JP5489146B2 - 肥満の遺伝的リスク検出法 - Google Patents

Description

本発明は、肥満の遺伝的リスク検出法等に関するものである。

肥満は、遺伝的要因・ライフスタイル・環境要因などの相互作用によって生じる疾患であり、世界的に広く蔓延している。デスクワークが中心の生活、高脂肪・高カロリーの食事、肥満になりやすい遺伝因子などの要因は全て肥満の蔓延に寄与する。遺伝連鎖解析（非特許文献１〜４。関連文献については、末尾にまとめて示す））と候補遺伝子解析（非特許文献５〜８）によって、肥満に関与するいくつかの遺伝子座と候補遺伝子が見出されているが、遺伝的感受性に寄与する遺伝子については未だに同定されていない。更に、遺伝的要因並びに民族間のライフスタイルの相違及び環境要因を考慮すると、各民族において、肥満に関与する遺伝子多型を検討することが重要である。
このように、肥満に関与する遺伝要因については、未だ十分に解明されているとは言えない状況にある。

本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、肥満について、遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法等を提供することにある。

本発明は、肥満に関し、３９０６名の日本人について、１４７カ所の遺伝子多型に関する大規模研究の結果として得られたものである。本研究の目的は、肥満に関与する遺伝子多型を同定し、この知見に基づいて、ある者に対して肥満を予防するための有用な情報を与えることである。

上記課題を解決するための第１の発明に係る肥満のリスク検出法は、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ、ＡＰＯＣ３の−４８２Ｃ→Ｔ、ＩＲＳ１の３９３１Ｇ→Ａ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、ＡＤＲＢ１の１１６５Ｇ→Ｃ、Ｆ１２の４６Ｃ→Ｔ、ＳＴＸ１Ａの２０５Ｔ→Ｃのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、年齢とを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする。
このとき、群を形成するときに使用する分散については、統計上の分散値、或いは標準偏差値（ＳＤ）、パーセントによる区分などを用いることができる。なお、遺伝子多型については、必ずしも上記９個には限られず、これら９個の多型のうちの任意の１個〜８個、或いは本明細書中で示される上記９個の他の多型を含む１０個以上で実施することもできる。

本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）→多型塩基」の順で記載する。例えば、「ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ」は、ＡＣＥ遺伝子について、−２４０位のＡがＴとなっている多型を意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置／データベースに登録されている数とその塩基→塩基数及び塩基」の順で記載する。例えば、「ＩＰＦ１の−１０８／３Ｇ→４Ｇ」は、ＩＰＦ１遺伝子について、−１０８位の３個の連続するＧが、４個の連続するＧとなる多型を意味している。また、場所の指定がない多型（例えば、ＴＮＦＳＦ４のＡ→Ｇ）については、表１〜表５に記載のｄｂＳＮＰのアクセス番号から、その内容を容易に理解することができる。また、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型としてデータベースに記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、「Ｔ／Ｃ」多型として記載されている場合には、データベース中の記録であるＡ／Ｇ多型と異なることがある。

一般に多型は、集団（例えば、日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なることが知られている。このため、日本人以外の集団において、肥満との関係が指摘されている多型であっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、国または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人における多型および肥満との関連が裏付けられるわけではない。

また、第２の発明に係る肥満の遺伝的リスク検出法は、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ、ＡＰＯＣ３の−４８２Ｃ→Ｔ、ＩＲＳ１の３９３１Ｇ→Ａ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、ＡＤＲＢ１の１１６５Ｇ→Ｃ、Ｆ１２の４６Ｃ→Ｔ、ＳＴＸ１Ａの２０５Ｔ→Ｃのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする。

本発明によれば、肥満について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、肥満に対する予防が可能となり、肥満が原因となって引き起こされる高血圧・糖尿病・メタボリック症候群・心筋梗塞・脳血管障害などの生活習慣病の罹患率を減少させることにより、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。

次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。

＜試験方法＞
研究対象
研究対象は、３９０６名（男性２２８６名、女性１６２０名）の日本人であった。彼らは、研究参加施設（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院）に、２００２年１０月から２００５年３月までに来院した者であった。肥満の定義は、日本人及びアジア人の肥満指数（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ：ＢＭＩ）に関する基準（非特許文献９）に基づき、ＢＭＩが２５ｋｇ／ｍ^２以上とした。この基準により、３９０６名のうち、１１９６名（男性６７７名、女性５１９名）が肥満者であると診断された。

