CN114907475B - 一种抗甲型流感病毒m2抗原的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种抗甲型流感病毒M2抗原的纳米抗体及其应用，属于生物医学或生物制药技术领域。本发明提供的纳米抗体包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成，可以利用其制备抗甲型流感病毒的药物和/或阻断或抑制甲型流感病毒M2抗原的质子传导功能的药物。

Description

一种抗甲型流感病毒M2抗原的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，具体涉及一种抗甲型流感病毒M2抗原的纳米抗体及其在制备抗甲型流感病毒药物和/或阻断或抑制甲型流感病毒M2抗原的质子传导功能的药物中的应用，特别涉及一种基于截短的甲型流感病毒的M2蛋白的抗甲型流感病毒M2抗原胞外区的纳米抗体及其应用。
背景技术
流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的一种常见的急性呼吸道传染性疾病。流感病毒是一类致命的病毒，据世界卫生组织WHO报告，全球每年约有29万至65万人死于流感。M2蛋白是流感病毒的基质蛋白，是流感病毒的表面抗原之一，天然状态下呈四聚体形式在病毒包膜上形成pH质子门控通道，还可以与M1结合，为病毒出芽招募蛋白，直接影响到病毒在宿主细胞的复制，M2包括97个氨基酸，其胞外区(1-23位氨基酸)是主要的抗原表位区，跨膜区(24-42位氨基酸)四聚形成质子通道以维持病毒复制所需的酸性环境，胞内区一段螺旋(43-60位氨基酸)帮助稳定跨膜区四聚结构，其中M2的胞外区在不同亚型的流感病毒中高度保守。
流感病毒，尤其是甲型流感病毒因其致命性和流行性对人类社会稳定、经济繁荣以及生活质量造成严重不良影响，因此，流感的防控工作也显得十分重要。目前主要应对方法是疫苗和抗病毒药物，其中使用疫苗的防控方法需要世界卫生组织WHO每年预测下一年度流行的流感病毒亚型。然而甲型流感病毒存在多种亚型，并且传统疫苗主要基于HA和NA，其非常容易突变和漂移重组，从而产生一大批独特的病毒株，它们的致病性、传播力和引起国际大流行的能力都是未知的。通常使用的抗病毒药物为金刚烷胺和金刚烷乙胺，然而由于近年耐药突变株不断出现，也导致这些抗病毒药物严重的耐药性问题。因此亟需一种抗甲型流感病毒且能够有效避免耐药性问题的抗甲型流感病毒药物。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，在本发明的第一方面，提供一种抗甲型流感病毒M2抗原的纳米抗体，其包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的第二方面，提供一种编码第一方面提供的纳米抗体的核酸分子。
在某些实施方式中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列或由其组成，或者所述核酸分子的核苷酸序列为在高严谨条件下能够与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
在本发明的第三方面，还提供一种包含第二方面提供的核酸分子的表达载体。
在某些实施方式中，所述表达载体为将第二方面提供的核酸分子***选自pcoldII、pcold-sumo、pET-28a、pET-22b、pET-32a和pET-33b的载体中获得。
在本发明的第四方面，还提供一种包含第三方面提供的表达载体的宿主细胞，此类宿主细胞例如可为大肠埃希菌，优选E.coli Shuffle T7-B。
在本发明的第五方面，还提供第一方面提供的纳米抗体在制备用于检测样品中甲型流感病毒M2抗原或其含量的检测试剂盒、抗甲型流感病毒药物、以及阻断或抑制甲型流感病毒M2抗原的质子传导功能的药物中的应用。
在某些实施方式中，所述甲型流感病毒包括H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型、或其突变体(S31N)。
基于以上技术方案提供的纳米抗体基于在各种甲型流感病毒亚型(例如H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型、或其突变体(S31N))之间都保守的基质蛋白M2的胞外区免疫鲨鱼(例如条纹斑竹鲨)筛选获得，经试验证明该纳米抗体具有对甲型流感病毒基质蛋白M2的高特异性亲和能力，并且能够阻断或抑制甲型流感病毒基质蛋白M2的质子传导功能，因此本发发明提供的纳米抗体可以对抗不同亚型的甲型流感病毒(包括对抗病毒药物金刚烷胺和金刚烷乙胺产生耐药性的甲型流感病毒)感染，而且还可以用来检测样品中甲型流感病毒M2抗原或其含量。相对于传统抗体，本发明通过噬菌体展示技术和生物淘筛技术筛选获得的纳米抗体仅含重链可变区单域，没有Fc型结构域，因此分子量更小，从而能够穿透血脑屏障，利于成药。相对于羊驼源纳米抗体，鲨鱼源纳米抗体缺乏CDR2区，而包含两个超可变区域HV2和HV4，是迄今为止发现的能够识别抗原的最小结构单元。另外，本发明提供的纳米抗体的CDR3较传统抗体的CDR3区长，可以形成凸环结构，从而可以识别抗原的隐藏区，对甲型流感病毒M2抗原的亲和力及特异性更高，能够有效阻断或抑制生物体内复杂环境中的甲型流感病毒M2抗原的质子传导功能，实现抗不同亚型的甲型流感病毒的目的。并且，本发明提供的纳米抗体能在原核细胞中大量表达，可以大大缩减成药成本。
