JP5502490B2 - 標的核酸を位置選択的に切断する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸を位置選択的に切断する方法、及び当該方法に用いる化合物、試薬並びにキットに関する。
ＤＮＡ鎖を任意の位置で切断し、これに外来ＤＮＡを結合する方法は、医学、分子生物学等、遺伝子を取り扱う諸分野において大きな役割を果たすことが期待されている。通常、ＤＮＡを切断する際は制限酵素が広く使用されているが、制限酵素は塩基配列の特異性が低く、巨大なＤＮＡを特定の位置で選択的に切断することができない。また制限酵素を使用しないＤＮＡ切断法としては、これまでに、ＤＮＡを金属イオンや金属イオン錯体でＤＮＡを切断する試みがなされ、例えばセリウム（ＩＶ）イオン等がＤＮＡ切断能を有することが知られている。しかし、この切断法は塩基配列特異性がほとんどなく、特に、巨大なＤＮＡを特定の位置で切断することは困難であった。
これに対し、近年、巨大なＤＮＡであっても、金属イオンや金属イオン錯体を用いて当該ＤＮＡを特定の位置で切断することができる方法が開発された（例えば、特開２００５−１４３４８４号公報、及び特開２００６−１７４７０２号公報 参照。）。
これに対し、近年、巨大なＤＮＡであっても、金属イオンや金属イオン錯体を用いて当該ＤＮＡを特定の位置で切断することができる方法が開発された（例えば、特開２００５−１４３４８４号公報、及び特開２００６−１７４７０２号公報 参照。）。
しかしながら、従来の方法では、金属イオン等を用いて巨大なＤＮＡを所望の位置で切断することが可能となったが、その位置選択性の高さや副反応性（非特異反応性）の低さ点で、より一層優れた方法の開発が求められている。また、経済性や簡便性の点でも実用性の高い方法が求められている。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、金属イオンや金属イオン錯体を核酸（ＤＮＡ等）の切断触媒として用いて標的核酸を所望の位置で切断する方法であって、位置選択性及び反応効率が高く、副反応性（非特異反応性）が低く、経済性及び簡便性にも優れた、標的核酸の切断方法を提供することにある。また、当該切断方法に用いる新規複合化合物、試薬及びキットを提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行い、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）複数のホスホノ基を含有する化合物と、特定の核酸配列に結合する化合物とが、Ｏ−アルキルオキシム基を含有するリンカー部分により結合されてなる、複合化合物。
本発明の複合化合物としては、例えば、前記核酸（核酸配列）がＤＮＡ（ＤＮＡ配列）であるものが挙げられる。
本発明の複合化合物において、前記特定の核酸配列に結合する化合物としては、例えば、オリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。ここで、当該オリゴヌクレオチドの塩基数は、例えば７〜５０塩基であり、又は当該ペプチド核酸の塩基数は、例えば５〜２５塩基である。
本発明の複合化合物としては、例えば、下記式（１）で表される複合化合物が挙げられる。
（式中、Ｒ１は特定の核酸配列に結合する化合物を表し、Ｒ２は複数のホスホノ基を含有する化合物を表し、Ｒ３は単結合又は任意の基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
ここで、上記式（１）中、例えば、Ｒ１がオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であり、かつＲ３が下記式（３）で表される基であってもよい。
（式中、ｑは０〜２を表し、ｒは０〜３０の整数を表す。）
また、上記式（１）中、Ｒ２が下記式（２）で表されるものであってもよい。
（式中、ｐは０〜３の整数を表す。）
本発明の複合化合物としては、例えば、前記ホスホノ基に、金属イオン又は金属錯体が結合したものが挙げられる。ここで、当該金属イオン又は金属錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体、又はセリウム（ＩＩＩ）イオン若しくはセリウム（ＩＩＩ）錯体が挙げられ、特に、これら錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）又はセリウム（ＩＩＩ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体が挙げられる。
（２）標的核酸に、上記（１）に記載の複合化合物（金属イオン等が結合したものを除く）と、金属イオン又は金属錯体とを接触させる、標的核酸の切断方法。ここで、当該金属イオン又は金属錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体、又はセリウム（ＩＩＩ）イオン若しくはセリウム（ＩＩＩ）錯体が挙げられ、特に、これら錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）又はセリウム（ＩＩＩ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体が挙げられる。
上記（２）の方法としては、例えば、上記セリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体を、標的核酸への接触前及び／又は接触以後に酸化させ、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体にすることを含む方法が挙げられる。
（３）標的核酸に、上記（１）に記載の複合化合物（金属イオン等が結合したもの）を接触させる、標的核酸の切断方法。
上記（３）の方法としては、例えば、上記複合化合物中の金属イオン又は金属錯体がセリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体であって、当該セリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体を、標的核酸への接触前及び／又は接触以後に酸化させ、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体にすることを含む方法が挙げられる。
本発明の標的核酸の切断方法（上記（２）及び（３）；以下同様）において、標的核酸としては、例えばＤＮＡが挙げられる。
本発明の標的核酸の切断方法としては、例えば、前記複合化合物として、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物（ａ）と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物（ｂ）とを使用する方法が挙げられる。ここで、複合化合物（ａ）が結合する標的核酸の５’末端領域と複合化合物（ｂ）が結合する標的核酸の３’末端領域との間にギャップが存在し、当該ギャップ中に所望の切断点が存在することが好ましい。また、複合化合物（ａ）及び複合化合物（ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、いずれも、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。
本発明の標的核酸の切断方法としては、例えば、前記標的核酸が２本鎖であり、前記複合化合物として、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ａ）と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ｂ）とを使用する方法が挙げられる。ここで、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、いずれも、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。また、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、例えば、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有するものが挙げられる。
（４）上記（１）に記載の複合化合物（金属イオン等が結合したものを除く）と、金属イオン又は金属錯体とを含む、標的核酸の切断用試薬。ここで、当該金属イオン又は金属錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体、又はセリウム（ＩＩＩ）イオン若しくはセリウム（ＩＩＩ）錯体が挙げられ、特に、これら錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）又はセリウム（ＩＩＩ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体が挙げられる。
（５）上記（１）に記載の複合化合物（金属イオン等が結合したもの）を含む、標的核酸の切断用試薬。
本発明の試薬（上記（４）及び（５）；以下同様）において、標的核酸としては、例えばＤＮＡが挙げられる。
本発明の試薬としては、例えば、前記複合化合物として、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物（ａ）と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物（ｂ）とを含む試薬が挙げられる。ここで、複合化合物（ａ）が結合する標的核酸の５’末端領域と複合化合物（ｂ）が結合する標的核酸の３’末端領域との間にギャップが存在し、当該ギャップ中に所望の切断点が存在することが好ましい。また、複合化合物（ａ）及び複合化合物（ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、いずれも、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。
本発明の試薬としては、例えば、前記標的核酸が２本鎖であり、前記複合化合物として、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ａ）と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ｂ）とを含む試薬が挙げられる。ここで、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、いずれも、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。また、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、例えば、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有するものが挙げられる。
（６）上記（４）又は（５）に記載の試薬を含む、標的核酸の切断用キット。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、金属イオンや金属イオン錯体を核酸（ＤＮＡ等）の切断触媒として用いて標的核酸を所望の位置で切断する方法であって、位置選択性及び反応効率が高く、副反応性（非特異反応性）が低く、経済性及び簡便性にも優れた、標的核酸の切断方法を提供することにある。また、当該切断方法に用いる新規複合化合物、試薬及びキットを提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行い、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）複数のホスホノ基を含有する化合物と、特定の核酸配列に結合する化合物とが、Ｏ−アルキルオキシム基を含有するリンカー部分により結合されてなる、複合化合物。
本発明の複合化合物としては、例えば、前記核酸（核酸配列）がＤＮＡ（ＤＮＡ配列）であるものが挙げられる。
本発明の複合化合物において、前記特定の核酸配列に結合する化合物としては、例えば、オリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。ここで、当該オリゴヌクレオチドの塩基数は、例えば７〜５０塩基であり、又は当該ペプチド核酸の塩基数は、例えば５〜２５塩基である。
本発明の複合化合物としては、例えば、下記式（１）で表される複合化合物が挙げられる。
