JP5489146B2

JP5489146B2 - Genetic risk detection method for obesity

Info

Publication number: JP5489146B2
Application number: JP2006056678A
Authority: JP
Inventors: 芳司山田; 義則野澤; 卓也越坂
Original assignee: G&G SCIENCE CO., LTD.
Current assignee: G&G SCIENCE CO., LTD.
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2026-03-02
Also published as: JP2007228917A

Description

本発明は、肥満の遺伝的リスク検出法等に関するものである。 The present invention relates to a method for detecting a genetic risk of obesity and the like.

肥満は、遺伝的要因・ライフスタイル・環境要因などの相互作用によって生じる疾患であり、世界的に広く蔓延している。デスクワークが中心の生活、高脂肪・高カロリーの食事、肥満になりやすい遺伝因子などの要因は全て肥満の蔓延に寄与する。遺伝連鎖解析（非特許文献１〜４。関連文献については、末尾にまとめて示す））と候補遺伝子解析（非特許文献５〜８）によって、肥満に関与するいくつかの遺伝子座と候補遺伝子が見出されているが、遺伝的感受性に寄与する遺伝子については未だに同定されていない。更に、遺伝的要因並びに民族間のライフスタイルの相違及び環境要因を考慮すると、各民族において、肥満に関与する遺伝子多型を検討することが重要である。
このように、肥満に関与する遺伝要因については、未だ十分に解明されているとは言えない状況にある。 Obesity is a disease caused by the interaction of genetic factors, lifestyles, environmental factors, and the like, and is widespread worldwide. Factors such as a life centered on desk work, a high-fat, high-calorie diet, and genetic factors prone to obesity all contribute to the spread of obesity. Genetic linkage analysis (Non-Patent Documents 1 to 4; related documents are shown together at the end) and candidate gene analysis (Non-Patent Documents 5 to 8) indicate that several loci and candidate genes involved in obesity Although it has been found, genes that contribute to genetic susceptibility have not yet been identified. Furthermore, considering genetic factors, lifestyle differences among ethnic groups, and environmental factors, it is important to examine genetic polymorphisms involved in obesity in each ethnic group.
Thus, genetic factors involved in obesity have not yet been fully elucidated.

本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、肥満について、遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法等を提供することにある。 This invention is made | formed in view of said situation, The objective is to provide the gene detection method etc. for obtaining one material for judging the genetic risk about obesity.

本発明は、肥満に関し、３９０６名の日本人について、１４７カ所の遺伝子多型に関する大規模研究の結果として得られたものである。本研究の目的は、肥満に関与する遺伝子多型を同定し、この知見に基づいて、ある者に対して肥満を予防するための有用な情報を与えることである。 The present invention relates to obesity and was obtained as a result of a large-scale study on 147 genetic polymorphisms in 3906 Japanese. The purpose of this study is to identify genetic polymorphisms involved in obesity, and to provide useful information for preventing obesity to a person based on this finding.

上記課題を解決するための第１の発明に係る肥満のリスク検出法は、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ、ＡＰＯＣ３の−４８２Ｃ→Ｔ、ＩＲＳ１の３９３１Ｇ→Ａ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、ＡＤＲＢ１の１１６５Ｇ→Ｃ、Ｆ１２の４６Ｃ→Ｔ、ＳＴＸ１Ａの２０５Ｔ→Ｃのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、年齢とを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする。
このとき、群を形成するときに使用する分散については、統計上の分散値、或いは標準偏差値（ＳＤ）、パーセントによる区分などを用いることができる。なお、遺伝子多型については、必ずしも上記９個には限られず、これら９個の多型のうちの任意の１個〜８個、或いは本明細書中で示される上記９個の他の多型を含む１０個以上で実施することもできる。 The obesity risk detection method according to the first invention for solving the above-mentioned problems includes: ACE −240A → T, GCK −30G → A, ESR1 −1989T → G, APOC3 −482C → T, IRS1 3931G → A, GCLC -129C → T, ADRB1 1165G → C, F12 46C → T, STX1A 205T → C polymorphism and age as evaluation factors , Calculate the risk of onset by multiplying the odds ratio of each evaluation factor, create multiple groups of 3 or more according to the average and variance or percentage classification of this risk, and detect the risk of onset according to each group It is characterized by doing.
At this time, as a variance used when forming a group, a statistical variance value, a standard deviation value (SD), a percentage division, or the like can be used. In addition, about gene polymorphism, it is not necessarily restricted to said 9 pieces, Arbitrary 1-8 of these 9 polymorphisms, or said 9 other polymorphisms shown in this specification It is also possible to carry out with 10 or more including.

本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）→多型塩基」の順で記載する。例えば、「ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ」は、ＡＣＥ遺伝子について、−２４０位のＡがＴとなっている多型を意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置／データベースに登録されている数とその塩基→塩基数及び塩基」の順で記載する。例えば、「ＩＰＦ１の−１０８／３Ｇ→４Ｇ」は、ＩＰＦ１遺伝子について、−１０８位の３個の連続するＧが、４個の連続するＧとなる多型を意味している。また、場所の指定がない多型（例えば、ＴＮＦＳＦ４のＡ→Ｇ）については、表１〜表５に記載のｄｂＳＮＰのアクセス番号から、その内容を容易に理解することができる。また、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型としてデータベースに記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、「Ｔ／Ｃ」多型として記載されている場合には、データベース中の記録であるＡ／Ｇ多型と異なることがある。 In this specification, the description method of a polymorphism is as follows. In principle, each gene is described in the order of “position where polymorphism occurs, base registered in database (A: adenine, G: guanine, C: cytosine, T: thymine) → polymorphic base”. . For example, “ACE -240A → T” means a polymorphism in which the A at −240 is T in the ACE gene. However, the insertion or deletion polymorphism is described in the order of “position where polymorphism occurs / number registered in database and its base → number of bases and base”. For example, “−108 / 3G → 4G of IPF1” means a polymorphism in which the three consecutive Gs at the −108 position become four consecutive Gs for the IPF1 gene. The polymorphism with no location designation (for example, A → G of TNFSF4) can be easily understood from the dbSNP access numbers described in Tables 1 to 5. Moreover, even if it is read in the forward strand and recorded in the database as an A / G polymorphism, it will be a T / C polymorphism if it is read in the reverse strand. If many documents are described as “T / C” polymorphisms, they may differ from A / G polymorphisms that are records in the database.

一般に多型は、集団（例えば、日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なることが知られている。このため、日本人以外の集団において、肥満との関係が指摘されている多型であっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、国または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人における多型および肥満との関連が裏付けられるわけではない。 In general, it is known that polymorphisms have different types and frequencies for different groups (for example, Japanese group, Western group, etc.). For this reason, even if the polymorphism has been pointed out to be related to obesity in a non-Japanese population, such a relationship is not necessarily recognized in the Japanese population. For this reason, conventional reports do not necessarily support the association between polymorphisms and obesity in Japanese when countries or diseases differ.