２７１０名（男性１６０９名、女性１１０１名）のコントロール者は、毎年の健康診断のために参加病院の外来を受診した者であり、ＢＭＩは２５ｋｇ／ｍ^２未満であった。研究プロトコールはヘルシンキ宣言に従い、三重大学医学部、弘前大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、および参加病院の倫理委員会によって承認された。各参加者に対しては書面によるインフォームドコンセントを得た。

多型の選択
公開データベースの使用および本発明者の鋭意検討により、１２４個の候補遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、血圧及び内分泌機能の制御、血管に関する生物学、単球・マクロファージに関する生物学、リンパ球及び白血球に関する生物学、凝固及び線溶系、並びに血小板機能に加えて、脂質及び脂肪組織代謝、インスリン及び糖代謝、その他の代謝因子に関与すると言われているものであった。本発明者は、これら１２４個の遺伝子について、１４７個の多型を選択した。これらの多型の多くは、プロモーター領域、エクソン、イントロンのスプライシングの供与部位或いは受容部位に多く位置しており、多型の結果として、コードされたタンパク質の機能または発現に変化を与える可能性があるものであった。これら１４７個の多型は、下記表１〜表５に示した。なお、表中においては、左欄から順に、座位（Locus）、遺伝子名（Gene）、簡易記載（Symbol）、多型（Polymorphism）、多型データベース登録番号（dbSNP）を示している。なお、多型データベース登録番号が無い場合には、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されている番号を示した。

遺伝子多型の検出方法
７ｍＬの静脈血を５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ(ジナトリウム塩)を含むチューブに採取し、ゲノムＤＮＡをキット(ゲノミックス社製)によって分離した。１４７個の多型の遺伝子型は、ＰＣＲと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブをサスペンジョン・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ：Ｌｕｍｉｎｅｘ １００）と組み合わせて使用する方法によって決定した（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社）。プライマー、プローブ、その他の条件は、下表６に示した。表６は左から順に、遺伝子表記（Gene Symbol）、多型（Polymorphism）、センスプライマー（Sense primer）、アンチセンスプライマー（Antisense primer）、プローブ１（Probe 1）、プローブ２（Probe 2）、アニーリング温度（Annealing）、およびサイクル数（Cycles）を示した。また、詳細な方法については、既報のもの（非特許文献１０）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、肥満との関連が認められなかった多型を検出するための条件については記載を省略した。

ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献１０に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面には、特異的な塩基配列を認識するプローブが結合されている。各ビーズには、一種類のプローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との割合を変化させることにより、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。

図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチンでラベルしたプライマーを用いた。１.５ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、及び０.１μＭ〜１０μＭプライマーセットを混合し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）と５０ｎｇ〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。

＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（３.７５Ｍ ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１２５％ Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。

＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリダイゼーション反応の後、各ウエルに１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。

＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。

統計解析
臨床データは、肥満者群（Obesity）とコントロール群（Controls）との間で、対応のないスチューデントt検定により比較した。質的データは、カイ二乗検定によって比較した。対立遺伝子頻度は遺伝子カウント法によって概算し、ハーディ・ワインベルク平衡にあてはまるかどうかを判断するためにカイ二乗検定を使った。各常染色体上の遺伝子多型における遺伝子型分布は、肥満者群とコントロール群との間でカイ二乗検定(３ｘ２)によって比較した。Ｘ染色体上にある遺伝子多型については、対立遺伝子頻度をカイ二乗検定(２ｘ２)によって比較した。

肥満と関連（Ｐ＜０.０６）する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別(sex：女性＝０、男性＝１)、喫煙状態(smoking：非喫煙者＝０、喫煙者＝１)、および各遺伝子型を独立変数とし、肥満を従属変数とした。各遺伝子型は、優性、劣性、および２つの付加（付加１および２）遺伝モデルに従って評価し、Ｐ値、オッズ比、および９５％信頼区間を計算した。

