JP5543694B2 - Separation and collection method of biological materials - Google Patents
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Description
本発明は、樹脂のランダム形状化された微粒子及び凝集剤を用いて試料中の生体関連物質を分離回収する方法に関する。 The present invention relates to a method for separating and recovering a biological material in a sample using resin-shaped fine particles and an aggregating agent.
疾患の原因となる病原微生物又は細胞の検出、あるいは環境中に存在する微生物又は細胞の検出には、これらの微生物又は細胞が含まれる試料を回収してその回収物から検出目的とする微生物又は細胞を採取する必要がある。
しかしながら、試料から検出目的の微生物又は細胞を採取するには種々の試薬を加えて分離工程を経るため、一般には、試料を洗浄するのに遠心分離操作を行っている。また、試料が微量のときは、試料中から微生物又は細胞を採取することが困難である。したがって、試料から目的微生物又は細胞を検出するためには、これらを簡便かつ効率よく回収することが望まれる。
For detection of pathogenic microorganisms or cells that cause disease, or detection of microorganisms or cells present in the environment, a sample containing these microorganisms or cells is recovered, and the target microorganism or cell is detected from the collected material. Need to be collected.
However, in order to collect microorganisms or cells for detection from a sample, various reagents are added and a separation process is performed. Therefore, a centrifugal separation operation is generally performed to wash the sample. Moreover, when a sample is a very small amount, it is difficult to collect microorganisms or cells from the sample. Therefore, in order to detect the target microorganism or cell from the sample, it is desired to recover these easily and efficiently.
他方、試料中の微生物又は細胞を検出する方法として、古典的培養法、PCR法、染色後の顕微鏡検査法などが知られている。
しかしながら、微生物又は細胞を回収して検出するには、多くの時間を必要とし、また作業が煩雑であることが多かった。また、前処理したサンプルの純度が低いためにPCR等で遺伝子を増幅してもバックグラウンドが出てしまい、検出感度が低下することもあった。
However, it takes a lot of time to collect and detect microorganisms or cells, and the work is often complicated. Further, since the purity of the pretreated sample is low, a background is generated even if the gene is amplified by PCR or the like, and the detection sensitivity may be lowered.
そこで本発明は、検出目的物質を得るための前処理法として、効率良く試料中の生体関連物質（微生物又は細胞等）を回収する方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for efficiently recovering a biological substance (microorganisms or cells) in a sample as a pretreatment method for obtaining a target substance for detection.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、正又は負の電荷を有する樹脂の微粒子と凝集剤との組合せにより、効率よくかつ高純度で生体関連物質を試料から分離することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventor efficiently separates a biological material from a sample with high purity by combining a resin fine particle having a positive or negative charge and an aggregating agent. As a result, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）生体関連物質を吸着することができるランダム形状化された微粒子１と、該微粒子１と結合することができる微粒子２と、試料とを混合することを特徴とする、試料中の生体関連物質の分離方法。
（２） 生体関連物質を吸着することができる凝集剤１、及び/又は前記微粒子２と結合することができる凝集剤２をさらに混合するものである、（１）に記載の方法。
（３）生体関連物質を吸着することができるランダム形状化された微粒子１と、該微粒子１と結合することができる凝集剤２と、試料とを混合することを特徴とする、試料中の生体関連物質の分離方法。
（４）生体関連物質を吸着することができる凝集剤１をさらに混合するものである、（３）に記載の方法。
（５）生体関連物質を吸着することができる凝集剤１と、該凝集剤１と結合することができる微粒子２と、試料とを混合することを特徴とする、試料中の生体関連物質の分離方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) Randomly shaped fine particles 1 capable of adsorbing a biological substance, fine particles 2 capable of binding to the fine particles 1, and a sample are mixed, and the biological material in the sample Method for separating substances.
(2) The method according to (1), wherein the flocculant 1 capable of adsorbing a biological substance and / or the flocculant 2 capable of binding to the fine particles 2 are further mixed.
(3) A living body in a sample, characterized by mixing a randomly shaped fine particle 1 capable of adsorbing a biological substance, an aggregating agent 2 capable of binding to the fine particle 1, and a sample. Method for separating related substances.
(4) The method according to (3), wherein the flocculant 1 capable of adsorbing the biological substance is further mixed.
(5) Separation of the biological substance in the sample, characterized by mixing the flocculant 1 capable of adsorbing the biological substance, the fine particles 2 capable of binding to the flocculant 1, and the sample. Method.
（６） 前記微粒子２と結合することができる凝集剤２をさらに混合するものである、（５）に記載の方法。
（７）生体関連物質を吸着することができる凝集剤１と、該凝集剤１と結合することができる凝集剤２と、試料とを混合することを特徴とする、試料中の生体関連物質の分離方法。
（８）生体関連物質を吸着することができるランダム形状化された微粒子１と、該微粒子１と結合することができる微粒子２と、試料との混合物を、凝集剤で処理することを特徴とする、試料中の生体関連物質の分離方法。
（９）生体関連物質を吸着することができるランダム形状化された微粒子１と、試料との混合物を、凝集剤で処理することを特徴とする、試料中の生体関連物質の分離方法。
（１０）生体関連物質を吸着することができる凝集剤１と結合することができる微粒子２と、試料との混合物を、凝集剤で処理することを特徴とする、試料中の生体関連物質の分離方法。
(6) The method according to (5), wherein the flocculant 2 capable of binding to the fine particles 2 is further mixed.
(7) A flocculant 1 capable of adsorbing a biological substance, a flocculant 2 capable of binding to the flocculant 1, and a sample are mixed, and the biological substance in the sample is mixed Separation method.
(8) A mixture of randomly shaped fine particles 1 capable of adsorbing a biological substance, fine particles 2 capable of binding to the fine particles 1, and a sample is treated with a flocculant. And a method for separating a biological substance in a sample.
(9) A method for separating a biological substance in a sample, comprising treating a mixture of randomly shaped fine particles 1 capable of adsorbing the biological substance and the sample with a flocculant.
(10) Separation of a biological substance in a sample, characterized in that a mixture of the microparticles 2 capable of binding to the flocculant 1 capable of adsorbing the biological substance and the sample is treated with the flocculant. Method.
（１１）微粒子１がイオン交換樹脂製のものである（１）から（４）、（８）及び（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）微粒子１が、樹脂の粉砕物である（１）から（４）、（８）、（９）及び（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３） 微粒子１の粒径が１から１８０μmである（１）から（４）、（８）、（９）、（１１）及び（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）微粒子２がイオン交換樹脂製のものである（１）、（２）、（５）、（６）、（８）及び（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）微粒子２が磁性粒子である（１）、（２）、（５）、（６）、（８）、（１０）及び（１４）のいずれか１項に記載の方法。
(11) The method according to any one of (1) to (4), (8), and (9), wherein the fine particles 1 are made of an ion exchange resin.
(12) The method according to any one of (1) to (4), (8), (9) and (11), wherein the fine particles 1 are a pulverized product of resin.
(13) The method according to any one of (1) to (4), (8), (9), (11), and (12), wherein the particle diameter of the fine particles 1 is 1 to 180 μm.
(14) The method according to any one of (1), (2), (5), (6), (8) and (10), wherein the fine particles 2 are made of an ion exchange resin.
(15) The method according to any one of (1), (2), (5), (6), (8), (10) and (14), wherein the fine particles 2 are magnetic particles.
（１６） 微粒子２の粒径が０．１から５００μmである（１）、（２）、（５）、（６）、（８）、（１０）、（１４）及び（１５）のいずれか１項に記載の方法。
（１７） 凝集剤が高分子である（２）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）試料が痰、喀痰、血液、口腔洗浄液、胃液、胸腔洗浄液、環境水、家庭排水、工場排水、飲用水、食物等洗浄液、及び生体関連物質が存在し得る道具の洗浄液からなる群から選択される少なくとも１つである、（１）から（１７）のいずれか１項に記載の方法。
（１９） 生体関連物質が微生物もしくは細胞又は核酸である、（１）から（１８）のいずれか１項に記載の方法。
（２０） 微生物がマイコバクテリウム属に属する微生物である（１９）に記載の方法。
(16) One of (1), (2), (5), (6), (8), (10), (14), and (15), wherein the particle diameter of the fine particles 2 is 0.1 to 500 μm 2. The method according to item 1.
(17) The method according to any one of (2) to (16), wherein the flocculant is a polymer.
(18) The sample is composed of sputum, sputum, blood, mouth washing liquid, gastric juice, chest cavity washing liquid, environmental water, household drainage, industrial wastewater, drinking water, washing liquid such as food, and a washing liquid for a tool that may contain a biological substance. The method according to any one of (1) to (17), wherein the method is at least one selected.
(19) The method according to any one of (1) to (18), wherein the biological material is a microorganism, a cell, or a nucleic acid.
(20) The method according to (19), wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Mycobacterium.
（２１） 生体関連物質が負電荷であり、かつ、微粒子１及び/又は凝集剤が正電荷である、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２２）生体関連物質が正電荷であり、かつ、微粒子１及び/又は凝集剤が負電荷である、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２３） 沈殿物と液体成分との分離工程を行う（１）から（２２）のいずれか１項に記載の方法。
（２４） 磁気分離工程を行う（１）、（２）、（５）、（６）、（８）、（１０）及び（１４）から（２３）のいずれか１項に記載の方法。
（２５） （１）から（２４）のいずれか１項に記載の方法により分離した分離物から生体関連物質を採取することを特徴とする生体関連物質の回収方法。
(21) The method according to any one of (1) to (20), wherein the biological substance is negatively charged and the fine particles 1 and / or the flocculant is positively charged.
(22) The method according to any one of (1) to (20), wherein the biological substance is positively charged and the fine particles 1 and / or the flocculant is negatively charged.
(23) The method according to any one of (1) to (22), wherein a step of separating the precipitate and the liquid component is performed.
(24) The method according to any one of (1), (2), (5), (6), (8), (10), and (14) to (23), wherein the magnetic separation step is performed.
(25) A method for recovering a biological material, wherein the biological material is collected from the separated product separated by the method according to any one of (1) to (24).
（２６） （２５）に記載の方法により回収された生体関連物質を直接観察もしくは培養又は増幅することを特徴とする生体関連物質の検出方法。
（２７） 以下の性質又は機能を有する微粒子１、微粒子２、凝集剤１及び凝集剤２からなる群から選ばれる少なくとも２つ（微粒子１と凝集剤１との組合せ、及び微粒子２と凝集剤２との組合せを除く）を含む、生体関連物質の分離用、回収用、又は検出用キット。
(a) 微粒子１：ランダム形状化されている。生体関連物質を吸着することができる。微粒子２及び/又は凝集剤２と結合することができる。
(b) 微粒子２：微粒子１、凝集剤１及び凝集剤２の少なくとも１つと結合することができる。
(c) 凝集剤１：生体関連物質を吸着することができる。微粒子２及び/又は凝集剤２と結合することができる。
(d) 凝集剤２：微粒子１、微粒子２及び凝集剤１の少なくとも１つと結合することができる。
(26) A method for detecting a biological substance, characterized in that the biological substance collected by the method according to (25) is directly observed, cultured, or amplified.
(27) At least two selected from the group consisting of fine particles 1, fine particles 2, flocculant 1 and flocculant 2 having the following properties or functions (combination of fine particles 1 and flocculant 1, and fine particles 2 and flocculant 2) A kit for separating, recovering, or detecting a biological substance.
(a) Fine particles 1: Randomly shaped. A biological substance can be adsorbed. It can be combined with the fine particles 2 and / or the flocculant 2.
