JP5544309B2 - サイトメガロウイルス感染の治療および診断のための組成物および方法 - Google Patents

サイトメガロウイルス感染の治療および診断のための組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願
この出願は、２００９年３月１０日に出願された仮出願ＵＳ第６１／０６８，７９８号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、一般に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染の治療、診断、およびモニタリングに関する。本発明は、より具体的には、ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）特異的抗体ならびにその製造および使用に関する。かかる抗体は、ＣＭＶ感染の防止および治療ならびにＣＭＶ感染の診断およびモニタリングのための薬学的組成物で有用である。
発明の背景
ＣＭＶは、広範囲の罹患率および死亡率に関連する。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染は一般的であり、アメリカ人の５０％から８５％の間で４０歳までにＣＭＶに感染すると見積もられている。ＣＭＶ感染は一般に健康な成人では無症状であるにもかかわらず、高リスク群（免疫無防備状態の臓器移植レシピエントおよびＨＩＶ感染個体が含まれる）は、ＣＭＶ関連疾患の発症リスクがある。さらに、ＣＭＶは、精神遅滞および発達障害を引き起こす先進国の先天性感染の重要な原因である。
ＣＭＶは、任意の種におけるヘルペスウイルスファミリーのメンバーである。ヒトでは、ＣＭＶ（ＨＣＭＶとも呼ばれる）は、ヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ−５）と表す。ＣＭＶはヘルペスウイルスファミリーの最も大きなメンバーであり、２４０ｋｂｐを超える二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、２００を超える潜在的タンパク質産物をコードすることができる。単核球およびリンパ球に感染するヘルペスウイルスであるので、ＣＭＶはベータヘルペスウイルス亜科とも呼ばれる。ヒトは、ＣＭＶ感染の唯一の天然宿主であるが、他の哺乳動物はＣＭＶの他の形態に感染される。
ＣＭＶ関連疾患を罹患した患者の医学的ケアは、栄養補給、終末器官症候群（特に、免疫無防備状態の患者における肺炎）の支持療法、および特定の抗ウイルス療法からなる。ＣＭＶ感染の治療または防止について少なくとも３つの抗ウイルス治療薬が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）で承認されている。これらには、ヌクレオシドであるガンシクロビル（ＧＣＶ）およびシドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）ならびにホスカルネットが含まれる。ＧＣＶは、疾患発症リスクが高い移植レシピエントにおける予防治療薬として一般的に使用される。アシクロビルはまた、実質臓器移植術の予防薬として使用されているが、生物学的利用能が低く、データによる小児における使用は支持されていない。免疫グロブリンはまた、ＣＭＶ関連疾患の防止のための受動免疫として使用されている。一般に、これらの薬剤は、ＣＭＶ感染の治療または防止での有効性が示されており、特に、ヌクレオシドは、重篤な副作用（貧血および他の血液の問題が含まれる）に関連する。したがって、小児におけるその使用は制限される。
明確には、症候性ＣＭＶ感染および関連疾患の治療および防止、特に小児の治療に有用な新規の薬剤が当該分野で必要である。
発明の概要
本発明は、単離抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメントであって、抗体が、Ｉ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＧＤＤＤＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３７）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＲＣＧＥＰＫＣＹＳＧＬＰＤＹ（配列番号３８）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＱＲＮＴＷＰＰＬＴ（配列番号４５）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＩＩ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＮＹＧＭＨ（配列番号４８）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＧＳＮＥＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４９）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＲＣＰＤＶＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５０）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＬＡ（配列番号５３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号５４）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＩＩＩ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＧＩＨ（配列番号５７）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５８）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＳＩＲＡＴ（配列番号６４）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号６５）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＩＶ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号６８）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＲＣＩＥＥＮＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号６９）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；Ｖ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨＹＡＤＳＶＲＧＲ（配列番号７９）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＲＣＩＥＥＫＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号８０）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＶＩ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＤＹＧＭＨ（配列番号８５）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＴＨＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号８６）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＫＣＰＤＬＫＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号８７）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＫＲＡＴ（配列番号９２）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号９３）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＶＩＩ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＸＸＧＸＨ（配列番号９５）、ＳＸＸＧＩＨ（配列番号９８）、またはＳＸＹＧＭＨ（配列番号１０１）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＸＤＸＸＸＸＸＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号９６）またはＶＩＳＸＤＧＸＮＸＨＹＡＤＳＶＸＧ（配列番号９９）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＸＣＳＸＸＸＣＹＳＧＬＸＤＹ（配列番号１００）、ＥＧＲＣＩＥＥＸＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号１０２）、またはＤＧＸＣＰＤＸＸＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号１０３）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＸＹＸＡ（配列番号１１１）またはＲＡＳＱＳＶＧＸＹＬＡ（配列番号１１４）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＸＡＳＸＲＡＴ（配列番号１１２）またはＤＡＳＸＲＡＴ（配列番号１１５）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＸＱＲＸＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１３）、ＨＱＲＳＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１６）、またはＱＱＲＳＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１７）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域を含む、単離抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメントを提供する。
本発明はまた、単離抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメントであって、抗体が、Ｉ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＮ（配列番号３９）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＧＤＤＤＲ（配列番号４０）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＲＣＧＥＰＫＣＹＳＧＬＰＤＹ（配列番号３８）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＱＲＮＴＷＰＰＬＴ（配列番号４５）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＩＩ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＬＴＦＳＮ（配列番号１１８）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＧＳＮＥＨ（配列番号５１）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＲＣＰＤＶＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５０）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＬＡ（配列番号５３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号５４）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＩＩＩ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳ（配列番号６０）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱ（配列番号６１）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＳＩＲＡＴ（配列番号６４）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号６５）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＩＶ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＫＦＩＦＳＮ（配列番号７０）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨ（配列番号７１）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＲＣＩＥＥＮＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号６９）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；Ｖ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＫＦＩＦＳＮ（配列番号７０）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨ（配列番号７１）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＲＣＩＥＥＫＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号８０）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＶＩ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＬＴＦＳＤ（配列番号８８）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＴＨ（配列番号８９）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＫＣＰＤＬＫＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号８７）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＫＲＡＴ（配列番号９２）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号９３）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域；ＶＩＩ：（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＸＸＸＦＳＸ（配列番号１０４）またはＧＸＴＦＳＸ（配列番号１０７）を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＸＤＸＸＸＸＸ（配列番号１０５）またはＶＩＳＫＤＧＴＮＸＨ（配列番号１０８）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＸＧＸＣＸＸＸＸＣＹＳＧＸＸＤＹ（配列番号１０６）、ＤＧＸＣＸＸＸＸＣＹＳＧＬＸＤＹ（配列番号１０９）、またはＥＧＲＣＩＥＥＸＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号１１０）を含むＶＨＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域；および（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＸＹＸＡ（配列番号１１１）またはＲＡＳＱＳＶＧＸＹＬＡ（配列番号１１４）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＸＡＳＸＲＡＴ（配列番号１１２）または ＤＡＳＸＲＡＴ（配列番号１１５）を含むＶＬＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＸＱＲＸＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１３）、ＨＱＲＳＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１６）、またはＱＱＲＳＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１７）を含むＶＬＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域を含む、単離抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメントを提供する。
本発明は、さらに、（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、（ｃ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、（ｄ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、（ｅ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、またはｆ）配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む単離抗ＣＭＶ抗体を提供する。
本発明の抗ＣＭＶ抗体は、ＣＭＶウイルスの糖タンパク質ｂ（ｇＢ）エンベロープタンパク質のエピトープに結合する。本発明の１つの態様では、エピトープはｇＢ、ｇｐ１１６の抗原決定基２部位１を含む。
本発明は、１つまたは複数の本明細書中に記載の抗体を含む組成物を提供する。一定の実施形態では、組成物はまた、抗ウイルス治療薬を含む。抗ウイルス治療薬の非限定的な例は、ガンシクロビル、ホスカルネット、シドフォビル、バルガンシクロビル、および静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）である。他の実施形態では、組成物は、さらに、第２の抗ＣＭＶ抗体を含む。
本発明は、さらに、治療薬または検出可能な標識に作動可能に連結された抗ＣＭＶ抗体（本明細書中に記載の抗ＣＭＶ抗体など）を提供する。
本発明は、本明細書中に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、対象のＣＭＶ感染の治療または防止方法を提供する。１つの態様では、本方法は、さらに、抗ウイルス治療薬を投与する工程を含む。抗ウイルス治療薬には、以下の例が含まれるが、これらに限定されない：ガンシクロビル、ホスカルネット、シドフォビル、バルガンシクロビル、および静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）。上記方法の別の態様では、抗ＣＭＶ抗体を含む組成物を、ＣＭＶ感染を中和するのに十分な用量でＣＭＶの曝露前または曝露後に投与する。
（ａ）患者から得た生物サンプルを本明細書中に記載の抗体と接触させる工程、（ｂ）生物サンプルに結合する抗体の量を検出する工程、および（ｃ）生物サンプルに結合する抗体の量をコントロール値と比較し、これから患者中のインフルエンザウイルスの存在を決定する工程を含む、患者のＣＭＶ感染の存在を検出するための本発明のさらなる方法を提供する。
本発明はまた、本明細書中に記載の抗体を含むキットを提供する。
あるいはまたはさらに、本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の糖タンパク質ｇＢ複合体の細胞外ドメイン中のエピトープに結合する、単離ヒトモノクローナル抗体を提供する。好ましい実施形態では、ＣＭＶはヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）である。別の好ましい実施形態では、抗体をヒトドナー由来のＢ細胞から単離する。
本発明の一定の態様では、単離ヒトモノクローナル抗体のエピトープはＣＭＶ ｇＢ複合体のＡＤ−２領域を含む。具体的には、エピトープはＣＭＶ ｇＢポリペプチドのアミノ酸７０〜８８位を含み、ここで、アミノ酸位置の数値は配列番号３０に従う。あるいは、エピトープはＣＭＶ ｇＢ複合体のアミノ酸６５〜９３位を含み、ここで、アミノ酸位置の数値は配列番号３０に従う。さらに別のエピトープはＣＭＶ ｇＢ複合体のアミノ酸６０〜９８位を含み、ここで、アミノ酸位置の数値は配列番号３０に従う。
本発明の一定の実施形態では、本明細書中に記載のエピトープは、アミノ酸配列ＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮ（配列番号３２）またはＮＩＸ３ＮＸ４ＴＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号３３）（式中、Ｘ１＝アミノ酸ＥまたはＴ、Ｘ２＝ＴまたはＶ、Ｘ３＝ＹまたはＲ、Ｘ４＝ＴまたはＬ、Ｘ５＝ＬまたはＡ、Ｘ６＝ＫまたはＳ、Ｘ７＝ＹまたはＶ、Ｘ８＝ＧまたはＤ、Ｘ９＝ＤまたはＦ、Ｘ１０＝ＶまたはＳ、Ｘ１１＝ＶまたはＱ、Ｘ１２＝Ｇまたはなし、Ｘ１３＝Ｖまたはなし、およびＸ１４＝Ｎまたはなし）を全部または部分的に含む。さらなる実施形態では、エピトープは、アミノ酸配列ＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＴＴＧＴＮＴＴＫ（配列番号３１）を全部または一部含む。
本発明の単離ヒトモノクローナル抗体は、２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１、４Ｐ１２、５Ｐ９、または９Ｃ１６である。あるいはまたはさらに、本発明は、２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１、４Ｐ１２、５Ｐ９、または９Ｃ１６と同一のエピトープに結合する抗体を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１、４Ｐ１２、５Ｐ９、または９Ｃ１６と同一のエピトープに結合する単離ヒトモノクローナル抗体を提供する。
本発明はまた、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記領域がヒトＩＧＨＶ３ＶＨ生殖系列配列または前記ＶＨ生殖系列遺伝子配列に相同な核酸配列によってコードされる、単離ヒトモノクローナル抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメントを提供する。１つの態様では、生殖系列配列に相同な核酸配列は、ＩＧＨＶ３生殖系列配列に少なくとも９０％相同である。本発明の抗体は、さらに、ヒトＩＧＫＶ３ ＶＬ生殖系列遺伝子配列または前記ＶＬ生殖系列遺伝子配列に相同なヌクレオチド酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。１つの態様では、ＶＬ生殖系列配列に相同な核酸配列は、ＩＧＫＶ３ ＶＬ生殖系列配列に少なくとも９０％相同である。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
単離抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメントであって、該抗体は、以下：
Ｉ：
（ａ）以下、
（ｉ）アミノ酸配列ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＧＤＤＤＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＲＣＧＥＰＫＣＹＳＧＬＰＤＹ（配列番号３８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＱＲＮＴＷＰＰＬＴ（配列番号４５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
ＩＩ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＮＹＧＭＨ（配列番号４８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＧＳＮＥＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＲＣＰＤＶＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＬＡ（配列番号５３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ （配列番号５４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
ＩＩＩ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＧＩＨ（配列番号５７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＳＩＲＡＴ（配列番号６４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ （配列番号６５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域
ＩＶ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号６８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＲＣＩＥＥＮＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号６９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
Ｖ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨＹＡＤＳＶＲＧＲ（配列番号７９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＲＣＩＥＥＫＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号８０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ （配列番号７６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
ＶＩ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＤＹＧＭＨ（配列番号８５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＴＨＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号８６）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＫＣＰＤＬＫＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号８７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＫＲＡＴ（配列番号９２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号９３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
ＶＩＩ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＸＸＧＸＨ（配列番号９５）、ＳＸＸＧＩＨ（配列番号９８）、またはＳＸＹＧＭＨ（配列番号１０１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＸＤＸＸＸＸＸＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号９６）またはＶＩＳＸＤＧＸＮＸＨＹＡＤＳＶＸＧ（配列番号９９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＸＣＳＸＸＸＣＹＳＧＬＸＤＹ（配列番号１００）、ＥＧＲＣＩＥＥＸＣＹＳＧＱＩＤＹ （配列番号１０２）、またはＤＧＸＣＰＤＸＸＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号１０３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＸＹＸＡ（配列番号１１１）またはＲＡＳＱＳＶＧＸＹＬＡ（配列番号１１４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＸＡＳＸＲＡＴ（配列番号１１２）またはＤＡＳＸＲＡＴ（配列番号１１５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＸＱＲＸＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１３）、ＨＱＲＳＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１６）、またはＱＱＲＳＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域
を含むＶ Ｌ 領域
を含む、単離抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメント。
（項目２）
単離抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメントであって、該抗体は、
Ｉ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＮ（配列番号３９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＧＤＤＤＲ（配列番号４０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＲＣＧＥＰＫＣＹＳＧＬＰＤＹ（配列番号３８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＱＲＮＴＷＰＰＬＴ（配列番号４５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
ＩＩ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＧＬＴＦＳＮ（配列番号１１８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＧＳＮＥＨ（配列番号５１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＲＣＰＤＶＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＬＡ（配列番号５３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号５４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
ＩＩＩ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳ（配列番号６０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱ（配列番号６１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＳＩＲＡＴ（配列番号６４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号６５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