（式中、Ｒ１は特定の核酸配列に結合する化合物を表し、Ｒ２は複数のホスホノ基を含有する化合物を表し、Ｒ３は単結合又は任意の基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
ここで、上記式（１）中、例えば、Ｒ１がオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であり、かつＲ３が下記式（３）で表される基であってもよい。
（式中、ｑは０〜２を表し、ｒは０〜３０の整数を表す。）
また、上記式（１）中、Ｒ２が下記式（２）で表されるものであってもよい。
（式中、ｐは０〜３の整数を表す。）
本発明の複合化合物としては、例えば、前記ホスホノ基に、金属イオン又は金属錯体が結合したものが挙げられる。ここで、当該金属イオン又は金属錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体、又はセリウム（ＩＩＩ）イオン若しくはセリウム（ＩＩＩ）錯体が挙げられ、特に、これら錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）又はセリウム（ＩＩＩ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体が挙げられる。
（２）標的核酸に、上記（１）に記載の複合化合物（金属イオン等が結合したものを除く）と、金属イオン又は金属錯体とを接触させる、標的核酸の切断方法。ここで、当該金属イオン又は金属錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体、又はセリウム（ＩＩＩ）イオン若しくはセリウム（ＩＩＩ）錯体が挙げられ、特に、これら錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）又はセリウム（ＩＩＩ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体が挙げられる。
上記（２）の方法としては、例えば、上記セリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体を、標的核酸への接触前及び／又は接触以後に酸化させ、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体にすることを含む方法が挙げられる。
（３）標的核酸に、上記（１）に記載の複合化合物（金属イオン等が結合したもの）を接触させる、標的核酸の切断方法。
上記（３）の方法としては、例えば、上記複合化合物中の金属イオン又は金属錯体がセリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体であって、当該セリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体を、標的核酸への接触前及び／又は接触以後に酸化させ、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体にすることを含む方法が挙げられる。
本発明の標的核酸の切断方法（上記（２）及び（３）；以下同様）において、標的核酸としては、例えばＤＮＡが挙げられる。
本発明の標的核酸の切断方法としては、例えば、前記複合化合物として、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物（ａ）と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物（ｂ）とを使用する方法が挙げられる。ここで、複合化合物（ａ）が結合する標的核酸の５’末端領域と複合化合物（ｂ）が結合する標的核酸の３’末端領域との間にギャップが存在し、当該ギャップ中に所望の切断点が存在することが好ましい。また、複合化合物（ａ）及び複合化合物（ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、いずれも、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。
本発明の標的核酸の切断方法としては、例えば、前記標的核酸が２本鎖であり、前記複合化合物として、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ａ）と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ｂ）とを使用する方法が挙げられる。ここで、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、いずれも、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。また、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、例えば、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有するものが挙げられる。
（４）上記（１）に記載の複合化合物（金属イオン等が結合したものを除く）と、金属イオン又は金属錯体とを含む、標的核酸の切断用試薬。ここで、当該金属イオン又は金属錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体、又はセリウム（ＩＩＩ）イオン若しくはセリウム（ＩＩＩ）錯体が挙げられ、特に、これら錯体としては、例えば、セリウム（ＩＶ）又はセリウム（ＩＩＩ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体が挙げられる。
（５）上記（１）に記載の複合化合物（金属イオン等が結合したもの）を含む、標的核酸の切断用試薬。
本発明の試薬（上記（４）及び（５）；以下同様）において、標的核酸としては、例えばＤＮＡが挙げられる。
本発明の試薬としては、例えば、前記複合化合物として、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物（ａ）と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物（ｂ）とを含む試薬が挙げられる。ここで、複合化合物（ａ）が結合する標的核酸の５’末端領域と複合化合物（ｂ）が結合する標的核酸の３’末端領域との間にギャップが存在し、当該ギャップ中に所望の切断点が存在することが好ましい。また、複合化合物（ａ）及び複合化合物（ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、いずれも、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。
本発明の試薬としては、例えば、前記標的核酸が２本鎖であり、前記複合化合物として、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ａ）と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ｂ）とを含む試薬が挙げられる。ここで、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、いずれも、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸が挙げられる。また、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分としては、例えば、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有するものが挙げられる。
（６）上記（４）又は（５）に記載の試薬を含む、標的核酸の切断用キット。
図１は、本発明の複合化合物及びそれを用いた標的ＤＮＡの切断の概要を示す図である。Ａが本発明の方法の一態様を示す概略図であり、Ｂが従来法の態様を示す概略図である。Ａの方法では、標的ＤＮＡの所望の領域に結合する分子２とＤＮＡ切断触媒３とを結合させて使用している。なお、Ｂの方法におけるＤＮＡ切断触媒３は、含有ホスホノ基が０又は１個のものである（Ａ方法におけるＤＮＡ切断触媒３は、ホスホノ基を複数個（２個以上）含有）。
図２は、本発明の複合化合物の合成例を示すスキーム図（概略）である。
図３は、本発明の複合化合物を用いた「２本鎖ＤＮＡの切断」の概要を示す図である。具体的には、２本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖に相補的に結合し得るペプチド核酸（ＰＮＡ）に、複数のホスホノ酸基を含有する基を結合することで、触媒（Ｃｅ（ＩＶ））が切断部位に濃縮されることを表している。
図４は、本発明の方法を用いた標的ＤＮＡの位置選択的切断（１）（実施例２；８５ ｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｗｉｔｈ ５−ｂａｓｅ ｇａｐ，ｔ＝１１４ ｈ，５０μＭ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ．）の結果を示す図である。左図（Ａ）は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であり、右図（Ｂ）は、標的ＤＮＡに対して使用した本発明の各種複合化合物の種類と組み合わせ（標的ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションさせたＤＮＡ誘導体の種類と態様）を概略的に示した図である。なお、レーン４の態様が、従来法の中では最も高いの切断活性を示すものである。
図５は、本発明の方法を用いた標的ＤＮＡの位置選択的切断（２）（実施例３；４１ ｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｗｉｔｈ １−ｂａｓｅ ｇａｐ，ｔ＝６７ ｈ，２０μＭ ｎｏｎ−ｉｎｃｕｂａｔｅｄ Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ．）の結果を示す図である。左図（Ａ）は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であり、右図（Ｂ）は、標的ＤＮＡに対して使用した本発明の各種複合化合物の種類と組み合わせ（標的ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションさせたＤＮＡ誘導体の種類と態様）を概略的に示した図である。
図６は、本発明の方法を用いた標的ＤＮＡの位置選択的切断（３）（実施例４；８５ ｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｗｉｔｈ ５−ｂａｓｅ ｇａｐ，ｔ＝５４ ｈ，４μＭ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ ｏｒ Ｃｅ（ＩＩＩ）．）の結果を示す図である。左図（Ａ）は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であり、右図（Ｂ）は、標的ＤＮＡに対して使用した本発明の各種複合化合物の種類と組み合わせ（標的ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションさせたＤＮＡ誘導体の種類と態様）を概略的に示した図である。
図２は、本発明の複合化合物の合成例を示すスキーム図（概略）である。
図３は、本発明の複合化合物を用いた「２本鎖ＤＮＡの切断」の概要を示す図である。具体的には、２本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖に相補的に結合し得るペプチド核酸（ＰＮＡ）に、複数のホスホノ酸基を含有する基を結合することで、触媒（Ｃｅ（ＩＶ））が切断部位に濃縮されることを表している。
図４は、本発明の方法を用いた標的ＤＮＡの位置選択的切断（１）（実施例２；８５ ｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｗｉｔｈ ５−ｂａｓｅ ｇａｐ，ｔ＝１１４ ｈ，５０μＭ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ．）の結果を示す図である。左図（Ａ）は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であり、右図（Ｂ）は、標的ＤＮＡに対して使用した本発明の各種複合化合物の種類と組み合わせ（標的ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションさせたＤＮＡ誘導体の種類と態様）を概略的に示した図である。なお、レーン４の態様が、従来法の中では最も高いの切断活性を示すものである。