(b) Fine particles 2: Can bind to at least one of fine particles 1, flocculant 1 and flocculant 2.
(c) Flocculant 1: A biological material can be adsorbed. It can be combined with the fine particles 2 and / or the flocculant 2.
(d) Flocculant 2: Can bind to at least one of fine particles 1, fine particles 2 and flocculant 1.
本発明により、生体関連物質を分離回収する方法が提供される。
本発明によれば、生体関連物質が混在している試料から、生体関連物質を効率的にかつ高純度で分離・調製することができる。
According to the present invention, a method for separating and recovering a biological substance is provided.
According to the present invention, it is possible to efficiently separate and prepare a biological substance from a sample in which the biological substance is mixed.
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明者は、臨床サンプル等から目的の微生物又は核酸を増殖又は増幅させて検出する際、擬陽性又は擬陰性の検出結果を少なくするためにはどのようにすべきかを鋭意検討した。その結果、検出工程の前処理において効率良く目的の微生物等を分離することが重要であることを見出した。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The following embodiment is an example for explaining the present invention, and is not intended to limit the present invention only to this embodiment. The present invention can be implemented in various forms without departing from the gist thereof.
It should be noted that documents cited in the present specification, as well as published gazettes, patent gazettes, and other patent documents are incorporated herein by reference.
The present inventor diligently studied how to reduce the number of false positive or false negative detection results when a target microorganism or nucleic acid is grown or amplified from a clinical sample or the like. As a result, it was found that it is important to efficiently separate target microorganisms and the like in the pretreatment of the detection process.
本発明は、以下の性質又は機能を有する微粒子１、微粒子２、凝集剤１及び凝集剤２からなる群から選ばれる少なくとも２つ（微粒子１と凝集剤１との組合せ、及び微粒子２と凝集剤２との組合せを除く）と試料とを混合することにより、生体関連物質を分離、回収することを特徴とするものである。
(a) 微粒子１：ランダム形状化されている。生体関連物質を吸着することができる。微粒子２及び/又は凝集剤２と結合することができる。
(b) 微粒子２：微粒子１、凝集剤１及び凝集剤２の少なくとも１つと結合することができる。
(c) 凝集剤１：生体関連物質を吸着することができる。微粒子２及び/又は凝集剤２と結合することができる。
(d) 凝集剤２：微粒子１、微粒子２及び凝集剤１の少なくとも１つと結合することができる。
The present invention includes at least two selected from the group consisting of fine particles 1, fine particles 2, flocculant 1 and flocculant 2 having the following properties or functions (a combination of fine particles 1 and flocculant 1, and fine particles 2 and flocculant: 2) and a sample are mixed to separate and recover the biological substance.
(a) Fine particles 1: Randomly shaped. A biological substance can be adsorbed. It can be combined with the fine particles 2 and / or the flocculant 2.
(b) Fine particles 2: Can bind to at least one of fine particles 1, flocculant 1 and flocculant 2.
(c) Flocculant 1: A biological material can be adsorbed. It can be combined with the fine particles 2 and / or the flocculant 2.
(d) Flocculant 2: Can bind to at least one of fine particles 1, fine particles 2 and flocculant 1.
一般に、微生物はその表面が正又は負に荷電しているため、微生物を分離回収するための担体として反対荷電を有する樹脂が利用されている。本発明者は、この樹脂をランダム形状の微粒子として用いることにより、微生物が効率よく微粒子に吸着し、微生物と微粒子との会合体が沈殿することを見出した。さらに、本発明においては無電荷又は正若しくは負に荷電した微粒子であって磁性又は非磁性の微粒子も使用することができ、これらの微粒子と凝集剤との組合せ及び混合順序を調節することにより、さらに効率的に生体関連物質を分離させることを見出した。 In general, since the surface of a microorganism is positively or negatively charged, a resin having an opposite charge is used as a carrier for separating and collecting the microorganism. The present inventor has found that by using this resin as random-shaped fine particles, microorganisms are efficiently adsorbed to the fine particles, and aggregates of the microorganisms and the fine particles are precipitated. Furthermore, in the present invention, non-charged or positively or negatively charged fine particles and magnetic or non-magnetic fine particles can also be used. By adjusting the combination and mixing order of these fine particles and the flocculant, Furthermore, it discovered that a biological material was isolate | separated efficiently.
１．微粒子
本発明において微粒子として使用される担体の材質は液体試料に対して不溶性の材質であり、正若しくは負の電荷又は無電荷の性質を有する。そして、担体の材質は、液体試料の溶媒の種類等に応じて適宜選択することができる。
本発明においては、以下の性質又は機能を有する微粒子１及び/又は微粒子２が使用される。
(a) 微粒子１：
非磁性である。
ランダム形状化されている。
負電荷又は正電荷を持つ。
生体関連物質を吸着することができる。
微粒子２及び/又は凝集剤２と結合することができる。
(b) 微粒子２：
磁性又は非磁性である。
無電荷であるか、あるいは負電荷又は正電荷を持つ。
微粒子１、凝集剤１及び凝集剤２の少なくとも１つと結合することができる。
キレート効果を有する場合もある。
無機化合物からなる磁性粒子、又はガラスやアルミナであってもよい。
1. Fine particle The material of the carrier used as the fine particle in the present invention is a material insoluble in the liquid sample, and has a positive or negative charge or non-charge property. And the material of a support | carrier can be suitably selected according to the kind etc. of solvent of a liquid sample.
In the present invention, fine particles 1 and / or fine particles 2 having the following properties or functions are used.
(a) Fine particles 1:
Non-magnetic.
Randomly shaped.
Has negative or positive charge.
A biological substance can be adsorbed.
It can be combined with the fine particles 2 and / or the flocculant 2.
(b) Fine particle 2:
Magnetic or non-magnetic.
It is uncharged or has a negative charge or a positive charge.
It can be combined with at least one of the fine particles 1, the flocculant 1, and the flocculant 2.
It may have a chelating effect.
Magnetic particles made of an inorganic compound, or glass or alumina may be used.
担体の材質としては、例えば、スチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、トリブロモプロピルアクリレート、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合物、α，β−不飽和カルボン酸のエステル類又はアミド類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、低級脂肪酸ビニルエステル等のビニル系単量体の１種以上を重合して得られるポリマー；アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体；メチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質の架橋体；ガラス、セラミックス等の無機材料；鉄、シリコン等の金属；これらの複合材料等が挙げられる。
粒子は非膨潤性であることが好ましいが、膨潤性であってもよい。粒子表面は多孔質であっても無孔質であってもよいが、粒子表面が多孔質である場合には無孔質である場合よりも多くの生体関連物質を吸着することができる。
Examples of the material of the carrier include styrene, chlorostyrene, chloromethylstyrene, α-methylstyrene, divinylbenzene, sodium styrenesulfonate, (meth) acrylic acid, methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, (Meth) acrylic acid-n-butyl, (meth) acrylic acid-2-hydroxyethyl, (meth) acrylic acid polyoxyethylene, (meth) acrylic acid glycidyl, ethylene glycol di- (meth) acrylic acid ester, ( (Meth) acrylic acid tribromophenyl, tribromopropyl acrylate, (meth) acrylonitrile, (meth) acrolein, (meth) acrylamide, methylenebis (meth) acrylamide, butadiene, isoprene, vinyl acetate, vinylpyridine, N-vinylpyrrolidone, chloride Aryl, vinyl bromide and other aromatic vinyl compounds, α, β-unsaturated carboxylic acid esters or amides, α, β-unsaturated nitrile compounds, halogenated vinyl compounds, conjugated diene compounds, lower fatty acid vinyl esters, etc. A polymer obtained by polymerizing one or more of the above vinyl monomers; a crosslinked product of a polysaccharide such as agarose, dextran, cellulose, carboxymethylcellulose; a crosslinked product of a protein such as methylated albumin, gelatin, collagen, casein; Examples thereof include inorganic materials such as glass and ceramics; metals such as iron and silicon; and composite materials thereof.
The particles are preferably non-swellable, but may be swellable. The particle surface may be porous or non-porous. However, when the particle surface is porous, more biological substances can be adsorbed than when the particle surface is non-porous.
本発明において、「結合することができる」とは、結合相手との電荷の違いに応じて結合する機能又は性質を有すること、あるいは凝集剤と相互作用して結合する機能又は性質を有することを意味する。ここでいう「結合」には、一方が他方を物理的に担持する結合様式、及び水素結合の様式、配位結合の様式あるいは静電相互作用の様式が含まれる。また、「吸着することができる」とは、電荷の違いに応じて微粒子が生体関連物質を引き寄せて生体関連物質を微粒子表面に接着させることを意味する。例えば、生体関連物質の電荷が負であって微粒子の１の電荷が正のときは、プラスとマイナスの電荷により両者は引き合い、微粒子に生体関連物質が貼りつくこととなる。すなわち、生体関連物質が正電荷を有するときは、負電荷を有する微粒子が生体関連物質を吸着することができ、生体関連物質が負電荷を有するときは、正電荷を有する微粒子が生体関連物質を吸着することができる。 In the present invention, “can bind” means having a function or property of binding according to a difference in charge from the binding partner, or having a function or property of interacting with and binding to an aggregating agent. means. As used herein, “bond” includes a bond mode in which one physically supports the other, a hydrogen bond mode, a coordinate bond mode, or an electrostatic interaction mode. Further, “being able to adsorb” means that the microparticles attract the biological material to adhere to the surface of the microparticle according to the difference in charge. For example, when the charge of the biological substance is negative and the charge of one of the fine particles is positive, both attract each other due to the positive and negative charges, and the biological substance adheres to the fine particles. That is, when the biological substance has a positive charge, fine particles having a negative charge can adsorb the biological substance, and when the biological substance has a negative charge, the positive particles have a biological charge. Can be adsorbed.
したがって、上記微粒子及び凝集剤は、生体関連物質が正電荷であるか負電荷であるかにより、結合様式は以下の通りとなる（凝集剤の性質及び機能については後述する）。
（１）生体関連物質が負電荷であるとき
微粒子１及び凝集剤：正電荷
微粒子２：負電荷、無電荷
（２）生体関連物質が正電荷であるとき
微粒子１及び凝集剤：負電荷
微粒子２：正電荷、無電荷
Therefore, the fine particles and the flocculant have the following binding modes depending on whether the biological substance is positively charged or negatively charged (the properties and functions of the flocculant will be described later).
(1) When the biological substance is negatively charged Fine particle 1 and flocculant: positive charge Fine particle 2: Negative charge, no charge (2) When biological substance is positively charged Fine particle 1 and flocculant: negative charge Fine particle 2 : Positive charge, no charge
本発明において、微粒子１及び微粒子２はイオン交換樹脂製のものを使用することができる。負電荷を有する樹脂として陽イオン交換樹脂、正電荷を有する樹脂として陰イオン交換樹脂を用いることが好ましい。イオン交換樹脂とは、イオン交換可能な酸性基（陽イオン交換基）又は塩基性基（陰イオン交換基）をもつ不溶性樹脂であり、三次元的網目構造の樹脂に共有結合でイオン交換基が保持された形態となっている。イオン交換基（イオン交換樹脂）としては、例えば-SO3H（強酸性基）、-COOH（弱酸性基）などの負電荷を有する交換基、あるいは-CH2-N+(CH3)2(C2H4OH)（強塩基性基）、-CH2-N+H(CH3)2などの正電荷を有する交換基が挙げられる。
最も一般的なイオン交換樹脂の構造はスチレン・ジビニルベンゼンの共重合体からなる母体を持つものである。ポリスチレン長鎖分子がジビニルベンゼンの架橋により立体的網目構造の樹脂を形成する。このため、イオン交換樹脂はビーズ状の粒子構造を形成し、その内部は広い表面積を有する。
In the present invention, fine particles 1 and fine particles 2 made of an ion exchange resin can be used. It is preferable to use a cation exchange resin as a resin having a negative charge and an anion exchange resin as a resin having a positive charge. An ion exchange resin is an insoluble resin having an ion-exchangeable acidic group (cation exchange group) or basic group (anion exchange group), and the ion exchange group is covalently bonded to a resin having a three-dimensional network structure. It is a retained form. Examples of the ion exchange group (ion exchange resin) include negatively charged exchange groups such as —SO 3 H (strongly acidic group) and —COOH (weakly acidic group), or —CH 2 —N + (CH 3 ) 2. Examples thereof include an exchange group having a positive charge such as (C 2 H 4 OH) (strongly basic group) and —CH 2 —N + H (CH 3 ) 2 .