ＩＶ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＫＦＩＦＳＮ（配列番号７０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨ（配列番号７１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＲＣＩＥＥＮＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号６９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
Ｖ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＫＦＩＦＳＮ（配列番号７０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨ（配列番号７１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＲＣＩＥＥＫＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号８０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
ＶＩ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＧＬＴＦＳＤ（配列番号８８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＫＤＧＴＮＴＨ（配列番号８９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＫＣＰＤＬＫＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号８７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＡＳＫＲＡＴ（配列番号９２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＳＷＰＰＬＴ （配列番号９３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｌ 領域、
ＶＩＩ：
（ａ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＸＸＸＦＳＸ（配列番号１０４）またはＧＸＴＦＳＸ（配列番号１０７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＸＤＸＸＸＸＸ（配列番号１０５）またはＶＩＳＫＤＧＴＮＸＨ（配列番号１０８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＸＧＸＣＸＸＸＸＣＹＳＧＸＸＤＹ（配列番号１０６）、ＤＧＸＣＸＸＸＸＣＹＳＧＬＸＤＹ（配列番号１０９）、またはＥＧＲＣＩＥＥＸＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号１１０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３領域；
を含むＶ Ｈ 領域、および
（ｂ）以下：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＸＹＸＡ（配列番号１１１）またはＲＡＳＱＳＶＧＸＹＬＡ（配列番号１１４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＸＡＳＸＲＡＴ（配列番号１１２）またはＤＡＳＸＲＡＴ（配列番号１１５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２領域；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＸＱＲＸＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１３）、ＨＱＲＳＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１６）、またはＱＱＲＳＸＷＰＰＬＴ（配列番号１１７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３領域
を含むＶ Ｌ 領域
を含む、単離抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメント。
（項目３）
ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列；
ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列；
ｃ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖配列；
ｄ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖配列；
ｅ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列；または
ｆ）配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖配列
を含む、単離抗ＣＭＶ抗体。
（項目４）
上記抗体が、ＣＭＶウイルスの糖タンパク質ｂ（ｇＢ）エンベロープタンパク質のエピトープに結合する、項目１、２、または３に記載の抗ＣＭＶ抗体。
（項目５）
上記エピトープがｇＢ、ｇｐ１１６の抗原決定基２部位１を含む、項目４に記載の抗ＣＭＶ抗体。
（項目６）
項目１、２、３、４、または５に記載の抗体を含む組成物。
（項目７）
抗ウイルス治療薬をさらに含む、項目６に記載の組成物。
（項目８）
上記抗ウイルス治療薬が、ガンシクロビル、ホスカルネット、シドフォビル、バルガンシクロビル、および静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）である、項目７に記載の組成物。
（項目９）
第２の抗ＣＭＶ抗体をさらに含む、項目６に記載の組成物。
（項目１０）
上記抗体が治療薬または検出可能な標識に作動可能に連結される、項目１、２、３，４、または５に記載の抗体。
（項目１１）
項目６に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、該対象のＣＭＶ感染を治療または防止するための方法。
（項目１２）
上記方法が、抗ウイルス治療薬を投与する工程をさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記抗ウイルス治療薬が、ガンシクロビル、ホスカルネット、シドフォビル、バルガンシクロビル、および静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
上記抗体をＣＭＶへの曝露前または曝露後に投与する、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
上記抗体をＣＭＶ感染を中和するのに十分な用量で投与する、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
患者のＣＭＶ感染の存在を決定するための方法であって、
（ａ）該患者から得た生物サンプルを項目１、２、３、４、または５に記載の抗体と接触させる工程、
（ｂ）該生物サンプルに結合する抗体の量を検出する工程、および
（ｃ）該生物サンプルに結合する抗体の量をコントロール値と比較し、それから該患者中のインフルエンザウイルスの存在を決定する工程、
を含む、方法。
（項目１７）
項目１、２、３、４、または５に記載の抗体を含む診断キット。
図１は、示したヒト抗ＣＭＶ抗体の可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１Ａはγ重鎖可変領域のアラインメントを示し、図１Ｂはκ軽鎖可変領域のアラインメントを示す。各アラインメントの下にコンセンサス配列を示す。赤色はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、またはＴである。淡緑色はＰである。淡青色はＮまたはＱである。黄色はＣまたはＭである。非常に薄い青色はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、またはＶである。濃青色はＲ、Ｈ、またはＫである。これらは配列比較のための視覚的補助のみを目的とする。 図１は、示したヒト抗ＣＭＶ抗体の可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１Ａはγ重鎖可変領域のアラインメントを示し、図１Ｂはκ軽鎖可変領域のアラインメントを示す。各アラインメントの下にコンセンサス配列を示す。赤色はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、またはＴである。淡緑色はＰである。淡青色はＮまたはＱである。黄色はＣまたはＭである。非常に薄い青色はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、またはＶである。濃青色はＲ、Ｈ、またはＫである。これらは配列比較のための視覚的補助のみを目的とする。 図２は、表示の競合ペプチドの存在下または非存在下でのＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２ペプチドへの２Ｆ１０ヒト抗ＣＭＶ抗体の結合を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連する蛍光を示す。 図３は、表示の競合ペプチドの存在下または非存在下でのＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２ペプチドへの２Ｍ１６ヒト抗ＣＭＶ抗体の結合を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連する蛍光を示す。 図４は、表示の競合ペプチドの存在下または非存在下でのＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２ペプチドへの２Ｎ９ヒト抗ＣＭＶ抗体の結合を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連する蛍光を示す。 図５は、表示の競合ペプチドの存在下または非存在下でのＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２ペプチドへの３Ｃ２１ヒト抗ＣＭＶ抗体の結合を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連する蛍光を示す。 図６は、表示の競合ペプチドの存在下または非存在下でのＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２ペプチドへの３Ｇ７ヒト抗ＣＭＶ抗体の結合を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連する蛍光を示す。 図７は、表示の競合ペプチドの存在下または非存在下でのＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２ペプチドへの４Ｐ１２ヒト抗ＣＭＶ抗体の結合を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連する蛍光を示す。 図８は、表示の競合ペプチドの存在下または非存在下でのＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２ペプチドへの５Ｊ１２ヒト抗ＣＭＶ抗体の結合を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連する蛍光を示す。 図９は、２Ｆ１０ヒト抗ＣＭＶ抗体によるＣＭＶウイルスの中和を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連するウイルス阻害量を示す。 図１０は、２Ｍ１６ヒト抗ＣＭＶ抗体によるＣＭＶウイルスの中和を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連するウイルス阻害量を示す。 図１１は、２Ｎ９ヒト抗ＣＭＶ抗体によるＣＭＶウイルスの中和を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連するウイルス阻害量を示す。 図１２は、３Ｃ２１ヒト抗ＣＭＶ抗体によるＣＭＶウイルスの中和を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連するウイルス阻害量を示す。 図１３は、３Ｇ７ヒト抗ＣＭＶ抗体によるＣＭＶウイルスの中和を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連するウイルス阻害量を示す。 図１４は、４Ｐ１２ヒト抗ＣＭＶ抗体によるＣＭＶウイルスの中和を示すグラフである。グラフは、表示濃度の抗体に関連するウイルス阻害量を示す。 図１５は、３つのヒト細胞株における３０〜０．００３μｇ／ｍｌの範囲の希釈度での６つの抗ＨＣＭＶ抗体（上の２列）および２つのコントロール（下の１列）を使用した相対％感染性対ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ウイルス株（ＶＲ１８１４）濃度の一連のグラフである。 図１６は、ヒト線維芽細胞株における３０〜０．００３μｇ／ｍｌの範囲の希釈度での６つの抗ＨＣＭＶ抗体（上の２列）および２つのコントロール（下の１列）を使用した相対％感染性対ＨＣＭＶウイルス株（８８１８、８８１９、および８８２４）濃度の一連のグラフである。 図１７は、ヒト内皮細胞株および上皮細胞株における種々の濃度での６つの抗ＨＣＭＶ抗体（上の２列）および２つのコントロール（下の１列）を使用した相対％感染性対ＨＣＭＶ 臨床分離株（８８１９）濃度の一連のグラフである。 図１８は、ＪＨ４細胞における種々の濃度での６つの抗ＨＣＭＶ抗体（上の２列）および２つのコントロール（下の１列）を使用した相対％感染性対モルモットＣＭＶ（ＧＰＣＭＶ）ウイルス株（Ｖ５４５／３２）濃度の一連のグラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染の診断、防止、および療法での組成物およびその使用に関する。以下にさらに記載するように、本発明の例示的な組成物には、ＨＣＭＶ特異的抗体ならびにそのフラグメントおよび誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
１つの実施形態では、本発明の抗ＣＭＶ抗体は、アミノ酸配列ＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＴＴＧＴＮＴＴＫ（配列番号３１）またはＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮ（配列番号３２）の全体または一部に結合する。最も好ましくは、本発明の抗ＣＭＶ抗体は、アミノ酸配列ＮＩＸ３ＮＸ４ＴＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号３３）（式中、Ｘ１＝アミノ酸ＥまたはＴ、Ｘ２＝ＴまたはＶ、Ｘ３＝ＹまたはＲ、Ｘ４＝ＴまたはＬ、Ｘ５＝ＬまたはＡ、Ｘ６＝ＫまたはＳ、Ｘ７＝ＹまたはＶ、Ｘ８＝ＧまたはＤ、Ｘ９＝ＤまたはＦ、Ｘ１０＝ＶまたはＳ、Ｘ１１＝ＶまたはＱ、Ｘ１２＝Ｇまたはなし、Ｘ１３＝Ｖまたはなし、およびＸ１４＝Ｎまたはなし）の全体または一部に結合する。このエピトープに結合する例示的な抗ＣＭＶモノクローナル抗体は、本明細書中に記載の抗体２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、４Ｐ１２、５Ｐ９、９Ｃ１６である。
本明細書中の実施例に記載の配列中のＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、（１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３）によって定義されるＣＤＲを含むアミノ酸をイタリック体で示し、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、（１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）によるものを下線を引いた太字で示す。当業者は、抗体の可変領域内のＣＤＲの標準的な定義方法がいくつか存在すると容易に認識するであろう。最も広く使用されている方法のうちの２つを本明細書中に示す。当業者はまた、ＣＤＲの他の当該分野で承認されている描写方法が本発明に含まれると容易に認識するであろう。
２Ｆ１０抗体は、以下の配列番号３４に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３５）および配列番号４１に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４２）を含む。
２Ｆ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）、ＶＩＳＳＤＧＤＤＤＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３７）、およびＤＧＲＣＧＥＰＫＣＹＳＧＬＰＤＹ（配列番号３８）。２Ｆ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）、およびＬＱＲＮＴＷＰＰＬＴ（配列番号４５）。
２Ｆ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＧＦＴＦＳＮ（配列番号３９）、ＶＩＳＳＤＧＤＤＤＲ（配列番号４０）、およびＤＧＲＣＧＥＰＫＣＹＳＧＬＰＤＹ（配列番号３８）。２Ｆ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）、およびＬＱＲＮＴＷＰＰＬＴ（配列番号４５）。
２Ｍ１６抗体は、以下の配列番号４６に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４７）および配列番号９４に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５２）を含む。
２Ｍ１６抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＳＮＹＧＭＨ（配列番号４８）、ＶＩＳＳＤＧＳＮＥＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４９）、およびＤＧＲＣＰＤＶＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５０）。２Ｍ１６抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＬＡ（配列番号５３）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）、およびＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号５４）。
２Ｍ１６抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＧＬＴＦＳＮ（配列番号１１８）、ＶＩＳＳＤＧＳＮＥＨ（配列番号５１）、およびＤＧＲＣＰＤＶＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５０）。２Ｍ１６抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＬＡ（配列番号５３）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）、およびＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号５４）。
２Ｎ９抗体は、以下の配列番号５５に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５６）および配列番号６２に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号６３）を含む。
２Ｎ９抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＳＳＮＧＩＨ（配列番号５７）、ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５８）、およびＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）。２Ｎ９抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）、ＡＳＩＲＡＴ（配列番号６４）、およびＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号６５）。
２Ｎ９抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＧＦＴＦＳＳ（配列番号６０）、ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱ（配列番号６１）、およびＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）。２Ｎ９抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）、ＡＳＩＲＡＴ（配列番号６４）、およびＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号６５）。
４Ｐ１２抗体は、以下の配列番号６６に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号６７）および配列番号７２に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号７３）を含む。
４Ｐ１２抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号６８）、およびＥＧＲＣＩＥＥＮＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号６９）。４Ｐ１２抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）、ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）、およびＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）。
４Ｐ１２抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＫＦＩＦＳＮ（配列番号７０）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨ（配列番号７１）、およびＥＧＲＣＩＥＥＮＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号６９）。４Ｐ１２抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）、ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）、およびＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）。
５Ｐ９抗体は、以下の配列番号７７に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号７８）および配列番号８１に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号８２）が含む。
５Ｐ９抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨＹＡＤＳＶＲＧＲ（配列番号７９）、およびＥＧＲＣＩＥＥＫＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号８０）。５Ｐ９抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）、ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）、およびＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）。
５Ｐ９抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＫＦＩＦＳＮ（配列番号７０）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨ（配列番号７１）、およびＥＧＲＣＩＥＥＫＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号８０）。５Ｐ９抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）、ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）、およびＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）。
９Ｃ１６抗体は、以下の配列番号８３に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号８４）および配列番号９０に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号９１）が含む。
９Ｃ１６抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＳＤＹＧＭＨ（配列番号８５）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＴＨＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号８６）、およびＤＧＫＣＰＤＬＫＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号８７）。９Ｃ１６抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）、ＤＡＳＫＲＡＴ（配列番号９２）、およびＨＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号９３）。
９Ｃ１６抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＧＬＴＦＳＤ（配列番号８８）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＴＨ（配列番号８９）、およびＤＧＫＣＰＤＬＫＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号８７）。９Ｃ１６抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義による以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）、ＤＡＳＫＲＡＴ（配列番号９２）、およびＨＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号９３）。
抗ＣＭＶ抗体は、配列番号３５、４７、５６、６７、７８、または８４のアミノ酸配列を有する重鎖可変部および配列番号４２、５２、６３、７３、８２，または９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部を含む。好ましくは、３つの重鎖ＣＤＲは、アミノ酸配列ＳＮＨＧＩＨ（配列番号３６）、ＶＩＳＳＤＧＤＤＤＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３７）、ＤＧＲＣＧＥＰＫＣＹＳＧＬＰＤＹ（配列番号３８）、ＳＮＹＧＭＨ（配列番号４８）、ＶＩＳＳＤＧＳＮＥＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４９）、ＤＧＲＣＰＤＶＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５０）、ＳＳＮＧＩＨ（配列番号５７）、ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５８）、ＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号６８）、ＥＧＲＣＩＥＥＮＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号６９）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨＹＡＤＳＶＲＧＲ（配列番号７９）、ＥＧＲＣＩＥＥＫＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号８０）、ＳＤＹＧＭＨ（配列番号８５）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＴＨＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号８６）、ＤＧＫＣＰＤＬＫＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号８７）（Ｋａｂａｔ法によって決定した場合）またはＧＦＴＦＳＮ（配列番号３９）、ＶＩＳＳＤＧＤＤＤＲ（配列番号４０）、ＤＧＲＣＧＥＰＫＣＹＳＧＬＰＤＹ（配列番号３８）、ＧＬＴＦＳＮ（配列番号３９）、ＶＩＳＳＤＧＳＮＥＨ（配列番号５１）、ＤＧＲＣＰＤＶＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５０）、ＧＦＴＦＳＳ（配列番号６０）、ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱ（配列番号６１）、ＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）、ＫＦＩＦＳＮ（配列番号７０）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＡＨ（配列番号７１）、ＥＧＲＣＩＥＥＮＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号６９）、ＥＧＲＣＩＥＥＫＣＹＳＧＱＩＤＹ（配列番号８０）、ＧＬＴＦＳＤ（配列番号８８）、ＶＩＳＫＤＧＴＮＴＨ（配列番号８９）、ＤＧＫＣＰＤＬＫＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号８７）、ＧＬＴＦＳＮ（配列番号１１８）（Ｃｈｏｔｈｉａ法によって決定した場合）と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％ ９８％、９９％またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を含み、３つのＣＤＲを有する軽鎖は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）、ＬＱＲＮＴＷＰＰＬＴ（配列番号４５）、ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＬＡ（配列番号５３）、ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号５４）、ＡＳＩＲＡＴ （配列番号６４）、ＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号６５）、ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）、ＤＡＳＩＲＡＴ（配列番号７５）、ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）、ＤＡＳＫＲＡＴ（配列番号９２）、ＨＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号９３）（Ｋａｂａｔ法によって決定した場合）またはＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）、ＬＱＲＮＴＷＰＰＬＴ（配列番号４５）、ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＬＡ（配列番号５３）、ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号５４）、ＡＳＩＲＡＴ（配列番号６４）、ＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号６５）、ＲＡＳＱＳＶＧＲＹＭＡ（配列番号７４）、ＤＡＳＩＲＡＴ （配列番号７５）、ＱＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号７６）、ＤＡＳＫＲＡＴ（配列番号９２）、ＨＱＲＳＳＷＰＰＬＴ（配列番号９３）（Ｃｈｏｔｈｉａ法によって決定した場合）と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一のアミノ酸配列を含む。抗体はＣＭＶ ｇＢに結合する。