また、第２の発明に係る肥満の遺伝的リスク検出法は、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ、ＡＰＯＣ３の−４８２Ｃ→Ｔ、ＩＲＳ１の３９３１Ｇ→Ａ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、ＡＤＲＢ１の１１６５Ｇ→Ｃ、Ｆ１２の４６Ｃ→Ｔ、ＳＴＸ１Ａの２０５Ｔ→Ｃのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする。 In addition, the genetic risk detection method for obesity according to the second invention includes: ACE −240A → T, GCK −30G → A, ESR1 −1989T → G, APOC3 −482C → T, IRS1 3931G → A , GCLC-129C → T, ADRB1 1165G → C, F12 46C → T, STX1A 205T → C, and at least one gene polymorphism is detected.

本発明によれば、肥満について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、肥満に対する予防が可能となり、肥満が原因となって引き起こされる高血圧・糖尿病・メタボリック症候群・心筋梗塞・脳血管障害などの生活習慣病の罹患率を減少させることにより、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。 According to the present invention, a detection method and the like for judging genetic risk and onset risk for obesity are provided. By using this invention, it becomes possible to prevent obesity, and by reducing the prevalence of lifestyle-related diseases such as hypertension, diabetes, metabolic syndrome, myocardial infarction, and cerebrovascular disorders caused by obesity, Can contribute greatly to medical and social issues such as extending healthy life expectancy, improving quality of life, preventing stickiness and reducing medical costs in the future.

次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。 Next, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. However, the technical scope of the present invention is not limited by these embodiments, and various forms can be made without changing the gist of the invention. Can be implemented. Further, the technical scope of the present invention extends to an equivalent range.

＜試験方法＞
研究対象
研究対象は、３９０６名（男性２２８６名、女性１６２０名）の日本人であった。彼らは、研究参加施設（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院）に、２００２年１０月から２００５年３月までに来院した者であった。肥満の定義は、日本人及びアジア人の肥満指数（ＢｏｄｙＭａｓｓＩｎｄｅｘ：ＢＭＩ）に関する基準（非特許文献９）に基づき、ＢＭＩが２５ｋｇ／ｍ^２以上とした。この基準により、３９０６名のうち、１１９６名（男性６７７名、女性５１９名）が肥満者であると診断された。 <Test method>
Study subjects The study subjects were 3906 Japanese (2286 men, 1620 women) Japanese. They visited the research participating facilities (Gifu Prefectural Gifu Hospital, Gifu Prefectural Tajimi Hospital, Gifu Prefectural Gero Onsen Hospital, Hirosaki University Hospital, Reimei Rehabilitation Hospital) from October 2002 to March 2005. . The definition of obesity was based on a standard (Non-patent Document 9) related to the body mass index (BMI) of Japanese and Asians, and BMI was 25 kg / m ² or more. Based on this standard, 1196 out of 3906 persons (677 males and 519 females) were diagnosed as obese.

２７１０名（男性１６０９名、女性１１０１名）のコントロール者は、毎年の健康診断のために参加病院の外来を受診した者であり、ＢＭＩは２５ｋｇ／ｍ^２未満であった。研究プロトコールはヘルシンキ宣言に従い、三重大学医学部、弘前大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、および参加病院の倫理委員会によって承認された。各参加者に対しては書面によるインフォームドコンセントを得た。 The 2710 (1609 men, 1101 women) controls were those who visited the participating hospitals for annual health examinations and had a BMI of less than 25 kg / m ² . The research protocol was approved by the Mie University School of Medicine, Hirosaki University School of Medicine, Gifu International Institute for Biotechnology, and the ethics committee of participating hospitals in accordance with the Declaration of Helsinki. Written informed consent was obtained for each participant.

多型の選択
公開データベースの使用および本発明者の鋭意検討により、１２４個の候補遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、血圧及び内分泌機能の制御、血管に関する生物学、単球・マクロファージに関する生物学、リンパ球及び白血球に関する生物学、凝固及び線溶系、並びに血小板機能に加えて、脂質及び脂肪組織代謝、インスリン及び糖代謝、その他の代謝因子に関与すると言われているものであった。本発明者は、これら１２４個の遺伝子について、１４７個の多型を選択した。これらの多型の多くは、プロモーター領域、エクソン、イントロンのスプライシングの供与部位或いは受容部位に多く位置しており、多型の結果として、コードされたタンパク質の機能または発現に変化を与える可能性があるものであった。これら１４７個の多型は、下記表１〜表５に示した。なお、表中においては、左欄から順に、座位（Locus）、遺伝子名（Gene）、簡易記載（Symbol）、多型（Polymorphism）、多型データベース登録番号（dbSNP）を示している。なお、多型データベース登録番号が無い場合には、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されている番号を示した。 Selection of polymorphisms 124 candidate genes were selected through the use of public databases and by the inventor's intensive studies. These genes regulate blood pressure and endocrine function, biology related to blood vessels, biology related to monocytes / macrophages, biology related to lymphocytes and leukocytes, coagulation and fibrinolytic systems, and platelet function, as well as lipid and adipose tissue metabolism. It was said to be involved in insulin and sugar metabolism and other metabolic factors. The inventor selected 147 polymorphisms for these 124 genes. Many of these polymorphisms are located in many promoter regions, exons, intron splicing donor or acceptor sites, and polymorphisms may alter the function or expression of the encoded protein. There was something. These 147 polymorphs are shown in Tables 1 to 5 below. In the table, the locus (Locus), gene name (Gene), simple description (Symbol), polymorphism (Polymorphism), and polymorphism database registration number (dbSNP) are shown in order from the left column. In addition, when there was no polymorphism database registration number, the number registered in NCBI gene bank was shown.

遺伝子多型の検出方法
７ｍＬの静脈血を５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ(ジナトリウム塩)を含むチューブに採取し、ゲノムＤＮＡをキット(ゲノミックス社製)によって分離した。１４７個の多型の遺伝子型は、ＰＣＲと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブをサスペンジョン・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ：Ｌｕｍｉｎｅｘ１００）と組み合わせて使用する方法によって決定した（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社）。プライマー、プローブ、その他の条件は、下表６に示した。表６は左から順に、遺伝子表記（Gene Symbol）、多型（Polymorphism）、センスプライマー（Sense primer）、アンチセンスプライマー（Antisense primer）、プローブ１（Probe 1）、プローブ２（Probe 2）、アニーリング温度（Annealing）、およびサイクル数（Cycles）を示した。また、詳細な方法については、既報のもの（非特許文献１０）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、肥満との関連が認められなかった多型を検出するための条件については記載を省略した。 Detection method of gene polymorphism 7 mL of venous blood was collected in a tube containing 50 mmol / L EDTA (disodium salt), and genomic DNA was separated using a kit (Genomics). The 147 polymorphic genotypes were determined by a method using PCR and sequence-specific oligonucleotide probes in combination with Suspension Array Technology (SAT: Luminex 100) (G & G Science Inc.). The primer, probe, and other conditions are shown in Table 6 below. Table 6 shows gene symbol (Gene Symbol), polymorphism (Sensemorph), antisense primer (Antisense primer), probe 1 (Probe 1), probe 2 (Probe 2), annealing from left to right. Temperature (Annealing) and number of cycles (Cycles) are shown. The detailed method was based on the previously reported one (Non-Patent Document 10) and the amplification conditions were changed appropriately. In addition, description about the conditions for detecting a polymorphism that was not associated with obesity was omitted.

ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献１０に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面には、特異的な塩基配列を認識するプローブが結合されている。各ビーズには、一種類のプローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との割合を変化させることにより、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。 The details of the PCR-SSOP-Luminex method are as described in Non-Patent Document 10. Below, the outline | summary of this method is demonstrated.
FIG. 1 shows the microstructure and characteristics of microbeads detected by Luminex 100 flow cytometry. Microbeads (symbol (A) in the figure) have a diameter of about 5.5 μm and are made of polystyrene. A probe that recognizes a specific base sequence is bound to the bead surface. One type of probe is bound to each bead. By changing the ratio of the red dye and the infrared dye to this microbead, the identification of each bead can be performed in a state where a maximum of 100 kinds are mixed, as indicated by the symbol (B) in the figure. It can be done. Microbeads with multiple types of probes (however, only one type of probe for each microbead) were mixed at an appropriate ratio to prepare a bead mix of 100 beads / μL (reference in the figure). (C)).

図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチンでラベルしたプライマーを用いた。１.５ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭｄＮＴＰｓ、及び０.１μＭ〜１０μＭプライマーセットを混合し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）と５０ｎｇ〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。 In FIG. 2, the outline | summary of the procedure of PCR-SSOP-Luminex method was shown.
<Amplification>
In the PCR reaction for amplifying the target DNA, a primer labeled with biotin at the 5 'end was used. A 1 × PCR solution (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3) containing 1.5 mM magnesium chloride, 2% DMSO, 0.2 mM dNTPs, and 0.1 μM to 10 μM primer set were mixed, and Taq DNA polymerase (50 U / mL) and 50 ng to 100 ng of genomic DNA were added to make 25 μL. The PCR reaction was treated at 95 ° C. for 10 minutes, followed by denaturation at 94 ° C. for 20 seconds, annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension at 72 ° C. for 30 seconds, and this was repeated 50 cycles. A GeneAmp9700 thermal cycler (Applied Biosystems) was used as the instrument.

＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（３.７５ＭＴＭＡＣ、６２.５ｍＭＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭＥＤＴＡ、０.１２５％Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。 <Hybridization>
The amplified DNA was denatured and then hybridized with the bead mix. In each well of a 96-well plate, 5 μL of amplified PCR solution, 5 μL of bead mix, and 40 μL of hybridization buffer (3.75 M TMAC, 62.5 mM TB (pH 8.0), 0.5 mM) EDTA, 0.125% N-lauroylsarcosine) was added to a total volume of 50 μL. The 96-well plate to which this mixed solution had been added was subjected to denaturation at 95 ° C. for 2 minutes and hybridization at 52 ° C. for 30 minutes (using a GeneAmp 9700 thermal cycler).
FIG. 2 shows a state in which only beads (1) having a probe that recognizes amplified DNA bind to DNA.

＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥＲｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリダイゼーション反応の後、各ウエルに１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。 <Streptavidin-phycoerythrin reaction (SA-PE Reaction)>
Next, the bead mix-DNA was reacted with SA-PE. After the hybridization reaction, 100 μL of PBS-Tween (1 × PBS (pH 7.5), 0.01% Tween-20) was added to each well, centrifuged at 1000 × g for 5 minutes, and the supernatant was removed. The microbeads were washed. To each microbead remaining in each well, 70 μL of SA-PE solution (commercially available product (G & G Science Co., Ltd.) diluted 100-fold with PBS-Tween) was added and mixed, and then at 52 ° C. for 15 minutes. (A GeneAmp9700 thermal cycler was used.)
FIG. 2 shows that biotinylated DNA is bound only to the probe of the bead (1), and thus SA-PE is bound to the biotin.

＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。 <Measurement>
Next, the sample after the reaction used Luminex 100 to identify the bead type and determine whether PE is bound to the bead. The measurement was performed using two types of lasers, the type of beads was identified by a 635 nm laser, and PE fluorescence was quantified using a 532 nm laser. For the DNA bound to the oligo beads, at least 50 beads were measured per measurement, and the quantified median fluorescence intensity (MFI) of PE was used.
In FIG. 2, since each bead (1) to (3) was identified and PE was measured only on the bead (1), the DNA recognized by the probe bound to the bead (1) was amplified. The situation is shown.

統計解析
臨床データは、肥満者群（Obesity）とコントロール群（Controls）との間で、対応のないスチューデントt検定により比較した。質的データは、カイ二乗検定によって比較した。対立遺伝子頻度は遺伝子カウント法によって概算し、ハーディ・ワインベルク平衡にあてはまるかどうかを判断するためにカイ二乗検定を使った。各常染色体上の遺伝子多型における遺伝子型分布は、肥満者群とコントロール群との間でカイ二乗検定(３ｘ２)によって比較した。Ｘ染色体上にある遺伝子多型については、対立遺伝子頻度をカイ二乗検定(２ｘ２)によって比較した。 Statistical analysis Clinical data were compared between the obese group (Obesity) and the control group (Controls) by an unpaired Student t test. Qualitative data were compared by chi-square test. Allele frequencies were estimated by the gene count method, and the chi-square test was used to determine if the Hardy-Weinberg equilibrium was met. The genotype distribution in the gene polymorphism on each autosome was compared by the chi-square test (3 × 2) between the obese group and the control group. For gene polymorphisms on the X chromosome, allele frequencies were compared by chi-square test (2 × 2).

肥満と関連（Ｐ＜０.０６）する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別(sex：女性＝０、男性＝１)、喫煙状態(smoking：非喫煙者＝０、喫煙者＝１)、および各遺伝子型を独立変数とし、肥満を従属変数とした。各遺伝子型は、優性、劣性、および２つの付加（付加１および２）遺伝モデルに従って評価し、Ｐ値、オッズ比、および９５％信頼区間を計算した。 Polymorphisms associated with obesity (P <0.06) were analyzed by multinomial logistic regression analysis with confounding factors. At this time, regarding confounding factors, age (age), sex (sex: female = 0, male = 1), smoking state (smoking: non-smoker = 0, smoker = 1), and each genotype are independent variables. And obesity as a dependent variable. Each genotype was evaluated according to dominant, recessive, and two addition (addition 1 and 2) genetic models, and P values, odds ratios, and 95% confidence intervals were calculated.