The most common ion exchange resin structure has a matrix made of a copolymer of styrene / divinylbenzene. Polystyrene long chain molecules form a three-dimensional network resin by cross-linking of divinylbenzene. For this reason, the ion exchange resin forms a bead-like particle structure, and the inside thereof has a large surface area.
イオン交換樹脂は、市販品、例えば陽イオン交換樹脂としてダウエックス５０Ｗ（ダウケミカル）、アンバーライトＩＲＣ５０（ローム・アンド・ハース）、ダイヤイオンＷＫ１００（三菱化学）また陰イオン交換樹脂としてダウエックス２２（ダウケミカル）、アンバーライトＩＲＡ６７（ローム・アンド・ハース）、デュオライトＡ７（ケムテックス）、ダイヤイオンＨＰＡ２５（三菱化学）を使用することもできる。 The ion exchange resin is a commercially available product, for example, Dowex 50W (Dow Chemical) as a cation exchange resin, Amberlite IRC50 (Rohm and Haas), Diaion WK100 (Mitsubishi Chemical), or Dowex 22 (as an anion exchange resin). Dow Chemical), Amberlite IRA67 (Rohm and Haas), Duolite A7 (Chemtex), Diaion HPA25 (Mitsubishi Chemical) can also be used.
本発明において、微粒子１は、ランダム形状化された微粒子（「トラップ粒子」ともいう）を使用する。「ランダム形状」とは、全体の粒子が球形のように一律に整った形状となっておらず、不整の任意形状を意味する。ランダム形状の微粒子１は、原料（例えば樹脂）から微粒子を製造する工程においてランダムに成形するよう制御することができるが、成形工程によって得られた成形粒子又は市販品の樹脂を物理的に粉砕することによりランダム形状化したものが好ましい。
本発明の好ましい態様において、一般的イオン交換クロマトグラフィー等に使用される樹脂（主に直径１ｍｍ程度の粒状樹脂）を粉砕することにより、粒径を小さくするとともに、形状をランダムにすることができる。これにより、粒子内部の広い表面積が露出し、生体関連物質を効率よく吸着することが可能となる。
樹脂を粉砕する方法は、乳鉢を用いて手動で粉砕する方法、又はミキサー若しくはビーズミルなどの機械を用いて粉砕する方法がある。また、市販の粉砕機（型名：ＭＩＣ−３０、奈良機械製作所）を使用して粉砕することもできる。
In the present invention, the fine particles 1 are randomly shaped fine particles (also referred to as “trap particles”). “Random shape” means that the entire particles are not in a uniform shape like a sphere, but an irregular arbitrary shape. The randomly shaped fine particles 1 can be controlled to be randomly formed in the step of producing fine particles from a raw material (for example, resin), but the formed particles obtained in the forming step or the commercially available resin are physically pulverized. What was random-shaped by this is preferable.
In a preferred embodiment of the present invention, by crushing a resin (mainly a granular resin having a diameter of about 1 mm) used for general ion exchange chromatography, the particle size can be reduced and the shape can be made random. . As a result, a large surface area inside the particle is exposed, and the biological substance can be adsorbed efficiently.
As a method of pulverizing the resin, there are a method of pulverizing manually using a mortar or a method of pulverizing using a machine such as a mixer or a bead mill. Moreover, it can also grind | pulverize using a commercially available grinder (model name: MIC-30, Nara Machinery Works).
微粒子２は、磁性又は非磁性であり、電荷は無電荷であってもよく、負電荷又は正電荷を持つものでもよい。微粒子２は、電荷の違いにより、あるいは凝集剤との相互作用により、微粒子１、凝集剤１及び凝集剤２の少なくとも１つと結合することができる。また、微粒子２の形状は任意であり、ランダム形状であっても球状のものであってもよく、特に限定されるものではない。なお、微粒子２は、キレート効果を有していてもよく、そのような効果を有する微粒子２を使用することも可能である。
微粒子の粒径は、微粒子１の場合は、下限が１μｍ程度、好ましくは５０μｍ程度であり、上限が１８０μｍ程度、好ましくは１００μｍ程度である。より好ましくは、１μｍ〜１８０μｍ、さらに好ましくは５０〜１００μｍである。微粒子２の場合は、下限が０．１μｍ程度、好ましくは１μｍ程度であり、上限が５００μｍ程度、好ましくは２００μｍ程度である。より好ましくは、０．１〜５００μｍ、さらに好ましくは１〜２００μｍである。
微粒子の粒径が上記範囲のときは、微粒子と試料との会合体が自然沈殿するため、試料中の生体関連物質を溶液から分離する際、遠心操作を不要にすることができる。
The fine particles 2 are magnetic or nonmagnetic, and the charge may be uncharged, or may have a negative charge or a positive charge. The fine particles 2 can be bonded to at least one of the fine particles 1, the flocculant 1, and the flocculant 2 by a difference in charge or by interaction with the flocculant. Moreover, the shape of the fine particles 2 is arbitrary, and may be a random shape or a spherical shape, and is not particularly limited. The fine particles 2 may have a chelate effect, and the fine particles 2 having such an effect can also be used.
In the case of the fine particle 1, the fine particle has a lower limit of about 1 μm, preferably about 50 μm, and an upper limit of about 180 μm, preferably about 100 μm. More preferably, they are 1 micrometer-180 micrometers, More preferably, they are 50-100 micrometers. In the case of the fine particles 2, the lower limit is about 0.1 μm, preferably about 1 μm, and the upper limit is about 500 μm, preferably about 200 μm. More preferably, it is 0.1-500 micrometers, More preferably, it is 1-200 micrometers.
When the particle size of the fine particles is within the above range, the aggregate of the fine particles and the sample spontaneously precipitates, so that the centrifugal operation can be eliminated when separating the biological substance in the sample from the solution.
２．生体関連物質及び試料
本発明において「生体関連物質」とは、試料中に含まれる分離、回収又は検出の対象となる物質であり、微生物、ウイルス、細胞、核酸、多糖、タンパク質、低分子などのあらゆる生体物質を意味する。
2. Biologically-related substance and sample In the present invention, the “biologically-related substance” is a substance to be separated, collected or detected in a sample, and includes microorganisms, viruses, cells, nucleic acids, polysaccharides, proteins, small molecules, etc. Any biological material is meant.
微生物には真菌及び真正細菌及び古細菌が含まれる。真菌としては、例えば、サッカロマイセス属、アスペルギルス属、カンジダ属などが挙げられる。真正細菌としては、例えば、マイコバクテリウム属、エッシェリヒア属、バチルス属、リステリア属、ビブリオ属、サルモネラ属、シュードモナス属、スタフィロコッカス属、マイコプラズマ属、リケッチア属、クラミジア属などに属する微生物が挙げられる。古細菌としては、例えば、サーモプラズマ属、ハロバクテリウム属、メタノバクテリウム属などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ種、アスペルギルス・ニデュランス種、カンジダ・アルビカンス種、マイコバクテリウム・ツベルクローシス種、マイコバクテリウム・アビウム種、マイコバクテリウム・イントラセルラー種、マイコバクテリウム・カンサシー種、エッシェリヒア・コリ種 、バチルス・セレウス種、バチルス・アンスラシス種、リステリア・モノサイトゲネス種、ビブリオ・パラヘモリティカス種、ビブリオ・コレラ種、サルモネラ・チフス種、シュードモナス・エレギノーサ種、スタフィロコッカス・アウレウス属、マイコプラズマ・ニューモニア種、リケッチア・プロワツェキイ種、クラミジア・トラコマチス種などを例示し得る。 Microorganisms include fungi and eubacteria and archaea. Examples of the fungi include Saccharomyces, Aspergillus, and Candida. Examples of eubacteria include microorganisms belonging to the genus Mycobacterium, Escherichia, Bacillus, Listeria, Vibrio, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Mycoplasma, Rickettsia, Chlamydia, etc. . Examples of archaea include Thermoplasma, Halobacteria, and Methanobacteria. Specifically, Saccharomyces cerevisiae species, Aspergillus nidulans species, Candida albicans species, Mycobacterium tuberculosis species, Mycobacterium abium species, Mycobacterium intracellulare species, Mycobacterium Kansasie species Species, Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Listeria monocytogenes, Vibrio parahemolyticus, Vibrio cholera, Salmonella typhoid, Pseudomonas eleginosa, Staphylococcus Aureus genus, Mycoplasma pneumonia species, Rickettsia prowaseky species, Chlamydia trachomatis species, etc. may be exemplified.
ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス科、バクテリオファージ科、レトロウイルス科などが挙げられる。具体的には、アデノウイルス、Ｔ７様ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ノロウイルス、ヒトロタウイルス、インフルエンザウイルスなどを例示し得る。
また、細胞は動物細胞、植物細胞、昆虫細胞のいずれも含まれる。
核酸としては、DNA、RNA、人工核酸などが挙げられる。
多糖としては、デンプン、グリコーゲン、キチン、カラギーナンなどが挙げられる。
タンパク質としては、抗体、酵素、色素タンパク質などが挙げられる。
低分子としては、ヌクレオチド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸などのヌクレオチド、グルコース又はガラクトースなどの糖、グルタミン酸又はリジンなどのアミノ酸、フルオロセイン又はエチジウムブロマイドなどの色素、エピネフリン又はペプチドホルモン又はステロイドなどのホルモンが挙げられる。
但し、上記生体関連物質は例示であり、これらの物質に限定されるものではない。
Examples of viruses include adenoviridae, bacteriophage, retroviridae, and the like. Specific examples include adenovirus, T7-like virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, human immunodeficiency virus, norovirus, human rotavirus, influenza virus and the like.
The cell includes any of animal cells, plant cells, and insect cells.
Examples of the nucleic acid include DNA, RNA, artificial nucleic acid and the like.
Examples of the polysaccharide include starch, glycogen, chitin, and carrageenan.
Examples of proteins include antibodies, enzymes, and chromoproteins.
Small molecules include nucleotides such as nucleotide triphosphates or deoxynucleotide triphosphates, sugars such as glucose or galactose, amino acids such as glutamic acid or lysine, dyes such as fluorescein or ethidium bromide, epinephrine or peptide hormones or steroids, etc. Hormones.
However, the above-mentioned bio-related substances are examples and are not limited to these substances.