図５は、本発明の方法を用いた標的ＤＮＡの位置選択的切断（２）（実施例３；４１ ｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｗｉｔｈ １−ｂａｓｅ ｇａｐ，ｔ＝６７ ｈ，２０μＭ ｎｏｎ−ｉｎｃｕｂａｔｅｄ Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ．）の結果を示す図である。左図（Ａ）は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であり、右図（Ｂ）は、標的ＤＮＡに対して使用した本発明の各種複合化合物の種類と組み合わせ（標的ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションさせたＤＮＡ誘導体の種類と態様）を概略的に示した図である。
図６は、本発明の方法を用いた標的ＤＮＡの位置選択的切断（３）（実施例４；８５ ｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｗｉｔｈ ５−ｂａｓｅ ｇａｐ，ｔ＝５４ ｈ，４μＭ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ ｏｒ Ｃｅ（ＩＩＩ）．）の結果を示す図である。左図（Ａ）は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であり、右図（Ｂ）は、標的ＤＮＡに対して使用した本発明の各種複合化合物の種類と組み合わせ（標的ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションさせたＤＮＡ誘導体の種類と態様）を概略的に示した図である。
１：標的ＤＮＡ、２：標的ＤＮＡの所望の領域に結合する分子、
３：ＤＮＡ切断触媒
３：ＤＮＡ切断触媒
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００７−２９９７４７号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
ＤＮＡ等の核酸を所定の位置で切断するには、（１）核酸を切断する触媒分子と、（２）核酸の所定の領域（位置）に結合して活性化する分子とを用いるのが一般的な手法である。（１）としては、本発明者が従来明らかにしているように、セリウム（ＩＶ）イオン及びその錯体が極めて有効である。しかし、これまでは、これらのイオン及びその錯体を、核酸の所定の領域に結合する分子に結合させる適当な手法がなかったため、上記（１）及び（２）の両者は独立に反応系に加えられており、そのため、切断効率が低く、切断の位置選択性も不十分であった。また、核酸を切断するために大量の触媒を必要とした。さらに細胞内で核酸を選択的に切断するには、セリウム（ＩＶ）錯体と核酸認識分子との両者をそれぞれ細胞内に導入する必要があり、これは容易に実現できるものではなかった。本発明は、このような課題を解決することを目的の一つとするものであり、水溶液中で容易に調製可能で、しかも安定で、核酸を所望の位置で効率的に切断する標的核酸の切断方法を提供するものである。
本発明の一態様は、水溶液中で容易に調製でき、しかも水溶液中で安定なリンカーを用いて、セリウム（ＩＶ）錯体と核酸認識分子とを結合し、これを用いて核酸を切断する方法である。このように、切断能を有するセリウム（ＩＶ）錯体を核酸中のターゲット領域に固定することで、核酸を所望位置のみで選択的に切断することができる（図１参照）。また、本発明の他の一態様としては、セリウム（ＩＶ）の代わりにセリウム（ＩＩＩ）（セリウム（ＩＩＩ）イオンやセリウム（ＩＩＩ）錯体）を用いる方法も挙げられる。セリウム（ＩＩＩ）は、反応系内で、空気中の酸素等と反応して自発的に酸化され、セリウム（ＩＶ）となり、ＤＮＡ切断活性を有するものとなる。
２．標的核酸の切断方法
本発明の標的核酸の切断方法は、標的核酸に、所定の複合化合物と金属イオン若しくは金属錯体とをそれぞれ接触させるか、又は所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたものを接触させる方法である。ここで、標的核酸としては、限定はされないが、例えばＤＮＡ（１本鎖及び２本鎖）が好ましい。
（１）複合化合物
本発明の方法においては、複数のホスホノ基（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）を含有する化合物と、特定の核酸配列に結合する化合物とが、Ｏ−アルキルオキシム基（−Ｏ−Ｎ＝）を含有するリンカー部分により結合されてなる複合化合物を用いることができる。
当該複合化合物としては、複数のホスホノ基（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）を含有する化合物中のホスホノ基の数は、複数であればよく限定はされないが、例えば、２〜１０が好ましく、より好ましくは３〜６である。
当該複合化合物としては、特定の核酸配列に結合する化合物が、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）であるものが好ましい。オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその誘導体が挙げられる。また、ＰＮＡは、アミド結合を主鎖に、核酸塩基を側鎖に持つ高分子であり、例えば「生命科学のニューセントラルドグマ」（化学同人、平成１４年発行）の第６６ページに記載されているものを利用することができる。当該オリゴヌクレオチドは、塩基数が７〜５０塩基であるものが好ましく、より好ましくは１０〜２０塩基である。また、当該ペプチド核酸は、塩基数が５〜２５塩基であるものが好ましく、より好ましくは７〜１５塩基である。
当該複合化合物においては、Ｏ−アルキルオキシム基（−Ｏ−Ｎ＝）を含有するリンカー部分は、上述した複数のホスホノ基を含有する化合物由来の部分と、特定の核酸配列に結合する化合物由来の部分とを連結する部分である。このＯ−アルキルオキシム基は、Ｏ−アルキルヒドロキシアミンとアルデヒド基とから水溶液中で容易に合成することができる（図２の合成スキーム参照）。詳しくは、複数のホスホノ基を含有する化合物にアルデヒド基を導入したものと、特定の核酸配列に結合する化合物（オリゴヌクレオチド等）にＯ−アルキルヒドロキシアミンを導入したものを調製し、これら両者を反応させることで、Ｏ−アルキルオキシム基が形成されるとともに当該基を介した複合化合物が生成される。当該複合化合物は、標的核酸の切断条件下において容易に調製することができるものである。また、Ｏ−アルキルオキシム基は、水溶液中の標的核酸の切断条件下で、構造上十分に安定性が高いため、結果として標的核酸の切断効率を高め、非特異切断を低減することにも効果を発揮するものである。なお、Ｏ−アルキルオキシム基を含有するリンカー部分は、図２に示した構造に限定されるわけではない。本発明において、当該複合化合物は、Ｏ−アルキルオキシム基をリンカー部分に用いることにより初めて得られた、核酸切断触媒である金属イオン等と特定の核酸配列に結合する化合物とを効率的にハイブリッドさせるために使用できる化合物である。
当該複合化合物は、例えば、下記式（１）で表されるものが好ましく挙げられる。
（式中、Ｒ１は特定の核酸配列に結合する化合物を表し、Ｒ２は複数のホスホノ基を含有する化合物を表し、Ｒ３は単結合又は任意の基を表し、ｎは１〜１０（好ましくは３〜６）の整数を表す。）
また、上記式（１）において、Ｒ１がオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であり、Ｒ３が下記式（３）で表される基である複合化合物が好ましく挙げられる。
（式中、ｑは０〜２（好ましくは０〜１）を表し、ｒは０〜３０（好ましくは０〜１０）の整数を表す。）
さらに、上記式（１）において、Ｒ２が下記式（２）で表されるものである複合化合物が好ましく挙げられる。
（式中、ｐは０〜３（好ましくは０〜１）の整数を表す。）
本発明においては、特に、上記式（１）において、Ｒ１がオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であり、Ｒ２が上記式（２）で表されるものであり、かつ、Ｒ３が上記式（３）で表される基である複合化合物が好ましい。このような複合化合物としては、例えば、下記に列挙する複合化合物等が挙げられる（但し、列挙した各複合化合物中のオリゴヌクレオチド部分（配列番号１又は２）は単なる例示であり、限定はされない。）。
本発明において、当該複合化合物としては、その含有する複数のホスホノ基に、金属イオン又は金属錯体が結合したものが好ましい態様として挙げられる。このように金属イオン等と結合した複合化合物を用いることにより、核酸の非特異的な切断を大いに低減し、切断効率及び位置選択性を飛躍的に向上させることができる。また、細胞内で標的核酸領域を選択的に切断する場合に、複合化合物と金属イオン等とをそれぞれ導入する必要がなく（通常、非常に困難である）、一度に導入するのみでよいため、細胞内の核酸を容易に切断することができる。さらには、核酸切断触媒となる金属イオン等の使用量を大きく低減することができ、経済性の点でも極めて好ましい。
上記金属イオン及び金属錯体は、核酸切断の触媒としての効果を有するものであればよく、限定はされないが、例えば、セリウム（ＩＶ）（Ｃｅ（ＩＶ））イオン、セリウム（ＩＶ）錯体、ジルコニウム（ＩＶ）イオン、ジルコニウム（ＩＶ）錯体、ランタニド（ＩＩＩ）イオン及びランタニド（ＩＩＩ）錯体等が好ましく、なかでもセリウム（ＩＶ）イオン及びセリウム（ＩＶ）錯体が特に好ましい。また、セリウム（ＩＶ）イオン及びセリウム（ＩＶ）錯体と同様に、セリウム（ＩＩＩ）イオン及びセリウム（ＩＩＩ）錯体も、特に好ましい。セリウム（ＩＩＩ）イオン及びセリウム（ＩＩＩ）錯体は、前述したように、標的核酸を切断する反応系において、空気中の酸素等と反応して自発的に酸化され、セリウム（ＩＶ）イオン及びセリウム（ＩＶ）錯体となり、核酸切断の触媒としての効果を有するものとなる。
セリウム（ＩＩＩ）イオン及びセリウム（ＩＩＩ）錯体は、中性の溶液中で水酸化物及びその沈殿を形成しにくく均一であるため、核酸切断分子として調製が容易である。また、不要なゲルとなって核酸の切断に直接に関与しない部分を構成することもないため、調製した分がほぼそのまま核酸切断に用いられるため、使用量を非常に低く抑えることができ、経済的に有利であるのみならず、反応系内での不要な核酸切断を避けることができる。さらに、細胞内での使用も容易になるという大きな利点を有する。
セリウム（ＩＶ）イオンを複合化合物のホスホノ基に結合させる場合、その反応においては、セリウム（ＩＶ）イオンは、硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）水溶液、硫酸セリウム（ＩＶ）水溶液、塩化セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物、硫酸セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物、過塩素酸セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物など、セリウム（ＩＶ）イオンを含む水溶液であれば、いずれの形態であっても反応系に導入することができるが、好ましくは硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）である。
セリウム（ＩＶ）錯体は、限定はされないが、例えば、セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体が特に好ましい。セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体は、セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸とを水中で接触することにより得ることができる（他の錯体も同様にして得られる。）。ここで、ポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸としては、「金属キレート、Ｉ−ＩＶ」（南江堂、昭和４２年発行）に記載のものを利用することができ、例えば、エチレンジアミン四酢酸、１，３−ジアミノプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１，４−ジアミノブタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸などが好ましく挙げられる。