各遺伝モデルは２つの群から構成される。優性モデルは「変異型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」対「野生型のホモ接合体」、劣性モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」、付加１モデルは「ヘテロ接合体」対「野生型のホモ接合体」、付加２モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体」である。組み合わせ遺伝子型（combined genotype）解析を行うために、年齢、性別、喫煙、および組み合わせ遺伝子型を独立変数とし、肥満を従属変数とした多項ロジスティック回帰分析法を実行した。各遺伝子型は、統計的有意性に基づいて優性モデルまたは劣性モデルを用いた。また、各組み合わせ遺伝子型は、肥満について最も大きい遺伝的リスクを与える組み合わせ遺伝子型と比較した。また、肥満に対する遺伝子型または他の交絡因子の効果を確認するために、ステップワイズ変数増加法により解析を行った。モデルへの包含の基準レベルを０.２５とし、モデルからの除外の基準レベルを０.１とした。 Each genetic model is composed of two groups. The dominant model is “mutant homozygous and heterozygous binding group” vs. “wild type homozygous”, the recessive model is “mutant homozygous” vs. “wild type homozygous and heterozygous” The “body binding group”, the addition 1 model is “heterozygote” vs. “wild type homozygote”, and the addition 2 model is “mutant homozygote” vs. “wild type homozygote”. To perform a combined genotype analysis, a multinomial logistic regression analysis was performed with age, gender, smoking, and the combined genotype as independent variables and obesity as the dependent variable. Each genotype used a dominant or recessive model based on statistical significance. Each combined genotype was also compared to the combined genotype that gave the greatest genetic risk for obesity. In addition, in order to confirm the effect of genotype or other confounding factors on obesity, analysis was performed by the stepwise variable increment method. The reference level for inclusion in the model was 0.25, and the reference level for exclusion from the model was 0.1.

肥満と遺伝子型の多重比較の結果を得る際に、タイプＩエラーを避けるために統計的有意性に関する厳密な基準（Ｐ＜０.０１)を採用した。その他の臨床的バックグラウンドデータについては、危険率５％未満（Ｐ＜０.０５）は統計的に有意であると見なした。統計的有意性は、両側検定によって試験した。統計解析は、ＪＭＰソフトウェア・バージョン５.１（ＳＡＳインスティテュート社製）によって実行した。 In obtaining results of multiple comparisons of obesity and genotype, strict criteria for statistical significance (P <0.01) were adopted to avoid type I errors. For other clinical background data, a risk rate of less than 5% (P <0.05) was considered statistically significant. Statistical significance was tested by a two-sided test. Statistical analysis was performed with JMP software version 5.1 (SAS Institute).

＜試験結果＞
３９０６名の研究対象に関する背景データを表７に示した。表には、左欄より順に、特徴（Characteristics）、肥満者（Obesity）、およびコントロール者（Controls）を示している。また、特徴欄は、上より順に、者数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（Sex(male/female)）、肥満指数（Body mass index）、現在または過去の喫煙率（Current or former smoker）、高血圧（Hypertenshion）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高コレステロール血症（Hypercholesterolemia）、総コレステロール（Total cholesterol）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、糖尿病（Diabetes mellitus）、空腹時血糖（Fasting plasma glucose）、及びヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を示している。 <Test results>
Table 7 shows background data on 3906 subjects. The table shows the characteristics (Characteristics), obesity (Obesity), and controls (Controls) in order from the left column. In addition, in the feature column, the number of persons (No. of subjects), age (Age), gender (male / female), body mass index, present or past Smoking rate (Current or former smoker), hypertension, systolic blood pressure, diastolic blood pressure, hypercholesterolemia, total cholesterol, HDL- It shows cholesterol (HDL-cholesterol), triglycerides, diabetes (Diabetes mellitus), fasting plasma glucose, and hemoglobin Alc (Glycosylated hemoglobin).

疾病率以外のデータは、平均±ＳＤで示した。喫煙率については、一日あたり１０本以上を吸った場合を喫煙とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上の者、或いは降圧剤を服用している者とした。糖尿病については、空腹時血糖値が６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％以上の者、或いは糖尿病薬を服用している者とした。高コレステロール血症については、血清総コレステロール値が５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ（２２０ｍｇ／ｄＬ）以上、または脂質降下薬を服用している者とした。また表中、(a)、(b)、(c)、(d)は、それぞれコントロールとの間で、Ｐ＜０.００１、Ｐ＜０.００５、Ｐ＜０.０５、Ｐ＜０.０１の危険率で有意であったことを意味している。 Data other than disease rates are shown as mean ± SD. Regarding the smoking rate, smoking was defined as the case where 10 or more cigarettes were smoked per day. Regarding hypertension, those with systolic blood pressure of 140 mmHg or higher, diastolic blood pressure of 90 mmHg or higher, or those taking antihypertensive agents. As for diabetes, fasting blood glucose level was 6.93 mmol / L (126 mg / dL) or more, hemoglobin Alc was 6.5% or more, or a person taking a diabetes drug. For hypercholesterolemia, the serum total cholesterol level was 5.72 mmol / L (220 mg / dL) or higher, or a person taking a lipid-lowering drug. In the table, (a), (b), (c), and (d) are respectively P <0.001, P <0.005, P <0.05, P <0.00 with control. It means that the risk rate of 01 was significant.

年齢については、肥満者は、コントロールに比べて有意に低かった。高血圧、高コレステロール血症、糖尿病については、肥満者がコントロールに比べて有意に高かった。収縮期血圧、拡張期血圧、総コレステロール、トリグリセリド、空腹時血糖、及びヘモグロビンＡｌｃについては、肥満者がコントロールに比べて、より高値であり、ＨＤＬ−コレステロールについては、肥満者がコントロールに比べて、より低値であった。
次に、肥満のリスク診断を行うために必要な因子を抽出するため、遺伝子多型および年齢・性別・喫煙について、ステップワイズ変数増加法による解析を行った（詳細については後述する）。その結果、次に説明するように、肥満に関するリスク診断を行えることが分かった。 In terms of age, obese people were significantly lower than controls. For hypertension, hypercholesterolemia, and diabetes, obese people were significantly higher than controls. For systolic blood pressure, diastolic blood pressure, total cholesterol, triglycerides, fasting blood glucose, and hemoglobin Alc, obese people have higher values than controls, and for HDL-cholesterol, obese people have higher values than controls, It was lower.
Next, in order to extract the factors necessary for the diagnosis of obesity risk, genetic polymorphism, age, sex, and smoking were analyzed by the stepwise variable increase method (details will be described later). As a result, it was found that risk diagnosis related to obesity can be performed as described below.