抗ＣＭＶ抗体の重鎖は、生殖系列Ｖ（可変）遺伝子（例えば、ＩＧＨＶ３生殖系列遺伝子など）に由来する。
本発明の抗ＣＭＶ抗体は、ヒトＩＧＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。ＩＧＨＶ３生殖系列遺伝子配列は、例えば、受入番号Ｍ９９６６３、Ｘ９２２１４、Ｌ０６６１６、Ｌ０６６１７、Ｍ７７３２７、およびＭ７７３３９中に示されている。本発明の抗ＣＭＶ抗体は、Ｘ生殖系列遺伝子配列に少なくとも８０％相同な核酸配列によってコードされるＶＨ領域を含む。好ましくは、核酸配列はＩＧＨＶ３生殖系列遺伝子配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩＧＨＶ３生殖系列遺伝子配列に少なくとも９８％、９９％相同である。抗ＣＭＶ抗体のＶＨ領域は、ＩＧＨＶ３ ＶＨ生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＨ領域のアミノ酸配列に少なくとも８０％相同である。好ましくは、抗ＣＭＶ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＩＧＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩＧＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列に少なくとも９８％、９９％相同である。
本発明の抗ＣＭＶ抗体はまた、ヒトＩＧＫＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。ヒトＩＧＫＶ３ ＶＬ生殖系列遺伝子配列は、例えば、受入番号Ｘ０１６６８、Ｋ０２７６８、Ｘ１７２６４、Ｌ１９２７１、およびＬ１９２７２に示されている。あるいは、抗ＣＭＶ抗体は、ＩＧＫＶ３生殖系列遺伝子配列に少なくとも８０％相同な核酸配列によってコードされるＶＬ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩＧＫＶ３生殖系列遺伝子配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、少なくともＩＧＫＶ３生殖系列遺伝子配列に少なくとも９８％、９９％相同である。抗ＣＭＶ抗体のＶＬ領域は、ＩＧＫＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＬ領域のアミノ酸配列に少なくとも８０％相同である。好ましくは、抗ＣＭＶ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＩＧＫＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩＧＫＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列に少なくとも９８％、９９％相同である。
他で定義しない限り、本発明と併せて使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。さらに、他の文脈によって必要とされない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれる。一般に、本明細書中に記載の細胞培養および組織培養、分子生物学、タンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリッド形成と組み合わせて使用した用語体系およびその技術は、当該分野で周知且つ一般に使用されているものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のための標準的な技術を使用する。酵素反応および精製技術を、製造者の仕様書に従って行うか、当該分野で一般的に行われているように行うか、本明細書中に記載のように行う。
本発明の実施には、具体的に逆に示されない限り、当業者の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法（その多数を、例示を目的として以下に記載している）を使用するであろう。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
本明細書中に記載の分析化学、合成有機化学、医薬品化学、および製薬化学と併せて使用される命名法ならびにその実験の手順および技術は、当該分野で周知であり、一般的に使用されている。化学合成、化学分析、医薬品、処方物、送達、および患者の治療のための標準的な技術を使用する。
以下の定義は、本発明を理解するのに有用である。
用語「抗体」（Ａｂ）には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントが含まれる。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）を、本明細書中の「抗体」と交換可能に使用する。
「単離抗体」は、その自然環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その自然環境の夾雑成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体を、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定した場合に９５重量％超の抗体、最も好ましくは９９重量％超の抗体になるまで、（２）回転カップシークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度になるまで、または（３）クーマーシーブルー、好ましくは銀染色を使用した還元下または非還元下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製する。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離抗体には組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕでの抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体を、少なくとも１つの精製工程によって調製する。
基本的な４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドと共に５つの基本ヘテロ四量体からなる。したがって、１０個の抗原結合部位を含む。一方で、分泌型ＩｇＡ抗体は、重合してＪ鎖と共に２〜５個の４鎖ユニットを含む多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結している一方で、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて１つまたは複数のジスルフィド結合によって相互に連結する。各Ｈ鎖およびＬ鎖はまた、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）、その後に各α鎖およびγ鎖についての３つの定常ドメイン（ＣＨ）ならびにμおよびεアイソタイプについての４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、その後にその他の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと並列しており、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と並列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間に界面を形成する。ＶＨとＶＬとの対合により、単一の抗原結合部位を形成する。異なる抗体クラスの構造および性質については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ ７１，ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照のこと。
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型の１つに割り当てられる。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。以下の５つの免疫グロブリンクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ（それぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）と指定した重鎖を有する）。γおよびαクラスは、ＣＨの配列および機能の相違が比較的小さいことに基づいてサブクラスにさらに分類される。例えば、ヒトは以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２。
用語「可変」は、Ｖドメインの一定のセグメントの配列が抗体間で広範に異なるという事実をいう。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸スパンにわたって均一に分布していない。その代わりとして、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる非常に変化するより短い領域によって分離された１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。未変性の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲを含み、ＦＲはそのほとんどが３つの超可変領域と連結したβシート配置の形態をとり、それにより、超可変領域はβシート構造に連結してループを形成し、いくつかの場合βシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって他の鎖由来の超可変領域とごく接近して相互に保持され、これが抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など）を示す。
用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」、すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、残基数がＶＬ中でおよそ２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、およびＶＨ中でおよそ３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）（Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、ナンバリングした場合）（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））；および／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、ＶＬ中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）およびＶＨ中の２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）、および９５〜１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステムに従って、ナンバリングした場合）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；および／または「超可変ループ」／ＣＤＲ由来の残基（例えば、ＶＬ中の残基２７〜３８（Ｌ１）、５６〜６５（Ｌ２）、および１０５〜１２０（Ｌ３）、およびＶＨ中の２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）、および１０５〜１２０（Ｈ３）（ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って、ナンバリングした場合）（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２（１９９９），Ｒｕｉｚ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１９−２２１（２０００））を含む。任意選択的に、抗体は、１つまたは複数の以下の点に対称的挿入を有する：ＶＬ中の２８、３６（Ｌ１）、６３、７４〜７５（Ｌ２）、および１２３（Ｌ３）、およびＶＨ中の２８、３６（Ｈ１）、６３、７４〜７５（Ｈ２）、および１２３（Ｈ３）（ＡＨｏに従って、ナンバリングした場合）（Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０（２００１））。
「生殖系列核酸残基」は、定常領域または可変領域をコードする生殖系列遺伝子中に天然に存在する核酸残基を意味する。「生殖系列遺伝子」は、生殖細胞（すなわち、卵になる運命にあるか、***中の細胞）中で見出されるＤＮＡである。「生殖系列変異」は、生殖細胞または単細胞期の接合体中に生じた特定のＤＮＡの遺伝性の変化をいい、子孫に伝達された場合、かかる変異は身体のあらゆる細胞に組み込まれる。生殖系列変異は、単一の体細胞中で獲得される体細胞変異と対照をなす。いくつかの場合、可変領域をコードする生殖系列ＤＮＡ配列中のヌクレオチドが変異し（すなわち、体細胞変異）、異なるヌクレオチドに置換される。
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一の抗体の集団から得た抗体をいう。すなわち、この集団を含む各抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である）。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向する。その特異性に加えて、他の抗体によって汚染されることなく合成することができるという点で、モノクローナル抗体は有利である。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法によって抗体を産生する必要があると解釈されるべきでない。例えば、本発明で有用なモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製するか、細菌細胞、真核動物細胞、または植物細胞において組換えＤＮＡ法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７を参照のこと）。また、「モノクローナル抗体」を、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離する。
モノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するか特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列が同一であるかまたは相同である一方で、鎖の残部が別の種に由来するか別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列が同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体およびかかる抗体のフラグメント（所望の生物学的活性を示す限り）が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照のこと）。本発明は、ヒト抗体由来の可変ドメイン抗原結合配列を提供する。したがって、特に興味深いキメラ抗体には、１つまたは複数のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲ）および非ヒト抗体由来の１つまたは複数の配列（例えば、ＦＲまたはＣ領域の配列）を含む抗体が含まれる。さらに、本明細書中の特に興味深いキメラ抗体には、１つの抗体クラスまたはサブクラスのヒト可変ドメイン抗原結合配列および別の配列（例えば、別の抗体クラスまたはサブクラス由来のＦＲまたはＣ領域の配列）を含むキメラ抗体が含まれる。目的のキメラ抗体には、本明細書中に記載の配列に関連するか非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）などの異なる種由来の可変ドメイン抗原結合配列を含むキメラ抗体も含まれる。キメラ抗体には、霊長類化抗体およびヒト化抗体も含まれる。
さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中に見出されない残基を含むことができる。抗体の性能をさらに精巧にするためにこれらの修飾を行う。さらに詳しくは、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
「ヒト化抗体」は、一般に、非ヒトである供給源由来のアミノ酸残基に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有するヒト抗体であると見なされている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基をいい、典型的には、この残基は「移入」可変ドメインから取る。ヒト化を伝統的には、Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、移入超可変領域配列を対応するヒト抗体配列の代わりに使用することによって行う。したがって、これらの「ヒト化」抗体は、実質的により小さなインタクトなヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列に置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。
「ヒト抗体」は、ヒトによって天然に産生された抗体中に存在する配列のみを含む抗体である。さらに、本発明のヒト抗体は、ヒトで天然に存在する未変性ヒト抗体であり、各重鎖および軽鎖がヒトから単離されるが、無作為にアセンブルされてあらゆる形態の天然抗体および非天然抗体が作製される組換えヒト抗体とは対照的である（ヒトから単離される組み合わせはごくわずかである）。
具体的には、未変性のヒト抗体は、インタクトなヒト免疫系の機能の結果として天然に生じる抗体である。ヒトウイルス疾患の治療のための未変性抗体の有用性は、過免疫ヒトグロブリンを使用した経験によって確立された。未変性の抗体は、クラスとして、組換えライブラリー法（ファージまたはトランスジェニックマウス）によって得られた抗体といくつかの点で異なり、ヒト疾患の理想的な治療法になり得る異なる性質を保有する（Ｄｅｓｓａｉｎら、Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｔｏ Ｃｒｅａｔｅ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３１７：１５５−１８３（２００８），（著作権）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。具体的には、ファージ由来抗体を超えるヒトＢ細胞から発現した未変性抗体のライブラリー特有の利点が存在する。これは、全ての元のまたは未変性の重鎖：軽鎖対合を再作製するにはファージアプローチに限界があり、したがって、重要な抗体構造のファージ生成ライブラリーへの組み込みが阻止されることに起因する。したがって、高処理法によって病原体の検出、診断、治療、および療法のためのヒトＢ細胞から発現した高品質の未変性のヒト抗体を得ることが望ましい。
しかし、本発明のヒト抗体は、天然に存在するヒト抗体で見出されない残基または修飾（本明細書中に記載の修飾および変異配列が含まれる）を含む。典型的には、抗体の性能をさらに精巧にするか増強するためにこれらを行う。
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含む抗体である。定常ドメインは、未変性配列の定常ドメイン（例えば、ヒト未変性配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。好ましくは、インタクトな抗体は１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
「抗体フラグメント」には、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域が含まれる。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照のこと）；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれる。
句である抗体の「機能的フラグメントまたはアナログ」は、全長抗体と共通の定量的な生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的フラグメントまたはアナログは、かかる分子の能力から高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）に結合する能力を阻止するか実質的に軽減させるような様式でＩｇＥ免疫グロブリンに結合することができるものである。
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントおよび残部である「Ｆｃ」フラグメント（容易に結晶化する能力を反映した命名）が得られる。Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）に沿った全Ｌ鎖および１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。各Ｆａｂフラグメントは抗原結合に関して１価である（すなわち、１つの抗原結合部位を有する）。抗体のペプシン処理により、２価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド連結Ｆａｂフラグメントにおおよそ対応し、依然として抗原を架橋することができる単一の巨大なＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなるいくつかの残基（抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインが含まれる）を有するという点でＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を保有するＦａｂ’についての本明細書中での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、最初に、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
「Ｆｃ」フラグメントは、ジスルフィドによって保持された両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域中の配列によって決定され、このＦｃ領域は一定の細胞型上で見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、強固な非共有結合性に会合した１つの重鎖および軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（それぞれＨ鎖およびＬ鎖由来の３つのループ）が生じる。しかし、全結合部位より親和性が低いにもかかわらず、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも抗原を認識して結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に連結したＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、さらに、ｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することができるポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間に含む。ｓＦｖについての概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５，以下を参照のこと。
用語「二特異性抗体」は、Ｖドメインが鎖内対合されるのではなく鎖間対合され、それによって２価のフラグメント（すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメント）が得られるようにＶＨドメインとＶＬドメインとの間で短いリンカー（約５〜１０残基）を使用してｓＦｖフラグメント（前段落を参照のこと）を構築することによって調製された小さな抗体フラグメントをいう。二重特異性を示す二特異性抗体は、２つの抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。二特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）中により完全に記載されている。
「内在化する」抗体は、哺乳動物細胞上の抗原（例えば、細胞表面ポリペプチドまたは受容体）への結合の際に細胞に取り込まれる（すなわち、侵入する）抗体である。内在化抗体には、抗体フラグメント、ヒト抗体またはキメラ抗体、および抗体抱合体が含まれる。一定の治療への適用のために、ｉｎ ｖｉｖｏでの内在化が意図される。抗体分子の内在化数は、細胞（特に、感染細胞）を死滅させるかその増殖を阻害するのに十分であるか適切である。抗体または抗体抱合体の効力に応じて、いくつかの場合、細胞への単一の抗体分子の取り込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、一定の毒素は、抗体に抱合した毒素１分子の内在化が感染細胞の死滅に十分であるように死滅において非常に強力である。
抗体が検出可能なレベル、好ましくは、約１０４Ｍ−１以上、約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、または１０８Ｍ−１以上の親和定数Ｋａで抗原に反応する場合、抗体は、抗原に「免疫特異的である」か、「特異的である」か、「特異的に結合する」といわれる。その同種抗原に対する抗体の親和性はまた一般に解離定数ＫＤとして示され、一定の実施形態では、１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する場合、ＨｕＭ２ｅ抗体はＭ２ｅに特異的に結合する。抗体の親和性は、従来の技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ら、（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５１：６６０（１９４９））に記載の技術）を使用して容易に決定される。
抗体のその抗原、細胞、または組織への結合特性を、免疫検出法（例えば、免疫蛍光ベースのアッセイ（免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）など）が含まれる）を使用して決定および評価する。
指定した抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、この抗体と他の抗体とを区別する抗体の１つまたは複数の生物学的特徴を保有する抗体である。例えば、一定の実施形態では、指定した抗体の生物学的特徴を有する抗体は、指定した抗体が結合するエピトープと同一のエピトープに結合し、そして／または指定した抗体と共通のエフェクター機能を有する。
用語「アンタゴニスト」抗体を最も広い意味で使用し、抗体が特異的に結合するエピトープ、ポリペプチド、または細胞の生物学的活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する抗体が含まれる。アンタゴニスト抗体の同定方法は、候補アンタゴニスト抗体が特異的に結合するポリペプチドまたは細胞を候補アンタゴニスト抗体と接触させる工程、および通常はポリペプチドまたは細胞に関連する１つまたは複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定する工程を含む。
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞の断片化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって決定されるプログラム細胞死を誘導する抗体である。好ましくは、細胞は感染細胞である。アポトーシスに関連する細胞事象の種々の評価方法を利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の移行をアネキシン結合によって測定することができる。ＤＮＡ断片化をＤＮＡラダーリングによって評価することができる。ＤＮＡ断片化を伴う核／クロマチン凝縮を低二倍体細胞の任意の増加によって評価する。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて非処置細胞と比較してアネキシン結合を約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍誘導する抗体である。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（未変性配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）が原因であり得、且つ抗体アイソタイプによって異なる生物学的活性をいう。抗体エフェクター機能の例には、以下が含まれる：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；およびＢ細胞活性化。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、一定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌型Ｉｇがこれらの細胞傷害性エフェクター細胞に抗原保有標的細胞を特異的に結合させ、その後に細胞毒素で標的細胞を死滅させることができる細胞傷害性の一形態である。抗体は細胞傷害性細胞を「武装し」、この細胞はかかる死滅に必要である。ＡＤＣＣ媒介のための主な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ（米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載のアッセイなど）を行うことができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が組まれる。あるいはまたはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）などに開示の動物モデルで）アッセイする。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。一定の実施形態では、ＦｃＲは未変性配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するＦｃＲであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングされた形態が含まれる）が含まれる。ＦＣγＲＩＩ受容体にはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害化受容体」）が含まれ、これらは主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害化受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベースの阻害化モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）中の概説Ｍを参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）で概説されている。他のＦｃＲ（将来的に同定されるＦｃＲが含まれる）は、本明細書中の用語「ＦｃＲ」に含まれる。この用語には、母系ＩｇＧの胎児への輸送を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が含まれ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然供給源（例えば、血液）から単離される。
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体存在下での標的細胞の溶解をいう。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）のその同種抗原に結合される（適切なサブクラスの）抗体への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載のＣＤＣアッセイを行う。
