JP7099724B2 - 規定された配列および長さのdna1本鎖分子の拡大可能な生物工学的生成 - Google Patents
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Description
DNAオリゴヌクレオチドは、種々の適用のために生命科学および医療において必要とされる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはリアルタイムPCR(RT-PCR)または定量的PCR(Q-PCR)を、それぞれに行うためのプライマーとして要求される。さらに、オリゴヌクレオチドは、新たな遺伝子の合成のための出発物質として必要とされる。DNAオリゴヌクレオチドに関する増大しつつある需要は、最小量で任意の所望の配列のDNAオリゴヌクレオチドを迅速に生成することを主に専門にする産業をもたらした。DNAオリゴヌクレオチドは、代表的には、固相上での周期的化学合成プロセスにおいて一塩基ずつ生成される。このプロセスは、微視的なビーズ上で、またはチップ表面上でのインクジェット方法で行われ得る。塩基付加反応は、100%効率では進まないので、任意の長さでDNA1本鎖を生成することは可能ではない。その収率は、指数関数的様式において、標的DNAオリゴヌクレオチドの所望の長さとともに低下する。代表的には、100塩基までの長さの分子は、筋の通った努力をして生成され得る。企業によっては、200塩基までの長さに対しては、DNAオリゴヌクレオチドの(コスト集約的)合成を提供する。さらに、DNAオリゴヌクレオチドの合成は、代表的には、ミリグラムスケールに制限される。これは、従来までの適用の大部分に関しては十分である。
本発明によれば、この目的は、DNA1本鎖分子の組換え生成のための方法であって、該方法は、
(1)偽遺伝子核酸を提供する工程であって、
ここで該偽遺伝子核酸は、少なくとも1種の標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する2種の自己切断DNA配列を含む核酸である、
工程、
(2)該偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を該ベクターで形質転換し、そして前駆ssDNAを該ベクターから細菌培養条件下で生成する工程であって、
ここで該前駆ssDNAは、該偽遺伝子核酸を含む、
工程;
(3)該前駆ssDNAを該細菌培養物から単離する工程;
(4)該前駆ssDNAを、該自己切断DNA配列が活性になる反応条件下で消化する工程;ならびに
(5)該標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得るために、該標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程、
を包含する方法によって解決される。
-DNAナノテクノロジーにおいて、
-研究ツールとして、
-診断用のプローブとして、
-遺伝子合成において、
-遺伝子治療において、
-分子検知において/分子センサーとして、
使用することにより解決される。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される:
(項目1)
DNA1本鎖分子の組換え生成のための方法であって、該方法は、
(1)偽遺伝子核酸を提供する工程であって、
ここで該偽遺伝子核酸は、少なくとも1種の標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する2種の自己切断DNA配列を含む核酸である、
工程、
(2)該偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を該ベクターで形質転換し、そして前駆ssDNAを該ベクターから細菌培養条件下で生成する工程であって、
ここで該前駆ssDNAは、該偽遺伝子核酸を含む、
工程;
(3)該前駆ssDNAを該細菌培養物から単離する工程;
(4)該前駆ssDNAを、該自己切断DNA配列が活性になる反応条件下で消化する工程;ならびに
(5)該標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得るために、該標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程、
を包含する方法。
(項目2)
前記自己切断DNA配列は、自己切断デスオキシリボザイムまたはDNAzyme、
例えば、Zn 2+ 依存性DNAzyme、例えば、I-R3
である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記偽遺伝子核酸は、2種、3種、4種または約50種より多くの標的DNAオリゴヌクレオチド配列を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、約20ヌクレオチドから約数千ヌクレオチドの範囲の長さを有する、項目1~3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記細菌は、E.coli、特に、K12由来E.coli安全株、例えば、DH5alpha、XL-1blueまたはJM109から選択される、項目1~4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記工程(2)におけるベクターは、少なくとも1種のファージミドであり、必要に応じて、さらなる構成要素:
例えば、
-パッケージング配列、
-細胞***の間に該ファージミドの伝播を保証する構成要素、
-選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子、
を含む、項目1~5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
さらにヘルパープラスミドまたはヘルパーファージが使用され、該ヘルパープラスミドまたはヘルパーファージは、さらなる構成要素、例えば、
-バクテリオファージ、例えば、M13バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子、
-細胞***の間に該ヘルパープラスミドの伝播を保証する構成要素、
-選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子、