＜肥満のリスク診断システム＞
表８には、肥満のリスク診断システムに関する詳細を示した。表には、左欄より順に、因子（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（９５％信頼区間）（OR(95%CI)）を示した。また、最下段には、従来の危険因子（Conventional risk factors）と、今回の研究で見出された遺伝因子（Genetic risk factors）のオッズ比を乗じた総合リスク（Total risk）を示した。 <Obesity risk diagnosis system>
Table 8 shows details regarding the risk diagnosis system for obesity. In the table, the factor (Variable), P value (P value), and odds ratio (95% confidence interval) (OR (95% CI)) are shown in order from the left column. The bottom row shows the total risk multiplied by the odds ratio of the conventional risk factors and the genetic risk factors found in this study.

後述のステップワイズ変数増加法で危険率が０.０５未満（P <0.05）であった遺伝子多型群および年齢・性別・喫煙を独立因子（交絡因子）とし、肥満を従属因子として多項ロジスティック回帰分析を行い、Ｐ値、オッズ比、９５％信頼区間を各因子について算出した。したがってこれらの因子は独立したものであり、オッズ比の積（かけ算）により総合的な肥満のリスクを予測することができる。多項ロジスティック回帰分析の結果、従来の危険因子としては年齢（高齢の方が高リスク）が、遺伝因子としては、ＡＣＥ、ＧＣＫ、ＥＳＲ１、ＡＰＯＣ３、ＧＣＬＣ、ＩＲＳ１、ＡＤＲＢ１、Ｆ１２、ＳＴＸ１Ａの各遺伝子多型が肥満に関連した。従来の危険因子では最小オッズ比が１.００で最大オッズ比が６.２５、遺伝因子では最小オッズ比が０.５０で最大オッズ比が７.５３であった。したがって、従来の危険因子と遺伝因子を総合すると、最小オッズ比が０.５０で最大オッズ比が４７.０７であり、９４倍の差が認められた。 Multivariate logistic regression with risk factors less than 0.05 (P <0.05) and polymorphism group with age, gender, and smoking as independent factors (confounding factors) and obesity as a dependent factor. Analysis was performed and P values, odds ratios, and 95% confidence intervals were calculated for each factor. These factors are therefore independent and the overall risk of obesity can be predicted by multiplying the odds ratio. As a result of multinomial logistic regression analysis, age (aged is higher risk) as a conventional risk factor, and genetic factors such as ACE, GCK, ESR1, APOC3, GCLC, IRS1, ADRB1, F12, STX1A The type was associated with obesity. Conventional risk factors have a minimum odds ratio of 1.00 and a maximum odds ratio of 6.25, and genetic factors have a minimum odds ratio of 0.50 and a maximum odds ratio of 7.53. Therefore, when the conventional risk factors and genetic factors were combined, the minimum odds ratio was 0.50 and the maximum odds ratio was 47.07, indicating a difference of 94 times.

本研究成果の臨床的な意義について以下に述べる。病院、クリニックまたは健診センターにおいて希望者に対して従来の危険因子と今回の遺伝因子に関する検査を行い、肥満のリスクの予測を行う。従来の危険因子と遺伝因子全体のオッズ比の積の分布からリスクの程度を３段階以上（例えば、５段階）に分ける。例えば、平均±１ＳＤの範囲を平均的リスク群とし、平均＋１ＳＤから平均＋２ＳＤをやや高リスク群、平均＋２ＳＤ以上を高リスク群とする。また、平均−１ＳＤから平均−２ＳＤをやや低リスク群、平均−２ＳＤ以下を低リスク群とする。
実際に本研究において、リスク値の分布は、リスクが高い群では肥満者群が８．４％でコントロール群が３．１％、リスクがやや高い群では肥満者群が２０．３％でコントロール群が１２．９％、平均的リスクの群では肥満者群が６４．０％でコントロール群が６８．１％、リスクがやや低い群では肥満者群が７．２％でコントロール群が１５．１％、リスクが低い群では肥満者群が０．１％でコントロール群が０．８％であった。他の方法として、コントロール群のリスク値の大きい順に全体を５％、２０％、５０％、２０％、５％に区分し、リスク値の最も大きい５％の群をリスクが高い群、次の２０％の群をリスクがやや高い群、次の５０％の群を平均的リスクの群、次の２０％の群をリスクがやや低い群、リスク値が最も小さい５％の群をリスクが低い群とする。実際に本研究における肥満者群の分布は、リスクが高い群は１１．４％（コントロール群は５．０％）、リスクがやや高い群は２８．８％（コントロール群は２０．０％）、平均的リスクの群は４６．４％（コントロール群は５０．０％）、リスクがやや低い群は１１．９％（コントロール群は２０．０％）、リスクが低い群は１．６％（コントロール群は５．０％）であった。
なお、本研究では有意な関連が認められなかったが、一般的に性別・喫煙・飲酒も肥満に影響すると考えられるのでこれらを含めることもできる。 The clinical significance of this research result is described below. At the hospital, clinic, or health checkup center, the risk factors for obesity are predicted by testing the applicant for the existing risk factors and the genetic factors. The degree of risk is divided into three or more levels (for example, five levels) from the distribution of the conventional product of risk factors and odds ratios of all genetic factors. For example, an average ± 1SD range is defined as an average risk group, an average of + 1SD to an average of + 2SD is set as a slightly high risk group, and an average of + 2SD or higher is set as a high risk group. Further, the average −1SD to the average −2SD are set as a low risk group, and the average −2SD or lower is set as a low risk group.
In fact, in this study, the risk value distribution was controlled at 8.4% in the obese group and 3.1% in the control group in the high-risk group, and 20.3% in the obese group in the slightly high-risk group. 12.9% in the group, 64.0% in the obese group and 68.1% in the control group in the average risk group, 7.2% in the obese group and 15.5 in the control group in the slightly low risk group. In the low risk group, the obese group was 0.1% and the control group was 0.8%. As another method, the control group is divided into 5%, 20%, 50%, 20%, and 5% in descending order of risk value, and the group with the highest risk value of 5% 20% group is a slightly higher risk group, the next 50% group is an average risk group, the next 20% group is a slightly lower risk group, and the 5% group with the lowest risk value is a lower risk group A group. Actually, the distribution of the obese group in this study was 11.4% for the group with high risk (5.0% for the control group), and 28.8% for the group with slightly high risk (20.0% for the control group). The average risk group is 46.4% (control group is 50.0%), the slightly lower risk group is 11.9% (control group is 20.0%), and the low risk group is 1.6% (The control group was 5.0%).
Although no significant association was found in this study, gender, smoking, and alcohol consumption are generally considered to affect obesity, and these can be included.