試料はこれらの生体関連物質を含む限り特に限定されるものではなく、例えば、
(i) 痰、喀痰、唾液、口腔洗浄液、胃液、胸腔洗浄液、血液、血清、血漿、糞便、尿、髄液、***等の臨床材料、
(ii) 細胞溶解液、組織溶解液、細胞培養物、組織培養物等の生物材料、
(iii) 家庭排水、工業排水などの排水、
(iv) 海洋水、河川水、池水、湖水、地下水などの環境水、
(v) 飲用水、食物等洗浄液、及び生体関連物質が存在し得る道具の洗浄液、
が試料に含まれる。「生体関連物質が存在し得る道具の洗浄液」とは、生体関連物質の存在を確認したい箇所を拭き取った道具の洗浄液、又は生体関連物質の存在を確認したい箇所を洗い流した洗浄液を意味し、例えば、調理用包丁の洗浄液、拭き取りクロス（台布巾）で物を拭き取った後の洗浄液などが挙げられる。
The sample is not particularly limited as long as it contains these biological materials, for example,
(i) Clinical materials such as sputum, sputum, saliva, mouthwash, gastric juice, chest cavity wash, blood, serum, plasma, feces, urine, spinal fluid, semen,
(ii) cell lysate, tissue lysate, cell culture, biological material such as tissue culture,
(iii) Wastewater such as domestic wastewater and industrial wastewater,
(iv) Environmental water such as ocean water, river water, pond water, lake water, ground water,
(v) potable water, cleaning fluids such as food, and cleaning fluids for utensils in which bio-related substances may be present,
Is included in the sample. The “cleaning liquid for a tool in which a biological substance can be present” means a cleaning liquid for a tool that wipes off a part where the presence of a biological substance is to be confirmed, or a cleaning liquid that is washed away from a part where the presence of a biological substance is desired. , A cleaning solution for cooking knives, a cleaning solution after wiping off an object with a wiping cloth (bed cloth width), and the like.
本発明において、試料を懸濁又は溶解する溶液は、上記生体関連物質に対して用いられる通常の緩衝液であればよく、例えばリン酸緩衝液、生理食塩水、蒸留水、培地などを使用することができる。
臨床材料や生物材料を懸濁又は溶解する場合は、塩濃度が生理的条件に比較的近く細胞等に対して穏和な緩衝液が好ましい。このような緩衝液としては、例えばHEPES、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水、蒸留水、培地等を挙げることができる。
排水や環境水を懸濁又は溶解する場合は、特に吸着阻害物質の阻害効果を緩和させる性質の緩衝液が好ましい。このような緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水、蒸留水、クエン酸、ＥＤＴＡ等を挙げることができる。
In the present invention, the solution for suspending or dissolving the sample may be an ordinary buffer solution used for the biological substance, for example, a phosphate buffer solution, physiological saline, distilled water, a medium, or the like is used. be able to.
When a clinical material or biological material is suspended or dissolved, a buffer solution having a salt concentration relatively close to physiological conditions and mild to cells and the like is preferable. Examples of such a buffer include HEPES, phosphate buffer, Tris buffer, physiological saline, distilled water, and culture medium.
In the case of suspending or dissolving waste water or environmental water, a buffer solution having a property that alleviates the inhibitory effect of the adsorption inhibitor is particularly preferable. Examples of such a buffer include phosphate buffer, Tris buffer, physiological saline, distilled water, citric acid, EDTA, and the like.
３．凝集剤
本発明において使用される凝集剤１及び凝集剤２は以下の性質を有するものである。
凝集剤１：生体関連物質、微粒子２及び凝集剤２の少なくとも１つと結合する。高分子である。
凝集剤２：微粒子１、微粒子２及び凝集剤１の少なくとも１つと結合する。高分子である。
高分子は、分子量は１００万〜２０００万、好ましくは２００万から４００万であり、例えば大明化学工業製のものが挙げられる。
凝集剤の濃度は、下限が０．０１mg/ml程度、好ましくは０．１mg/ml程度であり、上限が１００mg/ml程度、好ましくは１０mg/ml程度である。より好ましくは、０．１〜１０mg/ml、さらに好ましくは０．１から１mg/mlである。
3. Flocculant Flocculant 1 and flocculant 2 used in the present invention have the following properties.
Aggregating agent 1: Binds to at least one of the biological material, the fine particles 2 and the aggregating agent 2. It is a polymer.
Flocculant 2: Binds to at least one of fine particles 1, fine particles 2 and flocculant 1. It is a polymer.
The polymer has a molecular weight of 1,000,000 to 20,000,000, preferably 2,000,000 to 4,000,000, for example, those manufactured by Daimei Chemical Industry.
The lower limit of the concentration of the flocculant is about 0.01 mg / ml, preferably about 0.1 mg / ml, and the upper limit is about 100 mg / ml, preferably about 10 mg / ml. More preferably, it is 0.1-10 mg / ml, More preferably, it is 0.1-1 mg / ml.
４．分離方法及び回収方法
本発明の方法は、上記微粒子１、微粒子２、凝集剤１及び凝集剤２から選ばれる少なくとも２つと試料とを混合することを特徴とする。
生体関連物質、微粒子１、微粒子２、凝集剤１及び凝集剤２の前記性質及び機能を表１に示す。
4). Separation Method and Recovery Method The method of the present invention is characterized by mixing a sample with at least two selected from the above-mentioned fine particles 1, fine particles 2, flocculant 1 and flocculant 2.
Table 1 shows the properties and functions of the biological substance, fine particles 1, fine particles 2, flocculant 1 and flocculant 2.
また、生体関連物質の電荷と微粒子及び凝集剤の電荷との関係を表２に示す。表２は、以下の基準を満たすように電荷を組み合わせたものである。
微粒子及び凝集剤の電荷は、微粒子２と凝集剤２が相反する電荷（正と負の電荷）とならないようにする。また、粒子１又は凝集剤１と凝集剤２とが同じ電荷とならないようにする。
Table 2 shows the relationship between the charge of the biological substance and the charge of the fine particles and the flocculant. Table 2 shows combinations of charges so as to satisfy the following criteria.
The charges of the fine particles and the flocculant are set so that the fine particles 2 and the flocculant 2 do not have opposite charges (positive and negative charges). Further, the particles 1 or the flocculant 1 and the flocculant 2 are prevented from having the same charge.
表２において、「＋」は正電荷、「−」は負電荷、「０」は無電荷であることを意味する。
さらに、生体関連物質と、微粒子及び凝集剤との結合様式を図１に示す。図１において、生体関連物質、微粒子及び凝集剤のそれぞれの間を結んだ直線は、両者が結合できることを意味する。すなわち、微粒子１と凝集剤１は生体関連物質と相互作用し、微粒子２と凝集剤２は生体関連物質と相互作用しないという関係にある。
したがって、本発明において利用可能な微粒子と凝集剤との組合せは、図２に示す通りとなる。
In Table 2, “+” means positive charge, “−” means negative charge, and “0” means no charge.
Furthermore, FIG. 1 shows a binding mode between the biological substance, the fine particles, and the flocculant. In FIG. 1, a straight line connecting each of the biological material, the fine particles, and the flocculant means that both can be combined. That is, the fine particles 1 and the flocculant 1 interact with the biological substance, and the fine particles 2 and the flocculant 2 do not interact with the biological substance.
Therefore, the combination of the fine particles and the flocculant that can be used in the present invention is as shown in FIG.
第一の態様は、微粒子１が生体関連物質を吸着させるとともに、微粒子２と微粒子１とが結合する態様である（図２の１番）。凝集剤をさらに混合することにより、生体関連物質の沈殿効率を高めることができる。例えば、凝集剤１を混合することにより、さらに混合凝集剤１が微粒子２と結合する（図２の７番）。なお、凝集剤１は生体関連物質と結合し得る。また、凝集剤２を混合することにより、凝集剤２が微粒子１及び微粒子２と結合し（図２の８番）、凝集剤1及び凝集剤２の両者を混合することにより、凝集剤１は生体関連物質、微粒子２及び凝集剤２と結合し、凝集剤２は微粒子１、微粒子２及び凝集剤１と結合する（図２の11番）。 The first mode is a mode in which the microparticles 1 adsorb the biological substance, and the microparticles 2 and the microparticles 1 are coupled (No. 1 in FIG. 2). By further mixing the flocculant, the precipitation efficiency of the biological substance can be increased. For example, when the flocculant 1 is mixed, the mixed flocculant 1 further binds to the fine particles 2 (No. 7 in FIG. 2). In addition, the flocculant 1 can couple | bond with a biological material. Further, by mixing the flocculant 2, the flocculant 2 is combined with the fine particles 1 and 2 (# 8 in FIG. 2), and by mixing both the flocculant 1 and the flocculant 2, the flocculant 1 is It binds to the biological substance, the fine particles 2 and the flocculant 2, and the flocculant 2 binds to the fine particles 1, the fine particles 2 and the flocculant 1 (No. 11 in FIG. 2).
第二の態様は、微粒子１が生体関連物質を吸着させるとともに、凝集剤２と微粒子１とが結合する態様である（図２の３番）。凝集剤１をさらに混合することにより、凝集剤２は凝集剤１及び微粒子１と結合し、生体関連物質の沈殿効率を高めることができる（図２の９番）。 The second mode is a mode in which the microparticles 1 adsorb the biological substance and the flocculant 2 and the microparticles 1 are bonded (No. 3 in FIG. 2). By further mixing the flocculant 1, the flocculant 2 is combined with the flocculant 1 and the fine particles 1, and the precipitation efficiency of the biological substance can be increased (No. 9 in FIG. 2).
第三の態様は、微粒子２と凝集剤１とが結合するとともに、凝集剤１が生体関連物質と結合する態様である（図２の４番）。凝集剤２をさらに混合することにより、凝集剤１は生体関連物質、微粒子２及び凝集剤２と結合し、生体関連物質の沈殿効率を高めることができる（図２の10番）。 The third aspect is an aspect in which the fine particles 2 and the flocculant 1 are bonded, and the flocculant 1 is bonded to the biological substance (No. 4 in FIG. 2). By further mixing the flocculant 2, the flocculant 1 is combined with the biological substance, the fine particles 2 and the flocculant 2, and the precipitation efficiency of the biological substance can be increased (No. 10 in FIG. 2).
第四の態様は、凝集剤１と生体関連物質とが結合するとともに、凝集剤２と凝集剤１とが結合する態様である（図２の６番）。微粒子１及び２を使用しなくても、凝集剤同士の反応及び凝集剤１と生体関連物質との相互作用により、生体関連物質の沈殿効率を高めることができる。 The fourth mode is a mode in which the flocculant 1 and the biological substance are bonded, and the flocculant 2 and the flocculant 1 are bonded (No. 6 in FIG. 2). Even if the fine particles 1 and 2 are not used, the precipitation efficiency of the biological substance can be increased by the reaction between the aggregating agents and the interaction between the aggregating agent 1 and the biological substance.
但し、本発明においては、生体関連物質と微粒子及び/又は凝集剤とが一体として何らかの結合態様を取ることが必要である。したがって、微粒子１及び凝集剤１はいずれも生体関連物質を吸着/結合することができても、微粒子１と凝集剤１とは結合しないため、生体関連物質、微粒子1及び凝集剤１との間で一体的結合関係を形成しない態様となる（図２の３番）。また、微粒子２及び凝集剤２は互いに結合することができても、いずれも生体関連物質を吸着/結合することはできないため、生体関連物質、微粒子２及び凝集剤２との間で一体的結合関係を形成しない態様となる（図２の５番）。このような態様は、本発明の態様から除くこととする。 However, in the present invention, it is necessary that the biological substance and the fine particles and / or the aggregating agent are combined to take some form of bonding. Therefore, even though both the fine particle 1 and the flocculant 1 can adsorb / bond the biological substance, the fine particle 1 and the flocculant 1 do not bind to each other, and therefore, the fine particle 1 and the flocculant 1 are not bonded to each other. Thus, an integrated connection relationship is not formed (No. 3 in FIG. 2). In addition, even though the fine particles 2 and the flocculant 2 can be bonded to each other, neither of them can adsorb / bond the biological substance, so that the biological substance, the fine particles 2 and the flocculant 2 are integrally bonded. It becomes a mode in which no relationship is formed (No. 5 in FIG. 2). Such an aspect is excluded from the aspect of the present invention.
