を有する遠位末端とを含み、当該遠位短手寸法は、1ナノメートルから1ミリメートルであり;
(b) 当該第1の電極を使用して電界誘導力を生じることにより、当該粒子を第1の電極に向かって追い込むことと、ここで、当該電界誘導力が、電気浸透であり、
(c) 当該液体から当該第1の電極を取り除くことにより、当該第1の電極と当該液体の間に形成される毛管力により、当該第1の電極の軸と遠位末端の両方に当該複数の粒子を固定化すること、を含む方法。
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