結果については、医師等の有資格者の判断を含めてカウンセリングを行い、とりわけ高リスク群またはやや高リスク群に属する場合には生活習慣の改善（飲酒の減量・食事療法即ちカロリー制限・運動療法など）を行うことにより肥満の一次予防を積極的に推進する。多量の飲酒、高カロリー・高脂肪食、運動不足などの生活習慣は、一般的に肥満の原因と考えられているため、遺伝的に肥満のリスクが平均より高いと予測された場合は、生活習慣の改善により肥満のリスクを減少させるようにクライアントに説明する。特に肥満の家族歴のある人への適用が有効である。本システムにより肥満のオーダーメイド予防が可能になり、肥満に起因する高血圧・糖尿病やメタボリック症候群の発症予防、さらに心筋梗塞や脳血管障害の予防につながる。ひいては、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止や今後の医療費削減などにつながり、医学的・社会的に大きく貢献できる。 The results will be counseled, including the judgment of qualified personnel such as doctors, and especially if they belong to the high-risk group or a moderately high-risk group, improvement of lifestyle (reduction of alcohol consumption / dietary therapy, ie, calorie restriction / exercise therapy) Etc.) to actively promote primary prevention of obesity. Living habits such as heavy drinking, high-calorie / high-fat diet, and lack of exercise are generally considered to be the cause of obesity, so if you are genetically predicted to be at higher than average risk of obesity, Tell clients to improve their habits to reduce their risk of obesity. Application to people with a family history of obesity is particularly effective. This system enables tailor-made prevention of obesity, leading to prevention of hypertension / diabetes and metabolic syndrome caused by obesity, and prevention of myocardial infarction and cerebrovascular disorder. As a result, it can contribute to medical and social contributions by extending the healthy life expectancy of the elderly, improving QOL, preventing bedridden, and reducing medical costs in the future.

＜統計解析＞
次に、上記リスク判断システムを開発するに至った統計解析の結果について説明する。
カイ二乗検定により、１０個の遺伝子多型が肥満との関連を示した（Ｐ＜０.０６）。詳細を表９示した。表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、および危険率（Ｐ）を示している。 <Statistical analysis>
Next, the results of statistical analysis that led to the development of the risk judgment system will be described.
By chi-square test, 10 gene polymorphisms showed an association with obesity (P <0.06). Details are shown in Table 9. In the table, gene notation (Gene symbol), polymorphism (Polymorphism), and risk factor (P) are shown in order from the left column.

これらの多型については、肥満との関連について更に詳細に分析した。年齢、性別、および喫煙頻度を補正した多項ロジスティック回帰分析を行ったところ、グルコキナーゼ遺伝子（ＧＣＫ）の−３０Ｇ→Ａ多型が優性モデルにおいて、アンジオテンシン変換酵素遺伝子（ＡＣＥ）の−２４０Ａ→Ｔが優性モデル及び付加１モデルにおいて、アポリポプロテインＣ-III遺伝子（ＡＰＯＣ３）の−４８２Ｃ→Ｔが優性モデル及び付加１モデルにおいて、肥満の発生に有意に（Ｐ＜０.０１）関連した。また、エストロゲン受容体α遺伝子（ＥＳＲ１）の−１９８９Ｔ→Ｇも有意に肥満に関連した。このとき、ＡＰＯＣ３の−４８２Ｔ対立遺伝子は、肥満に対する危険因子となっており、ＧＣＫの−３０Ａ対立遺伝子、ＡＣＥの−２４０Ｔ対立遺伝子、及びＥＳＲ１の−１９８９Ｇ対立遺伝子は防御因子となっていた。詳細を表１０に示した。 These polymorphisms were analyzed in more detail for their association with obesity. A multinomial logistic regression analysis corrected for age, sex, and smoking frequency revealed that the −30G → A polymorphism of the glucokinase gene (GCK) is the dominant model, and the −240A → T of the angiotensin converting enzyme gene (ACE) is In the dominant model and the additional 1 model, -482C → T of the apolipoprotein C-III gene (APOC3) was significantly (P <0.01) related to the development of obesity in the dominant model and the additional 1 model. Also, -1989T → G of the estrogen receptor α gene (ESR1) was significantly associated with obesity. At this time, the -482T allele of APOC3 was a risk factor for obesity, and the -30A allele of GCK, the -240T allele of ACE, and the -1989G allele of ESR1 were protective factors. Details are shown in Table 10.

表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、優性モデル（Dominant）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、劣性モデル（Recessive）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加１モデル（Additive 1）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加２モデル（Additive 2）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）をそれぞれ示している。多項ロジスティック回帰分析は、年齢、性別、および喫煙の有無について補正して行った。また、表中、危険率が０.０１未満（Ｐ＜０.０１）のデータについては、太字で示した。肥満との関連が最も強いＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ多型では、肥満においては、ＧＧ遺伝子型が７０.５％、ＧＡ遺伝子型が２７.３％、ＡＡ遺伝子型が２.２％であり、コントロールにおいては、ＧＧ遺伝子型が６６.０％、ＧＡ遺伝子型が３０.６％、ＡＡ遺伝子型が３.４％であった。また、これらの多型の遺伝子型分布については、コントロール及び肥満者のいずれにおいてもハーディ・ワインバーグ平衡を満たしていた。 In the table, in order from the left column, genetic notation (Gene symbol), polymorphism (Polymorphism), dominant model (Dominant) risk rate (P), odds ratio (OR), 95% confidence interval (95% CI), Risk factor (P), odds ratio (OR), 95% confidence interval (95% CI) in recessive model (Recessive), risk factor (P), odds ratio (OR), 95% in additive 1 model (Additive 1) The risk interval (P), odds ratio (OR), and 95% confidence interval (95% CI) for the confidence interval (95% CI) and the additive 2 model (Additive 2) are shown. Multinomial logistic regression analysis was performed with correction for age, gender, and smoking status. In the table, data with a risk factor of less than 0.01 (P <0.01) are shown in bold. In the -30G → A polymorphism of GCK that is most strongly associated with obesity, in obesity, the GG genotype is 70.5%, the GA genotype is 27.3%, and the AA genotype is 2.2%. In the control, the GG genotype was 66.0%, the GA genotype was 30.6%, and the AA genotype was 3.4%. Further, the genotype distribution of these polymorphisms satisfied Hardy-Weinberg equilibrium in both control and obese subjects.

次に、肥満に対する１０個の多型の遺伝子型、年齢、性別、および喫煙の影響について、ステップワイズ変数増加法により解析した。結果を表１１に示した。表中には、左欄より順に、因子（Variable）、Ｐ値（P value）、寄与率（R²）を示している。 Next, the effects of 10 polymorphism genotypes, age, sex, and smoking on obesity were analyzed by the stepwise variable increment method. The results are shown in Table 11. In the table, the factor (Variable), P value (P value), and contribution rate (R ² ) are shown in order from the left column.