附图说明
图1示例性示出了不同克隆株的OD450值统计柱状图；
图2为表达的纳米抗体AM2H10-B的镍柱亲和层析纯化结果；
图3为纳米抗体AM2H10-B凝胶过滤层析纯化的谱图；
图4为纳米抗体AM2H10-B凝胶过滤层析纯化的SDS-PAGE鉴定图像；
图5为pull-down实验SDS-PAGE鉴定的结果；
图6为pull-down实验western blot鉴定的结果；
图7为质子流实验的测定结果，其中A幅表示不添加纳米抗体的对照体系中pH随时间的变化曲线，B幅表示向liposome-WT-K+中添加金刚烷胺前后pH随时间的变化曲线，C幅表示向liposome-WT-K+中添加纳米抗体AM2H10-B前后pH随时间的变化曲线，D幅表示向liposome-S31N-K+中添加金刚烷胺前后pH随时间的变化曲线，E幅表示向liposome-S31N-K+中添加纳米抗体AM2H10-B前后pH随时间的变化曲线；
图8为膜片钳实验的测定结果，其中A幅表示向liposome-WT-K+中添加金刚烷胺前后的电流-电压曲线，B幅表示向liposome-WT-K+中添加纳米抗体AM2H10-B前后的电流-电压曲线，C幅表示向liposome-S31N-K+中添加金刚烷胺前后的电流-电压曲线，D幅表示向liposome-S31N-K+中添加纳米抗体AM2H10-B前后的电流-电压曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。本发明提供了各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的公开内容不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例中所用序列均由吉尔生化(上海)有限公司合成，其中实施例1至实施例3中使用的M2抗原为截短的甲型流感病毒(H3N2亚型)M2抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(同专利文献CN111450243A中公开的氨基酸序列：MSLLTEVETP IRNEWGCRCN DSSDPLVVAASIIGILHLIL WILDRL)，为甲型流感病毒(H3N2亚型)M2抗原的第1-46氨基酸，记为M2(1-46)；实施例4至实施例6中使用的M2抗原为甲型流感病毒(H3N2亚型)M2抗原的第1-60氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(MSLLTEVETP IRNEWGCRCN DSSDPLVVAA SIIGILHLILWILDRLFFKC IYRFFEHGLK)，记为M2(1-60)；实施例5和实施例6中还验证了纳米抗体对M2(1-60)的突变体(S31N)的抑制作用。
实施例1：基于M2抗原的抗流感病毒纳米抗体文库的构建
该实施例的目的在于获得足够大库容的纳米抗体文库，用于筛选对M2抗原具有特异性的高亲和力纳米抗体，具体包括以下操作。
1.1、按照专利文献CN111450243A公开的方法将M2(1-46)组装到类膜模拟体系nanodisc中作为抗原，其中M2(1-46)的浓度为100μg/ml。
1.2、使用步骤1.1的抗原皮下免疫三只鲨鱼(购自海一水产养殖有限公司)侧鳍，两周一次，共免疫4次，刺激鲨鱼B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。
1.3、4次免疫结束后，分离鲨鱼脾脏细胞，用RNA提取试剂盒(购自QIAGEN公司)提取总RNA，按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX试剂盒(GIBICOL)说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。
1.4、以反转录的cDNA为模板，配制50μl PCR反应体系：rTaq(TAKARA)25μl、F引物(10μM)2μl、R引物(10μM)2μl、cDNA 2μl、ddH2O 19μl；并按照以下PCR反应程序进行PCR扩增：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；12℃∞。其中：
F引物为：CGTGGCCCAGGCGGCCATGGCCSMACGGSTTGAACAAACACC(SEQ ID NO：3)；