を含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記工程(2)におけるベクターは、少なくとも1種のファージミドであり、ローリングサークル増幅(RCA)を介して前記細菌細胞内部で増幅され、ファージミドssDNAを生じる、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記ファージミドssDNAは、好ましくは前記細胞から分泌されるファージ様粒子へとパッケージされる、項目8に記載の方法。
(項目10)
工程(3)は、前記ファージ様粒子を前記細胞培養物から抽出すること、そして前記ファージミドssDNAを該ファージ様粒子から抽出することを包含する、項目6~9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記工程(4)の消化は、Zn 2+ イオンの添加によって誘発される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記工程(5)における標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程は、
前記自己切断DNA配列、例えば、DNAzymeから、例えば、クロマトグラフィーを介して分離すること、
を包含する、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
(6)前記標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさらに加工処理する工程、
例えば、DNA折り紙構造、タイルに基づくDNAナノ構造、もしくは結晶性DNAナノ物質へと自己アセンブルおよび/または折りたたむ工程、
あるいは他の分子を結合、検出、または加工処理するためのアプタマーもしくはDNAzymeとしての使用、
をさらに包含する、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記細菌培養は、バイオリアクター、例えば、撹拌タンクバイオリアクターで行われる、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
先行する項目のいずれか1項に記載の方法において得られる標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの
-DNAナノテクノロジーにおける、
-研究ツールとしての、
-診断用のプローブとしての、
-遺伝子合成における、
-遺伝子治療における、
-分子検知における、
使用。
本発明を以下により詳細に記載する前に、本発明は、本明細書で記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことは、これらが変動し得ることから、理解されるべきである。本明細書で使用される用語法が、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、本発明の範囲を限定するとは意図されないことはまた、理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書で引用される全ての参考文献は、これらの全体において参考として援用される。
本発明は、DNA1本鎖分子、特に、1本鎖DNAオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの組換え生成のための方法を提供する。
(1)偽遺伝子核酸を提供する工程であって、
ここで上記偽遺伝子核酸は、少なくとも1種の標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する2種の自己切断DNA配列を含む核酸である
工程;
(2)上記偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を上記ベクターで形質転換し、前駆ssDNAを上記ベクターから細菌培養条件下で生成する工程であって、
ここで上記前駆ssDNAは、上記偽遺伝子核酸を含む
工程;
(3)上記前駆ssDNAを上記細菌培養物から単離する工程;
(4)上記前駆ssDNAを、自己切断DNA配列が活性になる反応条件下で消化する工程;ならびに
(5)上記標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離して得る工程、
を包含する。
「偽遺伝子核酸(pseudogene nucleic acid)」とは、少なくとも1種の標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する2種の自己切断DNA配列を含む核酸である。
例えば、
-Zn2+依存性DNAzyme、
例えば、I-R3、およびGuら, 2013に記載される他の改変体、ならびにGuら, 2013に記載されるものから得られる改変体、
である。
そしてここでP3は、自由裁量の配列のスペーサーであり、ここでP1およびP1’は、DNA二重らせんを形成する2種の相補的配列である。同じことが、P2およびP2’についても当てはまる。
工程(2)では、偽遺伝子核酸は、ベクターに組み込まれる。上記ベクターは、形質転換を介して細菌細胞へと導入され、前駆ssDNAは、上記ベクターから細菌培養条件下で生成される。
例えば、
-パッケージング配列、
-細胞***の間にファージミドの伝播を保証する構成要素、
-選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子
を含み得る。
-バクテリオファージ、例えば、M13バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子、
-細胞***の間にヘルパープラスミドの伝播を保証する構成要素、
-選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子
を含むヘルパープラスミドまたはヘルパーファージが、使用される。
前駆ssDNAは、細菌培養物から単離される。
-ファージ様粒子を細胞培養物から、好ましくは培養上清から
例えば、細胞をペレット化し、例えば、沈殿によって(例えば、PEGを使用して)、ファージ様粒子を上清から取り出し/抽出することを介して、
抽出する工程、
-ファージミドssDNAをファージ様粒子から、
例えば、タンパク質コートの化学的溶解およびssDNAのエタノール沈殿を介して
抽出する工程、
を包含する。
例えば、Kickら, 2015を参照のこと。
次いで、単離された前駆ssDNAは、自己触媒性様式で消化される、すなわち、自己切断DNA配列は、前駆ssDNAを切断する。