各遺伝モデルは２つの群から構成される。優性モデルは「変異型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」対「野生型のホモ接合体」、劣性モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」、付加１モデルは「ヘテロ接合体」対「野生型のホモ接合体」、付加２モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体」である。組み合わせ遺伝子型（combined genotype）解析を行うために、年齢、性別、喫煙、および組み合わせ遺伝子型を独立変数とし、肥満を従属変数とした多項ロジスティック回帰分析法を実行した。各遺伝子型は、統計的有意性に基づいて優性モデルまたは劣性モデルを用いた。また、各組み合わせ遺伝子型は、肥満について最も大きい遺伝的リスクを与える組み合わせ遺伝子型と比較した。また、肥満に対する遺伝子型または他の交絡因子の効果を確認するために、ステップワイズ変数増加法により解析を行った。モデルへの包含の基準レベルを０.２５とし、モデルからの除外の基準レベルを０.１とした。

肥満と遺伝子型の多重比較の結果を得る際に、タイプＩエラーを避けるために統計的有意性に関する厳密な基準（Ｐ＜０.０１)を採用した。その他の臨床的バックグラウンドデータについては、危険率５％未満（Ｐ＜０.０５）は統計的に有意であると見なした。統計的有意性は、両側検定によって試験した。統計解析は、ＪＭＰソフトウェア・バージョン５.１（ＳＡＳインスティテュート社製）によって実行した。

＜試験結果＞
３９０６名の研究対象に関する背景データを表７に示した。表には、左欄より順に、特徴（Characteristics）、肥満者（Obesity）、およびコントロール者（Controls）を示している。また、特徴欄は、上より順に、者数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（Sex(male/female)）、肥満指数（Body mass index）、現在または過去の喫煙率（Current or former smoker）、高血圧（Hypertenshion）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高コレステロール血症（Hypercholesterolemia）、総コレステロール（Total cholesterol）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、糖尿病（Diabetes mellitus）、空腹時血糖（Fasting plasma glucose）、及びヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を示している。

疾病率以外のデータは、平均±ＳＤで示した。喫煙率については、一日あたり１０本以上を吸った場合を喫煙とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上の者、或いは降圧剤を服用している者とした。糖尿病については、空腹時血糖値が６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％以上の者、或いは糖尿病薬を服用している者とした。高コレステロール血症については、血清総コレステロール値が５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ（２２０ｍｇ／ｄＬ）以上、または脂質降下薬を服用している者とした。また表中、(a)、(b)、(c)、(d)は、それぞれコントロールとの間で、Ｐ＜０.００１、Ｐ＜０.００５、Ｐ＜０.０５、Ｐ＜０.０１の危険率で有意であったことを意味している。

年齢については、肥満者は、コントロールに比べて有意に低かった。高血圧、高コレステロール血症、糖尿病については、肥満者がコントロールに比べて有意に高かった。収縮期血圧、拡張期血圧、総コレステロール、トリグリセリド、空腹時血糖、及びヘモグロビンＡｌｃについては、肥満者がコントロールに比べて、より高値であり、ＨＤＬ−コレステロールについては、肥満者がコントロールに比べて、より低値であった。
次に、肥満のリスク診断を行うために必要な因子を抽出するため、遺伝子多型および年齢・性別・喫煙について、ステップワイズ変数増加法による解析を行った（詳細については後述する）。その結果、次に説明するように、肥満に関するリスク診断を行えることが分かった。

＜肥満のリスク診断システム＞
表８には、肥満のリスク診断システムに関する詳細を示した。表には、左欄より順に、因子（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（９５％信頼区間）（OR(95%CI)）を示した。また、最下段には、従来の危険因子（Conventional risk factors）と、今回の研究で見出された遺伝因子（Genetic risk factors）のオッズ比を乗じた総合リスク（Total risk）を示した。

後述のステップワイズ変数増加法で危険率が０.０５未満（P <0.05）であった遺伝子多型群および年齢・性別・喫煙を独立因子（交絡因子）とし、肥満を従属因子として多項ロジスティック回帰分析を行い、Ｐ値、オッズ比、９５％信頼区間を各因子について算出した。したがってこれらの因子は独立したものであり、オッズ比の積（かけ算）により総合的な肥満のリスクを予測することができる。多項ロジスティック回帰分析の結果、従来の危険因子としては年齢（高齢の方が高リスク）が、遺伝因子としては、ＡＣＥ、ＧＣＫ、ＥＳＲ１、ＡＰＯＣ３、ＧＣＬＣ、ＩＲＳ１、ＡＤＲＢ１、Ｆ１２、ＳＴＸ１Ａの各遺伝子多型が肥満に関連した。従来の危険因子では最小オッズ比が１.００で最大オッズ比が６.２５、遺伝因子では最小オッズ比が０.５０で最大オッズ比が７.５３であった。したがって、従来の危険因子と遺伝因子を総合すると、最小オッズ比が０.５０で最大オッズ比が４７.０７であり、９４倍の差が認められた。

