JP5502373B2 - 平滑筋細胞の増殖抑制方法 - Google Patents
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Description
本発明の一実施例に係る平滑筋細胞の増殖抑制材料は、ダイヤモンド様炭素(DLC)膜等の炭素質膜であり、カルボキシル基を有している。以下に、その構成及び製造方法について詳細に説明する。
基材の表面にダイヤモンド様炭素(DLC)膜を形成した。細胞培養の際には基材として直径15mmのカバーガラスを用いた。DLC膜は化学気相堆積(CVD)法を用いて形成した。具体的には、基材を載置したチャンバ内にC2H2を流量が150sccm(cm3/分、但し1気圧、0℃)で、圧力が3Pa(22mTorr)となるように導入し、RF電極に100Wの高周波電力を印加した。これにより、カルボキシル基導入率が0%で膜厚が0.13μmのDLC膜を得た。なお、DLC膜とは、sp2炭素−炭素結合(グラファイト結合)及びsp3炭素−炭素結合(ダイヤモンド結合)を含むアモルファス膜である。
得られたDLC膜にプラズマを照射することにより、官能基導入率が異なるDLC膜を形成した。プラズマ照射は平行平板型のプラズマ照射装置により行った。ターボ分子ポンプを使用し、高真空条件下でプラズマ処理を行える装置と、ロータリーポンプのみを使用し、低真空条件下でプラズマ処理を行える装置とを用いた。プラズマ照射装置のチャンバ内にDLC膜を形成した基材をセットした後、チャンバ内の圧力を1×10-3Pa以下又は2Pa以下まで排気する。次に、チャンバ内にガスを所定の流量で導入し、平行平板電極の間に高周波電力を印加することによりプラズマを発生させた。高周波電力は、高真空条件の場合には100Wとし、低真空条件の場合には30Wとした。ガス流量の調整はマスフローコントローラにより行い、プラズマ照射時のチャンバ内圧力は高真空条件の場合には1Paとし、低真空条件の場合には130Paとした。高周波電力は、マッチングボックスを介して接続された高周波電源を用いて印加した。プラズマの生成に用いたガスは、アルゴン(Ar)、アセチレン(C2H2)、アンモニア(NH3)及び酸素(O2)である。これにより、カルボキシル基導入率が1.5%〜3.9%までの9種類のサンプルを形成した。
DLC膜の表面におけるカルボキシル基の導入率及び窒素の導入率はX線光電子分光(XPS)測定により評価した。XPS測定には、日本電子株式会社製の光電子分光装置JPS−9010MCを用いた。X線源にはアルミニウムKα線を用い、加速電圧が12.5kVで、エミッション電流が10mAの条件でX線を発生させた。試料中から任意に選択した直径5mmのエリアについて測定を行った。また、X線を試料に対して45度の角度で入射させ、検出角度を試料面に対して90度とすることにより、5nm程度の深さまでの組成を測定した。
細胞の増殖率は次の様にして求めた。COO/Cの値が異なる種々のDLC膜がコートされた直径15mmのカバーグラスを70%エタノールにより滅菌した後、24穴の細胞培養用マルチプレート(Costar 3516、コーニング社)の底に置き、超純水により3回洗浄した。カバーグラスの表面に人冠動脈由来の平滑筋細胞(Cell Applications社:HCASMC)を1×104cell/well(500μL)の密度で播種した。播種の後、温度を37℃とし、5%炭酸ガス雰囲気で4日間継続して培養を行った。培地には、Cell Applications社より販売されている各細胞専用の培地を使用し、培地交換は毎日行った。4日間培養した後の細胞増殖率をCell-Counting-Kit8(同仁化学製)を用いて求めた。測定法はキットに添付のマニュアルに従い行った。各DLC膜における増殖率の比較は、増殖した細胞数に対応する細胞内のミトコンドリアの活性により生じるWST-8 frmazanの濃度(吸光度)をマイクロプレートリーダーを用いて求め、市販の細胞培養プレート(TCP)上で培養を行った場合の吸光度を100%とし、これに対する各サンプルの%増殖率を算出すことにより増殖性を比較検討した。
図1は、COO/Cの値と平滑筋細胞の増殖率との関係を示している。図1に示すようにCOO/Cの値が大きくなると増殖率の値が大きくなった。COO/Cの値が3.5%以下の場合には、平滑筋細胞の増殖率が100%未満となったが、COO/Cの値が3.5%を越えると平滑筋細胞の増殖率が100%を越え、TCPよりも平滑筋細胞が増殖しやすくなった。TCPは優れた細胞増殖性を示すように処理がなされているが、カルボキシル基導入率が低いDLC膜は、TCPよりも優れた平滑筋細胞の増殖抑制材料となることが示された。
Claims (1)
- 表面にカルボキシル基が導入され、且つ前記カルボキシル基の全炭素に対する導入率が3.5%以下であるダイヤモンド様炭素膜を用いる、人体内を除く平滑筋細胞の増殖抑制方法。
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