なお、セリウム（ＩＩＩ）イオン及びセリウム（ＩＩＩ）錯体を用いる場合も、上記のセリウム（ＩＶ）イオン及びセリウム（ＩＶ）錯体を用いる場合の記載が同様に適用できる。
（２）標的核酸の切断方法
（ｉ）本発明の標的核酸の切断方法の一態様としては、標的核酸に対して、所定の複合化合物と金属イオン若しくは金属錯体とをそれぞれ接触させる方法が挙げられる。ここで、所定の複合化合物（金属イオン等との結合体は除く）とは、上記２．（１）項に説明した通りのものである。
（ｉｉ）また、本発明の標的核酸の切断方法の他の態様としては、標的核酸に対して、所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたものを接触させる方法が挙げられる。ここで、所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたもの（金属イオン等との結合体）とは、上記２．（１）項に説明した通りのものである。
上記（ｉ）及び（ｉｉ）の切断方法においては、金属イオン又は金属錯体がセリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体である場合、当該セリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体を、標的核酸への接触前及び／又は接触以後に酸化させ、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体にすることが好ましい。ここで、セリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体を酸化させる態様としては、特に限定はされないが、例えば、空中の酸素と反応し、自発的になされる酸化が好ましく挙げられる。
また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の切断方法においては、前記複合化合物として、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物（ａ）と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物（ｂ）とを使用することができる。この際、複合化合物（ａ）及び複合化合物（ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分は、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であることが好ましい。このような２種類の複合化合物を使用する場合は、複合化合物（ａ）が結合する標的核酸の５’末端領域と複合化合物（ｂ）が結合する標的核酸の３’末端領域との間にギャップが存在していて、当該ギャップ領域中に所望の切断点が存在するようにすることが好ましく、極めて位置選択性が高くかつ効率的な核酸切断が可能となる。当該切断方法は、標的核酸として、１本鎖ＤＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのいずれか一方の鎖を所望の位置で切断する際に有用な方法である。
さらに、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の切断方法においては、標的核酸が２本鎖であり、かつ、前記複合化合物として、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ａ）と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ｂ）とを使用することができる。ここで、これら２種類の複合化合物については、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分が、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有するものであることが、２本鎖の標的核酸を効果的に切断することができるため好ましい。このような２種類の複合化合物を使用する場合は、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分は、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であることが好ましいが、特に、ペプチド核酸であることが好ましい。ペプチド核酸である場合、図３に示すように、複合化合物中の標的部分と結合する部分が、２本鎖である標的核酸のそれぞれの鎖に結合（ハイブリダイゼーション）するとともに両鎖間に入り込んで２本鎖を解き（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、各鎖に部分的に一本鎖の領域を生じさせる。この一本鎖の領域に対して、核酸切断触媒である金属イオン又は金属イオン錯体が作用し、最終的に２本鎖の標的核酸を所望の位置で効率的に切断することができる。
（３）標的核酸の切断方法の用途
本発明の標的核酸の切断方法は、巨大な核酸鎖であっても所望の位置で選択的に切断することができる方法であるため、従来、制限酵素の位置特異性で決定されていた“核酸サイズの壁”を容易に打破することができる。すなわち、制限酵素を用いた遺伝子組換え技術において正確に操作できるのは、プラスミドＤＮＡに限られるが、本発明の方法を用いれば、ウイルスゲノムはもちろんのこと、高等生物の巨大な核酸鎖であっても所望の位置で選択的に切断して正確な操作が可能となる。例えば、本発明の方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用した場合は、従来の方法では容易に操作できなかった巨大ＤＮＡ等を正確に操作することができる。また、本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏで使用し、進入したウイルスゲノムを破壊すれば抗ウイルス剤となり、ヒトの特定の遺伝子（例えば癌遺伝子）を破壊すれば、有効な癌治療薬を提供することができる。さらに、ゲノムＤＮＡ中の特定の位置を切断することにより、類似ゲノム間の交換反応（相同組換え）を促進して、ゲノムを改変することにも利用することができる。
このように、本発明の方法の有用な用途を列挙すると、以下の通りとなる。（ａ）有用な核酸操作ツールの供給、（ｂ）新たなベクターの開発（アデノウイルスや各種レトロウイルス等の遺伝子操作）、（ｃ）ターゲット能に優れた抗ウイルス剤、（ｄ）抗癌剤の開発（テロメアの破壊等）、（ｅ）相同組換え（生体内における遺伝子組換え）の促進（品種改良等）。ここで、上記（ｂ）では、例えば、従来厳密な遺伝子操作が不可能であったアデノウイルス等を正確に遺伝子操作することにより優れたベクターを開発することが挙げられ、上記（ｃ）〜（ｅ）では、例えば、本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏで活用することが挙げられる。また、上記（ｃ）では、生体内に侵入したウイルスのゲノムを選択的に破壊することが挙げられ、上記（ｄ）及び（ｅ）では、ゲノムＤＮＡを所望の位置で切断して目的を実行することが挙げられる。
３．標的核酸の切断用試薬及びキット
（１）標的核酸切断用試薬
（ｉ）本発明の標的核酸切断用試薬の一態様としては、所定の複合化合物と、金属イオン又は金属錯体とを含むものが挙げられる。ここで、所定の複合化合物（金属イオン等との結合体は除く）とは、上記２．（１）項に説明した通りのものである。
（ｉｉ）また、本発明の標的核酸切断用試薬の他の態様としては、所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたものを含むものが挙げられる。ここで、所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたもの（金属イオン等との結合体）とは、上記２．（１）項に説明した通りのものである。
上記（ｉ）及び（ｉｉ）の試薬においては、前記複合化合物として、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物（ａ）と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物（ｂ）とを含むことができる。ここで、複合化合物（ａ）及び複合化合物（ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分は、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であることが好ましい。当該試薬は、標的核酸として、１本鎖ＤＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのいずれか一方の鎖を所望の位置で切断する際に有用なものである。
また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の試薬においては、標的核酸が２本鎖であり、かつ、前記複合化合物として、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ａ）と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ｂ）とを含むことができる。このような２種類の複合化合物を含む場合は、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分が、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有するものであることが、２本鎖の標的核酸を効果的に切断することができるため好ましい。ここで、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分は、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であることが好ましいが、特に、ペプチド核酸であることが好ましい。
本発明の試薬は、上述したもの以外に他の成分を含んでいてもよく、限定はされない。
（２）標的核酸切断用キット
本発明の標的核酸切断用キットは、上述した本発明の標的核酸切断用試薬を構成成分として含むものである。本発明のキットは、前述した本発明の標的核酸の切断方法に有効に利用することができ、極めて有用性及び実用性が高いものである。
本発明のキットは、上記構成成分以外に、他の構成成分を含んでいてもよい。他の構成成分としては、例えば、各種バッファ、滅菌水、エッペンドルフチューブ、核酸共沈剤、各種ゲル（粉末）及びアジ化ナトリウム等の防腐剤、並びに実験操作マニュアル（説明書）等のほか、必要に応じ、各種電気泳動装置等も挙げられる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００７−２９９７４７号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
ＤＮＡ等の核酸を所定の位置で切断するには、（１）核酸を切断する触媒分子と、（２）核酸の所定の領域（位置）に結合して活性化する分子とを用いるのが一般的な手法である。（１）としては、本発明者が従来明らかにしているように、セリウム（ＩＶ）イオン及びその錯体が極めて有効である。しかし、これまでは、これらのイオン及びその錯体を、核酸の所定の領域に結合する分子に結合させる適当な手法がなかったため、上記（１）及び（２）の両者は独立に反応系に加えられており、そのため、切断効率が低く、切断の位置選択性も不十分であった。また、核酸を切断するために大量の触媒を必要とした。さらに細胞内で核酸を選択的に切断するには、セリウム（ＩＶ）錯体と核酸認識分子との両者をそれぞれ細胞内に導入する必要があり、これは容易に実現できるものではなかった。本発明は、このような課題を解決することを目的の一つとするものであり、水溶液中で容易に調製可能で、しかも安定で、核酸を所望の位置で効率的に切断する標的核酸の切断方法を提供するものである。