R引物为：GCTGGCCGGCCTGGCCWTTCACAGTCASARKGGTSCC(SEQ ID NO：4)。
扩增纳米抗体的重链可变区片段(长度为约350bp)并纯化，将纯化后的可变区片段构建到噬菌体展示载体pcomb 3XSS、或pMES4、或pMESy4(NTCC商购)中获得重组载体，将重组载体电转化至感受态细胞ER2738(NTCC商购)中，将电转化的感受态细胞ER2738涂布含Amp抗性的2YT平板中于37℃条件下摇床培养过夜，构建获得抗流感病毒纳米抗体文库并测定库容，最终得到库容大小为108的纳米抗体文库。
实施例2：基于M2抗原的抗流感病毒纳米抗体的筛选
2.1、纳米抗体文库的恢复：接种1ml的文库细胞(即上述实施例1获得的经电转成功的感受态细胞ER2738，作为纳米抗体文库)于100mL 2YT/Amp中在37℃条件下培养至OD600达0.5；加入辅助噬菌体M13 KO7(20:l感染复数，NTCC商购)，随后进行以下程序：37℃，静置30min后，220rpm培养45min；4℃，8000rpm离心5min；弃上清，加入100mL新鲜的2YT/Amp/kan培养基重悬沉淀，30℃培养过夜；4℃8000rpm离心5min，上清加入1/5体积的PEG-NaCl溶液，冰上静置2h沉淀噬菌体；4℃10000rpm离心20min，弃上清，沉淀用10mL PBS重悬，获得鲨鱼的纳米抗体噬菌体展示文库；取10μL测定噬菌体浓度，可达1011pfu，并分装噬菌体用于后期筛选。
2.2、纳米抗体的亲和筛选：
(1)将10μg/mL PBS溶液中的M2(1-46)抗原(已按照文献CN111450243A公开的方法组装到类膜模拟体系nanodisc中)按100μL/孔包被在96孔NUNC酶标板上，4℃孵育过夜，同时设立负对照。
(2)PBST(PBS中含有0.05％Tween-20)洗涤4次后，加入200μL PBS配制的3％脱脂牛奶，室温封闭2小时。2小时后，弃封闭液并用PBST清洗酶标板10次，拍干。
(3)每孔加入100μL免疫鲨鱼的纳米抗体噬菌体展示文库(上述步骤2.1获得，1011cfu)，37℃孵育1小时后用PBST洗5遍(下述第二、第三和第四轮筛选时分别洗8遍，10遍和15遍)，以洗掉不结合的噬菌体，加入100μL的甘氨酸-盐酸缓冲液(0.2M，pH 2.2)洗脱8-10min后，立即用100μL Tris-HCl(1M，pH 9.1)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染50mL生长至对数期的ER2738菌株进行扩增，用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度，完成第一轮筛选，获得一级筛选抗体库，用于下一轮筛选的纳米抗体噬菌体展示文库。
(4)重复步骤(3)，进行循环筛选，最终经过4轮筛选，即获得四级筛选抗体库。其中在第二、第三、和第四轮的筛选过程中，在酶标板中包被的M2(1-46)(已按照文献CN111450243A公开的方法组装至类膜模拟体系nanodisc中)浓度分别为5μg/mL，2.5μg/mL和1.25μg/mL。在循环筛选的过程中，阳性克隆不断被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中M2抗原特异抗体的目的。
2.3、噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆
从第三轮和第四轮筛选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑取95个克隆，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法(phage-ELISA)进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体操作包括以下步骤。
(1)用PBS(pH 7.4)将M2(1-46)抗原(已按照文献CN111450243A公开的方法组装至类膜模拟体系nanodisc中)稀释至2μg/mL，4℃包被96孔酶标板过夜。
(2)第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入200μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时。
(3)弃封闭液，PBST洗涤3次后，加入100μL噬菌体扩增液(2.0×1011cfu)，以另一不相关的纳米抗体表达克隆(例如：透明质酸酶的纳米抗体，B23，Immunoway)作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13 KO7噬菌体二抗(华安生物)100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显10min；加入100μL终止液(2M H2SO4)终止反应。