本研究成果の臨床的な意義について以下に述べる。病院、クリニックまたは健診センターにおいて希望者に対して従来の危険因子と今回の遺伝因子に関する検査を行い、肥満のリスクの予測を行う。従来の危険因子と遺伝因子全体のオッズ比の積の分布からリスクの程度を３段階以上（例えば、５段階）に分ける。例えば、平均±１ＳＤの範囲を平均的リスク群とし、平均＋１ＳＤから平均＋２ＳＤをやや高リスク群、平均＋２ＳＤ以上を高リスク群とする。また、平均−１ＳＤから平均−２ＳＤをやや低リスク群、平均−２ＳＤ以下を低リスク群とする。
実際に本研究において、リスク値の分布は、リスクが高い群では肥満者群が８．４％でコントロール群が３．１％、リスクがやや高い群では肥満者群が２０．３％でコントロール群が１２．９％、平均的リスクの群では肥満者群が６４．０％でコントロール群が６８．１％、リスクがやや低い群では肥満者群が７．２％でコントロール群が１５．１％、リスクが低い群では肥満者群が０．１％でコントロール群が０．８％であった。他の方法として、コントロール群のリスク値の大きい順に全体を５％、２０％、５０％、２０％、５％に区分し、リスク値の最も大きい５％の群をリスクが高い群、次の２０％の群をリスクがやや高い群、次の５０％の群を平均的リスクの群、次の２０％の群をリスクがやや低い群、リスク値が最も小さい５％の群をリスクが低い群とする。実際に本研究における肥満者群の分布は、リスクが高い群は１１．４％（コントロール群は５．０％）、リスクがやや高い群は２８．８％（コントロール群は２０．０％）、平均的リスクの群は４６．４％（コントロール群は５０．０％）、リスクがやや低い群は１１．９％（コントロール群は２０．０％）、リスクが低い群は１．６％（コントロール群は５．０％）であった。
なお、本研究では有意な関連が認められなかったが、一般的に性別・喫煙・飲酒も肥満に影響すると考えられるのでこれらを含めることもできる。

結果については、医師等の有資格者の判断を含めてカウンセリングを行い、とりわけ高リスク群またはやや高リスク群に属する場合には生活習慣の改善（飲酒の減量・食事療法即ちカロリー制限・運動療法など）を行うことにより肥満の一次予防を積極的に推進する。多量の飲酒、高カロリー・高脂肪食、運動不足などの生活習慣は、一般的に肥満の原因と考えられているため、遺伝的に肥満のリスクが平均より高いと予測された場合は、生活習慣の改善により肥満のリスクを減少させるようにクライアントに説明する。特に肥満の家族歴のある人への適用が有効である。本システムにより肥満のオーダーメイド予防が可能になり、肥満に起因する高血圧・糖尿病やメタボリック症候群の発症予防、さらに心筋梗塞や脳血管障害の予防につながる。ひいては、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止や今後の医療費削減などにつながり、医学的・社会的に大きく貢献できる。

＜統計解析＞
次に、上記リスク判断システムを開発するに至った統計解析の結果について説明する。
カイ二乗検定により、１０個の遺伝子多型が肥満との関連を示した（Ｐ＜０.０６）。詳細を表９示した。表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、および危険率（Ｐ）を示している。