ＣＭＶとしても公知の用語「サイトメガロウイルス」は、任意の種（ヒトが含まれる）におけるヘルペスウイルスファミリーのメンバーを示す。ＣＭＶは、単核球およびリンパ球に感染するヘルペスウイルスであることから、ベータヘルペスウイルス亜科ともいう。
用語「ヒトサイトメガロウイルスまたはＨＣＭＶ」は、ヒトに感染するＣＭＶファミリーのメンバーを示す。ＨＣＭＶは、ゲノムサイズが２３０Ｋｂｐであり、７０種を超えるウイルスタンパク質をコードするベータヒトヘルペスウイルスである。ＨＣＭＶを、ヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ−５）とも示す。
感染治療を目的とした「哺乳動物」は、任意の哺乳動物（ヒト、家畜、および動物園の動物、競技動物、またはペット動物（イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど）が含まれる）をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「緩和」は、治療的処置および予防的または防止的処置の療法をいい、その目的は標的にした病理学的な容態または障害を防止または遅延（軽減）することである。治療を必要とする者には、既に障害を有する者および障害を有する傾向のある者、または障害を防止すべき者が含まれる。本発明の方法に従って治療量の抗体を投与した後、患者が、以下の１つまたは複数が観察可能および／または測定可能に減少するか消滅する場合、対象または哺乳動物は、首尾よく感染症が「治療」される：感染細胞数の減少または感染細胞の非存在；総感染細胞率の減少；および／または特定の感染に関連する１つまたは複数の症状のいくらかの範囲への緩和；罹患率および死亡率の減少、ならびに生活の質の問題の改善。疾患の首尾の良い治療および改善を評価するための上記パラメーターは、医師に周知の日常的手順によって容易に測定可能である。
用語「治療有効量」は、対象または哺乳動物の疾患または障害を「治療する」のに有効な抗体または薬物の量をいう。「治療」の前述の定義を参照のこと。
「慢性」投与は、長期間にわたって最初の治療効果（活性）を維持するための急性様式と対照的な連続様式での薬剤の投与をいう。「間欠」投与は、継続的に途切れることなく行わず、むしろ事実上周期的な治療である。
１つまたは複数のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与には、同時（併用）投与および任意の順序の連続投与が含まれる。
「キャリア」には、使用した投薬量および濃度で曝露された細胞または哺乳動物に無毒の薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤が含まれる。しばしば、生理学的に許容可能なキャリアは、水性のｐＨ緩衝液である。生理学的に許容可能なキャリアの例には、緩衝液（リン酸、クエン酸、および他の有機酸の緩衝液など）；抗酸化剤（アスコルビン酸が含まれる）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；および／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）など）が含まれる。
本明細書中で使用する場合、用語「細胞毒性薬」は、細胞の機能を阻害または防止し、そして／または細胞を破壊させる物質をいう。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｉｃｉｎ）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン）、または他の挿入剤、酵素、およびそのフラグメント（核酸分解酵素、抗生物質、および毒素（細菌、真菌、植物、または動物を起源とする小分子毒素または酵素的に活性な毒素（そのフラグメントおよび／またはバリアントが含まれる）など）、ならびに以下に開示の種々の抗腫瘍剤または抗癌剤など）が含まれることが意図される。他の細胞毒性薬を以下に記載する。
「増殖阻害剤」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで細胞の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。増殖阻害剤の例には、細胞周期の進行を遮断する薬剤（Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤など）が含まれる。古典的なＭ期遮断薬には、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビノレルビン、およびビンブラスチン）、タキサン、およびトポイソメラーゼＩＩインヒビター（ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなど）が含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤は、Ｓ期停止にも影響を及ぼす（例えば、ＤＮＡアルキル化剤（タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−Ｃなど））。さらなる情報を、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ “Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ” ｂｙ Ｍｕｒａｋａｍｉ ら、（Ｗ Ｂ Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）（特に、ｐ．１３）に見出すことができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、共にイチイ由来の抗癌薬である。ヨーロッパイチイ由来のドセタキセル（タキソテール（商標），Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセルの半合成アナログである（タキソール（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管のアセンブリを促進し、解重合の防止によって微小管を安定させ、それにより、細胞の有糸***が阻害される。
「標識」は、「標識した」抗体を生成するために抗体に直接または間接的に抱合される検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体が検出可能であるか（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒する。
用語「タグ化したエピトープ」は、キメラポリペプチド（「タグポリペプチド」に融合したポリペプチドが含まれる）をいう。タグポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを得るのに十分であるが、依然として融合されるポリペプチドの活性を妨害しないのに十分な短さである残基を有する。タグポリペプチドはまた、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないほど十分に固有である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６個のアミノ酸残基、通常は、約８個と５０個との間のアミノ酸残基（好ましくは、約１０個と２０との間のアミノ酸残基）を有する。
「小分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義する。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」を、一本鎖または二本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーをいうために交換可能に使用する。ポリヌクレオチドには、ゲノム配列、ゲノム外の配列およびプラスミドの配列、およびポリペプチドを発現するか、発現するように適応したより小さな操作遺伝子セグメントが含まれる。
「単離核酸」は、未変性配列に天然に付随する他のゲノムＤＮＡ配列ならびにタンパク質または複合体（リボゾームおよびポリメラーゼなど）から実質的に分離された核酸である。この用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を含み、組換えまたはクローン化されたＤＮＡ単離物および化学合成されたアナログまたは異種系によって生物学的に合成されたアナログが含まれる。実質的に純粋な核酸には、核酸の単離形態が含まれる。勿論、これは、最初に単離された核酸をいい、その後に人為的に単離核酸に付加された遺伝子または配列を除外しない。
用語「ポリペプチド」は、その従来の意味で、すなわち、アミノ酸配列として使用される。ポリペプチドは、特定の長さの産物に制限されない。ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれ、他で特に示さない限り、かかる用語を交換可能に使用する。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など）および当該分野で公知の他の修飾（共に天然に存在するか存在しない）をいわないか除外する。ポリペプチドはタンパク質全体またはそのサブシーケンスであり得る。本発明の文脈における特定の目的のポリペプチドは、アミノ酸サブシーケンス（ＣＤＲが含まれる）であり、ＣＭＶまたはＣＭＶ感染細胞に結合することができる。
「単離ポリペプチド」は、同定され、その自然環境の成分から分離および／または単離されたポリペプチドである。好ましい実施形態では、単離ポリペプチドを、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定した場合に９５重量％超のポリペプチド、最も好ましくは９９重量％超のポリペプチドになるまで、（２）回転カップシークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度になるまで、または（３）クーマーシーブルー、好ましくは銀染色を使用した還元下または非還元下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製するであろう。ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離ポリペプチドには組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕポリペプチドが含まれる。しかし、通常、単離ポリペプチドを、少なくとも１つの精製工程によって調製する。
「未変性配列」ポリヌクレオチドは、天然由来のポリヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。「未変性配列」ポリペプチドは、天然（例えば、任意の種）由来のポリペプチド（例えば、抗体）と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。かかる未変性配列のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、自然から単離するか、組換え手段または合成手段によって産生する。
ポリヌクレオチド「バリアント」は、１つまたは複数の置換、欠失、付加、および／または挿入で具体的に開示されたポリヌクレオチドと典型的に異なるポリヌクレオチドである。かかるバリアントは天然に存在するか、例えば、本明細書中に記載のように、そして／または当該分野で周知の多数の技術のいずれかを使用して１つまたは複数の本発明のポリヌクレオチド配列の修飾およびコードされたポリペプチドの１つまたは複数の生物学的活性の評価によって合成的に生成される。
ポリペプチド「バリアント」は、１つまたは複数の置換、欠失、付加、および／または挿入で本明細書中に具体的に開示されたポリペプチドと典型的に異なるポリペプチドである。かかるバリアントは天然に存在し得るか、例えば、本明細書中に記載のように、そして／または当該分野で周知の多数の技術のいずれかを使用して１つまたは複数の上記の本発明のポリペプチド配列の修飾およびポリペプチドの１つまたは複数の生物学的活性の評価によって合成的に生成することができる。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造を修飾するが、所望の特徴を有するバリアントまたは誘導ポリペプチドをコードする機能的分子が依然として得られる。本発明のポリペプチドの等価であるかさらに改良されたバリアントまたは一部を作製するためにポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることが望ましい場合、当業者は、典型的に、コードするＤＮＡ配列の１つまたは複数のコドンを変化させる。
例えば、他のポリペプチド（例えば、抗原）または細胞に結合する能力をあまり喪失することなくタンパク質構造中の一定のアミノ酸を他のアミノ酸の代わりに使用する。タンパク質の生物学的な機能活性を定義するのはタンパク質の結合能力および結合の性質であるので、タンパク質配列中の一定のアミノ酸配列および、勿論、その基礎をなすＤＮＡコード配列が置換されても、類似の性質を有するタンパク質を得ることができる。したがって、その生物学的有用性または活性をあまり喪失することなく、開示の組成物のペプチド配列またはこのペプチドをコードする対応ＤＮＡ配列を様々に変化されることが意図される。
多数の例では、ポリペプチドバリアントは１つまたは複数の保存的置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学分野の当業者によって実質的に変化すべきでないポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー性が予想されるようにアミノ酸を類似の性質を有する別のアミノ酸の代わりに使用する置換である。
かかる変化を得るには、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮する。タンパク質への生物学的相互作用機能の付与におけるアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当該分野で一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的ヒドロパシー性が得られたタンパク質の二次構造に寄与し、それにより、他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、および抗原など）とのタンパク質の相互作用を定義することが認められている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷の特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
一定のアミノ酸を類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換するが、依然として類似の生物学的活性を有するタンパク質を得ることができる（すなわち、依然として生物学的機能が等価なタンパク質を得ることができる）ことが当該分野で公知である。かかる変化を得るには、その疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸置換が好ましく、±１以内のアミノ酸置換が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸置換が特にさらにより好ましい。親水性に基づいて類似のアミノ酸の置換を有効に行うことができることも当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性に支配されるタンパク質の最も高い局所平均親水性がタンパク質の生物学的性質と相関することを示す。
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに使用するが、依然として生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができると理解されている。かかる変化では、その親水性値が±２以内のアミノ酸置換が好ましく、±１以内のアミノ酸置換が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸置換が特にさらにより好ましい。
上記で概説のように、したがって、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換の相対的類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、およびサイズなど）に基づく。種々の上記特徴を考慮する置換の例は当業者に周知であり、以下が含まれる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
アミノ酸置換を、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいてさらに行う。例えば、負電荷のアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。正電荷のアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれる。類似の親水性値を有する非電荷極性頭部基を有するアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他の基には以下が含まれる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。バリアントは、非保存的変化も含むか、代わりとして非保存的変化を含むことができる。好ましい実施形態では、５個以下のアミノ酸の置換、欠失、または付加によってバリアントポリペプチドは未変性配列と異なる。例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、およびハイドロパシー性に及ぼす影響が最小のアミノ酸の欠失または付加によってバリアントをさらに（または代わりとして）修飾することができる。
ポリペプチドは、翻訳と同時または翻訳後にタンパク質の輸送を指示するシグナル（またはリーダー）配列をタンパク質のＮ末端に含む。ポリペプチドを、ポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製、または同定を容易にするためか、ポリペプチドの固体支持体への結合を増強するためにリンカーまたは他の配列にインフレームで抱合する（例えば、融合する）こともできる。例えば、ポリペプチドを免疫グロブリンＦｃ領域に抱合する。
ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を比較する場合、下記のように、２つの配列中のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が最も対応するように整列させた場合に同一である場合、２つの配列は「同一である」という。典型的には、比較ウインドウ上の配列を比較して配列が類似する局所領域を同定および比較することによって２配列間の比較を行う。「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０個の連続する位置（通常３０〜約７５個、４０〜約５０個）のセグメントをいい、そのセグメント中で２つの配列を最適にアラインメントした後に配列を同数の連続する位置の基準配列と比較する。
デフォルトパラメーターを使用したバイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｕｉｔｅ中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、比較のための最適な配列アラインメントを行うことができる。このプラグラムは、以下の参照に記載のいくつかのアラインメントスキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ ｐｐ．６２６−６４５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。
あるいは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２の局所同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行プログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または検査によって比較のための最適な配列アラインメントを行う。
％配列同一性および％配列類似性の決定に適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ら、（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、例えば、本明細書中に記載のパラメーターと共に使用して、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの％配列同一性を決定する。ＢＬＡＳＴ分析の実行ソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に利用可能である。
１つの説明に役立つ例では、累積スコアを、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（マッチ残基対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。蓄積アラインメントスコアがその最大値から数量Ｘまで低下する場合、１つまたは複数の負にスコアリングされる残基アラインメントの蓄積によって累積スコアがゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合、各方向でのワードヒットの伸長が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）１１および期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメント、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
アミノ酸配列のために、スコアリング行列を使用して累積スコアを計算する。蓄積アラインメントスコアがその最大値から数量Ｘまで低下する場合、１つまたは複数の負にスコアリングされる残基アラインメントの蓄積によって累積スコアがゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合、各方向でのワードヒットの伸長が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。
１つのアプローチでは、「配列同一性のパーセンテージ」を、２つの最適にアラインメントされた配列を少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって比較することによって決定する。ここで、２つの配列の最適なアラインメントについて基準配列（付加または欠失を含まない）と比較した場合、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の位置は、２０％以下、通常は５〜１５％または１０〜１２％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。両配列中に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得ること、マッチした位置の数を基準配列（すなわち、ウインドウサイズ）中の位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって百分率を計算する。
「相同性」は、配列のアラインメントおよび必要に応じた最大％相同性を達成するためのギャップの導入の後に非バリアント配列と同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列バリアント中の残基の百分率をいう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのバリアントは、本明細書中に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性を有する。
「ベクター」には、シャトルベクターおよび発現ベクターが含まれる。典型的には、プラスミド構築物は、細菌中のプラスミドのそれぞれ複製および選択のための複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１複製起点）および選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）も含むであろう。「発現ベクター」は、細菌または真核細胞中での抗体（本発明の抗体フラグメントが含まれる）の発現に必要な調節配列または調節エレメントを含むベクターをいう。適切なベクターを以下に開示する。
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用する場合、他で内容が明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれる。
抗体
本発明はまた、ＣＭＶおよびＣＭＶ特異的抗体（本発明のポリペプチド（実施例１に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが含まれる）、実施例１および図１に記載のアミノ酸配列、ならびにそのフラグメントおよびバリアントが含まれる）を提供する。１つの実施形態では、抗体は、本明細書中で２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１、４Ｐ１２、５Ｐ９、または９Ｃ１６と表した抗体である。これらの抗体は、好ましくは、同一細胞型の非感染コントロール細胞と比較してＣＭＶ感染細胞に結合するか特異的に結合する。好ましい実施形態では、これらの抗体は、ＣＭＶの糖タンパク質 Ｂ（ｇＢ）に結合する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、アミノ酸配列ＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＴＴＧＴＮＴＴＫ（配列番号３１）を有するＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２部位Ｉに結合する。
当業者に理解されるように、本明細書中の抗体ならびにその調製および使用方法の一般的記載を、各抗体ポリペプチド構築物および抗体フラグメントに適用する。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。しかし、好ましい実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、本発明の抗体はヒト抗体である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生方法は当該分野で公知であり、一般に、例えば、米国特許第６，８２４，７８０号に記載されている。典型的には、本発明の抗体を、以下にさらに記載のように、当該分野で利用可能なベクターおよび方法を使用して、組換え的に産生する。ヒト抗体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって生成される（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
ヒト抗体はまた、内因性免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）中で産生される。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異マウス中の抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失によって内因性抗体産生が完全に阻害されると記載されている。かかる生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原誘発の際にヒト抗体が産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５９１，６６９号（全てＧｅｎＰｈａｒｍ）；米国特許第５，５４５，８０７号；およびＷＯ９７／１７８５２号を参照のこと。かかる動物を遺伝子操作して、本発明のポリペプチドを含むヒト抗体を産生する。
一定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトおよび非ヒト供給源の両方に由来する配列を含むキメラ抗体である。特定の実施形態では、これらのキメラ抗体は、ヒト化または霊長類化されている（商標）。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域の残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似部位由来の残基に置換されたヒト抗体である。
本発明の文脈では、キメラ抗体には、ヒトの超可変領域または１つまたは複数のＣＤＲが保持されているが、配列の１つまたは複数の他の領域が非ヒト動物由来の対応する配列に置換されている完全なヒト抗体も含まれる。
キメラ抗体の作製で使用すべき非ヒト配列（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗体をヒトでの治療に使用することを意図する場合に、抗原性およびヒト抗非ヒト抗体応答を軽減することが重要である。キメラ抗体が抗原に対する高い結合親和性および他の好ましい生物学的性質を保持することはさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、親ヒト配列および非ヒト配列の三次元モデルを使用した親配列および種々の概念的キメラ産物の分析過程によってキメラ抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者に良く知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元立体配座構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の観察により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析）が可能である。この方法では、所望の抗体の特徴（標的抗原に対する親和性の増加など）が達成されるようにＦＲ残基を選択し、レシピエントと組み合わせ、配列を移入することができる。一般に、超可変領域の残基は、抗原結合への影響に直接且つほとんど実質的に関与する。
上記のように、抗体（または免疫グロブリン）を、重鎖の定常領域中のアミノ酸配列の相違に基づいて５つの異なるクラスに分類することができる。所与のクラス内の全ての免疫グロブリンは、非常に類似した重鎖定常領域を有する。これらの相違を、配列研究によるか、より一般的には、血清学的手段（すなわち、これらの相違に指向する抗体の使用）によって検出することができる。本発明の抗体またはそのフラグメントは任意のクラスであり、したがって、γ、μ、α、δ、またはε重鎖を有することができる。γ鎖は、γ１、γ２、γ３、またはγ４であり、α鎖はα１またはα２である。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントはＩｇＧである。ＩｇＧは免疫グロブリン分子の全機能を実行することができるので、最も万能な免疫グロブリンと見なされている。ＩｇＧは血清中の主なＩｇであり、胎盤を通過する唯一のＩｇクラスである。ＩｇＧはまた固体を固定するが、ＩｇＧ４サブクラスは固定しない。マクロファージ、単球、ＰＭＮ、およびいくつかのリンパ球は、ＩｇＧのＦｃ領域のＦｃ受容体を有する。全てのサブクラスが等しく十分に結合するわけではなく、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４はＦｃ受容体に結合しない。ＰＭＮ、単球、およびマクロファージ上のＦｃ受容体への結合の重要性は、今のところ細胞が抗原をより良好に内在化することができるということである。ＩｇＧは食作用を増強するオプソニンである。他の細胞型上のＦｃ受容体へのＩｇＧの結合により、他の機能が活性化する。本発明の抗体は、任意のＩｇＧサブクラスの抗体であり得る。
別の好ましい実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントはＩｇＥである。ＩｇＥは抗原との相互作用前でさえも好塩基球および肥満細胞上のＦｃ受容体に非常に強固に結合するので、ＩｇＥは最少の血清Ｉｇである。好塩基球および肥満細胞への結合の結果として、ＩｇＥはアレルギー反応に関与する。細胞上のＩｇＥへのアレルゲンの結合により、種々の薬理学的メディエーターが放出されてアレルギー症状を生じる。ＩｇＥはまた、寄生性蠕虫疾患で役割を果たす。好酸球は、ＩｇＥのＦｃ受容体を有し、ＩｇＥコーティングされた蠕虫への好酸球の結合によって寄生虫を死滅させる。ＩｇＥは補体を固定しない。