本発明の一態様は、水溶液中で容易に調製でき、しかも水溶液中で安定なリンカーを用いて、セリウム（ＩＶ）錯体と核酸認識分子とを結合し、これを用いて核酸を切断する方法である。このように、切断能を有するセリウム（ＩＶ）錯体を核酸中のターゲット領域に固定することで、核酸を所望位置のみで選択的に切断することができる（図１参照）。また、本発明の他の一態様としては、セリウム（ＩＶ）の代わりにセリウム（ＩＩＩ）（セリウム（ＩＩＩ）イオンやセリウム（ＩＩＩ）錯体）を用いる方法も挙げられる。セリウム（ＩＩＩ）は、反応系内で、空気中の酸素等と反応して自発的に酸化され、セリウム（ＩＶ）となり、ＤＮＡ切断活性を有するものとなる。
２．標的核酸の切断方法
本発明の標的核酸の切断方法は、標的核酸に、所定の複合化合物と金属イオン若しくは金属錯体とをそれぞれ接触させるか、又は所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたものを接触させる方法である。ここで、標的核酸としては、限定はされないが、例えばＤＮＡ（１本鎖及び２本鎖）が好ましい。
（１）複合化合物
本発明の方法においては、複数のホスホノ基（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）を含有する化合物と、特定の核酸配列に結合する化合物とが、Ｏ−アルキルオキシム基（−Ｏ−Ｎ＝）を含有するリンカー部分により結合されてなる複合化合物を用いることができる。
当該複合化合物としては、複数のホスホノ基（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）を含有する化合物中のホスホノ基の数は、複数であればよく限定はされないが、例えば、２〜１０が好ましく、より好ましくは３〜６である。
当該複合化合物としては、特定の核酸配列に結合する化合物が、例えばオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）であるものが好ましい。オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその誘導体が挙げられる。また、ＰＮＡは、アミド結合を主鎖に、核酸塩基を側鎖に持つ高分子であり、例えば「生命科学のニューセントラルドグマ」（化学同人、平成１４年発行）の第６６ページに記載されているものを利用することができる。当該オリゴヌクレオチドは、塩基数が７〜５０塩基であるものが好ましく、より好ましくは１０〜２０塩基である。また、当該ペプチド核酸は、塩基数が５〜２５塩基であるものが好ましく、より好ましくは７〜１５塩基である。
当該複合化合物においては、Ｏ−アルキルオキシム基（−Ｏ−Ｎ＝）を含有するリンカー部分は、上述した複数のホスホノ基を含有する化合物由来の部分と、特定の核酸配列に結合する化合物由来の部分とを連結する部分である。このＯ−アルキルオキシム基は、Ｏ−アルキルヒドロキシアミンとアルデヒド基とから水溶液中で容易に合成することができる（図２の合成スキーム参照）。詳しくは、複数のホスホノ基を含有する化合物にアルデヒド基を導入したものと、特定の核酸配列に結合する化合物（オリゴヌクレオチド等）にＯ−アルキルヒドロキシアミンを導入したものを調製し、これら両者を反応させることで、Ｏ−アルキルオキシム基が形成されるとともに当該基を介した複合化合物が生成される。当該複合化合物は、標的核酸の切断条件下において容易に調製することができるものである。また、Ｏ−アルキルオキシム基は、水溶液中の標的核酸の切断条件下で、構造上十分に安定性が高いため、結果として標的核酸の切断効率を高め、非特異切断を低減することにも効果を発揮するものである。なお、Ｏ−アルキルオキシム基を含有するリンカー部分は、図２に示した構造に限定されるわけではない。本発明において、当該複合化合物は、Ｏ−アルキルオキシム基をリンカー部分に用いることにより初めて得られた、核酸切断触媒である金属イオン等と特定の核酸配列に結合する化合物とを効率的にハイブリッドさせるために使用できる化合物である。
当該複合化合物は、例えば、下記式（１）で表されるものが好ましく挙げられる。
（式中、Ｒ１は特定の核酸配列に結合する化合物を表し、Ｒ２は複数のホスホノ基を含有する化合物を表し、Ｒ３は単結合又は任意の基を表し、ｎは１〜１０（好ましくは３〜６）の整数を表す。）
また、上記式（１）において、Ｒ１がオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であり、Ｒ３が下記式（３）で表される基である複合化合物が好ましく挙げられる。
（式中、ｑは０〜２（好ましくは０〜１）を表し、ｒは０〜３０（好ましくは０〜１０）の整数を表す。）
さらに、上記式（１）において、Ｒ２が下記式（２）で表されるものである複合化合物が好ましく挙げられる。
（式中、ｐは０〜３（好ましくは０〜１）の整数を表す。）
本発明においては、特に、上記式（１）において、Ｒ１がオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であり、Ｒ２が上記式（２）で表されるものであり、かつ、Ｒ３が上記式（３）で表される基である複合化合物が好ましい。このような複合化合物としては、例えば、下記に列挙する複合化合物等が挙げられる（但し、列挙した各複合化合物中のオリゴヌクレオチド部分（配列番号１又は２）は単なる例示であり、限定はされない。）。
本発明において、当該複合化合物としては、その含有する複数のホスホノ基に、金属イオン又は金属錯体が結合したものが好ましい態様として挙げられる。このように金属イオン等と結合した複合化合物を用いることにより、核酸の非特異的な切断を大いに低減し、切断効率及び位置選択性を飛躍的に向上させることができる。また、細胞内で標的核酸領域を選択的に切断する場合に、複合化合物と金属イオン等とをそれぞれ導入する必要がなく（通常、非常に困難である）、一度に導入するのみでよいため、細胞内の核酸を容易に切断することができる。さらには、核酸切断触媒となる金属イオン等の使用量を大きく低減することができ、経済性の点でも極めて好ましい。
上記金属イオン及び金属錯体は、核酸切断の触媒としての効果を有するものであればよく、限定はされないが、例えば、セリウム（ＩＶ）（Ｃｅ（ＩＶ））イオン、セリウム（ＩＶ）錯体、ジルコニウム（ＩＶ）イオン、ジルコニウム（ＩＶ）錯体、ランタニド（ＩＩＩ）イオン及びランタニド（ＩＩＩ）錯体等が好ましく、なかでもセリウム（ＩＶ）イオン及びセリウム（ＩＶ）錯体が特に好ましい。また、セリウム（ＩＶ）イオン及びセリウム（ＩＶ）錯体と同様に、セリウム（ＩＩＩ）イオン及びセリウム（ＩＩＩ）錯体も、特に好ましい。セリウム（ＩＩＩ）イオン及びセリウム（ＩＩＩ）錯体は、前述したように、標的核酸を切断する反応系において、空気中の酸素等と反応して自発的に酸化され、セリウム（ＩＶ）イオン及びセリウム（ＩＶ）錯体となり、核酸切断の触媒としての効果を有するものとなる。
セリウム（ＩＩＩ）イオン及びセリウム（ＩＩＩ）錯体は、中性の溶液中で水酸化物及びその沈殿を形成しにくく均一であるため、核酸切断分子として調製が容易である。また、不要なゲルとなって核酸の切断に直接に関与しない部分を構成することもないため、調製した分がほぼそのまま核酸切断に用いられるため、使用量を非常に低く抑えることができ、経済的に有利であるのみならず、反応系内での不要な核酸切断を避けることができる。さらに、細胞内での使用も容易になるという大きな利点を有する。
セリウム（ＩＶ）イオンを複合化合物のホスホノ基に結合させる場合、その反応においては、セリウム（ＩＶ）イオンは、硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）水溶液、硫酸セリウム（ＩＶ）水溶液、塩化セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物、硫酸セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物、過塩素酸セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物など、セリウム（ＩＶ）イオンを含む水溶液であれば、いずれの形態であっても反応系に導入することができるが、好ましくは硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）である。
セリウム（ＩＶ）錯体は、限定はされないが、例えば、セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体が特に好ましい。セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体は、セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸とを水中で接触することにより得ることができる（他の錯体も同様にして得られる。）。ここで、ポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸としては、「金属キレート、Ｉ−ＩＶ」（南江堂、昭和４２年発行）に記載のものを利用することができ、例えば、エチレンジアミン四酢酸、１，３−ジアミノプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１，４−ジアミノブタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸などが好ましく挙げられる。
なお、セリウム（ＩＩＩ）イオン及びセリウム（ＩＩＩ）錯体を用いる場合も、上記のセリウム（ＩＶ）イオン及びセリウム（ＩＶ）錯体を用いる場合の記載が同様に適用できる。
（２）標的核酸の切断方法
（ｉ）本発明の標的核酸の切断方法の一態様としては、標的核酸に対して、所定の複合化合物と金属イオン若しくは金属錯体とをそれぞれ接触させる方法が挙げられる。ここで、所定の複合化合物（金属イオン等との結合体は除く）とは、上記２．（１）項に説明した通りのものである。
（ｉｉ）また、本発明の標的核酸の切断方法の他の態様としては、標的核酸に対して、所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたものを接触させる方法が挙げられる。ここで、所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたもの（金属イオン等との結合体）とは、上記２．（１）項に説明した通りのものである。
上記（ｉ）及び（ｉｉ）の切断方法においては、金属イオン又は金属錯体がセリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体である場合、当該セリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体を、標的核酸への接触前及び／又は接触以後に酸化させ、セリウム（ＩＶ）イオン若しくはセリウム（ＩＶ）錯体にすることが好ましい。ここで、セリウム（ＩＩＩ）イオン又はセリウム（ＩＩＩ）錯体を酸化させる態様としては、特に限定はされないが、例えば、空中の酸素と反応し、自発的になされる酸化が好ましく挙げられる。
また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の切断方法においては、前記複合化合物として、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物（ａ）と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物（ｂ）とを使用することができる。この際、複合化合物（ａ）及び複合化合物（ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分は、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であることが好ましい。このような２種類の複合化合物を使用する場合は、複合化合物（ａ）が結合する標的核酸の５’末端領域と複合化合物（ｂ）が結合する標的核酸の３’末端領域との間にギャップが存在していて、当該ギャップ領域中に所望の切断点が存在するようにすることが好ましく、極めて位置選択性が高くかつ効率的な核酸切断が可能となる。当該切断方法は、標的核酸として、１本鎖ＤＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのいずれか一方の鎖を所望の位置で切断する際に有用な方法である。