統計的有意性が高い順に、年齢、ＡＣＥ遺伝子型（優性モデル）、ＧＣＫ遺伝子型（優性モデル）、ＥＳＲ１遺伝子型（劣性モデル）、ＡＰＯＣ３遺伝子型（優性モデル）、ＩＲＳ１遺伝子型（優性モデル）、ＧＣＬＣ遺伝子型（劣性モデル）、ＡＤＲＢ１（優性モデル）、Ｆ１２遺伝子型（劣性モデル）ＳＴＸ１Ａ遺伝子型（劣性モデル）が有意であり（Ｐ＜０.０５）、各要因が独立して肥満に影響を与えることが分かった。
最後に、肥満の遺伝的リスクを評価するために、３個の多型（ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、及びＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ）の組み合わせ遺伝子型について、オッズ比、９５％信頼区間、およびＰ値を計算した。結果を表１２に示した。表中においては、左より順に、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔの遺伝子型、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａの遺伝子型、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇの遺伝子型、各組み合わせ遺伝子型における肥満者数／コントロール者数、オッズ比（９５％信頼区間）、およびＰ値を示した。 In descending order of statistical significance, age, ACE genotype (dominant model), GCK genotype (dominant model), ESR1 genotype (recessive model), APOC3 genotype (dominant model), IRS1 genotype (dominant model), GCLC genotype (recessive model), ADRB1 (dominant model), F12 genotype (recessive model) STX1A genotype (recessive model) are significant (P <0.05), and each factor independently affects obesity I found out that
Finally, to assess the genetic risk of obesity, odds ratios for the combined genotypes of the three polymorphisms (ACE -240A → T, GCK -30G → A, and ESR1 -1989T → G) , 95% confidence intervals, and P values were calculated. The results are shown in Table 12. In the table, from left to right, the ACE −240A → T genotype, the GCK −30G → A genotype, the ESR1 −1989T → G genotype, the number of obese persons in each combination genotype / control persons Number, odds ratio (95% confidence interval), and P value are shown.

３個の多型について組み合わせ遺伝子型を解析することにより、最小オッズ比の０.４５が、ＡＣＥについてＡＴまたはＴＴ、ＧＣＫについてＧＧ、ＥＳＲ１についてＧＧの組み合わせ遺伝子型について認められた。 By analyzing the combined genotypes for the three polymorphisms, a minimum odds ratio of 0.45 was found for the combined genotypes of AT or TT for ACE, GG for GCK, and GG for ESR1.

＜考察＞
本発明者は、肥満との関連が疑われる１２４個の候補遺伝子について、１４７カ所の多型を調べた。３９０６人の被験者について大規模研究を行ったところ、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ多型、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ多型、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ多型が、日本人の肥満と有意に関係していた。３個の多型（ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、及びＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ）の組み合わせ遺伝子型について解析を行ったところ、最小オッズ比の０.４５が得られた。 <Discussion>
The present inventor examined 147 polymorphisms for 124 candidate genes suspected to be associated with obesity. A large-scale study of 3906 subjects revealed that the ACE −240A → T polymorphism, GCK −30G → A polymorphism, and ESR1 −1989T → G polymorphism were significantly related to Japanese obesity. It was. Analysis of the combined genotypes of the three polymorphisms (-240A → T for ACE, -30G → A for GCK, and -1989T → G for ESR1) yielded a minimum odds ratio of 0.45. .

脂肪組織におけるレニン−アンジオテンシン系は、アンジオテンシンIIの活性を通じて、脂肪細胞の成長と分化に重要な影響を与えている。疫学調査の結果によれば、ＢＭＩは、アンジオテンシノーゲンの血中濃度、血中レニン活性、及び血中ＡＣＥ活性と関連があると言われている。２０年間の追跡調査によれば、白人成人男性では、ＡＣＥのイントロン１６に見られる挿入／欠失多型において欠失多型のホモ接合者は、加齢に伴う腹部肥満と体重増加傾向とが認められており、これらは脂肪組織における局所的なレニン−アンジオテンシン系の役割と、脂肪沈着の制御に対する遺伝的影響とが一致している（非特許文献１１）。 The renin-angiotensin system in adipose tissue has an important influence on adipocyte growth and differentiation through the activity of angiotensin II. According to the results of epidemiological studies, BMI is said to be related to blood concentration of angiotensinogen, blood renin activity, and blood ACE activity. According to a 20-year follow-up study, in white adult males, homozygotes with deletion polymorphisms in the insertion / deletion polymorphisms found in ACE intron 16 are associated with abdominal obesity and weight gain with age. This is consistent with the role of the local renin-angiotensin system in adipose tissue and the genetic influence on the control of fat deposition (11).

このＡＣＥの挿入／欠失多型は、冠動脈疾患患者において肥満と脂肪組織への脂肪沈着にも関連している。すなわち、欠失多型は、肥満及び脂肪沈着がより進みやすく、かつ体重及び腰回り長さも増加する（非特許文献１２）。ＡＣＥプロモータ領域のハプロタイプは、米国及びナイジェリアの黒人において、親から肥満となる子孫に優先的に伝達されていることから、ＡＣＥ多型は体重増加に影響を与えるのかも知れない（非特許文献１３）。本発明者らは、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ多型が肥満に関与しており、Ｔ多型が保護因子として働くことを明らかにした。この結果は、ＡＣＥ多型が肥満に関与するという従来の知見と一致するものである。 This ACE insertion / deletion polymorphism is also associated with obesity and fat deposition in adipose tissue in patients with coronary artery disease. That is, the deletion polymorphism facilitates obesity and fat deposition, and increases body weight and waist circumference length (Non-patent Document 12). Since the haplotype of the ACE promoter region is preferentially transmitted from parents to obese offspring in black people in the United States and Nigeria, the ACE polymorphism may affect weight gain (Non-patent Document 13). ). The present inventors have revealed that the -240A → T polymorphism of ACE is involved in obesity, and that the T polymorphism acts as a protective factor. This result is consistent with the conventional finding that ACE polymorphisms are involved in obesity.