微粒子１、微粒子２、試料及び凝集剤を混合する順序は特に限定されるものではなく、任意に設定することができる。例えば、上記第一の態様の場合、微粒子１、微粒子２、試料及び凝集剤を同時に混合することができる。また、微粒子１と試料とを混合した後に、微粒子２を混合し、その後、得られる混合物に凝集剤を混合することができる。あるいは、微粒子２と試料とを混合した後に、微粒子１を混合し、その後、得られる混合物に凝集剤を混合してもよい。第二〜第四の態様も、第一の態様に準じて、混合順序を任意に設定することができる。 The order of mixing the fine particles 1, the fine particles 2, the sample, and the flocculant is not particularly limited, and can be arbitrarily set. For example, in the case of the first aspect, the fine particles 1, the fine particles 2, the sample, and the aggregating agent can be mixed at the same time. Moreover, after mixing the microparticles | fine-particles 1 and a sample, the microparticles | fine-particles 2 can be mixed and a flocculant can be mixed with the mixture obtained after that. Or after mixing the microparticles | fine-particles 2 and a sample, the microparticles | fine-particles 1 may be mixed and a flocculant may be mixed with the mixture obtained after that. In the second to fourth aspects, the mixing order can be arbitrarily set according to the first aspect.
「混合」とは、微粒子、試料及び凝集剤が接触するように操作することを意味し、一方（例えば微粒子）に他方（例えば試料）を添加する行為が含まれる。もちろん、微粒子１用ノズル、微粒子２用ノズル、試料用ノズル、凝集剤用ノズルを設けて、自動化により混合操作を制御することもできる。 “Mixing” means that the microparticles, the sample and the flocculant are in contact with each other, and includes the act of adding the other (for example, the sample) to one (for example, the microparticle). Of course, it is possible to control the mixing operation by automation by providing a nozzle for fine particles 1, a nozzle for fine particles 2, a nozzle for sample, and a nozzle for flocculant.
本発明において、混合順序の態様を例示すると、以下の通りとなる。
(1) 微粒子１と、微粒子２と、試料とを混合する。この混合物に、凝集剤１及び/又は凝集剤２をさらに混合することができる。
(2) 微粒子１と、凝集剤２と、試料とを混合する。この混合物に、凝集剤１をさらに混合することができる。
(3) 凝集剤１と、微粒子２と、試料とを混合する。この混合物に、凝集剤２をさらに混合することができる。
(4) 凝集剤１と、凝集剤２と、試料とを混合する。
(5) 微粒子１と、微粒子２と、試料とを混合し、得られる混合物を凝集剤で処理する。
(6) 微粒子１と、試料とを混合し、得られる混合物を凝集剤で処理する。
(7) 微粒子２と、試料とを混合し、得られる混合物を、凝集剤で処理する。
上記(5)〜(7)において使用される凝集剤は、凝集剤１のみ又は凝集剤２のみであってもよく、両者を併用してもよい。
In the present invention, examples of the mixing order are as follows.
(1) The fine particles 1, the fine particles 2, and the sample are mixed. To this mixture, flocculant 1 and / or flocculant 2 can be further mixed.
(2) The fine particles 1, the flocculant 2, and the sample are mixed. The flocculant 1 can be further mixed with this mixture.
(3) The flocculant 1, the fine particles 2, and the sample are mixed. The flocculant 2 can be further mixed with this mixture.
(4) Mix flocculant 1, flocculant 2 and sample.
(5) Fine particles 1, fine particles 2 and a sample are mixed, and the resulting mixture is treated with a flocculant.
(6) The fine particles 1 and the sample are mixed, and the resulting mixture is treated with a flocculant.
(7) The fine particles 2 and the sample are mixed, and the resulting mixture is treated with a flocculant.
The flocculant used in the above (5) to (7) may be only flocculant 1 or flocculant 2, or both may be used in combination.
本発明においては、上記(1)の態様が、生体関連物質の沈殿効率が高い点で好ましい。
本発明では、上述した微粒子及び/又は凝集剤（微粒子等ともいう）と試料液とを接触させて、試料液中の生体関連物質を微粒子等に吸着/結合させ、吸着物（凝集塊）を沈殿させる。試料液と微粒子等との接触は、試料液中の生体関連物質が均一に微粒子等と接触できる条件であればよく、例えば静置、又はゆっくりとした攪拌混合などが挙げられる。静置又はゆっくりとした撹拌混合は、生体関連物質が微粒子等に対して均一に吸着又は結合することができ、操作が簡単である点で好ましい。
微粒子と試料とを混合する場合には、微粒子と試料液とが充分に混合接触可能となるように条件を設定する。例えば、微粒子が１０〜１００mgのときは、試料液は１〜５０mlとすることができる。また混合時間は、生体関連物質が微粒子に吸着して凝集する時間、例えば１０秒間〜１２時間、好ましくは３０秒間から５分間である。
微粒子と生体関連物質が沈殿すると、沈殿物は液体成分から分離する（固-液分離する）。本発明においては分離後の生体関連物質が回収される。回収する方法は、微粒子と生体関連物質との沈殿物から生体関連物質を採取すればよい。採取方法は特に限定されるものではないが、例えば液体部分を除去して凝集沈殿した沈殿物を採取する方法、沈殿物を磁性分離する方法、沈殿物をフィルターに通して生体関連物質を回収する方法などが挙げられる。
In the present invention, the above aspect (1) is preferable in that the precipitation efficiency of the biological substance is high.
In the present invention, the above-mentioned fine particles and / or aggregating agent (also referred to as fine particles) are brought into contact with the sample liquid to adsorb / bond the biological substance in the sample liquid to the fine particles, etc. Precipitate. The contact between the sample solution and the fine particles may be any conditions as long as the biological substance in the sample solution can uniformly contact with the fine particles, for example, standing or slow stirring and mixing. The stationary or slow stirring and mixing is preferable in that the biological material can be uniformly adsorbed or bound to the fine particles and the like and the operation is simple.
When the fine particles and the sample are mixed, conditions are set so that the fine particles and the sample liquid can be sufficiently mixed and contacted. For example, when the fine particles are 10 to 100 mg, the sample solution can be 1 to 50 ml. The mixing time is a time during which the biological substance is adsorbed and aggregated on the fine particles, for example, 10 seconds to 12 hours, preferably 30 seconds to 5 minutes.
When fine particles and biological materials are precipitated, the precipitate separates from the liquid component (solid-liquid separation). In the present invention, the biological material after separation is recovered. As a method for the recovery, the biological material may be collected from the precipitate of the fine particles and the biological material. The collection method is not particularly limited, but, for example, a method of collecting a coagulated precipitate by removing a liquid portion, a method of magnetically separating the precipitate, and collecting the biological material by passing the precipitate through a filter The method etc. are mentioned.
本発明においては、磁性の微粒子２を用いたときは、磁性粒子を用いて磁気分離工程又は回収工程を採用することができる。この方法は、後述する検出工程に応じて適宜選択する。例えば、核酸を抽出してPCR法で検出する場合は、微粒子を混合する前、混合中又は混合後に磁性粒子を添加することができる。磁性粒子としては、例えばマグネタイト、ラテックス磁気ビーズ、フェライト、鉄粉などの有機又は無機金属化合物が挙げられる。 In the present invention, when the magnetic fine particles 2 are used, the magnetic separation step or the recovery step can be employed using the magnetic particles. This method is appropriately selected according to the detection step described later. For example, when nucleic acid is extracted and detected by the PCR method, magnetic particles can be added before, during or after mixing the microparticles. Examples of the magnetic particles include organic or inorganic metal compounds such as magnetite, latex magnetic beads, ferrite, and iron powder.
検出工程で核酸を用いる場合は生体関連物質をトラップ粒子から剥がす（除去する）ことが好ましい。トラップ粒子から生体関連物質を剥がすためには溶出操作を行う。溶出操作は、特定の緩衝液によるｐＨショック、又はカオトロピック塩、又は高い塩濃度、又は熱を与えればよい。あるいは、グアニジン系の溶解液（例えばグアニジンチオシアネート）をトラップ粒子と磁性粒子と生体関連物質との会合体に加えると、溶出操作と同様の効果がある。 When using a nucleic acid in a detection process, it is preferable to peel (remove) a biological substance from a trap particle. An elution operation is performed to remove the biological substance from the trap particles. The elution operation may be performed by applying a pH shock by a specific buffer, or a chaotropic salt, or a high salt concentration, or heat. Alternatively, when a guanidine-based solution (for example, guanidine thiocyanate) is added to the aggregate of trap particles, magnetic particles, and biological substances, the same effect as the elution operation can be obtained.
磁性粒子を除く操作を行なった後、生体関連物質とトラップ粒子を含んだまま核酸抽出工程を行う。あるいは、磁性粒子とトラップ粒子を溶出物から分離した後、溶出物からの核酸抽出精製工程を行う。核酸抽出工程は、フェノール−クロロホルムを用いた手法、カラムを用いた手法、スピンカラムを用いた手法など手法は問わないが、磁性粒子を用いた核酸抽出方法が好ましい。磁性粒子を用いた核酸抽出方法を行う場合、核酸抽出操作の前に磁性の微粒子２を除去することが好ましい。磁性の微粒子２を除去する方法は、トラップ粒子から生体関連物質を剥がす溶出操作によって、トラップ粒子から生体関連物質を溶出した後、磁性分離、又は沈殿と上清の分離、又はフィルター分離のいずれかによって行うことができる。 After performing the operation of removing the magnetic particles, the nucleic acid extraction step is performed while containing the biological substance and trap particles. Alternatively, after separating the magnetic particles and trap particles from the eluate, a nucleic acid extraction and purification step from the eluate is performed. The nucleic acid extraction step is not limited to a method using phenol-chloroform, a method using a column, a method using a spin column, etc., but a nucleic acid extraction method using magnetic particles is preferable. When performing the nucleic acid extraction method using magnetic particles, it is preferable to remove the magnetic fine particles 2 before the nucleic acid extraction operation. The method for removing the magnetic fine particles 2 is one of eluting the biological substance from the trap particle by an elution operation for peeling the biological substance from the trap particle, and then separating the magnetic substance, the precipitate and the supernatant, or the filter separation. Can be done by.
核酸は、グアニジンの存在下ではトラップ粒子のアミンなどの官能基には作用できない環境であるため、特定の試薬の添加環によって核酸抽出用の磁性粒子のみにDNA及び/又はRNAが吸着する。更にB/F分離するとトラップ粒子は磁性がないので液中に残る。少量のトラップ粒子の持込み（凝集反応系試験管等への残存）は、核酸吸着粒子の洗浄工程を繰り返すことで回避できる。 Since nucleic acid is an environment that cannot act on functional groups such as amines of trap particles in the presence of guanidine, DNA and / or RNA is adsorbed only to magnetic particles for nucleic acid extraction by the addition ring of a specific reagent. Further, when the B / F is separated, the trapped particles remain in the liquid because they are not magnetic. Bringing in a small amount of trap particles (remaining in an agglutination reaction system test tube or the like) can be avoided by repeating the washing step of the nucleic acid adsorbing particles.