さらに、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の切断方法においては、標的核酸が２本鎖であり、かつ、前記複合化合物として、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ａ）と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ｂ）とを使用することができる。ここで、これら２種類の複合化合物については、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分が、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有するものであることが、２本鎖の標的核酸を効果的に切断することができるため好ましい。このような２種類の複合化合物を使用する場合は、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分は、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であることが好ましいが、特に、ペプチド核酸であることが好ましい。ペプチド核酸である場合、図３に示すように、複合化合物中の標的部分と結合する部分が、２本鎖である標的核酸のそれぞれの鎖に結合（ハイブリダイゼーション）するとともに両鎖間に入り込んで２本鎖を解き（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、各鎖に部分的に一本鎖の領域を生じさせる。この一本鎖の領域に対して、核酸切断触媒である金属イオン又は金属イオン錯体が作用し、最終的に２本鎖の標的核酸を所望の位置で効率的に切断することができる。
（３）標的核酸の切断方法の用途
本発明の標的核酸の切断方法は、巨大な核酸鎖であっても所望の位置で選択的に切断することができる方法であるため、従来、制限酵素の位置特異性で決定されていた“核酸サイズの壁”を容易に打破することができる。すなわち、制限酵素を用いた遺伝子組換え技術において正確に操作できるのは、プラスミドＤＮＡに限られるが、本発明の方法を用いれば、ウイルスゲノムはもちろんのこと、高等生物の巨大な核酸鎖であっても所望の位置で選択的に切断して正確な操作が可能となる。例えば、本発明の方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用した場合は、従来の方法では容易に操作できなかった巨大ＤＮＡ等を正確に操作することができる。また、本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏで使用し、進入したウイルスゲノムを破壊すれば抗ウイルス剤となり、ヒトの特定の遺伝子（例えば癌遺伝子）を破壊すれば、有効な癌治療薬を提供することができる。さらに、ゲノムＤＮＡ中の特定の位置を切断することにより、類似ゲノム間の交換反応（相同組換え）を促進して、ゲノムを改変することにも利用することができる。
このように、本発明の方法の有用な用途を列挙すると、以下の通りとなる。（ａ）有用な核酸操作ツールの供給、（ｂ）新たなベクターの開発（アデノウイルスや各種レトロウイルス等の遺伝子操作）、（ｃ）ターゲット能に優れた抗ウイルス剤、（ｄ）抗癌剤の開発（テロメアの破壊等）、（ｅ）相同組換え（生体内における遺伝子組換え）の促進（品種改良等）。ここで、上記（ｂ）では、例えば、従来厳密な遺伝子操作が不可能であったアデノウイルス等を正確に遺伝子操作することにより優れたベクターを開発することが挙げられ、上記（ｃ）〜（ｅ）では、例えば、本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏで活用することが挙げられる。また、上記（ｃ）では、生体内に侵入したウイルスのゲノムを選択的に破壊することが挙げられ、上記（ｄ）及び（ｅ）では、ゲノムＤＮＡを所望の位置で切断して目的を実行することが挙げられる。
３．標的核酸の切断用試薬及びキット
（１）標的核酸切断用試薬
（ｉ）本発明の標的核酸切断用試薬の一態様としては、所定の複合化合物と、金属イオン又は金属錯体とを含むものが挙げられる。ここで、所定の複合化合物（金属イオン等との結合体は除く）とは、上記２．（１）項に説明した通りのものである。
（ｉｉ）また、本発明の標的核酸切断用試薬の他の態様としては、所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたものを含むものが挙げられる。ここで、所定の複合化合物に金属イオン若しくは金属錯体を結合させたもの（金属イオン等との結合体）とは、上記２．（１）項に説明した通りのものである。
上記（ｉ）及び（ｉｉ）の試薬においては、前記複合化合物として、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物（ａ）と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物（ｂ）とを含むことができる。ここで、複合化合物（ａ）及び複合化合物（ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分は、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であることが好ましい。当該試薬は、標的核酸として、１本鎖ＤＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのいずれか一方の鎖を所望の位置で切断する際に有用なものである。
また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の試薬においては、標的核酸が２本鎖であり、かつ、前記複合化合物として、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ａ）と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物（Ｂ）とを含むことができる。このような２種類の複合化合物を含む場合は、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分が、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有するものであることが、２本鎖の標的核酸を効果的に切断することができるため好ましい。ここで、複合化合物（Ａ）及び複合化合物（Ｂ）中の、前記標的部分と結合する部分は、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であることが好ましいが、特に、ペプチド核酸であることが好ましい。
本発明の試薬は、上述したもの以外に他の成分を含んでいてもよく、限定はされない。
（２）標的核酸切断用キット
本発明の標的核酸切断用キットは、上述した本発明の標的核酸切断用試薬を構成成分として含むものである。本発明のキットは、前述した本発明の標的核酸の切断方法に有効に利用することができ、極めて有用性及び実用性が高いものである。
本発明のキットは、上記構成成分以外に、他の構成成分を含んでいてもよい。他の構成成分としては、例えば、各種バッファ、滅菌水、エッペンドルフチューブ、核酸共沈剤、各種ゲル（粉末）及びアジ化ナトリウム等の防腐剤、並びに実験操作マニュアル（説明書）等のほか、必要に応じ、各種電気泳動装置等も挙げられる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜本発明の複合化合物の合成＞
イソフタルイミドで水酸基を保護したホスホロアミダイトモノマーと、複数のホスホノ基を含有するベンズアルデヒド誘導体（図２上段に記載のＬ１−ＮＴＰ及びＬ１−ＥＤＴＰ等）とは、いずれも文献既知の合成方法により合成した。
図２下段に示すように、ＤＮＡ合成機により合成した所望のＤＮＡオリゴマーに、イソフタルイミドで水酸基を保護したホスホロアミダイトモノマーを反応させて、（ｉ）の化合物を得た。その後、当該（ｉ）の化合物を、ヒドラジン／ピリジン／酢酸混合物（１：３２：８（ｖ／ｖ／ｖ））で処理してイソフタルイミド基を除去して（図２下段のａの反応ステップ）、（ｉｉ）の化合物を得た。当該（ｉｉ）の化合物を、水溶液中にて、複数のホスホノ基を含有するベンズアルデヒド誘導体（Ｌ１−ＮＴＰ及びＬ１−ＥＤＴＰ等）と反応させ、反応させた両者間にＯ−アルキルオキシム基（−Ｏ−Ｎ＝）を形成させた（図２下段のｂ又はｃの反応ステップ）。
その結果、本発明の複合化後物として、Ｏ−アルキルオキシム基を含むリンカー部分を備えた、複数のホスホノ基を含有するＤＮＡ誘導体（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の化合物）を得た。
イソフタルイミドで水酸基を保護したホスホロアミダイトモノマーと、複数のホスホノ基を含有するベンズアルデヒド誘導体（図２上段に記載のＬ１−ＮＴＰ及びＬ１−ＥＤＴＰ等）とは、いずれも文献既知の合成方法により合成した。
図２下段に示すように、ＤＮＡ合成機により合成した所望のＤＮＡオリゴマーに、イソフタルイミドで水酸基を保護したホスホロアミダイトモノマーを反応させて、（ｉ）の化合物を得た。その後、当該（ｉ）の化合物を、ヒドラジン／ピリジン／酢酸混合物（１：３２：８（ｖ／ｖ／ｖ））で処理してイソフタルイミド基を除去して（図２下段のａの反応ステップ）、（ｉｉ）の化合物を得た。当該（ｉｉ）の化合物を、水溶液中にて、複数のホスホノ基を含有するベンズアルデヒド誘導体（Ｌ１−ＮＴＰ及びＬ１−ＥＤＴＰ等）と反応させ、反応させた両者間にＯ−アルキルオキシム基（−Ｏ−Ｎ＝）を形成させた（図２下段のｂ又はｃの反応ステップ）。
その結果、本発明の複合化後物として、Ｏ−アルキルオキシム基を含むリンカー部分を備えた、複数のホスホノ基を含有するＤＮＡ誘導体（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の化合物）を得た。
＜標的ＤＮＡの位置選択的切断（１）＞
実施例１に記載の方法により、本発明の複合化合物として、複数のホスホノ基を含有するＤＮＡ誘導体を各種合成した。なお、各種ＤＮＡ誘導体において、標的ＤＮＡに結合させる部分であるＤＮＡオリゴマー部分（塩基数２０）は、下記の配列番号１又は２に示される塩基配列からなるＤＮＡとした。
以下に、合成した各種ＤＮＡ誘導体を示した（５’−ＮＴＰ（２）、３’−ＮＴＰ（２）、５’−ＥＤＴＰ（３）、３’−ＥＤＴＰ（３）、５’−２ＮＴＰ（４）、３’−２ＮＴＰ（４）、５’−２ＥＤＴＰ（６）及び３’−２ＥＤＴＰ（６）（括弧内の数字は１分子当たりのホスホノ基の含有数））。但し、後述する実施例３及び実施例４で用いたＤＮＡ誘導体も合わせて列挙した。
また、比較対照として、ＤＮＡオリゴマーの末端にリン酸基（１個）を有するＤＮＡ誘導体や、未処理のＤＮＡオリゴマーも準備した。
標的ＤＮＡの切断反応においては、まず、５’−末端をＦＡＭで標識した標的ＤＮＡ（塩基数８５のオリゴヌクレオチド：５’−ＦＡＭ−ＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＧＴＡＧＡＣＧＣＡＡＴＧＴＣＧＧＡＣＧＴＡ−３’（配列番号３；下線部は各ＤＮＡ誘導体中のＤＮＡオリゴマー部分が結合（ハイブリダイズ）する領域））の１μＭ水溶液（ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＭ，ｐＨ７、ＮａＣｌ １００ｍＭ）に、２種（場合により１種）の前記ＤＮＡ誘導体をそれぞれ終濃度２μＭとなるように加えた。その後、９０℃で１分間加熱し、室温まで徐冷して２本鎖を形成させ（ハイブリダイゼーション）、標的ＤＮＡ中に５塩基のギャップ部分を作った。なお、各種ＤＮＡ誘導体を用いた実験の態様は、図４の右側の概略図（Ｂ）に示す通りである。次いで、ハイブリダイゼーション後の反応系に、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ水溶液を終濃度５０μＭとなるように添加し、３７℃で１１４時間反応させた。標的ＤＮＡの切断を確認するための分析は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。
結果は、図４の左側の写真（Ａ）に示す通りであった。各レーンの詳細は以下の通りである。
レーン１：未処理
レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ
レーン３：２本のＤＮＡを未処理で用いたもの
レーン４：２本のＤＮＡの末端にリン酸基を結合したもの
レーン５：２本のＤＮＡの一方にのみＮＴＰ基を結合したもの
レーン６：２本のＤＮＡの他方にのみＮＴＰ基を結合したもの
レーン７：２本のＤＮＡの両方にＮＴＰ基を結合したもの
レーン８：２本のＤＮＡの一方にのみＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン９：２本のＤＮＡの他方にのみＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン１０：２本のＤＮＡの両方にＥＤＴＰ基を結合したもの