次に、標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、特に、工程(4)の副生成物である自己切断DNA配列から分離される。
例えば、
例えば、エタノールおよび酢酸カリウムでの、またはポリエチレングリコールでの沈殿、
クロマトグラフィー、
またはこれらの組み合わせ、
によって行われ得る
一実施形態において、本発明の方法は、さらなる工程、
(6)標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさらに加工処理する工程、
を包含する。
本発明は、本発明の方法において得られる標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、DNAナノテクノロジーにおける使用を提供する。
DNA折り紙構造は、以下であり得る:
DNAナノロッド、
例えば、本明細書の実施例1に記載されるもの;
DNAナノポア、
例えば、欧州特許出願第2 695 949号に記載されるもの;
DNAヘリックスチューブ、
例えば、本明細書の実施例3に記載されるもの;
DNAポインター物体、
例えば、本明細書の実施例3またはBaiら, 2012に記載されるもの;
治療上活性なDNAナノ構造または薬物送達ビヒクル、配置デバイス(positioning device)、
ナノセンサー。
本発明者らは、細菌における1本鎖DNAオリゴヌクレオチドの組換え生成のための生物工学的方法を提示する。上記方法を用いると、数千塩基までの長さを有する1本鎖DNA分子は、任意の拡大可能な量で生成され得る。この方法に起因して、DNAベースのナノ構造の大量生産が、事実上可能になる。
2種のDNAプラスミドが、E.coli細胞の中に、同時形質転換を介して導入される(図2)。その「ヘルパープラスミド」は、M13バクテリオファージのタンパク質およびE.coli細胞***の間に娘細胞へのヘルパープラスミドの伝播を保証するさらなる情報(プラスミド骨格)のための遺伝子を含む。その「ファージミド」(=ファージ-プラスミド)は、特別の条件付き形態(「連結された前駆ssDNA」)において生成されるべきDNAオリゴヌクレオチド配列およびとりわけ、細胞***の間のそのファージミドの伝播を保証するさらなる情報を含む。
図3は、上記特別の条件付き形態、すなわち、「連結された前駆ssDNA」における偽遺伝子の構造を示す。
切断に起因して、その前駆ssDNAは、所望の1本鎖DNAオリゴヌクレオチドおよび触媒性DNAzyme(これは、副生成物である)へと、分離または分かれる。そのDNAzymeは、標的DNAオリゴヌクレオチドから、例えば、クロマトグラフィーを介して分離され得る。
ヘルパープラスミド(Marchiら, 2014)または酵素(Schmidtら, 2015)を用いる1本鎖ファージミドDNAの生物工学的生成のための方法は、当該分野で記載されている。さらに、長い環状ssDNAをユーザー定義の配列において制限エンドヌクレアーゼの助けを借りて消化する工程を包含する方法が、当該分野で記載されている(Ducaniら, 2013)。
プロトタイプとして、DNAベースのナノロッドを、本発明の方法によって専ら生成したDNA物質から生成した。そのDNAベースのナノロッドを消化し、DNA折り紙デザイン法(Rothemund, 2006を参照のこと;米国特許出願2007/117109 A1号および同2012/ 251583 A1号;米国特許第7,842,793 B2号および同第8,501,923 B2号もまた参照のこと)で発展させた。このナノロッドは、ハニカム格子の状態で平行に整列されかつ鎖接続(strand connection)を介して架橋される10種のDNA二重らせんからなる(図4Aを参照のこと)。そのナノロッドに関しては、2500塩基長の1本鎖DNA骨格分子(「足場鎖」)は、21のDNAオリゴヌクレオチド(「ステープル鎖」)(各々は、約100塩基の長さを有する)と同様に必要とされる。全ての要求される構築エレメントは、そのために特別に構築されたファージミドに由来する。
-配列:
DNAzyme:
そしてここでP3は、自由裁量の配列のスペーサーであり、ここでP1およびP1’は、DNA二重らせんを形成する2種の相補的配列である。その同じことがP2およびP2’にも当てはまる。
この実施例において、ファージミド1本鎖DNAを、E.coli液体培養物中で生成し、そこから精製した。この目的のために、ケミカルコンピテントDH5alpha細胞を、ファージミドおよびヘルパープラスミドで共形質転換した。そのようにして得られた株を、50mg/l カナマイシンおよび100mg/l カルベニシリンを含む2×YT培地中で増殖させた。37℃において一晩のインキュベーション後、その培養物を4000rcfにおいて30分間遠心分離した。固体PEG 8000およびNaClを、各々最終濃度3%(m/v)になるようにその上清に添加した。次いで、ファージ様粒子を、4000rcfにおいて30分間遠心分離することによって沈殿させた。ssDNAを、Kickら, 2015に記載されるようにこれらの粒子から抽出した。
次いで、そのファージミド1本鎖DNAを、反応緩衝液(50mM Hepes pH7、100mM NaCl、2mM ZnCl2)中で、3時間、37℃においてインキュベートした。インキュベーション後、そのDNAを所望のセグメントへと完全に消化する(図5を参照のこと)。その後、そのDNAをエタノールおよび酢酸カリウムで沈殿させ、折り紙折りたたみ緩衝液(10mM Tris、5mM NaCl、1mM EDTA、20mM MgCl2)中に溶解する。そのDNA溶液を、15分間にわたって65℃へと加熱し、次いで、60℃から40℃へとゆっくりと冷却する(3時間/1℃)。ゲル電気泳動分析(図4Bを参照のこと)および透過型電子顕微鏡法(図4Cを参照のこと)から、標的構造の成功裡のアセンブルが確認される。
本発明者らのファージミドを構築するために、本発明者らは、制限酵素結合部位が挿入されるその同じ方法で、その標的オリゴヌクレオチド間に一定のDNAzyme配列を単に置くことはしない。DNAzymeの配列は、生成されるべきであるオリゴヌクレオチドの末端配列に依存する。Guら(Biotechniques 2013)は単に同じ末端配列、従って同じDNAzymeを使用するが、本発明者らの方法は、異なる標的オリゴヌクレオチド配列を生成するために異なるDNAzyme配列を使用する
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Claims (25)
- DNA1本鎖分子の組換え生成のための方法であって、該方法は、