グルコキナーゼは、膵β細胞と肝細胞で発現されており、その発現は二つの組織特異的プロモーターによって調節されている（非特許文献１４）。膵グルコキナーゼは、インスリン分泌の調節に際し、グルコースセンサーとして働く。ＧＣＫの変異は、若年者における成人発症型糖尿病の１０％〜５０％に関与している（非特許文献１５）。ＧＣＫのβ細胞特異的プロモーターに位置する−３０Ｇ→Ａ多型は、日本人においてβ細胞機能の低下と糖耐能障害に関与している（非特許文献１６、１７）。本発明者らは、この多型が肥満に関与しており、Ａ多型が防御因子として働くことを明らかにした。Ａ多型が、β細胞機能の低下、糖耐能障害、及び肥満リスクの減少に対する作用メカニズムについては、依然として不明のままである。また、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ多型が、近傍に存在して実際に肥満に影響を及ぼす他の遺伝子多型と連鎖不平衡の状態にあると考えることもできる。 Glucokinase is expressed in pancreatic β cells and hepatocytes, and its expression is regulated by two tissue-specific promoters (Non-patent Document 14). Pancreatic glucokinase acts as a glucose sensor in regulating insulin secretion. The mutation of GCK is involved in 10% to 50% of adult-onset diabetes in young people (Non-patent Document 15). The −30G → A polymorphism located in the β-cell specific promoter of GCK is involved in the decrease in β-cell function and impaired glucose tolerance in Japanese (Non-patent Documents 16 and 17). The present inventors have revealed that this polymorphism is involved in obesity and that the A polymorphism acts as a protective factor. The mechanism of action of the A polymorphism on decreased beta cell function, impaired glucose tolerance, and reduced risk of obesity remains unclear. It can also be considered that the −30G → A polymorphism of GCK is in linkage disequilibrium with other gene polymorphisms that exist in the vicinity and actually affect obesity.

ＥＳＲ１が欠損したマウスでは、雌雄を問わず、白色脂肪細胞の肥厚化と肥大化、インスリン抵抗性、及び耐糖能障害が認められる（非特許文献１８）。エストロゲン−ＥＳＲ１シグナルは、雄性及び雌性の白色脂肪組織に重要な影響を与えている。ＥＳＲ１を欠損した雄性マウスでは、肥満は、エネルギー摂取の増加よりも、エネルギー支出が減少することによって起こる。ＥＳＲ１の第１イントロンには、二つの多型が見出されている。すなわち、制限酵素ＰｖｕIIによって認識されるＴ→Ｃ多型と、制限酵素ＸｂａＩによって認識されるＡ→Ｇ多型（Ａ対立遺伝子があると制限酵素部位が存在し（ｘアレル）、Ｇ対立遺伝子があると制限酵素部位がなくなる（Ｘアレル））である。 In mice lacking ESR1, thickening and hypertrophy of white adipocytes, insulin resistance, and impaired glucose tolerance are observed in both males and females (Non-patent Document 18). The estrogen-ESR1 signal has an important effect on male and female white adipose tissue. In male mice deficient in ESR1, obesity is caused by a decrease in energy expenditure rather than an increase in energy intake. Two polymorphisms have been found in the first intron of ESR1. That is, the T → C polymorphism recognized by the restriction enzyme PvuII and the A → G polymorphism recognized by the restriction enzyme XbaI (the A allele has a restriction enzyme site (x allele) and the G allele is If there is, the restriction enzyme site disappears (X allele)).

ＧＧ（ＸＸ）遺伝子型は、健常者に比べると、２型糖尿病患者と男性型肥満患者（android-type obesity）に有意に多く認められる（非特許文献１９）。ＸｂａＩ多型のＧＧ（ＸＸ）遺伝子型は、中年と閉経前の日本女性における男性型脂肪蓄積（android-type fat）の進展に寄与している（非特許文献２０）。今回の研究では、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ多型が肥満の発症に有意に関連しており、Ｇ対立遺伝子が保護因子として作用することが分かった。日本人では、−１９８９Ｔ→Ｇ多型はＸｂａＩ多型と連鎖不平衡にあり、前者の多型のＧ対立遺伝子と後者の多型のＡ（ｘ）対立遺伝子とは関連している（非特許文献２１）。ＧＧ（ＸＸ）遺伝子型が男性型肥満に関連しているという従来の知見は、今回の研究結果と一致している。 GG (XX) genotype is significantly more common in type 2 diabetic patients and android-type obesity than in healthy individuals (Non-patent Document 19). The GG (XX) genotype of the XbaI polymorphism contributes to the development of android-type fat in middle-aged and premenopausal Japanese women (Non-patent Document 20). In this study, it was found that the -1989T → G polymorphism of ESR1 is significantly associated with the development of obesity, and that the G allele acts as a protective factor. In Japanese, the -1989T → G polymorphism is in linkage disequilibrium with the XbaI polymorphism, and the former polymorphic G allele and the latter polymorphic A (x) allele are related (non-patented). Reference 21). The conventional finding that the GG (XX) genotype is associated with male obesity is consistent with the results of this study.

このように本実施形態によれば、肥満について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法を提供することができる。この実施形態を用いることにより、肥満の予防が可能となり、肥満が原因となって引き起こされる高血圧・糖尿病・メタボリック症候群・心筋梗塞・脳血管障害などの生活習慣病の罹患率を減少させることにより、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。 Thus, according to the present embodiment, it is possible to provide a detection method for determining a genetic risk and an onset risk for obesity. By using this embodiment, obesity can be prevented, and by reducing the prevalence of lifestyle-related diseases such as hypertension, diabetes, metabolic syndrome, myocardial infarction, and cerebrovascular disorders caused by obesity, It can greatly contribute medically and socially, such as extending healthy life expectancy, improving QOL, preventing bedridden, and reducing medical costs in the future.

Hager J, Dina C, Francke S, et al. A genome-wide scan for human obesity genes reveals a major susceptibility locus on chromosome 10. Nat Genet. 1998;20:304-8.Hager J, Dina C, Francke S, et al. A genome-wide scan for human obesity genes reveals a major susceptibility locus on chromosome 10. Nat Genet. 1998; 20: 304-8. Lee JH, Reed DR, Li WD, et al. Genome scan for human obesity and linkage to markers in 20q13. Am J Hum Genet. 1999;64:196-209.Lee JH, Reed DR, Li WD, et al. Genome scan for human obesity and linkage to markers in 20q13. Am J Hum Genet. 1999; 64: 196-209. Feitosa MF, Borecki IB, Rich SS, et al. Quantitative-trait loci influencing body-mass index reside on chromosomes 7 and 13: the National Heart, Lung, and Blood Institute Family Heart Study. Am J Hum Genet. 2002;70:72-82.Feitosa MF, Borecki IB, Rich SS, et al.Quantitative-trait loci influencing body-mass index reside on chromosomes 7 and 13: the National Heart, Lung, and Blood Institute Family Heart Study. 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Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。It is a figure which shows the fine structure and characteristic of a microbead detected with Luminex100. ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。It is a figure which shows the outline | summary of the procedure of PCR-SSOP-Luminex method.

Claims

ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ、ＡＰＯＣ３の−４８２Ｃ→Ｔ、ＩＲＳ１の３９３１Ｇ→Ａ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、及びＡＤＲＢ１の１１６５Ｇ→Ｃの遺伝子多型を検出することを特徴とする肥満の遺伝的リスク検出法。
ACE −240A → T, GCK −30G → A, ESR1 −1989T → G, APOC3 −482C → T, IRS1 3931G → A, GCLC −129C → T, and ADRB1 1165G → C A method for detecting a genetic risk of obesity, characterized by detecting a type.