２種のＤＮＡ誘導体のいずれのＤＮＡオリゴマーにもＮＴＰ基又はＥＤＴＰ基を結合した場合は、標的ＤＮＡがギャップ部分で効率よく切断された（レーン７及び１０）。それに対して、未処理のＤＮＡオリゴマーを用いた場合は（レーン３）、標的ＤＮＡの切断はほとんど観測されず、また２種のＤＮＡ誘導体のＤＮＡオリゴマーの末端にリン酸基を結合した場合も（レーン４）、非常に弱い切断しか観測されなかった。
実施例１に記載の方法により、本発明の複合化合物として、複数のホスホノ基を含有するＤＮＡ誘導体を各種合成した。なお、各種ＤＮＡ誘導体において、標的ＤＮＡに結合させる部分であるＤＮＡオリゴマー部分（塩基数２０）は、下記の配列番号１又は２に示される塩基配列からなるＤＮＡとした。
以下に、合成した各種ＤＮＡ誘導体を示した（５’−ＮＴＰ（２）、３’−ＮＴＰ（２）、５’−ＥＤＴＰ（３）、３’−ＥＤＴＰ（３）、５’−２ＮＴＰ（４）、３’−２ＮＴＰ（４）、５’−２ＥＤＴＰ（６）及び３’−２ＥＤＴＰ（６）（括弧内の数字は１分子当たりのホスホノ基の含有数））。但し、後述する実施例３及び実施例４で用いたＤＮＡ誘導体も合わせて列挙した。
また、比較対照として、ＤＮＡオリゴマーの末端にリン酸基（１個）を有するＤＮＡ誘導体や、未処理のＤＮＡオリゴマーも準備した。
標的ＤＮＡの切断反応においては、まず、５’−末端をＦＡＭで標識した標的ＤＮＡ（塩基数８５のオリゴヌクレオチド：５’−ＦＡＭ−ＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＧＴＡＧＡＣＧＣＡＡＴＧＴＣＧＧＡＣＧＴＡ−３’（配列番号３；下線部は各ＤＮＡ誘導体中のＤＮＡオリゴマー部分が結合（ハイブリダイズ）する領域））の１μＭ水溶液（ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＭ，ｐＨ７、ＮａＣｌ １００ｍＭ）に、２種（場合により１種）の前記ＤＮＡ誘導体をそれぞれ終濃度２μＭとなるように加えた。その後、９０℃で１分間加熱し、室温まで徐冷して２本鎖を形成させ（ハイブリダイゼーション）、標的ＤＮＡ中に５塩基のギャップ部分を作った。なお、各種ＤＮＡ誘導体を用いた実験の態様は、図４の右側の概略図（Ｂ）に示す通りである。次いで、ハイブリダイゼーション後の反応系に、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ水溶液を終濃度５０μＭとなるように添加し、３７℃で１１４時間反応させた。標的ＤＮＡの切断を確認するための分析は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。
結果は、図４の左側の写真（Ａ）に示す通りであった。各レーンの詳細は以下の通りである。
レーン１：未処理
レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ
レーン３：２本のＤＮＡを未処理で用いたもの
レーン４：２本のＤＮＡの末端にリン酸基を結合したもの
レーン５：２本のＤＮＡの一方にのみＮＴＰ基を結合したもの
レーン６：２本のＤＮＡの他方にのみＮＴＰ基を結合したもの
レーン７：２本のＤＮＡの両方にＮＴＰ基を結合したもの
レーン８：２本のＤＮＡの一方にのみＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン９：２本のＤＮＡの他方にのみＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン１０：２本のＤＮＡの両方にＥＤＴＰ基を結合したもの
２種のＤＮＡ誘導体のいずれのＤＮＡオリゴマーにもＮＴＰ基又はＥＤＴＰ基を結合した場合は、標的ＤＮＡがギャップ部分で効率よく切断された（レーン７及び１０）。それに対して、未処理のＤＮＡオリゴマーを用いた場合は（レーン３）、標的ＤＮＡの切断はほとんど観測されず、また２種のＤＮＡ誘導体のＤＮＡオリゴマーの末端にリン酸基を結合した場合も（レーン４）、非常に弱い切断しか観測されなかった。
＜標的ＤＮＡの位置選択的切断（２）＞
標的ＤＮＡとして塩基数４１のオリゴヌクレオチド：５’−ＦＡＭ−ＣＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣＮＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＧ−３’（配列番号４；下線部は各ＤＮＡ誘導体中のＤＮＡオリゴマー部分が結合（ハイブリダイズ）する領域）を用いたこと、ギャップ部位における塩基数が１であること、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ濃度が２０μＭであること、ならびに反応時間が６７時間であること以外は、基本的に実施例２（図４）と同様の操作を行った。
結果は、図５の左側の写真（Ａ）（２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果）に示す通りであった。
２種のＤＮＡ誘導体のいずれのＤＮＡオリゴマーにもＥＤＴＰ基又は２ＥＤＴＡ基を結合させた場合は（それぞれレーン５，８，９，１０）、標的ＤＮＡがほぼ単一の箇所のみで（ギャップ部分で）切断された。また、２種のＤＮＡ誘導体のいずれか一方のＤＮＡオリゴマーにのみ２ＥＤＴＰ基を結合した場合は（レーン６，７）、レーン５，８，９，１０の結果には劣るものの、十分に有効な切断が観測された。
標的ＤＮＡとして塩基数４１のオリゴヌクレオチド：５’−ＦＡＭ−ＣＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣＮＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＧ−３’（配列番号４；下線部は各ＤＮＡ誘導体中のＤＮＡオリゴマー部分が結合（ハイブリダイズ）する領域）を用いたこと、ギャップ部位における塩基数が１であること、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ濃度が２０μＭであること、ならびに反応時間が６７時間であること以外は、基本的に実施例２（図４）と同様の操作を行った。
結果は、図５の左側の写真（Ａ）（２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果）に示す通りであった。
２種のＤＮＡ誘導体のいずれのＤＮＡオリゴマーにもＥＤＴＰ基又は２ＥＤＴＡ基を結合させた場合は（それぞれレーン５，８，９，１０）、標的ＤＮＡがほぼ単一の箇所のみで（ギャップ部分で）切断された。また、２種のＤＮＡ誘導体のいずれか一方のＤＮＡオリゴマーにのみ２ＥＤＴＰ基を結合した場合は（レーン６，７）、レーン５，８，９，１０の結果には劣るものの、十分に有効な切断が観測された。
＜標的ＤＮＡの位置選択的切断（３）＞
実施例１に記載の方法により、本発明の複合化合物として、複数のホスホノ基を含有するＤＮＡ誘導体を各種合成した。具体的には、実施例２中に示した５’−ＥＤＴＰ（３）及び３’−ＥＤＴＰ（３）のＤＮＡ誘導体（括弧内の数字は１分子当たりのホスホノ基の含有数）を合成した。なお、各種ＤＮＡ誘導体において、標的ＤＮＡに結合させる部分であるＤＮＡオリゴマー部分（塩基数２０）は、実施例２と同様、下記の配列番号１又は２に示される塩基配列からなるＤＮＡとした。
また、比較対照についても、実施例２と同様に、ＤＮＡオリゴマーの末端にリン酸基（１個）を有するＤＮＡ誘導体、及び未処理のＤＮＡオリゴマーを準備した。
標的ＤＮＡの切断反応においては、まず、５’−末端をＦＡＭで標識した標的ＤＮＡ（塩基数８５のオリゴヌクレオチド：５’−ＦＡＭ−ＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＧＴＡＧＡＣＧＣＡＡＴＧＴＣＧＧＡＣＧＴＡ−３’（配列番号３；下線部は各ＤＮＡ誘導体中のＤＮＡオリゴマー部分が結合（ハイブリダイズ）する領域））の１μＭ水溶液（ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＭ，ｐＨ７、ＮａＣｌ １００ｍＭ）に、２種（場合により１種）の前記ＤＮＡ誘導体をそれぞれ終濃度１μＭとなるように加えた。その後、９０℃で１分間加熱し、室温まで徐冷して２本鎖を形成させ（ハイブリダイゼーション）、標的ＤＮＡ中に５塩基のギャップ部分を作った。なお、各種ＤＮＡ誘導体を用いた実験の態様は、図６の右側の概略図（Ｂ）に示す通りである。次いで、ハイブリダイゼーション後の反応系に、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ水溶液あるいはＣｅ（ＩＩＩ）水溶液（具体的にはＣｅ（ＮＯ３）３水溶液）を、終濃度４μＭとなるように添加し、５０℃で９４時間反応させた。ここで、添加したＣｅ（ＩＩＩ）は、反応系内で、（空気中由来の酸素によって自発的に）酸化されＣｅ（ＩＶ）に変化した。標的ＤＮＡの切断を確認するための分析は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。
結果は、図６の左側の写真（Ａ）に示す通りであった。各レーンの詳細は以下の通りである。
レーンＮ：未処理
レーンＰ４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ
レーンＰ３：Ｃｅ（ＩＩＩ）のみ
レーン１：２本のＤＮＡの両方の末端にリン酸基を結合したもの
レーン２：１本のＤＮＡにＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン３：１本のＤＮＡにＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン４：２本のＤＮＡの両方にＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン５：２本のＤＮＡの両方の末端にリン酸基を結合したもの
レーン６：１本のＤＮＡにＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン７：１本のＤＮＡにＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン８：２本のＤＮＡの両方にＥＤＴＰ基を結合したもの
（レーン１〜４はＣｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体を添加，レーン５〜８はＣｅ（ＩＩＩ）を添加）
Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡを添加した反応系では（レーン１〜４）、２種のＤＮＡ誘導体のいずれのＤＮＡオリゴマーにもＥＤＴＰ基を結合した場合に（レーン４）、標的ＤＮＡのギャップ部分での切断効率が顕著に高かった。
これに対して、Ｃｅ（ＩＩＩ）を添加した反応系では（レーン５〜８）、１種のＤＮＡ誘導体のＤＮＡオリゴマーにＥＤＴＰ基を結合した場合でも（レーン６）、ある程度高い切断効率が認められ、２種のＤＮＡ誘導体のいずれのＤＮＡオリゴマーにもＥＤＴＰ基を結合した場合は（レーン８）は、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡを添加した場合（レーン４）よりも相当顕著に高い切断効率が認められた。
実施例１に記載の方法により、本発明の複合化合物として、複数のホスホノ基を含有するＤＮＡ誘導体を各種合成した。具体的には、実施例２中に示した５’−ＥＤＴＰ（３）及び３’−ＥＤＴＰ（３）のＤＮＡ誘導体（括弧内の数字は１分子当たりのホスホノ基の含有数）を合成した。なお、各種ＤＮＡ誘導体において、標的ＤＮＡに結合させる部分であるＤＮＡオリゴマー部分（塩基数２０）は、実施例２と同様、下記の配列番号１又は２に示される塩基配列からなるＤＮＡとした。
また、比較対照についても、実施例２と同様に、ＤＮＡオリゴマーの末端にリン酸基（１個）を有するＤＮＡ誘導体、及び未処理のＤＮＡオリゴマーを準備した。