これらの多型については、肥満との関連について更に詳細に分析した。年齢、性別、および喫煙頻度を補正した多項ロジスティック回帰分析を行ったところ、グルコキナーゼ遺伝子（ＧＣＫ）の−３０Ｇ→Ａ多型が優性モデルにおいて、アンジオテンシン変換酵素遺伝子（ＡＣＥ）の−２４０Ａ→Ｔが優性モデル及び付加１モデルにおいて、アポリポプロテインＣ-III遺伝子（ＡＰＯＣ３）の−４８２Ｃ→Ｔが優性モデル及び付加１モデルにおいて、肥満の発生に有意に（Ｐ＜０.０１）関連した。また、エストロゲン受容体α遺伝子（ＥＳＲ１）の−１９８９Ｔ→Ｇも有意に肥満に関連した。このとき、ＡＰＯＣ３の−４８２Ｔ対立遺伝子は、肥満に対する危険因子となっており、ＧＣＫの−３０Ａ対立遺伝子、ＡＣＥの−２４０Ｔ対立遺伝子、及びＥＳＲ１の−１９８９Ｇ対立遺伝子は防御因子となっていた。詳細を表１０に示した。

表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、優性モデル（Dominant）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、劣性モデル（Recessive）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加１モデル（Additive 1）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加２モデル（Additive 2）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）をそれぞれ示している。多項ロジスティック回帰分析は、年齢、性別、および喫煙の有無について補正して行った。また、表中、危険率が０.０１未満（Ｐ＜０.０１）のデータについては、太字で示した。肥満との関連が最も強いＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ多型では、肥満においては、ＧＧ遺伝子型が７０.５％、ＧＡ遺伝子型が２７.３％、ＡＡ遺伝子型が２.２％であり、コントロールにおいては、ＧＧ遺伝子型が６６.０％、ＧＡ遺伝子型が３０.６％、ＡＡ遺伝子型が３.４％であった。また、これらの多型の遺伝子型分布については、コントロール及び肥満者のいずれにおいてもハーディ・ワインバーグ平衡を満たしていた。

次に、肥満に対する１０個の多型の遺伝子型、年齢、性別、および喫煙の影響について、ステップワイズ変数増加法により解析した。結果を表１１に示した。表中には、左欄より順に、因子（Variable）、Ｐ値（P value）、寄与率（R²）を示している。

統計的有意性が高い順に、年齢、ＡＣＥ遺伝子型（優性モデル）、ＧＣＫ遺伝子型（優性モデル）、ＥＳＲ１遺伝子型（劣性モデル）、ＡＰＯＣ３遺伝子型（優性モデル）、ＩＲＳ１遺伝子型（優性モデル）、ＧＣＬＣ遺伝子型（劣性モデル）、ＡＤＲＢ１（優性モデル）、Ｆ１２遺伝子型（劣性モデル）ＳＴＸ１Ａ遺伝子型（劣性モデル）が有意であり（Ｐ＜０.０５）、各要因が独立して肥満に影響を与えることが分かった。
最後に、肥満の遺伝的リスクを評価するために、３個の多型（ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、及びＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ）の組み合わせ遺伝子型について、オッズ比、９５％信頼区間、およびＰ値を計算した。結果を表１２に示した。表中においては、左より順に、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔの遺伝子型、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａの遺伝子型、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇの遺伝子型、各組み合わせ遺伝子型における肥満者数／コントロール者数、オッズ比（９５％信頼区間）、およびＰ値を示した。

３個の多型について組み合わせ遺伝子型を解析することにより、最小オッズ比の０.４５が、ＡＣＥについてＡＴまたはＴＴ、ＧＣＫについてＧＧ、ＥＳＲ１についてＧＧの組み合わせ遺伝子型について認められた。

＜考察＞
本発明者は、肥満との関連が疑われる１２４個の候補遺伝子について、１４７カ所の多型を調べた。３９０６人の被験者について大規模研究を行ったところ、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ多型、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ多型、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ多型が、日本人の肥満と有意に関係していた。３個の多型（ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、及びＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ）の組み合わせ遺伝子型について解析を行ったところ、最小オッズ比の０.４５が得られた。

脂肪組織におけるレニン−アンジオテンシン系は、アンジオテンシンIIの活性を通じて、脂肪細胞の成長と分化に重要な影響を与えている。疫学調査の結果によれば、ＢＭＩは、アンジオテンシノーゲンの血中濃度、血中レニン活性、及び血中ＡＣＥ活性と関連があると言われている。２０年間の追跡調査によれば、白人成人男性では、ＡＣＥのイントロン１６に見られる挿入／欠失多型において欠失多型のホモ接合者は、加齢に伴う腹部肥満と体重増加傾向とが認められており、これらは脂肪組織における局所的なレニン−アンジオテンシン系の役割と、脂肪沈着の制御に対する遺伝的影響とが一致している（非特許文献１１）。