ところで、試料中には、生体関連物質が正電荷のもの及び負電荷のものが混在する場合がある。本発明においては、このような正、負の電荷が混在する生体関連物質が含まれる試料であっても、正電荷を有する微粒子及び/又は凝集剤、並びに負電荷を有する微粒子及び/又は凝集剤を併用することで、それぞれの電荷の生体関連物質を分離することが可能である。例えば、初めに負電荷の生体関連物質を分離するために正電荷を有する微粒子及び/又は凝集剤を用いて生体関連物質を分離回収し、その後正電荷の生体関連物質を分離するために負電荷を有する微粒子及び/又は凝集剤を用いて生体関連物質を分離回収することができる。
また、回収工程において試料液から生体関連物質を回収した後であっても、微粒子には、一部の生体関連物質が弱く吸着している場合がある。そこで、微粒子に吸着した生体関連物質を更に回収するために、微粒子に吸着した生体関連物質を分離するための脱着液を微粒子に接触させることが好ましい。
ここで用いられる脱着液としては、pHとイオン強度の観点から生体関連物質に対して穏和な化合物であって、微粒子と生体関連物質との吸着を相対的に低下させるものであればよい。例えば、塩化ナトリウム溶液、界面活性剤、キレート剤、緩衝液などを挙げることができる。
脱着液は、生体関連物質を回収した後の微粒子と均一に混合し得る量であればよく、例えば微粒子１００mgあたり０．１〜１ml、好ましくは０．２〜０．５mlである。脱着時間は、例えば１０秒〜３０分、好ましくは１〜１０分である。
By the way, in the sample, there may be a case where a biologically related substance has a positive charge and a negative charge. In the present invention, fine samples and / or flocculants having positive charges, and fine particles and / or flocculants having negative charges, even in a sample containing such a biological substance containing both positive and negative charges By using together, it is possible to separate biologically related substances having respective charges. For example, first, the biological material is separated and collected using fine particles and / or an aggregating agent having a positive charge to separate the negatively charged biological material, and then the negative charge is used to separate the positively charged biological material. The bio-related substance can be separated and recovered using the fine particles having the above and / or the flocculant.
Further, even after the biological material is collected from the sample solution in the collecting step, some biological materials may be weakly adsorbed to the fine particles. Therefore, in order to further collect the biological material adsorbed on the fine particles, it is preferable to contact the fine particles with a desorption liquid for separating the biological material adsorbed on the fine particles.
The desorption liquid used here may be any compound that is mild to the biological substance from the viewpoint of pH and ionic strength and relatively reduces the adsorption between the fine particles and the biological substance. For example, sodium chloride solution, surfactant, chelating agent, buffer solution and the like can be mentioned.
The desorption liquid may be an amount that can be uniformly mixed with the microparticles after collecting the biological substance, and is, for example, 0.1 to 1 ml, preferably 0.2 to 0.5 ml per 100 mg of the microparticles. The desorption time is, for example, 10 seconds to 30 minutes, preferably 1 to 10 minutes.
５．検出方法
本発明は、上記方法により回収された生体関連物質を(i)直接観察する、(ii)培養する、又は(iii)増幅することを特徴とする生体関連物質の検出方法を提供する。
生体関連物質が細胞又は細菌の場合は、回収された生体関連物質を目視等により直接観察することができる。あるいは、回収された生体関連物質を培地に培養して増殖させ、存在を観察することができる。生体関連物質が核酸の場合は、PCR等により増幅させ、増幅産物を確認すればよい。
5. Detection Method The present invention provides a method for detecting a biological substance, which comprises (i) directly observing, (ii) culturing, or (iii) amplifying the biological substance collected by the above method.
When the biological substance is a cell or a bacterium, the collected biological substance can be directly observed visually. Alternatively, the recovered biological substance can be cultured in a culture medium and proliferated, and the presence can be observed. When the biological substance is a nucleic acid, it may be amplified by PCR or the like and the amplified product may be confirmed.
例えば、マイコバクテリウム属に属する細菌（結核菌又は抗酸菌）を検出する場合は、試料を喀痰、胃液、気管洗浄液、血液、尿、便、組織片とし、これらからの菌の回収工程、及び菌の検出工程を経る。検出系は、培養検査（薬剤感受性検査及び鑑別・同定検査を含む）、塗抹検査、遺伝子検査の３種類に大別される（結核菌検査指針２００７ 日本結核予防会 抗酸菌検査法検討委員会 編）。 For example, when detecting a bacterium belonging to the genus Mycobacterium (tuberculosis or acid-fast bacterium), the sample is sputum, gastric juice, tracheal lavage fluid, blood, urine, stool, tissue piece, And the bacteria detection step. Detection systems are broadly classified into three types: culture tests (including drug susceptibility tests and differential / identification tests), smear tests, and genetic tests (Japan Tuberculosis Test Guideline 2007 Mycobacterium tuberculosis prevention committee, mycobacteria test method review committee) Hen).
培養検査は、主として小川培地又はその変法による検査とＭＧＩＴシステムによる検査が行われている。
「小川培地」とは、培地基中の燐酸塩をKH2PO4のみとした卵培地であり、現在わが国で最もよく使われている培地である。菌の分離培養には、基汁100mlに対し１〜３gのKH2PO4を含む培地（１〜３％小川培地）を用いる。本発明においては、喀痰などの臨床材料由来の生体関連物質を強アルカリ溶液で前処理した後、処理物を小川培地に接種し、菌の増殖を観察する。培養した陽性検体について、薬剤感受性検査、及び／又はイムノクロマト法、及び／又は他の培地での生育検査、遺伝子検査によって鑑別・同定を行う。
The culture test is mainly performed by the Ogawa medium or its modified method and the MGIT system.
“Ogawa Medium” is an egg medium in which the phosphate in the medium is only KH 2 PO 4 , and is currently the most commonly used medium in Japan. A medium containing 1 to 3 g of KH 2 PO 4 per 100 ml of base juice (1 to 3% Ogawa medium) is used for the isolation culture of the bacteria. In the present invention, a biological material derived from a clinical material such as sputum is pretreated with a strong alkaline solution, and then the treated product is inoculated into Ogawa's medium, and the growth of the bacteria is observed. The cultured positive specimens are identified and identified by drug susceptibility testing and / or immunochromatography, and / or growth testing in other media, and genetic testing.
「MGIT」（Mycobacteria Growth Indicator Tube）法とは、抗酸菌の迅速検出法の１つである。液体培地を含む試験管の中には、培地中の溶存酸素に感受性の蛍光化合物が混合されており、紫外線照射によりその蛍光を検出することができる。活発に呼吸する抗酸菌が存在すると酸素が消費されるため、紫外線照射によりオレンジ色蛍光が観察される。 The “MGIT” (Mycobacteria Growth Indicator Tube) method is one of rapid detection methods for acid-fast bacteria. In a test tube containing a liquid medium, a fluorescent compound sensitive to dissolved oxygen in the medium is mixed, and the fluorescence can be detected by ultraviolet irradiation. Oxygen is consumed in the presence of actively respiring mycobacteria, and orange fluorescence is observed by UV irradiation.
塗抹検査は、わが国での多くの場合、喀痰を均等化・遠心集菌した試料をスライドガラス等に塗布し、染色操作を行うことで抗酸菌の有無を顕微鏡によって確認する検査である。アジア・アフリカ諸国では遠心集菌を行わずに染色操作を行う場合もある。顕微鏡検査では、本発明において沈殿させた沈殿物、又は回収された生体関連物質を顕微鏡で直接観察する。走査電子顕微鏡を使用すると、微粒子の表面に付着した菌を観察することができる。光学顕微鏡を使用するときは、チール・ネールゼン（Ziehl-Neelsen)染色、又はオーラミンＯ染色、又はアクリジンオレンジ染色のいずれか又は２法以上を行う。これらの染色により、抗酸菌が存在する染色されるため、その染色具合により存在を観察することができる。 In many cases in Japan, smear inspection is an inspection in which a sample obtained by equalizing and collecting bacteria from a sputum is applied to a slide glass and the like, and the presence or absence of acid-fast bacteria is confirmed by a staining operation. In Asian and African countries, staining may be performed without centrifugation. In the microscopic examination, the sediment precipitated in the present invention or the collected biological substance is directly observed with a microscope. When a scanning electron microscope is used, bacteria attached to the surface of the fine particles can be observed. When using an optical microscope, perform Ziehl-Neelsen staining, auramine O staining, or acridine orange staining, or two or more methods. Since these stains result in the presence of acid-fast bacteria, the presence can be observed depending on the degree of staining.
遺伝子検査では、核酸増幅法及びＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを組み合わせたコバスアンプリコア・マイコバクテリウム（ロシュ・ダイアグノスティクス）がわが国で唯一診療保険点数が認められたキットである。検出目的の核酸に対応したプライマーを設計して適当な増幅サイクルで増幅する。増幅産物に相補的な蛍光ラベルＤＮＡプローブをハイブリダイズし、その後検出装置又は電気泳動により存在を確認することができる。PCR法は、当分野において周知技術であり、当業者であれば、プライマーの設計及び合成、並びにサイクル条件の設定は適宜なし得る。この他、標的ＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させると共に蛍光色素と消光物質を持つＴａｑＭａｎプローブを用いて検出するリアルタイムＰＣＲ法、標的ＲＮＡを逆転写酵素によってＤＮＡを合成してＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡを反復合成させる増幅法であるＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification）法、標的ＲＮＡを逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼによる逆転写及び転写反応を繰り返す増幅法である、ＴＲＣ（Transcription-Reverse Transcription）法、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal AMPlification）法など多くの遺伝子検査法が開発されている。例えば、ＰＣＲは「コバス アンプリコア マイコバクテリウム」（ロシュ・ダイアグノスティクス）、リアルタイムＰＣＲは「コバス ＴａｑＭａｎ ＭＴＢ」（ロシュ・ダイアグノスティクス）、ＴＭＡは「ＤＮＡプローブＦＲ−ＭＴＢ」（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、富士レビオ）、ＴＲＣは「結核菌群ｒＲＮＡ検出試薬 ＴＲＣＲａｐｉｄ Ｍ．ＴＢ」（東ソー）などのキットを使用することが可能である。
なお、上記３種類の検出法は、マイコバクテリウム属細菌の検出に限定されるものではない。
In genetic testing, Cobas Amplicor Mycobacterium (Roche Diagnostics), which combines nucleic acid amplification and DNA-DNA hybridization, is the only kit in Japan that has a medical insurance score. A primer corresponding to the nucleic acid to be detected is designed and amplified in an appropriate amplification cycle. A fluorescence-labeled DNA probe complementary to the amplification product is hybridized, and then the presence can be confirmed by a detection device or electrophoresis. The PCR method is a well-known technique in this field, and those skilled in the art can appropriately design and synthesize primers and set cycle conditions. In addition, the target DNA is amplified by the PCR method and detected using a TaqMan probe having a fluorescent dye and a quenching substance. The target RNA is synthesized by reverse transcriptase and the RNA is synthesized repeatedly by RNA polymerase. TMA (Transcription Mediated Amplification) method, which is an amplification method, TRC (Transcription-Reverse Transcription) method, which is an amplification method that repeats reverse transcription and transcription reaction of target RNA with reverse transcriptase and RNA polymerase, and strand displacement DNA polymerase Many genetic testing methods such as the LAMP (Loop-mediated isothermal AMPlification) method have been developed. For example, PCR is “Cobas Amplicor Mycobacterium” (Roche Diagnostics), Real-time PCR is “Cobas TaqMan MTB” (Roche Diagnostics), and TMA is “DNA Probe FR-MTB” (Gen-Probe, Fuji). Rebio) and TRC can use kits such as “Mycobacterium tuberculosis group rRNA detection reagent TRCRapid M.TB” (Tosoh).