(1)偽遺伝子核酸を提供する工程であって、
ここで該偽遺伝子核酸は、少なくとも1種の標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および自己切断DNA配列を含む核酸であり、各標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、その両方の末端において、1つの自己切断DNA配列に隣接する、
工程、
(2)該偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌培養物中で細菌細胞を該ベクターで形質転換し、そして前駆ssDNAを該ベクターから細菌培養条件下で生成する工程であって、
ここで該前駆ssDNAは、該偽遺伝子核酸を含む、
工程;
(3)該前駆ssDNAを該細菌培養物から単離する工程;
(4)該前駆ssDNAを、該自己切断DNA配列が活性になる反応条件下で消化して、標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを生成する工程;ならびに
(5)該標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得るために、該標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程、
を包含する方法。 - 前記自己切断DNA配列は、自己切断デオキシリボザイムまたはDNAzymeである、請求項1に記載の方法。
- 前記自己切断DNA配列は、Zn2+依存性DNAzymeである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記Zn2+依存性DNAzymeは、I-R3である、請求項3に記載の方法。
- 前記偽遺伝子核酸は、2種、3種、4種または約50種より多くの標的DNAオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 標的DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、約20ヌクレオチドから約数千ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、E.coli、またはK12由来E.coli安全株から選択される細菌由来である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、DH5alpha、XL-1blueまたはJM109である、請求項7に記載の方法。
- 前記工程(2)におけるベクターは、少なくとも1種のファージミドである、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(2)におけるベクターは、
-パッケージング配列、
-細胞***の間に該ファージミドの伝播を保証する構成要素、
-選択マーカー、
をさらなる構成要素として含む、少なくとも1種のファージミドである、請求項9に記載の方法。 - さらにヘルパープラスミドまたはヘルパーファージが使用され、該ヘルパープラスミドまたはヘルパーファージは、さらなる構成要素を含む、請求項9または10に記載の方法。
- 前記ヘルパープラスミドまたはヘルパーファージは、
-バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子、
-細胞***の間に該ヘルパープラスミドの伝播を保証する構成要素、
-選択マーカー、
をさらなる構成要素として含む、請求項11に記載の方法。 - 前記バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子は、M13バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項12に記載の方法。
- 前記選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である、請求項10または12に記載の方法。
- 前記工程(2)におけるベクターは、少なくとも1種のファージミドであり、ローリングサークル増幅(RCA)を介して前記細菌細胞内部で増幅され、ファージミドssDNAを生じる、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ファージミドssDNAは、前記細菌細胞から分泌されるファージ様粒子へとパッケージされる、請求項15に記載の方法。
- 工程(3)は、前記ファージ様粒子を前記細菌培養物から抽出すること、そして前記ファージミドssDNAを該ファージ様粒子から抽出することを包含する、請求項16に記載の方法。
- 前記工程(4)の消化は、Zn2+イオンの添加によって誘発される、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(5)における標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程は、
前記自己切断DNA配列から分離すること、
を包含する、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。 - 前記自己切断DNA配列からの分離は、クロマトグラフィーを介する、請求項19に記載の方法。
- (6)前記標的1本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさらに加工処理する工程、
をさらに包含する、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。 - 前記さらに加工処理する工程は、DNA折り紙構造、タイルに基づくDNAナノ構造、もしくは結晶性DNAナノ物質へと自己アセンブルおよび/または折りたたむことを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記さらに加工処理する工程は、他の分子を結合、検出、または加工処理するためのアプタマーもしくはDNAzymeとしての使用を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記工程(2)は、バイオリアクターで行われる、請求項1~23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記バイオリアクターは、撹拌タンクバイオリアクターである、請求項24に記載の方法。
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