(4)用酶标仪(Thermo Scientific Multiskan FC)测定450nm处的吸收值。选取OD450值大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆，将阳性克隆孔的菌转摇在含有400μL的2YT培养基中以便进行测序。根据序列比对软件DNAMAN分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR3序列相同的克隆株视为同一克隆株，而其序列不同的克隆株视为不同克隆株。
经间接Phage Elisa初筛，与阴性对照比较，在随机挑选的95株克隆中筛选得到编号为A2E1、A2H1、A2C2、A2F2、A2H1、A2E9、A2NOF1、A2NOE4、A2NOA3、AM2C6、AM2E10、AM2H10、AM2G11的阳性克隆，如图1所示，示例性示出了这些阳性克隆的OD450值的结果，其中还示例性示出了阴性克隆A2B4和A2NOE5的OD450值的结果。对上述编号为AM2H10的阳性克隆表达的纳米抗体(即抗体重链可变区，将该纳米抗体命名为AM2H10-B)进行测序，该阳性克隆表达的纳米抗体AM2H10-B的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，对应的编码核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。对该纳米抗体AM2H10-B的重链可变区的结构进行分析，可知该纳米抗体AM2H10-B的重链可变区具有两个互补决定区(complementarity determining region，CDR)：CDRl和CDR3，和三个框架区(framework region，FR)：FR1、FR2和FR4，另外该纳米抗体还具有一个被切割成两个片段(HV2和HV4)的超变区(hypervariable region)，以及一个被切割成两个片段(FR3A和FR3B)的框架区，即其结构为：FR1-CDR1-FR2-HV2-FR3A-HV4-FR3B-CDR3-FR4，其中CDR1的氨基酸序列为：KS STCALGST(SEQ ID NO:7)，CDR3的氨基酸序列为：EARQQGCGLFATY IEGG(SEQ ID NO:8)。
实施例3：纳米抗体的诱导表达和纯化
将实施例2筛选获得的阳性克隆AM2H10所对应的纳米抗体AM2H10-B的编码核苷酸序列(SEQ ID NO：6)亚克隆至表达性的载体pcoldII(NTCC商购)，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌E.coli Shuffle T7-B(ATCC商购)中诱导表达获得纳米抗体，并对表达获得的纳米抗体进行纯化，具体包括以下步骤。
3.1、将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌E.coli Shuffle T7-B中后，从转化平板挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃200r/min摇床培养过夜。接种1mL的过夜菌种至500mL LB培养基中，37℃200r/min振荡培养到OD600值达到0.6-1时，加入0.5mM IPTG，16℃200r/min振荡培养24h。
3.2、高速离心收集菌体沉淀，反复冻融4至6次后超声彻底裂解菌体(工作2s、间歇6s，功率为40％)。随后将相对澄清的裂解液进行12000rpm高速离心，收获上清液，沉淀使用裂解buffer(20mM Tris，100mM NaCl)复溶，经镍柱亲和层系纯化和凝胶过滤层析纯化后，均获得了高纯度的纳米抗体。
结果如图2、3和4所示，其中图2所示从左到右的条带分别是：泳道M为标准蛋白分子，泳道1为菌体破碎液流过镍柱的穿出液，泳道2为30mmol咪唑洗涤的样品，泳道3为250mmol咪唑洗脱的蛋白样品。图3所示为凝胶过滤层析的谱图；图4所示为凝胶过滤层析的各峰经SDS-PAGE分析的结果，结果显示图3主峰的样品为高纯度纳米抗体；图2、图3和图4说明纳米抗体经过纯化后，其纯度可达到99％以上。
实施例4：pull-down实验验证纳米抗体与抗原相互作用
为了确定本发明纳米抗体与抗原的相互作用，该实施例利用上述实施例3获得的纳米抗体AM2H10-B与抗原做pull-down实验，其原理为：由于抗原组装至lioposome(脂质体)中，超速离心下会沉淀在离心管底部，若纳米抗体可与抗原相互作用，纳米抗体会随抗原一起沉淀。为排除磷脂对蛋白SDS-PAGE结果鉴定的影响，超速离心的沉淀样品经冰丙酮处理。该实施例具体包括以下步骤。
