JP5484068B2 - 不均一な細胞集団中の小さな細胞集団を決定するための方法 - Google Patents
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Description
妊娠の間に、血液は、通常、胎児循環から母体循環へ通過する(胎児母体間出血、FMH)。文献によれば、これは、およそ0.1ml〜30mlに達する。妊娠の96〜98%では、FMHは、<2mlであるが、妊娠の0.3%では、30mlを超える量が移行される。母体血液の量が5000mlと推定されると、これは、0.002%〜0.6%の、母親のものから逸脱する抗原プロフィールを有する第2の型の赤血球が母体循環へ入ったことを意味し、それが免疫化をもたらす場合、これは臨床的に意義があることとなる。最も顕著な例として、D+胎児を妊娠しているD母親がある。母親が抗D抗体を産生する場合、これは、別のD+胎児の妊娠において致命的な結果を有し得る(新生児溶血性疾患、HDN)。このため、これらの状況では、母親に「抗D予防薬」が投与される。しかしながら、例えば、>30mlのFMHでは、標準抗D治療が、もはや十分な保護を与えることができないために、FMHの量を推定できることには大きな関心が寄せられている。したがって、USAでは標準免疫化は、250〜300μgの抗D(IgG)を含んでなり、これは、その循環に、15mlの胎児赤血球、すなわち、25〜30mlの胎児血液が入った妊婦に対して十分な予防を達成する。欧州で投与される標準用量は、より少ない、すなわち、100〜150μgの抗D(IgG)であることが多く、これは8〜10mlのFMHで保護を与える。抗D予防薬を投与する各機関は、通常よりも多量のFMHを検出する方法を使用しなければならない(非特許文献1)。
ロゼット試験:約10ml
このアッセイは、赤血球凝集を検出することおよびその顕微鏡的評価に基づいている。胎児D抗原の検出。
(非特許文献2〜4)
このアッセイは、酸での溶出に対する胎児赤血球の高い抵抗性およびその顕微鏡的評価に基づいている。胎児細胞の検出。
(非特許文献5)
D抗原またはヘモグロビンFを対応する抗体で標識し、蛍光二次抗体によって検出する。胎児D抗原/ヘモグロビンの検出。
(非特許文献6および7)
このアッセイは、FMHを決定するための第1のアッセイであり、血液型を決定する常法(ゲル技術)に基づいて設計されている。胎児赤血球による抗D試薬の消費に基づいている。ゲル試験では、反応上清を、D陽性試験細胞とともにインキュベートし、遠心分離する。胎児D抗原の検出。
(非特許文献8および9)
ドナーおよびレシーバーの血清学のもう1つの課題として、D抗原の弱いまたは部分的な発現がある。特に弱いD発現を有するDEL表現型が記載されるまでは、モノクローナル抗体および間接クームス試験における確認によって、このような弱い血液型でさえ分類することは確実であると思われていた(「正常」D:10〜30000の赤血球あたりの抗原(RBC);D weak:400〜1000;DEL:<30)。
(非特許文献10)
輸血は、常に、同一または適合するABOおよび適合するDを用いて投与されなければならない。ある場合、例えば、以前輸血された患者に関する場合には、その他の抗原についても同一血液型を輸血するよう臨床的に指示される。しかし、すべての血液型において同一の血液型を輸血することは決して可能ではない(例外:自家輸血)。このことが、通常、あるヒトが、特定の血液型の特徴について診断上陽性かつ陰性であるという輸血後状態をもたらす。診断では、「mixed−field反応」が見られ、例えば、高感度法、特に、検出の間に個々の赤血球および凝集物を空間的に分離できるものによって容易に検出できる。例えば、300ml(67%)の赤血球濃縮物が、循環(45%のヘマクリット)が5000mlの血液を有するK陰性のヒト(血液型kk)に投与され、濃縮物がK+(血液型KkまたはKK)である場合、名目上、前記ヒトの約8%の赤血球がK+であり、赤血球の92%がK−である。
Nelson M.、Popp H.、Sharpe K.、Ashenden M. Haematologica2003年;88:1284頁(非特許文献12)
Issitt P.D.およびAnstee D.J. In: Applied Blood Group Serology(第4版)、Montgomery Scientific Publications.第3章:Hemolytic disease of the newborn. 1045〜1050頁(非特許文献13)
ヘマトクリットまたは赤血球の総容積は、全血の総容積に対する赤血球の容積の割合であり、パーセンテージとして表される。全血に対する赤血球の容積割合は、赤血球の容積および数によって影響を受ける。