種々の実施形態では、本発明の抗体およびそのフラグメントは、κおよびλのいずれかの可変軽鎖を含む。λ鎖は任意のサブタイプ（例えば、λ１、λ２、λ３、およびλ４が含まれる）のいずれかである。
上記のように、本発明は、さらに、本発明のポリペプチドを含む抗体フラグメントを提供する。一定の環境では、抗体全体よりもむしろ抗体フラグメントを使用する方が有利である。例えば、より小さなサイズのフラグメントは迅速なクリアランスが可能であり、一定の組織（固形腫瘍など）への接近が改善される。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体；線状抗体；単鎖抗体；および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれる。
種々の抗体フラグメントの産生技術が開発されている。伝統的に、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性の消化を介して誘導されていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントを、現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖ抗体フラグメントの全てをＥ．ｃｏｌｉ中に発現し、これから分泌することができるので、これらのフラグメントを容易に大量に産生することが可能である。Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え細胞培養物から直接単離することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント（サルベージ受容体結合エピトープ残基が含まれる）は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体フラグメントの他の産生技術は、当業者に明らかであろう。
他の実施形態では、最適な抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号を参照のこと。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠くインタクトな組み合わせ部位を有する唯一の種である。したがって、これらは、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用時の非特異的結合を減少させるのに適切である。ｓＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでのエフェクタータンパク質の融合物を得ることができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、前出を参照のこと。抗体フラグメントはまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の「線状抗体」である。かかる線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性であり得る。
一定の実施形態では、本発明の抗体は二重特異性または多重特異性である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに結合特異性を有する抗体である。例示的二重特異性抗体は、単一抗原の２つの異なるエピトープに結合する。他のかかる抗体は、第１の抗原結合部位が第２の抗原の結合部位と組み合わされている。あるいは、感染細胞に細胞防御機構を集中および局在化するために、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）（ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）など）などの白血球上の誘発分子に結合するアームと抗ＣＭＶアームを組み合わせる。また、二重特異性抗体を使用して、感染細胞に細胞毒性薬を局在化させる。これらの抗体は、ＣＭＶ結合アームおよび細胞毒性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）に結合するアームを保有する。二重特異性抗体を、完全長の抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製する。ＷＯ９６／１６６７３号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載しており、米国特許第５，８３７，２３４号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示している。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体はＷＯ９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示している。
二重特異性抗体の作製方法は当該分野で公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な作製は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（この２つの鎖は異なる特異性を有する）の同時発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の無作為な分類のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子（そのうちの１つのみが正確な二重特異性構造を有する）の有望な混合物を産生する。通常はアフィニティクロマトグラフィ工程によって行われる正確な分子の精製はむしろ手間がかかり、生成物の収率は低い。類似の手順は、ＷＯ９３／０８８２９号およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
異なるアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。好ましくは、Ｉｇの重鎖定常ドメイン（ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む）に融合する。軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有し、これが少なくとも１つの融合物中に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および（必要に応じて）免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを個別の発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に同時トランスフェクトする。これにより、構築物中で使用した不均等な比の３つのポリペプチド鎖によって最適な収量の所望の二重特異性抗体が得られる実施形態で、３つのポリペプチドフラグメントの相互の比率がより柔軟に調整される。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現によって高収量が得られるか、比が所望の鎖組み合わせの収量に有意な影響を及ぼさない場合、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。たった半分の二重特異性分子中に免疫グロブリン軽鎖が存在することによって容易に分離する方法が得られるので、この非対称構造が望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載の別のアプローチに従って、抗体分子対の間の界面を、組換え細胞培養物からのヘテロ二量体の回収率を最大にするように操作することができる。好ましい界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換する。巨大側鎖と同一または類似のサイズの代償的な「空洞」を、巨大アミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置換することによって第２の抗体分子の界面上に作製する。これにより、他の望ましくない副産物（ホモ二量体など）を超えるヘテロ二量体の収率の増加機構が得られる。
二重特異性抗体には、架橋抗体または「ヘテロ抱合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ抱合体中の抗体の一方をアビジンとカップリングし、他方をビオチンとカップリングする。かかる抗体は、例えば、望ましくない細胞を免疫系細胞の標的にし（米国特許第４，６７６，９８０号）、ＨＩＶ感染治療用の抗体であることが提案されている（ＷＯ９１／００３６０号、ＷＯ９２／２００３７３号、およびＥＰ０３０８９号）。任意の従来の架橋方法を使用して、ヘテロ抱合体抗体を作製する。適切な架橋剤は当該分野で周知であり、多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
抗体フラグメントからの二重特異性抗体の生成技術は文献にも記載されている。例えば、化学的架橋を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解によって切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を記載している。これらのフラグメントをジチオール錯化剤（亜砒酸ナトリウム）の存在下で還元して、隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成したＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方をＦａｂ’−チオールに変換し、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化剤として使用することができる。
最近の進歩により、Ｅ．ｃｏｌｉからのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接回収が容易になった。このフラグメントを化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化した二重特異性抗体 Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントをＥ．ｃｏｌｉから個別に分泌させ、このフラグメントをｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導された化学的カップリングに供して二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体および通常のヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合し、ヒト***腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法を、抗体ホモ二量体の産生のために使用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載の「二特異性抗体」テクノロジーは、二重特異性抗体フラグメントの別の作製機構を提供している。フラグメントは、短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間で対合できないリンカーによってＶＬに連結したＶＨを含む。したがって、一方のフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインに対して別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインとの対合を強制し、それにより、抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用による二重特異性抗体フラグメントの別の作製ストラテジーも報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
２つを超える結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異性抗体を調製する。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。多価抗体を、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも迅速に内在化（および／または異化）することができる。本発明の抗体は３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（例えば、三価抗体）であり、これを、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生することができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含む。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域およびＦｃ領域に対してアミノ末端側の３つ以上の抗原結合部位を含む。好ましい多価抗体は、３〜約８個であるが、好ましくは４個の抗原結合部位を含む。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、このポリペプチド鎖は２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃ（式中、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、Ｆｃは１つのＦｃ領域のポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを示し、ｎは０または１である）を含む。例えば、ポリペプチド鎖は以下を含む：ＶＨ−ＣＨ１−可動性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖。多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つの（好ましくは４つの）軽鎖可変ドメインのポリペプチドをさらに含む。例えば、多価抗体は、約２個〜約８個の軽鎖可変ドメインのポリペプチドを含む。本明細書中で意図する軽鎖可変ドメインのポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、任意選択的にＣＬドメインをさらに含む。
本発明の抗体は単鎖抗体をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明の抗体は内在化抗体である。
本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を意図する。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改良する。抗体またはその鎖をコードするポリヌクレオチドへの適切なヌクレオチドの変化の導入またはペプチド合成によって抗体のアミノ酸配列バリアントを調製する。例示的な修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴を保有する場合、最終抗体に到達するように欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせる。アミノ酸の変化により、抗体の翻訳後プロセシングを変化させることもできる（グリコシル化部位の数または位置の変化など）。本発明のポリペプチドの上記の任意の異形および修飾物は本発明の抗体に含まれる。
変異誘発に好ましい位置である抗体の一定の残基または領域の有用な同定方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載のように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここでは、標的残基の残基または群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、アミノ酸のＰＳＣＡ抗原との相互作用に影響を及ぼすように中性または負電荷のアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）に置換する。次いで、置換に対する機能的感受性が証明されたアミノ酸の位置を、置換部位でのまたは置換部位のためのさらなるまたは他のバリアントの導入によって精巧にする。したがって、アミノ酸配列異形の導入のための部位を予め決定する一方で、変異自体の性質を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異能力を分析するために、標的コドンまたは標的領域でａｌａスキャニング変異誘発またはランダム変異誘発を行い、発現した抗抗体バリアントを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列の挿入には、１残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体または細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体が含まれる。抗体の他の挿入バリアントには、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が含まれる。
別のバリアント型はアミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、抗体分子中に異なる残基に置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発のための最も興味深い部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの変化も意図される。保存的置換および非保存的置換が意図される。
（ａ）置換領域中のポリペプチド骨格の構造（例えば、シート立体配座またはヘリックス立体配座として）、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に及ぼすその影響が有意に異なる置換の選択によって抗体の生物学的特性における実質的な修飾を行う。
抗体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基も一般にセリンに置換して、分子の酸化安定性を改良し、異常な架橋を防止する。逆に、システイン結合を抗体に添加して、その安定性を改良する（特に、抗体が抗体フラグメント（Ｆｖフラグメントなど）である場合）。
１つの置換バリアント型は、親抗体の１つまたは複数の超可変領域の残基の置換を含む。一般に、さらなる開発のために選択した得られたバリアントの生物学的性質を、これらが生成された親抗体と比較して改良した。かかる置換バリアントの都合の良い生成方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を含む。簡潔に述べれば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を、各部位に全ての可能なアミノ置換が得られるように変異する。このようにして生成した抗体バリアントを、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として糸状ファージ粒子から１価の様式でディスプレイする。次いで、本明細書中に開示のように、ファージディスプレイされたバリアントを、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域の残基を同定する。あるいはまたはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原または感染細胞との間の接触点を同定する。これらの接触残基および隣接残基は、本明細書中に詳述した技術に従った置換の候補である。一旦これらのバリアントが生成されると、一連のバリアントを本明細書中に記載のスクリーニングに供し、１つまたは複数の関連するアッセイで優れた性質を有する抗体をさらなる開発のために選択する。
抗体の別のアミノ酸バリアント型は、抗体の元のグリコシル化パターンが変化している。変化は、抗体中に見出される１つまたは複数の炭水化物部分の欠失および／または抗体中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着をいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される可能性がある。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用することができる）への糖であるＮ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースの１つの付着をいう。
抗体へのグリコシル化部位の付加を、１つまたは複数の上記トリペプチド配列を含むようなアミノ酸配列の変化によって都合よく行う（Ｎ結合型グリコシル化部位用）。また、元の抗体配列に対する１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加または置換によって変化させる（Ｏ結合型グリコシル化部位用）。
例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾する。これを、抗体のＦｃ領域中の１つまたは複数のアミノ酸置換の導入によってこれを行うことができる。あるいはまたはさらに、システイン残基をＦｃ領域中に導入し、それにより、この領域中に鎖間ジスルフィド結合が形成される。このように生成されたホモ二量体抗体は、内在化能力が改善され、そして／または補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増加し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。抗感染活性が増強されたホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載のヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製する。あるいは、二重のＦｃ領域を有するように抗体を操作し、それにより、補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載のように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体フラグメント）に組み込む。用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期の増加を担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。
また、本発明の抗体を、例えば、生成または診断に適用するためのエピトープタグまたは標識を含むように修飾する。本発明はまた、免疫抱合体（抗癌剤（細胞毒性薬または増殖阻害剤など）に抱合した抗体が含まれる）を使用した療法に関する。かかる免疫抱合体の生成で有用な化学療法薬は上に記載されている。
抗体と１つまたは複数の小分子毒素（カリチアマイシン、マイタンシノイド、アウリスタチン、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）、およびＣＣ１０６５など）および毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体との抱合体も本明細書中で意図される。
１つの好ましい実施形態では、本発明の抗体（全長またはフラグメント）を、１つまたは複数のマイタンシノイド分子に抱合する。マイタンシノイドは、チューブリン重合の阻害によって作用する有糸***（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）インヒビターである。メイタンシンは、東アフリカの低木であるＭａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、一定の微生物もマイタンシノイド（マイタンシノールおよびＣ−３マイタンシノールエステルなど）を産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；同第４，２４８，８７０号；同第４，２５６，７４６号；同第４，２６０，６０８号；同第４，２６５，８１４号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３０８，２６８号；同第４，３０８，２６９号；同第４，３０９，４２８号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３１７，８２１号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４２４，２１９号；同第４，４５０，２５４号；同第４，３６２，６６３号；および同第４，３７１，５３３号に開示されている。
その治療指数を改善するために、メイタンシンおよびマイタンシノイドを、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体に抱合した。マイタンシノイドを含む免疫抱合体およびその治療用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、および欧州特許第ＥＰ０４２５２３５Ｂ１号に開示されている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３（１９９６）は、ヒト結腸直腸癌に指向するモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結したＤＭ１と呼ばれるマイタンシノイドを含む免疫抱合体を記載していた。抱合体は、培養結腸癌細胞に対して高い細胞傷害性を示すことが見出され、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。
抗体−マイタンシノイド抱合体を、抗体またはマイタンシノイド分子の生物学的活性を有意に減少させることなくマイタンシノイド分子に抗体を化学結合することによって調製する。１つの毒素／抗体分子でさえも裸の抗体の使用よりも細胞傷害性が増強されると予想されるにもかかわらず、抗体分子あたり平均して３〜４個のマイタンシノイド分子の抱合が抗体の機能または溶解性に負の影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞傷害性を増強するのに有効であることが示された。マイタンシノイドは当該分野で周知であり、公知の技術によって合成するか、天然供給源から単離することができる。適切なマイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号ならびに本明細書中の上記で言及した他の特許および非特許刊行物に開示されている。好ましいマイタンシノイドは、マイタンシノールおよびマイタンシノール分子の芳香環内または他の位置で修飾されたマイタンシノールアナログ（種々のマイタンシノールエステルなど）である。
抗体抱合体の作製のための当該分野で公知の連結基が多数存在する（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０４２５２３５Ｂ１、およびＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示の連結基が含まれる）。連結基には、上記で確認した特許に開示のジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、またはエステラーゼ不安定性基が含まれ、ジスルフィド基およびチオエーテル基が好ましい。
種々の二官能性タンパク質カップリング剤（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジピミド酸ジメチル塩酸塩など）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）など）を使用して免疫抱合体を作製する。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を得るためのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）が含まれる。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載のように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン四酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの抱合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞中の細胞傷害性薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」である。例えば、酸不安定性リンカー（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
別の目的の免疫抱合体には、１つまたは複数のカリチアマイシン分子に抱合した抗体が含まれる。抗生物質のカリチアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ分解物を産生することができる。カリチアマイシンファミリーの抱合体の調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、同第５，８７７，２９６号（全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。抗体が抱合する別の薬物は抗葉酸剤ＱＦＡである。カリチアマイシンおよびＱＦＡは共に細胞内活性部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。したがって、抗体媒介性内在化を介したこれらの薬剤の細胞取り込みによってその細胞傷害効果が非常に増強される。
本発明の抗体に抱合する他の薬剤の例には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチン、および５−フルオロウラシル（米国特許第５，０５３，３９４号、同第５，７７０，７１０号に記載の集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー）、およびエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６）が含まれる。
使用される酵素活性毒素およびそのフラグメントには、例えば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシインヒビター、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。例えば、ＷＯ９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、さらに、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅなど））との間に形成された免疫抱合体を含む。
感染細胞の選択的破壊のために、抗体は高放射性原子を含む。種々の放射性同位体は、放射性抱合した抗ＰＳＣＡ抗体の産生のために利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｃ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。抱合体を診断のために使用する場合、抱合体は、シンチグラフィ研究のための放射性原子（例えば、ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３）または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像法（ｍｒｉ）としても公知）のためのスピン標識（ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄など）を含む。
放射性標識または他の標識を、公知の方法で抱合体に組み込む。例えば、ペプチドを生合成するか、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用したアミノ酸化学合成によって合成する。標識（ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、およびＩｎ１１１など）を、ペプチド中のシステイン残基を介して付着させる。イットリウム−９０を、リジン残基を介して付着させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ ら、（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７を使用して、ヨウ素−１２３を組み込む。“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）には、他の方法が詳述されている。