(1)将2mg大肠杆菌极性磷脂提取物(Escherichia coli polar lipid extract，购自Avanti Polar Lipids)和20nmol M2(1-60)(作为抗原)溶于1.1ml氯仿和甲醇的混合液(氯仿：甲醇＝1:1)，氮气吹成膜，750μL氯仿重新溶解，氮气再次吹膜后冻干过夜。用1mlPBS溶解冻干的膜，旋转溶解5h以上。旋转后的混合液在液氮和37℃之间反复冻融10次以上，再用200nm碳酸膜挤压21次，即得到组装至liposome的M2(1-60)抗原，命名为liposome-M2。
(2)将上述实施例3获得的纳米抗体AM2H10-B用PBS稀释至40μM，4℃7000rpm离心30min以去除样品中的不溶物质，上清与100μL上述步骤(1)获得的liposome-M2在4℃旋转孵育30min后，4℃7000rpm离心40min，上清吸出加蛋白loading buffer用于SDS-PAGE鉴定，沉淀用200μL PBS轻轻洗涤两次，再加200μL PBS重悬沉淀转移至1.5ml EP管，用于丙酮沉淀。
(3)将4×样品体积的-80℃预冷的丙酮加入上述步骤(2)的重悬液中，在-20℃孵育1h，13000g离心10min，弃去上清液，室温下空气干燥沉淀5min，将沉淀重悬于35μL PBS，加蛋白loading buffer用于SDS-PAGE鉴定。
图5示出了实施例3获得的纳米抗体pull-down鉴定的结果，其中M表示marker，1为liposome-M2样品，2为40μM纳米抗体，3为pull-down实验的上清，4为pull-down实验的沉淀。图5中明显可见沉淀中有清晰的纳米抗体条带，说明本发明纳米抗体与抗原有较明显的相互作用。这里需要解释的是，上清中的纳米抗体条带是因为纳米抗体与抗原的结合中，纳米抗体是远远过量的，与抗原反应的那部分随liposome-M2进入沉淀中，而过量的那部分仍以可溶蛋白的形式出现在上清中。为了进一步确定沉淀中的是纳米抗体而不是M2(1-60)，本实施例利用纳米抗体带his标签，而合成的M2(1-60)不带，做了Western blot实验来进一步佐证。如图6所示，其中M表示marker，1为40μM的纳米抗体，2为liposome-M2，3为pull-down实验的上清，4为pull-down实验的沉淀，可见只有含纳米抗体的样品产生印迹条带，该结果与图5结果一致，说明本发明纳米抗体确实与抗原M2(1-60)有相互作用。
实施例5：质子流实验验证纳米抗体功能
本实施例利用了M2抗原传导质子的功能，将M2(1-60)组装到liposome脂质体囊泡，囊泡内为强缓冲buffer，囊泡外为弱缓冲buffer，通过加盐酸改变囊泡外pH值，即提高囊泡外质子浓度，驱动M2通道开启，将囊泡外质子运输到囊泡内，导致囊泡外pH值先降(加浓盐酸)后升(M2传导质子)。若纳米抗体能阻断M2传导质子的功能，则导致囊泡外pH值下降后不再上升。该实施例中还将H3N2亚型的野生型M2(1-60)的突变体(S31N)组装到liposome脂质体囊泡，同步验证了纳米抗体AM2H10-B对突变体S31N(该突变体为金刚烷胺的主要耐药突变体)的抑制作用。为了防止囊泡内外电势差对M2传导质子的干扰，本实施例还将K+缬氨霉素一同组装到了liposome中。具体包括以下步骤。
(1)将20nmol M2(1-60)的野生型(WT)和突变体(S31N)分别与10mg大肠杆菌极性磷脂提取物(Escherichia coli polar lipid extract，购自Avanti Polar Lipids)及0.2nmol K+缬氨霉素溶于1.1ml氯仿和甲醇的混合液(氯仿：甲醇＝1:1)，氮气吹成膜，750μL氯仿重新溶解，氮气再次吹膜后冻干过夜。使用1ml强缓冲buffer(50mM Na2HPO4，50mM柠檬酸，122mM KCl，122mM NaCl，0.01％NaN3，pH 7.7)溶解冻干的膜，旋转溶解5h以上。旋转后的混合液在液氮和37℃之间反复冻融10次以上，再用200nm碳酸膜挤压21次，即得组装了M2(1-60)和K+缬氨霉素的liposome，分别命名为liposome-WT-K+和liposome-S31N-K+。
(2)将上述步骤(1)获得的样品经5ml HiTrap脱盐柱将囊泡外强缓冲buffer换成弱缓冲buffer(2mM Na2HPO4，2mM柠檬酸，122mM KCl，122mM NaCl，0.01％NaN3，pH 7.8)，1ml样品经过此步骤得到2ml囊泡内外缓冲能力不同的liposome-WT-K+或liposome-S31N-K+样品。对于对照组，加入4μL 1M HCl同时快速搅拌使囊泡外pH降至6.05左右来驱动M2传导质子，通过加20μL 500μM去耦剂CCCP(sigma)终止M2的质子传导。全程用pH计实时连续跟踪囊泡外pH值。对于加纳米抗体的实验组，在测pH之前，先加128μM金刚烷胺或纳米抗体(实施例3获得的纳米抗体AM2H10-B)到liposome-WT-K+或liposome-S31N-K+中，孵育5min，再进行同对照组一样的质子流检测。