標的ＤＮＡの切断反応においては、まず、５’−末端をＦＡＭで標識した標的ＤＮＡ（塩基数８５のオリゴヌクレオチド：５’−ＦＡＭ−ＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＧＴＡＧＡＣＧＣＡＡＴＧＴＣＧＧＡＣＧＴＡ−３’（配列番号３；下線部は各ＤＮＡ誘導体中のＤＮＡオリゴマー部分が結合（ハイブリダイズ）する領域））の１μＭ水溶液（ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＭ，ｐＨ７、ＮａＣｌ １００ｍＭ）に、２種（場合により１種）の前記ＤＮＡ誘導体をそれぞれ終濃度１μＭとなるように加えた。その後、９０℃で１分間加熱し、室温まで徐冷して２本鎖を形成させ（ハイブリダイゼーション）、標的ＤＮＡ中に５塩基のギャップ部分を作った。なお、各種ＤＮＡ誘導体を用いた実験の態様は、図６の右側の概略図（Ｂ）に示す通りである。次いで、ハイブリダイゼーション後の反応系に、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ水溶液あるいはＣｅ（ＩＩＩ）水溶液（具体的にはＣｅ（ＮＯ３）３水溶液）を、終濃度４μＭとなるように添加し、５０℃で９４時間反応させた。ここで、添加したＣｅ（ＩＩＩ）は、反応系内で、（空気中由来の酸素によって自発的に）酸化されＣｅ（ＩＶ）に変化した。標的ＤＮＡの切断を確認するための分析は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。
結果は、図６の左側の写真（Ａ）に示す通りであった。各レーンの詳細は以下の通りである。
レーンＮ：未処理
レーンＰ４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ
レーンＰ３：Ｃｅ（ＩＩＩ）のみ
レーン１：２本のＤＮＡの両方の末端にリン酸基を結合したもの
レーン２：１本のＤＮＡにＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン３：１本のＤＮＡにＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン４：２本のＤＮＡの両方にＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン５：２本のＤＮＡの両方の末端にリン酸基を結合したもの
レーン６：１本のＤＮＡにＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン７：１本のＤＮＡにＥＤＴＰ基を結合したもの
レーン８：２本のＤＮＡの両方にＥＤＴＰ基を結合したもの
（レーン１〜４はＣｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体を添加，レーン５〜８はＣｅ（ＩＩＩ）を添加）
Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡを添加した反応系では（レーン１〜４）、２種のＤＮＡ誘導体のいずれのＤＮＡオリゴマーにもＥＤＴＰ基を結合した場合に（レーン４）、標的ＤＮＡのギャップ部分での切断効率が顕著に高かった。
これに対して、Ｃｅ（ＩＩＩ）を添加した反応系では（レーン５〜８）、１種のＤＮＡ誘導体のＤＮＡオリゴマーにＥＤＴＰ基を結合した場合でも（レーン６）、ある程度高い切断効率が認められ、２種のＤＮＡ誘導体のいずれのＤＮＡオリゴマーにもＥＤＴＰ基を結合した場合は（レーン８）は、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡを添加した場合（レーン４）よりも相当顕著に高い切断効率が認められた。
本発明によれば、金属イオンや金属イオン錯体を核酸（ＤＮＡ等）の切断触媒として用いて標的核酸を所望の位置で切断する方法であって、位置選択性及び反応効率が高く、副反応性（非特異反応性）が低く、さらに経済性及び簡便性にも優れた、標的核酸の切断方法を提供することができる。ここで、経済性については、例えば、金属イオン等の切断触媒の使用量を大きく低減することができ、簡便性については、例えば、当該方法に用いる新規化合物を核酸の切断反応条件下で合成することができるという点で優れている。このような点で、本発明の標的核酸の切断方法は、極めて有用であり実用性の高いものである。
また本発明によれば、上記本発明の切断方法に用い得る新規複合化合物、試薬及びキットを提供することができる。当該新規複合化合物は、上述のように、核酸の切断反応条件下において合成可能であるため簡便性に優れ、また合成後は、同条件下において構造上非常に安定なものであるため、標的核酸の切断効率を一層向上させることができる。
また本発明によれば、上記本発明の切断方法に用い得る新規複合化合物、試薬及びキットを提供することができる。当該新規複合化合物は、上述のように、核酸の切断反応条件下において合成可能であるため簡便性に優れ、また合成後は、同条件下において構造上非常に安定なものであるため、標的核酸の切断効率を一層向上させることができる。
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号４：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置２１）。
［配列表］
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号４：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置２１）。
［配列表］
Claims (33)
- 少なくとも３つのホスホノ基を含有する化合物と、特定の核酸配列に結合する化合物とが、Ｏ−アルキルオキシム基を含有するリンカー部分により結合されてなる、複合化合物。
- 特定の核酸配列に結合する化合物が、オリゴヌクレオチド又はペプチド核酸である、請求項１記載の複合化合物。
- オリゴヌクレオチドの塩基数が７〜５０塩基であり、又はペプチド核酸の塩基数が５〜２５塩基である、請求項２記載の複合化合物。
- 前記核酸がDNAである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合化合物。
- 下記式（１）で表される請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合化合物。
- Ｒ１がオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸であり、Ｒ３が下記式（３）で表される基である、請求項５記載の複合化合物。
- Ｒ２が下記式（２）で表されるものである、請求項５又は６記載の複合化合物。
- 前記ホスホノ基に、金属イオン又は金属錯体が結合したものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合化合物。
- 金属イオン又は金属錯体が、セリウム(IV)イオン若しくはセリウム(IV)錯体、又はセリウム(III)イオン若しくはセリウム(III)錯体である、請求項８記載の複合化合物。
- 錯体が、セリウム(IV)又はセリウム(III)とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体である、請求項９記載の複合化合物。
- 標的核酸に、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合化合物と、金属イオン又は金属錯体とを接触させる、標的核酸の切断方法。
- 金属イオン又は金属錯体が、セリウム(IV)イオン若しくはセリウム(IV)錯体、又はセリウム(III)イオン若しくはセリウム(III)錯体である、請求項１１記載の方法。
- 錯体が、セリウム(IV)又はセリウム(III)とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体である、請求項１２記載の方法。
- セリウム(III)イオン又はセリウム(III)錯体を、標的核酸への接触前及び／又は接触以後に酸化させ、セリウム(IV)イオン若しくはセリウム(IV)錯体にすることを特徴とする、請求項１２又は１３記載の方法。
- 標的核酸に、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の複合化合物を接触させる、標的核酸の切断方法。
- 複合化合物中の金属イオン又は金属錯体がセリウム(III)イオン又はセリウム(III)錯体であって、当該セリウム(III)イオン又はセリウム(III)錯体を、標的核酸への接触前及び／又は接触以後に酸化させ、セリウム(IV)イオン若しくはセリウム(IV)錯体にすることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
- 標的核酸がDNAである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記複合化合物として、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物(a)と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物(b)とを使用する、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
- 複合化合物(a)が結合する標的核酸の５’末端領域と複合化合物(b)が結合する標的核酸の３’末端領域との間にギャップが存在し、当該ギャップ中に所望の切断点が存在する、請求項１８記載の方法。
- 複合化合物(a)及び複合化合物(b)中の、前記標的部分と結合する部分が、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸である、請求項１９記載の方法。
- 標的核酸が２本鎖であり、前記複合化合物として、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物(A)と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物(B)とを使用する、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
- 複合化合物(A)及び複合化合物(B)中の、前記標的部分と結合する部分が、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸である、請求項２１記載の方法。
- 複合化合物(A)及び複合化合物(B)中の、前記標的部分と結合する部分が、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有する、請求項２２記載の方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合化合物と、金属イオン又は金属錯体とを含む、標的核酸の切断用試薬。
- 金属イオン又は金属錯体が、セリウム(IV)イオン若しくはセリウム(IV)錯体、又はセリウム(III)イオン若しくはセリウム(III)錯体である、請求項２４記載の試薬。
- 錯体が、セリウム(IV)又はセリウム(III)とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体である、請求項２５記載の試薬。
- 請求項８〜１０のいずれか１項に記載の複合化合物を含む、標的核酸の切断用試薬。
- 前記複合化合物が、標的核酸の標的部分の５’末端領域に結合する複合化合物(a)と、当該標的部分の３’末端領域に結合する複合化合物(b)とを含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の試薬。
- 複合化合物(a)及び複合化合物(b)中の、前記標的部分と結合する部分が、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸である、請求項２８記載の試薬。
- 標的核酸が２本鎖であり、前記複合化合物が、標的核酸の一方の鎖の標的部分と結合する複合化合物(A)と、標的核酸の他方の鎖の標的部分と結合する複合化合物(B)とを含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の試薬。
- 複合化合物(A)及び複合化合物(B)中の、前記標的部分と結合する部分が、いずれもオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸である、請求項３０記載の試薬。
- 複合化合物(A)及び複合化合物(B)中の、前記標的部分と結合する部分が、互いに相補的な部分を有し、且つそれぞれの５’末端側及び／又は３’末端側に互いに相補的でない部分を有する、請求項３１記載の試薬。
- 請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の試薬を含む、標的核酸の切断用キット。
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