Note that the above three types of detection methods are not limited to detection of Mycobacterium bacteria.
６．キット
本発明は、以下の性質を有する微粒子１、微粒子２、凝集剤１及び凝集剤２からなる群から選ばれる少なくとも２つ（微粒子１と凝集剤１との組合せ、及び微粒子２と凝集剤２との組合せを除く）を含む、生体関連物質の分離用、回収用、又は検出用キットを提供する。
(a) 微粒子１：ランダム形状化されている。生体関連物質を吸着することができる。微粒子２及び/又は凝集剤２と結合することができる。
(b) 微粒子２：微粒子１、凝集剤１及び凝集剤２の少なくとも１つと結合することができる。
(c) 凝集剤１：生体関連物質を吸着することができる。微粒子２及び/又は凝集剤２と結合することができる。
(d) 凝集剤２：微粒子１、微粒子２及び凝集剤１の少なくとも１つと結合することができる。
6). Kit The present invention includes at least two selected from the group consisting of fine particles 1, fine particles 2, flocculant 1 and flocculant 2 having the following properties (a combination of fine particles 1 and flocculant 1, and fine particles 2 and flocculant 2). And a kit for separating, recovering, or detecting a biological substance.
(a) Fine particles 1: Randomly shaped. A biological substance can be adsorbed. It can be combined with the fine particles 2 and / or the flocculant 2.
(b) Fine particles 2: Can bind to at least one of fine particles 1, flocculant 1 and flocculant 2.
(c) Flocculant 1: A biological material can be adsorbed. It can be combined with the fine particles 2 and / or the flocculant 2.
(d) Flocculant 2: Can bind to at least one of fine particles 1, fine particles 2 and flocculant 1.
本発明においては、使用される微粒子１はランダム形状化された担体（樹脂等）であるが、粉砕前の成形された担体をキットに含めることができる。この場合、ユーザは、担体の使用に際して適宜粉砕処理すればよい。
また、本発明のキットには、試料を溶解又は懸濁するための緩衝液、試料と微粒子１又は微粒子２との混合順序、凝集剤の混合量やその順序を記載した説明書、さらには、生体関連物質の検出用器具、例えばMGIT法を想定するときは溶存酸素に感受性を有する蛍光化合物を含有させた試験管、PCRによる検出を想定するときはPCR用の緩衝液やプライマー、古典的検出を想定するときは小川培地、光学顕微鏡検査を想定するときはチール・ネールゼン染色液を含めることができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
In the present invention, the microparticles 1 to be used are randomly shaped carriers (resins etc.), but a shaped carrier before pulverization can be included in the kit. In this case, the user may pulverize appropriately when using the carrier.
In addition, the kit of the present invention includes a buffer solution for dissolving or suspending the sample, a mixing order of the sample and the fine particles 1 or the fine particles 2, an instruction describing the mixing amount and the order of the flocculant, Instruments for detecting biological substances, such as test tubes containing fluorescent compounds sensitive to dissolved oxygen when assuming the MGIT method, buffers and primers for PCR when detecting by PCR, classical detection Can be included, Ogawa's medium can be included, and when optical microscopy is assumed, Thiel-Neelsen stain can be included.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
大腸菌の吸着プロトコル
(i) 菌液の調製
常法に従ってLB培地で培養した大腸菌（Escherichia coli）の菌体濃度をバクテリアカウンター（エルマ）を用いて測定し、生理食塩水で1×103 cells/mlになるように調製した。
(ii) SS-M粒子での吸着
(i)で調製した菌液1mlを1.5ml遠心チューブ（アシスト）に採取し、陰イオン交換樹脂の粉砕粒子であるSS-M粒子（1g/5ml）100μlを加えた。静かに3分間転倒混和した（約90回の転倒混和）。
(iii) 凝集剤の添加
凝集剤であるTC-833を10mg/ml、1mg/ml、または0.1mg/mlの濃度のものをそれぞれ別々に用意した(ii)の遠心チューブに100μlずつ添加した。比較対照として凝集剤を加えずに(iv)へ進める試験も同時に行った。
(iv) 鉄粉の添加
鉄粉を加え、静かに転倒混和を30秒間行った（30秒間で約15回の転倒混和）。
(v) 沈降
5〜6分静置し、粒子を沈降させた。その際、チューブの壁面に粒子が張り付いている場合、チューブ立てに立てたまま遠心チューブを回して粒子を壁面から落とした。
(vi) 上清と沈殿の分離
遠心チューブの蓋を静かに開け、なるべく沈降している粒子を吸引しないように静かに上のほうから上清を0.3mlの沈殿が残るように採取した。採取した上清は、新しい遠心チューブに保存した。
(vii) コントロールの作製
上記(i)で作製した103cfu/mlのサンプル0.1mlをLB寒天培地に塗布し、これをコントロールとした。
(viii) 寒天培地への塗布
(vi)で採取した上清から各上清と沈殿の合計の10分の1量および10分の3量をLB寒天培地に塗布し、37度で培養した。
(ix) 検出
培養後、各LB寒天培地のコロニー数を測定し、コントロールのコロニー数を100％として各工程の吸着率を算出した（表３）。
E. coli adsorption protocol
(i) Preparation of bacterial solution Measure the cell concentration of Escherichia coli cultured in LB medium according to a conventional method using a bacterial counter (Elmer) and adjust to 1 × 10 3 cells / ml with physiological saline. Prepared.
(ii) Adsorption on SS-M particles
1 ml of the bacterial solution prepared in (i) was collected in a 1.5 ml centrifuge tube (assist), and 100 μl of SS-M particles (1 g / 5 ml) that were pulverized particles of anion exchange resin were added. Gently mixed by inversion for 3 minutes (approximately 90 times of inversion).
(iii) Addition of flocculant The flocculant TC-833 having a concentration of 10 mg / ml, 1 mg / ml, or 0.1 mg / ml was added in an amount of 100 μl each to the separately prepared centrifuge tube (ii). As a comparative control, a test proceeding to (iv) without adding a flocculant was also performed at the same time.
(iv) Addition of iron powder Iron powder was added and gently mixed by inversion for 30 seconds (about 15 times of inversion for 30 seconds).
(v) Sedimentation
The particles were allowed to settle for 5-6 minutes. At that time, when the particles adhered to the wall surface of the tube, the centrifugal tube was rotated while standing on the tube stand to drop the particles from the wall surface.
(vi) Separation of supernatant and precipitate The lid of the centrifuge tube was gently opened, and the supernatant was collected from the top so that 0.3 ml of precipitate remained, so as not to suck the sedimented particles as much as possible. The collected supernatant was stored in a new centrifuge tube.
(vii) Preparation of control 0.1 ml of the 10 3 cfu / ml sample prepared in (i) above was applied to an LB agar medium and used as a control.
(viii) Application to agar medium
From the supernatant collected in (vi), one-tenth and three-tenths of the total of each supernatant and precipitate was applied to an LB agar medium and cultured at 37 degrees.
(ix) Detection After culture, the number of colonies in each LB agar medium was measured, and the adsorption rate in each step was calculated with the number of control colonies as 100% (Table 3).
抗酸菌の吸着プロトコル MGIT
(i) 培地の成分の除外
培養した非定型抗酸菌（M.Kansasii）含有溶液1mlを1.5mlエッペンドルフチューブに取り、遠心分離機（「チビタン」（商品名、テックジャム社製））で遠心してペレットにした。上清を取り除き、チューブに1mlの生理食塩水を加え、ペレットを完全に溶解した。
(ii) サンプルの希釈
上記(i)で培地を生理食塩水に置き換えたM.Kansasiiを生理食塩水で10-6および10-7に希釈した。
(iii) サンプルの調製
上記(ii)で希釈したM.Kansasii 1mlとNALC（N-Acetyl-L-Cystein)-NaOH-PBS 9mlを15mlの遠心チューブに入れた。
(iv) SS-M粒子での吸着
陰イオン交換樹脂の粉砕粒子であるSS-M粒子（1g/5ml）100ulを(iii)で調製したサンプルの入った遠心チューブに加え、静かに転倒混和を3分間行った（3分間で約90回の転倒混和）。
(v) 凝集剤の添加
凝集剤であるTC-833(1mg/ml)（大明化学工業製）100μlを加え、静かに転倒混和を30秒間行った（30秒間で約15回の転倒混和）。
Mycobacterial adsorption protocol MGIT
(i) Exclusion of medium components Take 1 ml of cultured M. Kansasii-containing solution in a 1.5 ml Eppendorf tube, and centrifuge (“Chibitan” (trade name, manufactured by Techjam)). Keep it in a pellet. The supernatant was removed and 1 ml of saline was added to the tube to completely dissolve the pellet.
(ii) Dilution of sample M. Kansasii in which the medium was replaced with physiological saline in (i) above was diluted to 10 -6 and 10 -7 with physiological saline.
(iii) Sample Preparation 1 ml of M. Kansasii diluted in (ii) and 9 ml of NALC (N-Acetyl-L-Cystein) -NaOH-PBS were placed in a 15 ml centrifuge tube.
(iv) Adsorption with SS-M particles Add 100 ul of SS-M particles (1 g / 5 ml), which are pulverized particles of anion exchange resin, to the centrifuge tube containing the sample prepared in (iii), and gently invert and mix. It was performed for 3 minutes (mixed by inverting 90 times in 3 minutes).
(v) Addition of flocculant TC-833 (1 mg / ml) as a flocculant (manufactured by Daimei Chemical Industry) was added and gently mixed by inversion for 30 seconds (about 15 times of inversion for 30 seconds).
(vi) 鉄粉の添加
鉄粉(0.2g/ml)100μlを加え、静かに転倒混和を30秒間行った（30秒間で約15回の転倒混和）。
(vii) 沈降
15mlの遠心チューブを垂直に立て、5〜6分静置し、粒子を沈降させた。その際、チューブの壁面に粒子が張り付いている場合、チューブ立てに立てたまま遠心チューブを回して粒子を壁面から落とした。
(viii) 上清と沈殿の分離
遠心チューブの蓋を静かに開け、なるべく沈降している粒子を吸引しないように静かに上のほうから上清を9ml除去した。除去した上清は、新しい遠心チューブに保存した。
(ix)コントロールの作製
上記(ii)で作製した10-7に希釈したサンプル500μl又はDW500μlに「SS-M」「TC-833(1mg/ml)」「鉄粉」それぞれ100μlを加えたものを作製した（計8種類）。10-7に希釈したサンプルを含む溶液を陽性コントロール、蒸留水（DW）を含む溶液を陰性コントロールとした。
(x) MGITの準備
MGIT本体にMGITの取扱説明書に従ってサプリメント２種を加えた。
(vi) Addition of iron powder 100 μl of iron powder (0.2 g / ml) was added and gently mixed by inversion for 30 seconds (about 15 times of inversion for 30 seconds).
(vii) Sedimentation
A 15 ml centrifuge tube was set up vertically and allowed to stand for 5-6 minutes to settle the particles. At that time, when the particles adhered to the wall surface of the tube, the centrifugal tube was rotated while standing on the tube stand to drop the particles from the wall surface.
(viii) Separation of supernatant and precipitate The lid of the centrifuge tube was gently opened, and 9 ml of the supernatant was gently removed from the top so as not to aspirate the sedimenting particles. The removed supernatant was stored in a new centrifuge tube.