结果如图7所示，其中A幅表示不添加药物(例如纳米抗体AM2H10-B)的对照组中pH随着时间的变化曲线，B幅表示向liposome-WT-K+中加入金刚烷胺后pH随着时间的变化曲线，C幅表示向liposome-WT-K+中加入纳米抗体AM2H10-B后pH随着时间的变化曲线，D幅表示向liposome-S31N-K+中加入金刚烷胺后pH随着时间的变化曲线，E幅表示向liposome-S31N-K+中加入纳米抗体AM2H10-B后pH随着时间的变化曲线。可见在没有加纳米抗体的对照组(A幅)中，囊泡外pH值在加了浓盐酸之后急剧下降，随后M2将质子传导至囊泡内，导致囊泡外pH值缓慢上升，理论上，如果纳米抗体对M2的功能有抑制作用，会观察到囊泡外的pH上升过程被抑制。图B、C中分别跟踪了与金刚烷胺和纳米抗体孵育后的liposome-WT-K+中的pH随时间的变化，可见针对H3N2亚型的野生型M2(1-60)，纳米抗体AM2H10具有与金刚烷胺相当的抑制效果。图D、E中分别跟踪了与金刚烷胺和纳米抗体孵育后的liposome-S31N-K+中的pH随时间的变化，可见纳米抗体AM2H10对金刚烷胺耐受的S31N突变体仍有抑制效果。
实施例6：膜片钳实验验证纳米抗体功能
为了定量检测纳米抗体对M2质子传导的阻断效果，本实施例利用M2是离子通道的性质，将M2(1-60)的野生型(WT)和突变体(S31N)分别组装到细胞尺寸大小的巨脂质体，用膜片钳的手段观察加药(例如本发明提供的纳米抗体)前后流经M2(1-60)通道的电流大小。为了更客观地评价本发明纳米抗体对M2的阻断效果，本实施例将其与M2商品化抑制剂金刚烷胺的效果进行了对比。具体包括以下步骤。
(1)将2mg M2(1-60)的野生型(WT)和突变体(S31N)分别溶于1ml氯仿，按40μL/管分装至1.5ml EP管，氮气吹膜，冻干过夜。同时，将80mg POPC(Avanti)溶于4ml去离子水，涡旋30min，氮气保护下超声处理10min至磷脂混合液呈半透明状态，加入4ml2×透析液(140mM NaCl，5.3mM KCl，0.5mM MgSO4，5.5mM glucose，15mM HEPES，pH 7.4)。每管用800μL磷脂溶液4℃旋转溶解冻干的样品8h，在400-600倍体积的透析液中透析70h，透析后的样品于4℃，159200g离心1h，所得沉淀重悬于80μL含5％乙二醇的15mM HEPES(pH 7.4)溶液。按每份15μL分装于干净的直径为18mm的圆形玻片，玻片用变色硅胶或无水氯化钙在干燥器中部分脱水3-6h后，贮于4℃冰箱。样品使用前用15μL透析液覆盖复水，并静置于底部放有湿润滤纸的封闭塑料小皿中过夜。
(2)将玻片放在测膜片钳专用的小皿中，在小皿中再加500μL巨脂质体透析液，在显微镜下操控膜片钳微管与巨脂质体接触，让巨脂质体与膜片钳微管形成GΩ级别的高阻抗封接，采用-160mV-160mV的ramp(电压斜坡)测量连续的电流-电压关系。
结果如图8所示，其中A、C幅表示阳性对照M2商品化抑制剂金刚烷胺的电流-电压曲线，B、D幅表示纳米抗体(实施例3制备的纳米抗体AM2H10-B)的电流-电压曲线(其中斜率指示通过M2的离子流大小，斜率越大，通过的离子越多；加药后相比加药前斜率降的越多说明药物作用效果越好)，从A、B幅可见流经野生型M2质子通道的电流对100nM金刚烷胺敏感，100nM纳米抗体AM2H10-B能将电流阻断90％，且纳米抗体AM2H10-B的阻断能力要强于金刚烷胺。此外，从C、D幅可见对于金刚烷胺耐受的S31N，纳米抗体AM2H10-B(1μM)仍能发挥一定的抑制作用。以上结果表明本发明纳米抗体能与甲型流感病毒及其变体的M2抗原结合，且能有效抑制M2抗原的质子传导功能。
综上实施例的结果，本发明获得一种具有抗甲型流感病毒M2抗原的纳米抗体，该纳米抗体与甲型流感病毒(例如H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型、或其突变体(S31N))的M2抗原有较强的特异性结合能力，并且能阻断和抑制甲型流感病毒M2的质子传导功能，能够用于制备抗甲型流感病毒的药物，并且基于该纳米抗体与甲型流感病毒的M2抗原有较强的特异性结合能力，还可以用来检测样品中甲型流感病毒M2抗原或其含量。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院合肥物质科学研究院
<120> 一种抗甲型流感病毒M2抗原的纳米抗体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu
35 40 45
<210> 2
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Phe Phe Glu His Gly Leu Lys
50 55 60
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtggcccag gcggccatgg ccsmacggst tgaacaaaca cc 42