あるいは、融合タンパク質（抗体および細胞毒性薬が含まれる）を、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製する。ＤＮＡ長は、相互に隣接するか、抱合体の所望の性質を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離された抱合体の２つの部分をコードする各領域を含む。
本発明の抗体はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬（ＷＯ８１／０１１４５号を参照のこと））を活性な抗癌薬（例えば、ＷＯ８８／０７３７８号および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと）に変換するプロドラッグ活性化酵素への抗体の抱合による抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）で使用される。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫抱合体の酵素成分には、プロドラッグをそのより活性な細胞傷害性形態に変換するような方法でプロドラッグに作用することができる任意の酵素が含まれる。本発明の方法で有用な酵素には、以下が含まれるが、これらに限定されない：リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なプロテアーゼ（セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）など）；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグの変換に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグの遊離薬物への変換に有用な炭水化物切断酵素（β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなど）；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；およびそのアミン窒素にてフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基で誘導体化された薬物をそれぞれ遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ（ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなど）。あるいは、当該分野で「アブザイム」としても公知の酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと）。抗体−アブザイム抱合体を、感染細胞集団へのアブザイムの送達について本明細書中に記載のように調製することができる。
当該分野で周知の技術（上記で考察したヘテロ二官能性架橋試薬の使用など）によって、本発明の酵素を抗体に共有結合させる。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結した本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築する（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照のこと）。
抗体の他の修飾を本明細書中で意図する。例えば、抗体を、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー）の１つに連結する。また、抗体を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中に捕捉する。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
本明細書中に開示の抗体を、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物の送達に有用な種々の型の脂質、リン脂質、および／または界面活性剤から構成される小胞である。リポソーム成分を、一般に、生体膜の脂質配置に類似の二分子膜構成に配置する。抗体を含むリポソームを、当該分野で公知の方法（Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；および１９９７年１０月２３日公開のＷＯ９７／３８７３１号に記載の方法など）によって調製する。循環期間が増加したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ由来ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用した逆相蒸発法によって生成する。リポソームを、規定の孔サイズのフィルターを介して押し出して所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、ジスルフィド鎖間反応によってＭａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のリポソームに抱合することができる。化学療法薬を任意選択的にリポソーム内に含める。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照のこと。
本発明の抗体またはそのフラグメントは、任意の種々の生物学的または機能的特徴を保有することができる。一定の実施形態では、これらの抗体はＣＭＶ特異的抗体であり、これらの抗体が他のウイルスと比較して、ＣＭＶまたはＨＣＭＶにそれぞれ特異的に結合するか優先的に結合することを示す。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、特異的または優先的に結合するポリペプチドまたは細胞の生物学的活性を部分的または完全に遮断または阻害するアンタゴニスト抗体である。他の実施形態では、本発明の抗体は、結合する感染細胞の増殖を部分的または完全に遮断または阻害する増殖阻害抗体である。別の実施形態では、本発明の抗体はアポトーシスを誘導する。さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害または補体依存性細胞傷害性を誘導または促進する。
ポリヌクレオチド
本発明は、他の態様では、ポリヌクレオチド組成物を提供する。好ましい実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド（例えば、ＣＭＶに結合する抗体の可変鎖領域）をコードする。当業者にも認識されるように、本発明のポリヌクレオチドは一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）または二本鎖であり、ＤＮＡ分子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子には、ＨｎＲＮＡ分子（イントロンを含み、１対１様式でＤＮＡ分子に対応する）およびｍＲＮＡ分子（イントロンを含まない）が含まれる。さらなるコード配列または非コード配列は本発明のポリヌクレオチド内に存在することができ（しかし、その必要はない）、ポリヌクレオチドは他の分子および／または支持材料に連結することができる（しかし、その必要はない）。本発明のポリヌクレオチドを、例えば、ハイブリッド形成アッセイで使用して、生物サンプルおよび本発明のポリペプチドの組換え産生物におけるＣＭＶ特異的抗体の存在を検出する。
したがって、本発明の別の態様によれば、ポリヌクレオチド組成物（実施例１に記載のいくつかまたは全てのポリヌクレオチド配列、実施例１に記載のポリヌクレオチド配列の相補物、および実施例１に記載のポリヌクレオチド配列の縮重バリアントが含まれる）を提供する。一定の好ましい実施形態では、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列は、正常なコントロール非感染細胞と比較した場合にＣＭＶ感染細胞に優先的に結合することができるポリペプチド（実施例１または図１に記載の配列を有するポリペプチドが含まれる）をコードする。さらに、本発明は、任意の本発明のポリペプチドをコードする全てのポリヌクレオチドを意図する。
他の関連する実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の方法（例えば、標準的なパラメーターを使用したＢＬＡＳＴ分析）を使用して決定した場合に実施例１に記載の配列（または可変ドメインまたは機能的ドメインをコードするその一部）と実質的に同一の配列（例えば、本発明のポリヌクレオチド配列（または本発明のポリペプチドの可変ドメインまたは機能的ドメインをコードするそのフラグメント）と比較して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を含む配列）を有するポリヌクレオチドバリアントを提供する。当業者は、これらの値を適切に調整して、コドン縮重、アミノ酸類似性、および読み取り枠の位置などを考慮することによって２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができると認識するであろう。
典型的には、ポリヌクレオチドバリアントは、好ましくは、バリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原性結合性が本明細書中に具体的に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと比較して実質的に減少しないような１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含む。
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書中に開示の１つまたは複数の配列と同一または相補的な種々の長さの連続する配列を含むポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本発明は、本明細書中に開示の１つまたは複数の配列の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００個、またはそれを超える連続するヌクレオチドおよびその間の全ての中間の長さを含むポリヌクレオチドを提供する。「中間の長さ」は、この文脈では、引用した値の間の任意の長さ（１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１，１０２、１０３など；および１５０、１５１、１５２、１５３など（２００〜５００；５００〜１，０００の間の全ての整数が含まれる）など）を意味すると容易に理解されるであろう。
本発明の別の実施形態では、中程度から高いストリンジェンシー条件下で本明細書中に提供したポリヌクレオチド配列、そのフラグメント、またはその相補配列とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリッド形成技術は、分子生物学分野で周知である。例示のために、本発明のポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドとのハイブリッド形成の試験に適切な中程度にストリンジェントな条件には、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む溶液での予備洗浄；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリッド形成；その後の０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣでの６５℃で２０分間の各２回の洗浄が含まれる。当業者は、ハイブリッド形成溶液の塩含有量および／またはハイブリッド形成の実施濃度の変更などによってハイブリッド形成のストリンジェンシーを容易に操作することができると理解するであろう。例えば、別の実施形態では、適切な高ストリンジェントハイブリッド形成条件には、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃にハイブリッド形成温度を上昇させることを除いた上記の条件が含まれる。
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントまたはフラグメントによってコードされるポリペプチドは、未変性のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同一の結合特異性を有する（すなわち、特異的または優先的にＣＭＶに結合する）。一定の好ましい実施形態では、上記のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドバリアント、フラグメント、およびハイブリッド形成配列）は、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド配列の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％の結合活性レベルを有するポリペプチドをコードする。
本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを、コード配列自体の長さと無関係に、その長さ全体が非常に変化するように他のＤＮＡ配列（プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、多重クローニング部位、および他のコードセグメントなど）と組み合わせる。ほとんどの任意の長さの核酸フラグメントが使用され、好ましくは、意図する組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用の容易さによって全長が制限される。例えば、全長が約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、および約５０塩基対長など（中間の長さが全て含まれる）の例示的ポリヌクレオチドセグメントは、本発明を多数実施する上で有用である。
遺伝暗号の縮重の結果として本明細書中に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が多数存在すると当業者に認識されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の未変性遺伝子のヌクレオチド配列に対して最少の相同性を有する。それにもかかわらず、本発明のポリペプチドをコードするが、コドン利用頻度の相違のために異なるポリペプチドを本発明で特に意図する。さらに、本明細書中に提供したポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの１つまたは複数の変異（欠失、付加、および／または置換など）の結果として変化した内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、構造または機能が変化し得るが、その必要はない。標準的な技術（ハイブリッド形成、増幅、および／またはデータベースでの配列比較など）を使用して対立遺伝子を同定する。
本発明の一定の実施形態では、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つまたは複数の性質（その結合特異性または結合強度など）を変化させるための開示のポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。変異誘発技術は当該分野で周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両バリアントを作製するために広く使用されている。変異誘発アプローチ（部位特異的変異誘発など）を、本明細書中に記載のポリペプチドのバリアントおよび／または誘導体を調製するために使用する。このアプローチにより、ポリペプチド配列をコードする基礎をなすポリヌクレオチドの変異誘発によってポリペプチド配列が特異的に修飾される。これらの技術により、ポリヌクレオチドへの１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の導入による配列バリアントを調製および試験するための簡潔なアプローチ（例えば、１つまたは複数の上記検討材料の組み込み）が得られる。
部位特異的変異誘発により、横たわっている欠失連結部（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の両側で安定な二重鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列の複雑さのプライマー配列を得るために、特定のオリゴヌクレオチド配列（望ましく変異したヌクレオチド配列が含まれる）および十分な数の隣接ヌクレオチドの使用によって変異体を産生することが可能である。選択されたポリヌクレオチド配列を変異させて、ポリヌクレオチド自体の性質を改良、変更、減少、修飾、または変化させ、そして／またはコードされるポリペプチドの性質、活性、組成、安定性、または一次配列を変化させる。
本発明の他の実施形態では、本明細書中に提供されたポリヌクレオチド配列を、核酸ハイブリッド形成のためのプローブまたはプライマーとして（例えば、ＰＣＲプライマーとして）使用する。かかる核酸プローブが目的の配列と特異的にハイブリッド形成する能力により、このプローブを所与のサンプル中の相補配列の存在の検出で用いることができるであろう。しかし、他の使用（変異種プライマーまたは他の遺伝子構築物の調製で使用するプライマーの調製のための配列情報の使用など）も想定される。そのようなものとして、本明細書中に開示の１５ヌクレオチド長の連続配列と同一の配列を有するか、相補的である少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続配列の配列領域を含む核酸セグメントが特に有用であることが意図される。より長い連続する同一または相補的な配列（例えば、約２０、３０，４０、５０、１００、２００、５００、１０００個（全ての中間の長さが含まれる）の配列およびさらに全長までの配列）も一定の実施形態で使用される。
本明細書中に開示のポリヌクレオチド配列と同一であるか相補的な１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、またはさらに１００〜２００ヌクレオチドほど（その中間の長さも含まれる）の連続するヌクレオチドストレッチを含む配列領域を有するポリヌクレオチド分子を、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングで用いるハイブリッド形成プローブおよび／または例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いるプライマーとして特に意図する。フラグメントの全サイズおよび相補ストレッチのサイズは、最終的に、特定の核酸セグメントの意図する使用または適用に依存するであろう。より小さなフラグメントをハイブリッド形成実施形態で使用し、連続する相補領域の長さを変化させることができるが（約１５から約１００ヌクレオチドの間など）、検出すべき相補配列の長さに応じてより大きな連続相補ストレッチを使用することができる。
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリッド形成プローブの使用により、安定且つ選択的である二重鎖分子が形成される。しかし、ハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それにより、得られた特異的ハイブリッド分子の質および程度を改善するために、１２塩基長を超えるストレッチにわたって連続する相補配列を有する分子が一般に好ましい。１５〜２５個またはさらに長い連続ヌクレオチドの遺伝子相補ストレッチを有する核酸分子が好ましい。
ハイブリッド形成プローブを、本明細書中に開示の任意の配列の任意の部分から選択する。必要なのは、プローブまたはプライマーとして使用することを望む本明細書中に記載の配列または配列の任意の連続部分（約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列以下）を検討することだけである。プローブおよびプライマー配列の選択は種々の要因に支配され得る。例えば、全配列の末端から末端までのプライマーを使用することが望まれ得る。
本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントもしくはバリアントを、自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して一般的に実施される化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって容易に調製する。また、フラグメントを、核酸再生テクノロジー（米国特許第４，６８３，２０２号のＰＣＲ（商標）テクノロジーなど）の適用、組換え産生のための組換えベクターへの選択された配列の導入、および分子生物学分野の当業者に一般に知られている他の組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。
ベクター、宿主細胞、および組換え法
本発明は、ベクターおよび宿主細胞（本発明の核酸が含まれる）ならびに本発明のポリペプチドの産生のための組換え技術を提供する。本発明のベクターには、任意の細胞型または生物型で複製することができるベクター（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、およびミニ染色体が含まれる）が含まれる。種々の実施形態では、ベクター（本発明のポリヌクレオチドが含まれる）は、ポリヌクレオチドの増殖または複製に適切なベクターまたは本発明のポリペプチドの発現に適切なベクターである。かかるベクターは当該分野で公知であり、市販されている。
本発明のポリヌクレオチドを合成し、次いでその全部または一部を組み合わせ、日常的な分子生物学技術および細胞生物学技術（例えば、適切な制限部位および制限酵素を使用した線状化ベクターへのポリヌクレオチドのサブクローニングが含まれる）を使用してベクターに挿入する。本発明のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの各鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる。これらのプライマーはまた、ベクターへのサブクローニングを容易にするための制限酵素切断部位を含むことができる。複製可能なベクター成分には、一般に、１つまたは複数の以下が含まれるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、および１つまたは複数のマーカー遺伝子または選択遺伝子。
本発明のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその機能的等価物を、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入する。当業者に周知の方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築する。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。かかる技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら、（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙに記載されている。
ポリヌクレオチド配列を含めて発現させるために種々の発現ベクター／宿主系を使用する。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミド ＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリシウイルスモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
１つの実施形態内で、目的のモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域を、ヌクレオチドプライマーを使用してハイブリドーマ細胞から増幅する。当業者はこれらのプライマーを合成することができるか、販売業者（例えば、マウスおよびヒトの可変領域の増幅用プライマーを販売しているＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照のこと）から購入することができる。プライマーを使用して重鎖または軽鎖の可変領域を増幅し、次いで、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）ＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのベクターにそれぞれ挿入する。次いで、これらのベクターをＥ．ｃｏｌｉ、酵母、または哺乳動物ベースの発現系に導入する。ＶＨドメインおよびＶＬドメインの融合物を含む大量の単鎖タンパク質を、これらの方法を使用して産生することができる（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）を参照のこと）。
発現ベクター中に存在する「調節エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を行うために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。これらのエレメントは、その強度および特異性が異なり得る。使用したベクター系および宿主に応じて、多数の適切な転写および翻訳エレメント（構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターが含まれる）を使用する。
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターの例には、ｐｈｏａプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびハイブリッドプロモーター（ｔａｃプロモーターなど）が含まれる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。細菌系で用いるプロモーターはまた、通常、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルカルノ配列を含む。誘導性プロモーター（ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターなど）を使用することができる。
真核生物の種々のプロモーター配列は公知であり、本発明に従って、任意のプロモーター配列を使用することができる。実質的に全ての真核生物遺伝子は、転写開始部位から約２５〜３０塩基上流に存在するＡＴリッチな領域を有する。多数の遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流で見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの全配列を、真核生物発現ベクターに適切に挿入する。
哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが一般に好ましい。哺乳動物宿主細胞中でのベクター由来のポリペプチド発現を、例えば、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉種ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましいサルウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから得たプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）および熱ショックプロモーター（但し、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合する場合）によって調節することができる。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要である場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターを、適切な選択マーカーと共に有利に使用することができる。適切な発現ベクターの一例はＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。
多数のウイルスベースの発現系が、ポリペプチドの哺乳動物発現に利用可能である。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的のポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび３断片からなるリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲーションする。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域中の挿入を使用して、感染宿主細胞中でポリペプチドを発現することができる生存ウイルスを得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなど）を使用して、哺乳動物宿主細胞中での発現を増加させる。
細菌系では、ポリペプチド発現を意図した使用に応じて多数の発現ベクターのいずれかを選択する。例えば、大量発現を望む場合、容易に生成される高レベルの融合タンパク質発現を指示するベクターを使用する。かかるベクターには、多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター（ｐＥＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）など）（目的のポリペプチドをコードする配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続く７残基についての配列と共にインフレームでベクターにライゲーションし、それにより、ハイブリッドタンパク質が産生される）およびｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）も使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着およびその後の遊離グルタチオンの存在下での溶離によって溶解した細胞から容易に精製することができる。目的のクローニングしたポリペプチドを任意にＧＳＴ部分から放出することができるように、かかる系で作製されたタンパク質を、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインする。
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、構成性または誘導性プロモーター（α因子、アルコールオキシダーゼ，およびＰＧＨ）を含む多数のベクターを使用する。酵母宿主と使用するための他の適切なプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素（エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｃｎａｓｅ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど）のプロモーターが含まれる。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌ ら、（前出）およびＧｒａｎｔ ら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。増殖条件によって調節される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、マルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域が含まれる。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。酵母エンハンサーを、酵母プロモーターと共に使用することも有利である。