このＡＣＥの挿入／欠失多型は、冠動脈疾患患者において肥満と脂肪組織への脂肪沈着にも関連している。すなわち、欠失多型は、肥満及び脂肪沈着がより進みやすく、かつ体重及び腰回り長さも増加する（非特許文献１２）。ＡＣＥプロモータ領域のハプロタイプは、米国及びナイジェリアの黒人において、親から肥満となる子孫に優先的に伝達されていることから、ＡＣＥ多型は体重増加に影響を与えるのかも知れない（非特許文献１３）。本発明者らは、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ多型が肥満に関与しており、Ｔ多型が保護因子として働くことを明らかにした。この結果は、ＡＣＥ多型が肥満に関与するという従来の知見と一致するものである。

グルコキナーゼは、膵β細胞と肝細胞で発現されており、その発現は二つの組織特異的プロモーターによって調節されている（非特許文献１４）。膵グルコキナーゼは、インスリン分泌の調節に際し、グルコースセンサーとして働く。ＧＣＫの変異は、若年者における成人発症型糖尿病の１０％〜５０％に関与している（非特許文献１５）。ＧＣＫのβ細胞特異的プロモーターに位置する−３０Ｇ→Ａ多型は、日本人においてβ細胞機能の低下と糖耐能障害に関与している（非特許文献１６、１７）。本発明者らは、この多型が肥満に関与しており、Ａ多型が防御因子として働くことを明らかにした。Ａ多型が、β細胞機能の低下、糖耐能障害、及び肥満リスクの減少に対する作用メカニズムについては、依然として不明のままである。また、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ多型が、近傍に存在して実際に肥満に影響を及ぼす他の遺伝子多型と連鎖不平衡の状態にあると考えることもできる。

ＥＳＲ１が欠損したマウスでは、雌雄を問わず、白色脂肪細胞の肥厚化と肥大化、インスリン抵抗性、及び耐糖能障害が認められる（非特許文献１８）。エストロゲン−ＥＳＲ１シグナルは、雄性及び雌性の白色脂肪組織に重要な影響を与えている。ＥＳＲ１を欠損した雄性マウスでは、肥満は、エネルギー摂取の増加よりも、エネルギー支出が減少することによって起こる。ＥＳＲ１の第１イントロンには、二つの多型が見出されている。すなわち、制限酵素ＰｖｕIIによって認識されるＴ→Ｃ多型と、制限酵素ＸｂａＩによって認識されるＡ→Ｇ多型（Ａ対立遺伝子があると制限酵素部位が存在し（ｘアレル）、Ｇ対立遺伝子があると制限酵素部位がなくなる（Ｘアレル））である。

ＧＧ（ＸＸ）遺伝子型は、健常者に比べると、２型糖尿病患者と男性型肥満患者（android-type obesity）に有意に多く認められる（非特許文献１９）。ＸｂａＩ多型のＧＧ（ＸＸ）遺伝子型は、中年と閉経前の日本女性における男性型脂肪蓄積（android-type fat）の進展に寄与している（非特許文献２０）。今回の研究では、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ多型が肥満の発症に有意に関連しており、Ｇ対立遺伝子が保護因子として作用することが分かった。日本人では、−１９８９Ｔ→Ｇ多型はＸｂａＩ多型と連鎖不平衡にあり、前者の多型のＧ対立遺伝子と後者の多型のＡ（ｘ）対立遺伝子とは関連している（非特許文献２１）。ＧＧ（ＸＸ）遺伝子型が男性型肥満に関連しているという従来の知見は、今回の研究結果と一致している。

このように本実施形態によれば、肥満について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法を提供することができる。この実施形態を用いることにより、肥満の予防が可能となり、肥満が原因となって引き起こされる高血圧・糖尿病・メタボリック症候群・心筋梗塞・脳血管障害などの生活習慣病の罹患率を減少させることにより、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。

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Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。 ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。

Claims (1)

1. ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ、ＡＰＯＣ３の−４８２Ｃ→Ｔ、ＩＲＳ１の３９３１Ｇ→Ａ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、及びＡＤＲＢ１の１１６５Ｇ→Ｃの遺伝子多型を検出することを特徴とする肥満の遺伝的リスク検出法。