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctggccggc ctggccwttc acagtcasar kggtscc 37
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Met Ala Gln Arg Leu Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys
1 5 10 15
Glu Ala Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Ser Ser Thr
20 25 30
Cys Ala Leu Gly Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr
35 40 45
Lys Lys Ala Asp Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Thr Lys Asn
50 55 60
Thr Ala Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Val Arg Val Glu
65 70 75 80
Asp Ser Gly Thr Tyr His Cys Glu Ala Arg Gln Gln Gly Cys Gly Leu
85 90 95
Phe Ala Thr Tyr Ile Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys Ala
100 105 110
Ala Gly Ala Ala
115
<210> 6
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggccatgg cccaacggct tgaacaaaca ccgacaacga caacaaagga ggcaggcgaa 60
tcactgacca tcaattgcgt cctaaaaagt tccacctgtg cattgggtag cacgtactgg 120
tatttcacaa aaaagggcgc aacaaagaag gcggacttat caactggcgg acgatactcg 180
gacacaaaga atacggcatc aaagtccttt tccttgcgaa ttagtgacgt aagagttgaa 240
gacagtggta catatcactg tgaagcccga caacagggat gtgggttatt tgccacctat 300
attgaaggag ggggcaccat tctgactgtg aaagcggccg gcgcggcc 348
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Lys Ser Ser Thr Cys Ala Leu Gly Ser Thr
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ala Arg Gln Gln Gly Cys Gly Leu Phe Ala Thr Tyr Ile Glu Gly
1 5 10 15
Gly

Claims (10)

1.一种抗甲型流感病毒M2抗原的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.一种编码权利要求1所述的纳米抗体的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
4.一种包含权利要求2或3所述的核酸分子的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其为将权利要求2或3所述的核酸分子***选自pcoldII、pcold-sumo、pET-28a、pET-22b、pET-32a和pET-33b的载体中获得。
6.一种包含权利要求4或5所述的表达载体的宿主细胞。
7.权利要求1所述的纳米抗体在制备用于检测样品中甲型流感病毒M2抗原或其含量的检测试剂盒中的应用。
8.权利要求1所述的纳米抗体在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。
9.权利要求1所述的纳米抗体在制备阻断或抑制甲型流感病毒M2抗原的质子传导功能的药物中的应用。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的应用，其中所述甲型流感病毒包括H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型、或其突变体S31N。
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