植物発現ベクターを使用する場合、ポリペプチドをコードする配列の発現を多数のプロモーターのいずれかによって駆動する。例えば、ウイルスプロモーター（ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなど）を単独で使用するか、ＴＭＶ由来のωリーダー配列と組み合わせて使用する（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなど）を使用することができる（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．，ら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物を、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞に導入する。かかる技術は、一般に利用可能な多数の概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．ｏｒ Ｍｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．ｉｎ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；ｐｐ．１９１−１９６を参照のこと）．
また、昆虫系を使用して目的のポリペプチドを発現する。例えば、１つのかかる系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫中の外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用する。ポリペプチドをコードする配列を、ウイルスの非必須領域（ポリヘドリン遺伝子など）にクローン化し、ポリヘドリンプロモーターの調節下におくことができる。ポリペプチドコード配列の首尾の良い挿入によってポリヘドリン遺伝子が不活性にされ、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが産生される。次いで、組換えウイルスを使用して、例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫に感染させ、目的のポリペプチドを発現することができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
特異的開始シグナルを使用して、目的のポリペプチドをコードする配列をより有効に翻訳することもできる。かかるシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適切な発現ベクターに挿入する場合、さらなる転写および翻訳調節シグナルが必要であり得る。しかし、コード配列またはその一部のみを挿入する場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルを準備する。さらに、開始コドンは、挿入されたポリヌクレオチドの正確な翻訳を確実にするために正確な読み取り枠中に存在する。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）であり得る。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を、しばしば、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加させる。多数のエンハンサー配列が公知であり、例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリンをコードする遺伝子中で同定されたエンハンサー配列が含まれる。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例には、複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化エレメントの増強については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）も参照のこと。エンハンサーを、ポリペプチドコード配列の５’側または３’側の位置でベクターにスプライシングすることができるが、好ましくは、プロモーターから５’側の部位に存在する。
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、典型的には、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。かかる配列は、一般に、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側、時折３側の’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、抗ＰＳＣＡ抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６号およびこれに開示した発現ベクターを参照のこと。
本明細書中のベクター中でのＤＮＡのクローニングまたは発現に適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、植物、または高等真核生物の細胞である。この目的に適切な原核生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｌｅ）の例には、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌などの真正細菌（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａなど）、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０号に開示のＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）など）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）など）が適切である。これらの例は、本発明を制限するよりもむしろ例示である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（すなわち、一般的なパン酵母）は、下等真核宿主生物の間で最も一般的に使用されている。しかし、多数の他の属、種、および株が本明細書中で一般的に利用可能であり、且つ有用である（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（例えば、Ｋ ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど）；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなど）；および糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒなど）など）など）。
一定の実施形態では、宿主細胞株を、挿入した配列の発現を調整する能力または発現したタンパク質を所望の様式でプロセシングする能力について選択する。かかるポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングを使用して、正確な挿入、折り畳み、および／または機能を容易にすることもできる。かかる翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的な機構を有する異なる宿主細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８など）を、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択することができる。
抗体またはそのフラグメントの発現に特異的に適応した方法および試薬も公知であり且つ当該分野で利用可能であり、例えば、米国特許第４８１６５６７号および同第６３３１４１５号に記載のものが含まれる。種々の実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖またはそのフラグメントを、同一または異なる発現ベクターから発現させる。１つの実施形態では、両鎖を、同一細胞中に発現させ、それにより、機能的抗体またはそのフラグメントの形成が容易にする。
特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合（治療抗体を細胞毒性薬（例えば、毒素）に抱合する場合など）、全長抗体、抗体フラグメント、および抗体融合タンパク質を細菌中で産生することができ、免疫抱合体自体が感染細胞の破壊で有効性を示す。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えば、発現および分泌を最適にするための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載している米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、および同第５，８４０，５２３号を参照のこと。発現後、抗体を可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離し、例えば、アイソタイプに応じてプロテインＡまたはＧカラムを使用して精製する。例えば、ＣＨＯ細胞中で発現した抗体の精製のために使用したプロセスに類似のプロセスを使用して最終精製を行う。
グリコシル化したポリペプチドおよび抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞（例えば、アオウキクサなど）および昆虫細胞が含まれる。宿主（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｉｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉなど）由来の多数のバキュロウイルス株およびバリアントならびに対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株は公的に利用可能であり（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株）、かかるウイルスを、本発明に従って、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのためのウイルスとして使用することができる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物も宿主として使用する。
培養（組織培養）における脊椎動物細胞中での抗体ポリペプチドおよびそのフラグメントの増殖は、日常的手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は以下である：ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；懸濁培養での増殖についてサブクローン化されたヒト胚腎臓株（２９３または２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）。
宿主細胞を、ポリペプチド産生のための上記発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増殖に適切なように改変した従来の栄養培地中で培養する。
組換えタンパク質の長期間の高収率産生のために、一般に安定な発現が好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株を、同一または個別のベクター上にウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含むことができる発現ベクターを使用して形質転換することができる。ベクターの導入後、細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、その後に選択培地にスイッチすることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在により、導入された配列が首尾よく発現する細胞を増殖および回収することが可能である。安定に形質転換された細胞の耐性クローンを、細胞型に適切な組織培養技術を使用して増殖させることができる。
多数の選択系を使用して、形質転換された細胞株を回収することができる。これらには、それぞれｔｋ−細胞またはａｐｒｔ−細胞で使用される単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら、（１９９０）Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤に対する耐性を選択基準として使用する（例えば、ｄｈｆｒ（メトトレキサート耐性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０）；ｎｐｔ（アミノグリコシド，ネオマイシン、およびＧ−４１８への耐性を付与する）（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）；およびａｌｓまたはｐａｔ（それぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼへの耐性を付与する）（Ｍｕｒｒｙ，前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている（例えば、ｔｒｐＢ（細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させる）またはｈｉｓＤ（細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させる）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１））。視覚可能なマーカーの使用が支持されており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーは、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系による一過性または安定なタンパク質発現を定量するためにも広範に使用される（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子も存在することが示唆されるにもかかわらず、その存在および発現を確認する必要があり得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列をマーカー遺伝子配列内に挿入する場合、配列を含む組換え細胞をマーカー遺伝子機能の非存在によって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子を、単一のプロモーターの調節下でポリペプチドコード配列と並行して配置することができる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、縦列遺伝子の発現も示す。
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、且つ発現する宿主細胞を、当業者に公知の種々の手順によって同定する。これらの手順には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成およびタンパク質バイオアッセイまたは免疫アッセイ技術（例えば、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップベースのテクノロジーが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
産物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用したポリヌクレオチドにコードされた産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコールは当該分野で公知である。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる。所与のポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに反応性を示すモノクローナル抗体を使用した２部位のモノクローナルベースの免疫アッセイはいくつかの適用で好ましいかもしれないが、競合結合アッセイも使用することができる。これらおよび他のアッセイは、他の場所（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６））に記載されている。
種々の標識および抱合技術は当業者に公知であり、種々の核酸およびアミノ酸アッセイで使用することができる。ポリヌクレオチドに関連する配列の検出のための標識したハイブリッド形成プローブまたはＰＣＲプローブの産生手段には、標識したヌクレオチドを使用したオリゴ標識、ニック翻訳、末端標識、またはＰＣＲ増幅が含まれる。あるいは、配列またはその任意の一部を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクターにクローン化することができる。かかるベクターは当該分野で公知であり、一般に利用可能であり、このベクターを使用して、適切なＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６など）および標識したヌクレオチドの付加によってｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成することができる。これらの手順を、種々の市販のキットを使用して行うことができる。使用される適切なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤、ならびに基質、補因子、インヒビター、および磁性粒子などが含まれる。
組換え細胞によって産生されたポリペプチドを、使用される配列および／またはベクターに応じて、分泌させるか、細胞内に含める。当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核細胞膜を介してコードされたポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列を含むようにデザインすることができる。
一定の実施形態では、本発明のポリペプチドを、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをさらに含む融合ポリペプチドとして産生する。かかる精製を容易にするドメインには、金属キレート化ペプチド（固定化金属上で精製が可能なヒスチジン−トリプトファンモジュールなど）、固定化した免疫グロブリン上で精製が可能なプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製システム（Ａｍｇｅｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で使用されるドメインが含まれるが、これらに限定されない。切断可能なリンカー配列（精製ドメインとコードされたポリペプチドとの間の第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に特異的な配列など）の含有させて精製を容易にすることができる。１つのかかる発現ベクターにより、目的のポリペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６個以上のヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質が発現される。Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、（１９９２，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載のように、ヒスチジン残基はＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ）での精製を容易にする一方で、エンテロキナーゼ切断部位によって融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段が得られる。融合タンパク質産生に有用なベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９３；ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４４１−４５３）に示されている。
一定の実施形態では、本発明のポリペプチドを、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであり得る異種ポリペプチドに融合する。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。原核生物宿主細胞のために、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択することができる。酵母分泌のために、シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーが含まれる）、酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６号に記載のシグナルから選択することができる。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）を利用可能である。
組換え技術を使用する場合、ポリペプチドまたは抗体を、細胞内に産生するか、細胞周辺腔中に産生するか、培地に直接分泌することができる。ポリペプチドまたは抗体を細胞内に産生する場合、最初の工程として、粒子状のデブリ（宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれか）を、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌される抗体の単離手順を記載している。簡潔に述べれば、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって解凍する。細胞デブリを遠心分離によって除去することができる。ポリペプチドまたは抗体を培地中に分泌する場合、かかる発現系由来の上清を、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して最初に濃縮する。プロテアーゼインヒビター（ＰＭＳＦなど）を、タンパク質分解を阻害するための任意の上記工程に含めることができ、偶発性の夾雑物質の増殖を防止するために抗生物質を含めることができる。
細胞から調製したポリペプチドまたは抗体組成物を、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、ポリペプチドまたは抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づいて抗体またはそのフラグメントを精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に推奨されている（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着するマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスが利用可能である。機械的に安定なマトリックス（孔が調節されたガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど）により、アガロースを使用した場合よりも流速を速め、処理時間を短くすることが可能である。ポリペプチドまたは抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）は精製に有用である。他のタンパク質精製技術（イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿など）も、回収すべきポリペプチドまたは抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程後、目的のポリペプチドまたは抗体および夾雑物を含む混合物を、約ｐＨ２．５〜４．５の溶離緩衝液を使用し、好ましくは低塩濃度（例えば、塩濃度約０〜０．２５Ｍ）で行う低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに供することができる。
薬学的組成物
本発明は、所望の純度の本発明のポリペプチド、抗体、またはモジュレーター、および薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤を含む薬学的組成物をさらに含む（Ｒｅｍｉｎｇｉｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。一定の実施形態では、保存中のポリペプチドまたは抗体の安定性が強化されるように、例えば、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で薬学的組成物を調製する。
許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒であり、例えば、緩衝液（酢酸、Ｔｒｉｓ、リン酸、クエン酸、および他の有機酸の緩衝液など）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンが含まれる）；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルまたはプロピルパラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；等張化剤（トレハロースおよび塩化ナトリウムなど）；糖（スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなど）；界面活性剤（ポリソルベートなど）；自己形成対イオン（ナトリウムなど）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が含まれる。一定の実施形態では、治療処方物は、好ましくは、５〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度でポリペプチドまたは抗体を含む。
本明細書中の処方物はまた、特定の適応症（例えば、治療すべき感染症）の治療または望ましくない副作用の防止に適切な１つまたは複数のさらなる治療薬を含むことができる。好ましくは、さらなる治療薬は、本発明のポリペプチドまたは抗体に相補的な活性を有し、この２つは相互に有害に作用しない。例えば、本発明のポリペプチドまたは抗体に加えて、１つの処方物中に、例えば、さらなる抗体、抗ウイルス剤、抗感染剤、および／または心臓保護薬を含むことが望ましいかもしれない。かかる分子は、薬学的処方物中に意図する目的に有効な量で適切に存在する。
有効成分（例えば、本発明のポリペプチドおよび抗体ならびに他の治療薬）を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびメチルメタクリラート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中に捕捉することもできる。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成型品（例えば、フィルム、マイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセタート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｒｙｒｉｃ ａｃｉｄ）など）が含まれる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用すべき処方物は無菌であることが好ましい。滅菌濾過膜による濾過によってこれを容易に行う。
診断での使用
本発明の抗体およびそのフラグメントは、正常なコントロール細胞および組織と比較してＣＭＶ感染細胞または組織に特異的に結合するか、優先的に結合する。したがって、本発明の抗体を使用して、種々の診断方法および予後診断法（本明細書中に記載のものが含まれる）のいずれかを使用して、患者、生物サンプル、または細胞集団中の感染細胞または組織を検出することができる。抗ＣＭＶ抗体が感染細胞を検出する能力は、勿論、その結合特異性に依存するであろう。この結合特異性を、異なる患者および／または異なるＣＭＶ株に感染した患者から得た感染細胞または組織に結合する能力を試験することによって容易に決定することができる。
診断方法は、一般に、患者から得た生物サンプル（例えば、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブサンプル、または組織生検など）をＣＭＶ特異的抗体と接触させる工程およびコントロールサンプルまたは所定のカットオフ値と比較して抗体がサンプルに優先的に結合するかどうかを決定し、それにより、感染細胞の存在が示される工程を含む。特定の実施形態では、少なくとも２倍、３倍、または５倍以上のＣＭＶ特異的抗体が、適切なコントロール正常細胞または組織サンプルと比較して感染細胞に結合する。所定のカットオフ値を、例えば、試験される生物サンプルの診断アッセイを行うために使用した条件と同一の条件下でいくつかの異なる適切なコントロールサンプルに結合するＣＭＶ特異的抗体量を平均することによって決定することができる。
結合した抗体を、本明細書中に記載され、当該分野で公知の手順を使用して検出することができる。一定の実施形態では、本発明の診断方法を、結合した抗体の検出を容易にするための検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）に抱合したＣＭＶ特異的抗体を使用して実施する。しかし、本発明の診断方法を、ＣＭＶ特異的抗体の二次検出方法を使用して実施することもできる。これらには、例えば、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、沈殿、凝集、補体結合、および免疫蛍光が含まれる。
一定の手順では、ＣＭＶ特異的抗体を標識する。標識を、直接検出することができるか（放射性標識および蛍光色素など）、検出されるように反応するか誘導体化されるべき部分（酵素など）であり得る。同位体標識の例は、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、および３５Ｓである。使用することができる蛍光物質には、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、オーラミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリア、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチーム、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。
酵素標識を、現在使用されている比色分析技術、分光測定技術、蛍光分光測定技術、またはガス定量技術のいずれかによって検出することができる。これらの手順で使用することができる多数の酵素は公知であり、これらを使用することができる。例は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、および酸性ホスファターゼである。
公知の方法によって抗体をかかる標識でタグ化することができる。例えば、カップリング剤（アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミダート、スクシンイミド、およびｂｉｄジアゾ化ベンザジンなど）を使用して、上記蛍光標識、化学発光標識、および酵素標識で抗体をタグ化することができる。酵素を、典型的には、カルボジイミド、過ヨウ素酸塩、ジイソシアナート、およびグルタルアルデヒドなどの架橋分子を使用して抗体と組み合わせる。種々の標識技術は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２ｂ，１０３（１９７４），Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４，３７６２（１９７３）およびＢｏｌｔｏｎ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１３３，５２９（１９７３）に記載されている。
本発明のＣＭＶ特異的抗体は、本明細書中に提供した代表的なアッセイを使用して、ＣＭＶ感染患者と非感染患者とを区別し、患者が感染しているかどうかを決定することができる。１つの方法に従って、ＣＭＶ感染を有する疑いがあるか、有することが知られている患者から生物サンプルを得る。好ましい実施形態では、生物サンプルには、患者由来の細胞が含まれる。サンプルを、例えば、ＣＭＶ特異的抗体をサンプル中に存在する感染細胞に結合させるのに十分な時間および条件下でＣＭＶ特異的抗体と接触させる。ＣＭＶ特異的抗体の結合量を決定し、コントロール値と比較する。このコントロール値は、例えば、所定の値または正常な組織サンプルから決定された値であり得る。コントロールサンプルと比較した患者サンプルへの抗体の結合量の増加は、患者サンプル中の感染細胞の存在を示す。