(ix) Preparation of control 500 μl of 10-7 diluted sample prepared in (ii) above or 500 μl of DW with 100 μl each of `` SS-M '', `` TC-833 (1 mg / ml) '' and `` iron powder '' added Produced (total 8 types). A solution containing the sample diluted 10-7 was used as a positive control, and a solution containing distilled water (DW) was used as a negative control.
(x) Preparation of MGIT
Two supplements were added to the MGIT body according to the MGIT instruction manual.
(xi) MGITへの菌の添加
上記(viii)で分離した沈殿をよくピペッティングしてほぐした後、サプリメントを加えたMGITに菌含有溶液を500μl添加した。
(xii) MGITへの上清の添加
上記(viii)で沈殿と分離した上清の500μl、をサプリメント含有MGITに添加した。
(xiii) MGITへのコントロールの添加
上記(ii)で希釈したサンプルを500μlずつ、サプリメントを加えたMGITに添加した。
上記(ix)で作製した陽性及び陰性コントロールの全量を、サプリメントを加えたMGITに添加した。
(xiv) MGITでの培養
上記(xiii)で調製したサンプルを37℃の恒温槽に入れてインキュベートし、2〜3日後から42日までMGIT専用の陽性判定装置バクテックマイクロMGIT（BD）測定し、培養を始めてからの陽性判定が示されるまでの日数を記録した。42日後までに陽性判定が得られなかった場合を陰性とした。さらに上述の方法で操作を行った粒子法と指針（結核菌検査指針2007 日本結核予防会抗酸菌検査法検討委員会編）に記述された遠心法で濃縮された濃縮産物の陽性検出結果を３回ずつ比較した。遠心濃縮法の操作は、結核菌検査指針2007に記載された手順に従った。
(xi) Addition of fungus to MGIT The precipitate separated in (viii) above was thoroughly pipetted to loosen, and then 500 μl of the fungus-containing solution was added to MGIT to which the supplement was added.
(xii) Addition of supernatant to MGIT 500 μl of the supernatant separated from the precipitate in (viii) above was added to the supplement-containing MGIT.
(xiii) Addition of control to MGIT The sample diluted in (ii) above was added in an amount of 500 μl to MGIT supplemented.
The total amount of positive and negative controls prepared in (ix) above was added to MGIT supplemented.
(xiv) Cultivation with MGIT The sample prepared in (xiii) above is incubated in a 37 ° C constant temperature bath, and after 2 to 3 days to 42 days, MGIT-specific positive judgment device Bactec Micro MGIT (BD) is measured. The number of days from the start of culture until a positive determination was shown was recorded. A case where no positive determination was obtained by 42 days was regarded as negative. Furthermore, the positive detection result of the concentrated product concentrated by the centrifugation method described in the particle method and guideline operated by the above-mentioned method (edited by the Mycobacterium tuberculosis test guideline 2007 Japan Mycobacterium tuberculosis prevention group mycobacteria test method) Comparison was performed three times. The operation of the centrifugal concentration method was in accordance with the procedure described in the tuberculosis test guideline 2007.
結果を図３、４、および５に示す。図３から、微粒子１、凝集剤１、および微粒子２が抗酸菌の生育やMGIT法での検出に影響を及ぼさないことが示された。図４から分かるとおり、上清から陰性の結果が得られたため、微粒子１、凝集剤１、および微粒子２を用いた抗酸菌の濃縮効率が高いことが示された。また、図５に示されるとおり、遠心濃縮法では陽性と陰性判定の結果が不安定であるのに対し、粒子濃縮法では安定し、かつ遠心濃縮法よりも短期間で陽性判定日数が得られた。 The results are shown in FIGS. FIG. 3 shows that the microparticles 1, the flocculant 1 and the microparticles 2 do not affect the growth of acid-fast bacteria and the detection by the MGIT method. As can be seen from FIG. 4, since a negative result was obtained from the supernatant, it was shown that the concentration efficiency of acid-fast bacteria using microparticles 1, flocculant 1 and microparticles 2 was high. Further, as shown in FIG. 5, the positive and negative determination results are unstable in the centrifugal concentration method, whereas the particle concentration method is stable, and the positive determination days can be obtained in a shorter period of time than the centrifugal concentration method. It was.
抗酸菌の吸着プロトコル 小川培地試験
(i) 培地の成分の除外
培養した非定型抗酸菌（M.Kansasii）およびBCG（弱毒化M.bovis）含有溶液1mlを1.5mlエッペンドルフチューブに取り、遠心分離機（「チビタン」（商品名、テックジャム社製））で遠心してペレットにした。上清を取り除き、チューブに1mlの生理食塩水を加え、ペレットを完全に溶解した。
(ii) サンプルの希釈
上記(i)で培地を生理食塩水に置き換えた抗酸菌を生理食塩水で10-6および10-7に希釈した。
(iii) サンプルの調製
上記(ii)で希釈した抗酸菌 1mlとNALC（N-Acetyl-L-Cystein)-NaOH-PBS 9mlを15mlの遠心チューブに入れた。
(iv) SS-M粒子での吸着
陰イオン交換樹脂の粉砕粒子であるSS-M粒子（1g/5ml）100μlを(iii)で調製したサンプルの入った遠心チューブに加え、静かに転倒混和を3分間行った（3分間で約90回の転倒混和）。
(v) 凝集剤の添加
凝集剤であるTC-833(1mg/ml)（大明化学工業製）100μlを加え、静かに転倒混和を30秒間行った（30秒間で約15回の転倒混和）。
Mycobacterial adsorption protocol Ogawa medium test
(i) Exclusion of medium components 1 ml of cultured atypical mycobacteria (M. Kansasii) and BCG (attenuated M. bovis) containing solution is placed in a 1.5 ml Eppendorf tube and centrifuged ("Chibitan" (trade name) , Manufactured by Tech Jam Co., Ltd.) and centrifuged to form a pellet. The supernatant was removed and 1 ml of saline was added to the tube to completely dissolve the pellet.
(ii) Dilution of sample The acid-fast bacterium whose medium was replaced with physiological saline in (i) above was diluted to 10 -6 and 10 -7 with physiological saline.
(iii) Sample preparation 1 ml of acid-fast bacteria diluted in (ii) above and 9 ml of NALC (N-Acetyl-L-Cystein) -NaOH-PBS were placed in a 15 ml centrifuge tube.
(iv) Adsorption with SS-M particles Add 100 μl of anion exchange resin ground particles of SS-M particles (1 g / 5 ml) to the centrifuge tube containing the sample prepared in (iii), and gently mix by inversion. It was performed for 3 minutes (mixed by inverting 90 times in 3 minutes).
(v) Addition of flocculant TC-833 (1 mg / ml) as a flocculant (manufactured by Daimei Chemical Industry) was added and gently mixed by inversion for 30 seconds (about 15 times of inversion for 30 seconds).
(vi) 鉄粉の添加
鉄粉(0.2g/ml)100μlを加え、静かに転倒混和を30秒間行った（30秒間で約15回の転倒混和）。
(vii) 沈降
15mlの遠心チューブを垂直に立て、5〜6分静置し、粒子を沈降させた。その際、チューブの壁面に粒子が張り付いている場合、チューブ立てに立てたまま遠心チューブを回して粒子を壁面から落とした。
(viii) 上清と沈殿の分離
遠心チューブの蓋を静かに開け、なるべく沈降している粒子を吸引しないように静かに上のほうから上清を9ml除去した。除去した上清は、新しい遠心チューブに保存した。
(ix) 小川培地への菌の添加
上記(viii)で分離した沈殿をよくピペッティングしてほぐした後、小川培地に菌含有溶液を100μl添加した。
(x) 小川培地への上清の添加
上記(viii)で沈殿と分離した上清の100μl若しくは300μlを小川培地に添加した。
(vi) Addition of iron powder 100 μl of iron powder (0.2 g / ml) was added and gently mixed by inversion for 30 seconds (about 15 times of inversion for 30 seconds).
(vii) Sedimentation
A 15 ml centrifuge tube was set up vertically and allowed to stand for 5-6 minutes to settle the particles. At that time, when the particles adhered to the wall surface of the tube, the centrifugal tube was rotated while standing on the tube stand to drop the particles from the wall surface.
(viii) Separation of supernatant and precipitate The lid of the centrifuge tube was gently opened, and 9 ml of the supernatant was gently removed from the top so as not to aspirate the sedimenting particles. The removed supernatant was stored in a new centrifuge tube.
(ix) Addition of Bacteria to Ogawa Medium After the precipitate separated in (viii) above was thoroughly pipetted and loosened, 100 μl of the bacteria-containing solution was added to the Ogawa medium.
(x) Addition of supernatant to Ogawa medium 100 μl or 300 μl of the supernatant separated from the precipitate in (viii) above was added to Ogawa medium.
(xi) 小川培地での培養
上記(xiii)で調製したサンプルを37℃の恒温槽に入れて42日間インキュベートし、小川培地に対するコロニーが占める割合を記録した。42日後までにコロニーが得られなかった場合を陰性とした。さらに上述の方法で操作を行った粒子法と指針（結核菌検査指針2007 日本結核予防会抗酸菌検査法検討委員会編）に記述された遠心法で濃縮された濃縮産物の陽性検出結果を10-7に希釈したM.kansasiiについて３回ずつ比較した。遠心濃縮法の操作は、結核菌検査指針2007に記載された手順に従った。
結果を図６および図７に示す。図６から、コロニーの形成が沈殿に集中しており、高い濃縮効果であることが示された。また、粒子を除去しなくても培養に用いることが可能であった。また、図７から、菌濃度が低い条件において、指針で定められた遠心濃縮法と比較して非常に高い濃縮効果を示した。
(xi) Culture in Ogawa Medium The sample prepared in (xiii) above was placed in a thermostatic chamber at 37 ° C. and incubated for 42 days, and the ratio of colonies to the Ogawa medium was recorded. A case where no colony was obtained by 42 days was regarded as negative. Furthermore, the positive detection result of the concentrated product concentrated by the centrifugation method described in the particle method and guideline operated by the above-mentioned method (edited by the Mycobacterium tuberculosis test guideline 2007 Japan Mycobacterium tuberculosis prevention group mycobacteria test method) Comparisons were made in triplicate for M.kansasii diluted to 10 -7 . The operation of the centrifugal concentration method was in accordance with the procedure described in the tuberculosis test guideline 2007.
The results are shown in FIG. 6 and FIG. FIG. 6 shows that the formation of colonies is concentrated in the precipitate, which is a high concentration effect. Moreover, it was possible to use for culture without removing the particles. Further, FIG. 7 shows a very high concentration effect as compared with the centrifugal concentration method defined by the guideline under the condition where the bacteria concentration is low.
Claims (13)
(a) 微粒子：イオン交換樹脂製でランダム形状化されている。生体関連物質を結合することができる。磁性粒子と結合することができる。
(b) 磁性粒子：微粒子及び凝集剤溶液と結合することができる。
(c) 凝集剤溶液：生体関連物質を吸着することができる。分子量100万〜2000万の高分子からなる。
A kit for separating, collecting, or detecting a biological substance, including the following fine particles, magnetic particles, and an aggregating agent solution.
(a) Fine particles: made of ion exchange resin and randomly shaped. Biologically relevant substances can be bound. It can be combined with magnetic particles .
(b) Magnetic particles : can be combined with fine particles and aggregating agent solution.
(c) Flocculant solution: A biological substance can be adsorbed. It consists of a polymer with a molecular weight of 1 to 20 million.
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