関連する方法では、患者から得た生物サンプルを、抗体を感染細胞に結合させるのに十分な時間および条件下でＣＭＶ特異的抗体と接触させる。次いで、結合した抗体を検出し、結合抗体の存在は、サンプルが感染細胞を含むことを示す。この実施形態は、ＣＭＶ特異的抗体が検出可能なレベルで正常細胞に結合しない場合に特に有用である。
一定の実施形態では、感染細胞に結合する抗体は、好ましくは、少なくとも約２０％の感染患者、より好ましくは少なくとも約３０％の患者で感染の存在が検出されることを示すシグナルを生成するであろう。あるいはまたはさらに、抗体は、少なくとも約９０％の非感染個体で感染の非存在が検出されることを示す負のシグナルを生成するであろう。各抗体は上記基準を満たすべきである。しかし、当業者は、本発明の抗体を組み合わせて使用して感度を改良することができると認識するであろう。
本発明はまた、本発明の抗体を使用した診断アッセイおよび予後診断アッセイの実施で有用なキットを含む。これらのキットは、標識形態または非標識形態の１つまたは複数の本発明のＣＭＶ特異的抗体を含む適切な容器を含むであろう。さらに、抗体を間接的な結合アッセイに適切な標識形態で供給する場合、キットは、さらに、適切な間接的アッセイの実施に有用な試薬を含むことができる。例えば、キットは、標識の性質に応じて、酵素基質または誘導体化剤を含む１つまたは複数の適切な容器を含むことができる。コントロールサンプルおよび／または説明書も含めることができる。
治療での使用
本発明のＣＭＶ特異的抗体およびそのフラグメントは、正常なコントロール非感染細胞および組織と比較して、感染細胞に特異的に結合するか、優先的に結合する。したがって、これらのＣＭＶ特異的抗体を使用して、患者中の感染細胞または組織、生物サンプル、または細胞集団を選択的にターゲティングすることができる。これらの抗体の感染特異的結合性を考慮して、本発明は、感染細胞の増殖を調節（例えば、阻害）する方法、感染細胞を死滅させる方法、および感染細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。これらの方法は全て、感染細胞を本発明のＣＭＶ特異的抗体に接触させる工程を含む。これらの方法をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。
本発明の薬学的組成物を、標的の患者集団（非常に高齢および若い免疫無防備状態の対象（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、別の免疫抑制疾患、または免疫系が不十分になるか、もしくは損なわれる遺伝的障害の対象）、移植レシピエント（全臓器、組織、特に、造血幹細胞集団または骨髄の移植または置換を受けた患者が含まれる）、免疫抑制療法を受けた対象（例えば、関節炎、移植片拒絶、および癌などの容態のために薬物投与された対象）、およびＣＭＶへの曝露またはＣＭＶ感染のリスクのあるＣＭＶ陰性の妊婦（ＣＭＶはこれらの対象を通過して胎児に到達し、全出生児のほぼ１％で聴覚消失および認知障害を引き起こす）が含まれるが、これらに限定されない）に投与する。
種々の実施形態では、抗体はそれ自体が本質的に治療活性を示し、および／または抗体を、抗体が結合した感染細胞の治療で有用な細胞毒性薬または増殖阻害剤（例えば、放射性同位体または毒素）に抱合する。
１つの実施形態では、本発明は、ＣＭＶ感染症と判断された患者、発症リスクのある患者、または有する疑いのある患者に本発明のＣＭＶ特異的抗体を投与する工程を含む、患者の感染症を治療または防止する方法を提供する。本発明の方法を、感染の一次治療、その後の治療、または再発性もしくは軟治性の感染の治療で使用することができる。本発明の抗体を使用した治療は単独治療であり得るか、患者を治療するために１つまたは複数のさらなる治療薬も使用される併用療法レジメンの１つの構成要素または段階であり得る。
ヒトまたは非ヒト患者のｉｎ ｖｉｖｏ治療のために、患者に、通常、本発明のＣＭＶ特異的抗体を含む薬学的処方物を投与する。ｉｎ ｖｉｖｏ療法のために使用する場合、本発明の抗体を、治療有効量（すなわち、患者のウイルス負荷を消失または減少させる量）で患者に投与する。静脈内投与（例えば、長期間にわたるボーラス注入または連続注入として）、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路などの公知の方法に従ってヒト患者に抗体を投与する。抗体を、可能であれば標的細胞部位に非経口投与するか静脈内投与することができる。抗体の静脈内または皮下投与が一定の実施形態で好ましい。
非経口投与のために、抗体を、薬学的に許容可能な非経口ビヒクルと組み合わせた単位投薬注射形態（溶液、懸濁液、乳濁液）で処方することができる。かかるビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。非水性ビヒクル（固定油およびオレイン酸エチルなど）も使用することができる。キャリアとしてリポソームを使用することができる。ビヒクルは、等張性および化学的安定性を強化する物質などの少量の添加物（例えば、緩衝液および防腐剤）を含むことができる。抗体を、典型的には、かかるビヒクル中で約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で処方するであろう。
用量および投薬レジメンは、医師によって容易に決定される種々の要因（感染性および抗体に抱合した特定の細胞毒性薬または増殖阻害剤（使用する場合）の特性（例えば、その治療指数）、患者、および患者の病歴など）に依存するであろう。一般に、治療有効量の抗体を患者に投与する。特定の実施形態では、抗体の投与量は、典型的には、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲であろう。感染の型および重症度に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体は、例えば、１つまたは複数の個別投与または連続注入のいずれかによる患者への投与のための最初の候補投薬量であり得る。この療法の進行を、従来の方法およびアッセイならびに医師または他の当業者に公知の基準に基づいて容易にモニタリングすることができる。
１つの特定の実施形態では、細胞毒性薬と抱合した抗体を含む免疫抱合体を患者に投与する。好ましくは、免疫抱合体が細胞に内在化され、それにより、免疫抱合体が結合する細胞の死滅における免疫抱合体の治療有効性が増加する。１つの実施形態では、細胞毒性薬は、感染細胞中の核酸をターゲティングするか干渉する。かかる細胞毒性薬の例は、上に記載されており、マイタンシノイド、カリチアマイシン、リボヌクレアーゼ、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
他の治療レジメンを、本発明のＣＭＶ特異的抗体の投与と組み合わせることができる。併用投与には、個別の処方物または単一の薬学的処方物を使用した同時投与およびいずれかの順序の連続投与が含まれ、好ましくは、両方（または全て）の活性薬剤がその生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。好ましくは、かかる併用療法により、相乗的な治療効果が得られる。
一定の実施形態では、本発明の抗体の投与を感染因子に関連する別の抗原に指向する別の抗体と組み合わせることが望ましい。
患者への抗体タンパク質の投与を除いて、本出願は、遺伝子療法による抗体の投与を意図する。抗体をコードする核酸のかかる投与は、表現「治療有効量の抗体の投与」に含まれる。例えば、細胞内抗体を生成するための遺伝子療法の使用に関するＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９６／０７３２１号を参照のこと。
本明細書中で言及し、そして／または出願データシートに列挙した上記の全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
（実施例１）
抗ＣＭＶ抗体の産生
ＣＭＶに特異的なヒトモノクローナル抗体を、下記のように組換え的に産生した。
８９のヒト血漿サンプルを、アミノ酸配列ＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＴＴＧＴＮＴＴＫ（配列番号３１）を有するＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２部位に対応するポリペプチドを使用し、ＥＬＩＳＡによってＣＭＶ抗体の存在についてスクリーニングした。試験した２つの血漿サンプルが陽性であり、これは、抗ＣＭＶ ｇｐ１１６抗体の存在を示す。
ＰＢＭＣを、ＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２に対して高ＩｇＧ力価を有するドナー血液サンプルから得た。ＣＤ１９＋細胞を富化し、ビオチン化形態のＣＭＶ ｇｐ１１６ＡＤ２ペプチドと混合し、抗原特異的Ｂ細胞をストレプトアビジンコーティングしたマイクロビーズを使用して富化した。これらの抗原選択性Ｂ細胞を、１細胞／ウェルを超える密度でマイクロタイター皿にプレートし、Ｂ細胞の増殖および活性化を好む条件下（例えば、Ｂ細胞***促進因子（リポ多糖（ＬＰＳ）またはＣＤ４０リガンドなどの存在下）で培養して、抗体産生Ｂ細胞を生成した。次いで、Ｂ細胞から得た細胞上清を、ＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２に結合する抗体の存在について試験し、それにより、抗原特異的抗体を産生するＢ細胞を含む１１ウェルを同定した。
抗原特異的抗体の抗原結合領域を含む組換え抗体を、ｐｃＤＮＡ３．１＋発現ベクターへの抗体鎖の可変領域をコードするＤＮＡのサブクローニングによって産生した。一過性トランスフェクションを２９３ＦＴ細胞中で行い、これらの抗体を再構成し、組換えによって産生した。次いで、組換え的に産生した抗体を、ＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２に結合する能力について試験し、この抗原に結合した７つの組換えＩｇＧを同定した。その後に、２つのさらなる抗ＣＭＶ抗体をこれらの同一の方法に従って生成した。抗体の結合親和性を、表１に示すように決定した。
抗体の配列（２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１，４Ｐ１２、５Ｐ９、９Ｃ１６と指定した抗体のγ重鎖およびκ軽鎖の可変領域の配列が含まれる）を決定した。さらに、抗体配列をコードする各ポリヌクレオチド配列を決定した。可変領域のＮ末端（または５’末端）に太字で示したシグナルペプチドおよびＣ末端（または３’末端）に太字で示した定常領域と共にγ重鎖およびκ軽鎖のポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列を以下に示す（プレーンテキストで示す）。
（実施例２）
保存された抗体可変領域の同定
図１Ａおよび１Ｂに示すように、実施例１に記載のように産生した７つの抗体のκ軽鎖およびγ重鎖可変領域のアミノ酸配列をアラインメントし、保存された領域および残基を同定した。
生成された抗ＣＭＶ抗体の可変領域は高度に保存されていた。例えば、３Ｃ２１および４Ｐ１２と指定した抗体は、重鎖可変領域が同一であり、κ軽鎖中でたった１つのアミノ酸が相違し、４Ｐ１２配列が生殖系列に適合するので、その相違はＰＣＲのアーティファクトと考えられる。５Ｐ９γ鎖は３Ｇ７γ鎖と同一であり、３Ｃ２１および４Ｐ１２のγ鎖由来のＣＤ３内に１つのアミノ酸相違を有していた。５Ｐ９κ鎖は、５Ａ１１、３Ｃ２１、および４Ｐ１２のκ鎖と密接に適合した（１アミノ酸相違）（後者の２つの鎖は、Ｄ／Ｅスイッチを除いて相互に同一である）。９Ｃ１６γ鎖は２Ｍ１６γ鎖に最も類似し、９Ｃ１６κ鎖は２Ｎ９κ鎖に最も類似した（たった２つのアミノ酸の相違）。３Ｇ７κ鎖は他（５Ｐ９が含まれる）と非常に異なり、観察された結合が重鎖に起因することが示唆された。
これらのデータは、ＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２に特異的に結合する抗体の高度に保存された性質を証明しており、かかる特異性に重要な抗体領域が同定される。
（実施例３）
ＣＭＶへの組換え抗体の結合
組換え抗体２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１、３Ｇ７、４Ｐ１２、および５Ｊ１２を、２９３ＰＥＡＫ細胞における大量一過性トランスフェクションによってｍｇ単位で産生し、ＥＬＩＳＡによってプレート上にコーティングしたＵＶ不活化ＣＭＶウイルスに結合する能力について試験した。抗体の結合能力を、競合ＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２ペプチドの非存在下および存在下で試験し、ＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２にも結合するコントロール抗体ＩＴＣ８８の結合とも比較した（Ｏｈｌｉｎ ら、１９９３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：７０３−７１０）。
二次ＨＲＰ抱合抗ヒト抗体を、検出試薬として使用した。
図２〜８に示すように、２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１、および４Ｐ１２抗体はそれぞれＣＭＶに結合し、ＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープＡＤ２ペプチドと競合した。これらのデータは、ＣＭＶ ｇｐ１１６エピトープに対して生成されたヒト組換え抗体がＣＭＶウイルスにも特異的に結合することができることを証明している。
（実施例４）
組換え抗体によるＣＭＶの中和
組換え抗体２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１、３Ｇ７、４Ｐ１２を、ｈＣＭＶウイルスと各抗体との混合およびその後の細胞に感染させるための混合物の使用によってｈＣＭＶを阻害する能力について試験した。次いで、総細胞に対する感染細胞の比を、抗体濃度の関数としてプロットした。総細胞核をＹＯＹＯ−１での染色によって計数し、細胞の透過および１−Ｋ−１０（マウスＩｇＧ２ａ；Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）と指定したモノクローナル抗体（これは、次いで、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（ＡＦ）６４７抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して検出される）とのＣＭＶ最初期抗原の結合の決定によってｈＣＭＶ感染核を決定した。コントロール抗体ＩＴＣ８８も各実験で使用した。
図９〜１４に示すように、２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１、および４Ｐ１２抗体は、それぞれ、コントロールＩＴＣ８８抗体と類似のレベルまでｈＣＭＶを阻害した。これらのデータは、ＣＭＶ ｇｐ１１６ＡＤ２エピトープに対して生成されたヒト組換え抗体がＣＭＶウイルスを中和することができることを証明している。
（実施例５）
ＨＣＭＶ抗体の中和能力および範囲：実験デザインおよび一般的方法
ＣＭＶは、広範なヒト細胞型に侵入することができる。最近、ＣＭＶ糖タンパク質−宿主受容体相互作用は細胞型によって異なることが報告されている。しかし、ＣＭＶが全ての細胞型に侵入する能力に関する中心的課題は、糖タンパク質ｇＢ複合体（タンパク質ｇｐ５８およびｇｐ１１６から構成される）の宿主細胞受容体との相互作用である。
一連の抗ＨＣＭＶ抗体を、実施例１に記載のように、数人の健康なヒトボランティアからの採血およびその後のＢ細胞の回収および刺激を含む手順によって生成した。分泌型ＩｇＧを、ｇＢのアミノ末端内のＡＤ２エピトープに対する反応性について試験した。重鎖および軽鎖を、ＡＤ２結合ＩｇＧを発現するＢ細胞からクローン化した。各抗体についての結合親和性を決定した。
全ての試験した抗体は、ウイルス株や感染細胞型と無関係にＣＭＶ侵入を強力に中和した。これはモルモットＣＭＶ感染と対照的であり、予想通り、中和抗体では効果がなかった。ＨＣＭＶ ｇＢ対ＧＰＣＭＶ ｇＢの抗ＨＣＭＶ抗体の特異性は、抗体結合の有効性に影響を及ぼすこれらのタンパク質内の多様な配列に起因する（表３）。下記のデータは、このＣＭＶ中和抗体組のさらなる試験および他のＣＭＶ糖タンパク質複合体のターゲティングを支持する。
材料と方法
抗体
抗体２Ｎ９、５Ｐ９、２Ｆ１０、４Ｐ１２、２Ｍ１６、およびＩＴＣ８８を、上記の方法を使用して得た。抗体ｇＨ（１）は、基準中和抗糖タンパク質Ｈ抗体である。Ｃｙｔｏｔｅｃｔ（商標）は、Ｃｈｏｎｇ Ｌａｐ（Ｈ．Ｋ．）ＣＯ．ＬＴＤ製の市販のＣＭＶ治療薬である。
ウイルス
ＨＣＭＶ ＶＲ１８１４株を、妊婦の頚部分泌物から得た。３つの臨床ＨＣＭＶ分離株８８１８、８８１９、および８８２４を、感染患者の痰，気管支肺胞洗浄物、および肺組織からそれぞれ単離し、内皮細胞株ＡＲＰＥ−１９中で増殖させた。モルモットＣＭＶ Ｖ５４５／８２株を、Ｍａｒｋ Ｓｃｈｌｅｉｓｓから入手し、これはＧＦＰレポーター遺伝子を含む（ＭｃＧｒｅｇｏｒ Ａ．ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｉｓｓ Ｍ．Ｒ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ７２（１）：１５−２６）。
細胞株
これらのアッセイで使用した細胞株は、ヒト由来上皮細胞株ＡＲＰＥ−１９（網膜色素上皮細胞、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２３０２）、ヒト由来線維芽細胞株ＮＮ−ＮＨＤＦ（新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞、Ｌｏｎｚａカタログ番号ＣＣ−２５０９）、ヒト由来内皮細胞株ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞、Ｌｏｎｚａカタログ番号ＣＣ−２５１７）、およびモルモット由来線維芽細胞株ＪＨ４（モルモット肺線維芽細胞ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−１５８）である。
侵入アッセイ
ＡＲＰＥ−１９、ＮＮ−ＮＨＤＦ、ＨＵＶＥＣ、およびＪＨ４細胞を、８×ｌ０３細胞／ウェルの濃度で１００μｌの増殖培地を含む９６ウェルプレートに播種した。ＡＲＰＥ−１９細胞を完全ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で増殖させ、ＮＮ−ＮＨＤＦ細胞を完全ＤＭＥＭで増殖させ、ＨＵＶＥＣ細胞をＥＧＭ−２培地で増殖させ、ＪＨ４細胞をＦ−１２Ｋ培地で増殖させた。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、増殖培地を除去し、ウェルあたり１００μｌの無血清培地で各ウェルを３回洗浄することによって細胞を最初に感染させた。ＡＲＰＥ−１９細胞をＳＦ−ＤＭＥＭ／Ｆ−１２で洗浄し、ＮＮ−ＮＨＤＦ細胞をＳＦ−ＤＭＥＭで洗浄し、ＨＵＶＥＣ細胞をＥＢＭ−２で洗浄し、ＪＨ４細胞をＳＦ−Ｆ−１２Ｋ培地で洗浄した。抗体を、各細胞株（上記を参照のこと）について無血清培地で連続希釈し、９６ウェル中で５０％の細胞を感染させるのに十分なウイルスと混合し、３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。ウェルを、３連の５０μｌ／ウェルの体積のウイルス／抗体混合物の添加によって感染させた。ＡＲＰＥおよびＨＵＶＥＣのプレートを、３７℃および５％ＣＯ２で３時間インキュベートし、ＮＮ−ＮＨＤＦおよびＪＨ４のプレートを３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。ウイルス／抗体含有培地を除去し、ウェルをウェルあたり１００μｌの適切な完全培地（上記を参照のこと）で３回洗浄した。最終洗浄液は除去されなかった。プレートを３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
ＶＲ１８１４および臨床ＨＣＭＶ分離株のＩＥ染色
培地を除去し、細胞を１００μｌ／ウェルの４％パラホルムアルデヒドにて室温（ＲＴ）で２０分間固定した。次いで、パラホルムアルデヒドを除去し、細胞を１００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ−ＧＣで２０００倍希釈した５０μｌのマウス抗ＣＭＶ ＩＥ抗体を添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。
ＩＥ抗体を除去し、ウェルを１００μ１／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ−ＧＣで２０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗マウス抗体とＰＢＳ−ＧＣで５０００倍希釈したＤＡＰＩとの混合によって同一工程で５０μｌの二次抗体および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を各ウェルに添加した。プレートを、暗所にてＲＴで１時間インキュベートした。二次抗体を除去し、ウェルを１００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。３回目の洗浄液は除去されなかった。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＶＴＩハイコンテント画像化プラットフォームにてプレートを読み取った。
ＧＰＣＭＶの染色
培地を除去し、細胞を１００μｌ／ウェルの４％パラホルムアルデヒドにてＲＴで２０分間固定した。次いで、パラホルムアルデヒドを除去し、細胞を、１００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルに、ＰＢＳ−ＧＣで５０００倍希釈した５０μｌのＤＡＰＩを添加した。プレートを、暗所にてＲＴで１０分間インキュベートした。ＤＡＰＩを除去し、ウェルを１００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。３回目の洗浄液は除去されなかった。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＶＴＩハイコンテント画像化プラットフォームにてプレートを読み取った。
分析
中和アッセイ由来のデータを、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＶＴＩハイコンテント画像化プラットフォームを使用して回収した。プレートを透明な粘着プレートシールでシールし、ロボットアームによってロードした。ＶＲ１８１４およびＨＣＭＶ臨床分離株を感染させたプレートを、標的活性化プロトコールＮＢ−ＴＡ−２ＣＨ（ウェルあたり１０００個の対象物を計数）を使用して分析した。ＧＰＣＭＶを感染させたプレートを、分子移行プロトコールＮＢ−ＭＴ−モルモットＣＭＶ（ウェルあたり１０００個の対象物を計数）を使用して分析した。ウェルあたりのＣＭＶ陽性細胞数（ウイルスに応じてＩＥまたはＧＦＰのいずれかによって検出）をウェルあたりの細胞数で割り、１００を掛けることによって％感染性を計算した。各希釈物についての相対％感染性を、抗体を含まない（ウイルスのみ）ウェルの％感染性を取り、これを各抗体の各希釈物の％感染性で割り、これに１００を掛けることによって計算した。相対％感染性をμｇ／ｍｌ単位の抗体濃度に対してグラフ化し、最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を、ウイルスのみのコントロール中で認められた感染ウイルスの５０％が中和される抗体濃度として決定する（５０％相対感染性）。
まとめ
ここに示したデータは、ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ上のＤＬＤのＡＤ−２領域をターゲティングする６つの抗体がヒト由来線維芽細胞株、上皮細胞株、および内皮細胞株へのＨＣＭＶの侵入を中和することができることを示す。各抗体のＩＣ５０は、ＶＲ１８１４を感染させた３つ全ての細胞株の間で一致し、細胞株と無関係の侵入中和能力を示す。これらの抗体は３つの低継代数のＨＣＭＶ臨床分離株のＮＮ−ＮＨＤＦへの侵入を中和することもでき、各抗体間で中和能力の相違はほとんど認められなかった。この効果は、ＨＣＭＶの８８１９臨床分離株を感染させたＨＵＶＥＣ細胞およびＡＲＰＥ−１９細胞でも認められる。試験した抗体は、モルモット線維芽細胞株ＪＨ４へのＧＰＣＭＶ侵入を中和することができなかった。しかし、ＧＰＣＭＶ ｇＢとＨＣＭＶ ｇＢとの間でこのタンパク質のＡＤ−２領域の配列多様性が非常に高いので、これは予想外ではない。全ての抗ＨＣＭＶ ｇＢ抗体は、効力が有意に異なることなく３つ全てのヒト由来細胞株に対して試験した全てのＨＣＭＶウイルス株を一貫して中和した。
（実施例６）
ＨＣＭＶ抗体はヒト上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、および線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来のＶＲ１８１４感染を強く中和する
抗ＨＣＭＶ抗体を３０〜０．００３μｇ／ｍｌの範囲の希釈度で試験し、この抗体は３つ全ての細胞型のＨＣＭＶ ＶＲ１８１４感染を中和することができた（図１５）。記録されたＩＣ５０は０．３５〜１．７３μｇ／ｍｌであり、これはポジティブコントロールｇＨ（１）に匹敵した。各抗体間で中和能力の相違はほとんど認められなかった。６つ全ての抗体は、ＩＣ５０が有意に変動することなく、全ての細胞株において一貫したＶＲ１８１４の中和を示した。
（実施例７）
ＨＣＭＶ抗体はＨＣＭＶ臨床分離株８８１８、８８１９、および８８２４の線維芽細胞感染を強く中和する
抗ＨＣＭＶ抗体を、３０〜０．００３μｇ／ｍｌの範囲の希釈度で試験し、この抗体はＨＣＭＶ臨床分離株８８１８、８８１９、および８８２４の線芽細胞感染を中和することができた（図１６）。記録されたＩＣ５０は０．１９〜０．８３μｇ／ｍｌであり、これは、ｇＨ（１）についてのＩＣ５０のシフト（より高い方向）を示した臨床分離株８８２４を除いてポジティブコントロールｇＨ（１）に匹敵した。各抗体間で相違はほとんど認められなかった。６つ全ての抗体は、ＩＣ５０が有意に変動することなく、線維芽細胞の３つ全ての臨床分離株感染の一貫した中和を示す。
（実施例８）
ＨＣＭＶ抗体はＨＣＭＶ臨床分離株８８１９の内皮（ＨＵＶＥＣ）および上皮（ＡＲＰＥ−１９）感染を強く中和する
臨床分離株８８１８および８８２４は内皮細胞および上皮細胞の感染に完全に適応しているわけではないので、現在、ＨＵＶＥＣ細胞およびＡＲＰＥ−１９細胞感染の統計的有意差を測定するには十分に高い力価ではない。したがって、８８１９のみをこれらの細胞型に対して使用した。抗ＨＣＭＶ抗体を３０〜０．００３μｇ／ｍｌの範囲の希釈度で試験し、この抗体は、ＨＣＭＶ臨床分離株８８１９の上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）および内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）感染を強く中和することができた（図１７）。記録されたＩＣ５０は０．１９〜０．８３μｇ／ｍｌであり、これはポジティブコントロールｇＨ（１）に匹敵した。各抗体間で相違はほとんど認められなかった。６つ全ての抗体は、ＩＣ５０が有意に変動することなく、両細胞株に関して８８１９臨床分離株を一貫して中和した。ＨＵＶＥＣ細胞におけるいくつかのサンプルで認められた高い標準偏差は、少量の感染性ウイルスに原因がある。８８１９はＨＵＶＥＣに感染することができるにもかかわらず％感染性は低く、このことが相対％感染性をより変動しやすくしている。
（実施例９）
ＨＣＭＶ抗体はＪＨ４細胞へのＧＰＣＭＶ侵入を中和しない
抗ＨＣＭＶ抗体はＪＨ４細胞においてＧＰＣＭＶのＶ５４５／８２株を中和することができなかった（図１８）。抗ＨＣＭＶ抗体は、３００μｇ／ｍｌ（試験した最高濃度であった）まででＧＰＣＭＶ侵入に対する効果は認められなかった。ヘパリンは、ＪＨ４細胞へのＧＰＣＭＶ侵入を阻害することができる唯一の化合物であった。これらの抗体のＧＰＣＭＶ侵入の遮断の失敗は、ＧＰＣＭＶ ｇＢと試験した他のＨＣＭＶ分離株上のｇＢ配列との間の配列変動性が高いことに原因がある（表３）。
上記から、本発明の特定の実施形態を例示を目的として本明細書中に記載しているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の修正形態を得ることができると認識されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲を以外に制限されない。

Claims (14)

  1. 単離抗ＣＭＶ抗体であって、該抗体は、以下：
    （ａ）以下：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＧＩＨ（配列番号５７）を含むＶＨＣＤＲ１領域；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５８）を含むＶＨＣＤＲ２領域；
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）を含むＶＨＣＤＲ３領域；
    を含むＶＨ領域、および
    （ｂ）以下：
    （ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＳＩＲＡＴ（配列番号６４）を含むＶＬＣＤＲ２領域；
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ （配列番号６５）を含むＶＬＣＤＲ３領域；
    を含むＶＬ領域
    を含む、単離抗ＣＭＶ抗体。
  2. 単離抗ＣＭＶ抗体であって、該抗体は、
    （ａ）以下：
    （ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳ（配列番号６０）を含むＶＨＣＤＲ１領域；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＶＩＳＳＤＡＮＤＫＱ（配列番号６１）を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＧＴＣＳＧＧＮＣＹＳＧＬＩＤＹ（配列番号５９）を含むＶＨＣＤＲ３領域；
    を含むＶＨ領域、および
    （ｂ）以下：
    （ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＧＧＹＬＡ（配列番号４３）を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＳＩＲＡＴ（配列番号６４）を含むＶＬＣＤＲ２領域；
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号６５）を含むＶＬＣＤＲ３領域；
    を含むＶＬ領域、
    を含む、単離抗ＣＭＶ抗体。
  3. 配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖配列
    を含む、単離抗ＣＭＶ抗体。
  4. 前記抗体が、ＣＭＶウイルスの糖タンパク質ｂ（ｇＢ）エンベロープタンパク質のエピトープに結合する、請求項１、２、または３に記載の抗ＣＭＶ抗体。
  5. 請求項１、２、３、または４に記載の抗体を含む組成物。
  6. 抗ウイルス治療薬をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記抗ウイルス治療薬が、ガンシクロビル、ホスカルネット、シドフォビル、バルガンシクロビル、および静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）である、請求項６に記載の組成物。
  8. 第２の抗ＣＭＶ抗体をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
  9. 前記抗体が治療薬または検出可能な標識に作動可能に連結される、請求項１、２、３、または４に記載の抗体。
  10. 請求項５に記載の組成物を含む、対象のＣＭＶ感染を治療するための組成物。
  11. 前記組成物が、抗ウイルス治療薬とともに投与されることを特徴とする、請求項１０記載の組成物。
  12. 前記抗ウイルス治療薬が、ガンシクロビル、ホスカルネット、シドフォビル、バルガンシクロビル、および静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記組成物をＣＭＶ感染を中和するのに十分な用量で投与することを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
  14. 請求項１、２、３、または４に記載の抗体を含む診断キット。
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