−液体サンプルを適用するための、少なくとも1つの供給ゾーン(5)と、
−細胞成分が透過するのに適しており、少なくとも1つの指標ゾーンを膜上に含み、指標ゾーンが、細胞結合分析物と相互作用でき、細胞結合分析物に対する少なくとも1種の結合要素を含む、多孔質膜(2)と、
−液体が指標ゾーンを通過した後に液体を吸収する、膜上の少なくとも1つの吸収領域(3)と
を含んでなる装置を用いて実施され、
少なくとも1つの指標ゾーンが、供給ゾーン(5)と吸収領域(3)の間に位置し、例えば、胎児母体間出血の場合において、またはキメラにおいて、不均一な細胞集団中の小さな細胞集団を濃縮および定量するために、細胞上に低濃度で存在する分析物を検出するために、ヘマトクリット値を決定するために、および/またはmixed−field反応において細胞結合分析物を同時に決定するために実施される、液体サンプル中の1種以上の細胞結合分析物を決定する方法を提供することによって解決される。
a)細胞を含有するサンプルを供給ゾーンに適用するステップと、
b)希釈剤を適用するステップと、
c)アッセイを実施するステップと、
d)細胞が指標ゾーンに結合しているかどうかを決定することによってアッセイを評価するステップ。
a)赤血球を含有する血液サンプルを供給ゾーン適用するステップと、
b)希釈剤を供給ゾーンに適用するステップと、
c)アッセイを実施するステップと、
d)赤血球が指標ゾーン(複数の指標ゾーン)と結合しているかどうかを決定することによってアッセイを評価するステップと
を含んでなり、
本方法は、胎児母体間出血(FMH)の場合に細胞結合分析物を同時に決定するために、Mixed−field反応における決定のために、同種血輸血を検出するために、またはヘマトクリット値を決定するために実施される。
−液体サンプルを適用するための、供給ゾーン(5)と、
−細胞成分が透過するのに適しており、少なくとも2つの指標ゾーンを膜上に含み、指標ゾーンが、細胞結合分析物(複数の分析物)と相互作用でき、細胞結合分析物に対する結合要素を含む、多孔質膜と、
−液体が指標ゾーンを通過した後に液体を吸収する、少なくとも1つの吸収領域(3)と
を含んでなり、
指標ゾーンが、供給ゾーン(5)と吸収領域(3)の間に位置し、少なくとも2つの指標ゾーンが、サンプル液体が各フロートラックにおいて2以上指標ゾーンを通過するような方法でフローの方向に縦に並んで配置される。
側方流動装置の使用によってまた、血液型およびヘマトクリットを同時に決定することが可能となる。
本発明との関連では、以下の用語は、以下に示されるように理解されなければならない:
用語「不均一な細胞集団中の小さい細胞集団」とは、細胞集団が、同様に不均一な細胞集団中に存在する1種以上のその他の細胞集団と比較して、少量または低濃度で存在することを意味する。不均一な細胞集団全体に基づく、小さい細胞集団の濃度は、これでは、50%未満、好ましくは、10%未満、特に好ましくは、1%未満、特には、0.1%未満である。
原則として、DE10330982A1およびWO2005/005986に明記される側方流動装置はいずれも適している。
好ましい実施形態によれば、本方法は、胎児母体間出血(FMH)を決定するために実施され、これでは、サンプルは、赤血球を含み、指標ゾーンは、抗体または抗体混合物を含むことが好ましい。
インキュベーション法に関する上記の説明はまた、特に断りのない限り、2指標ゾーン法にも当てはまる。
試験ストリップの調製:2種の異なる抗体の各場合における連続適用を行う
試験ストリップは、中央の供給ゾーン、2つの指標ゾーン領域および2つの吸収領域からなる。Millipore HiFlow Plus 075種類の膜を、10対の設計のために大きさ19×75mm(幅/長さ;y/x)のストリップに切断し、支持層(例えば、G&Lによる裏打ちシート)に貼り付ける。中央供給ゾーン(双方向フロー)を用い、それぞれ、種々の血液型特異的モノクローナル抗体の溶液の0.3μlラインおよび0.1μlスポットを、供給ゾーンの両側で平行列の指標ゾーン領域に、ディスペンサー、例えば、AD3200(Biodot)を用いて適用し、各場合において2種の異なる抗体(一方はスポットとして、もう一方はラインとして)の連続適用を行う:
供給ゾーンの左に:
抗A → 抗B
抗B → 抗A
抗D → 抗RBC
抗RBC → 抗D
抗K → 抗k
供給ゾーンの右に:
抗C → 抗c
抗c → 抗C
抗E → 抗e
抗e → 抗E
抗k → 抗K
50μlの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、200μlの希釈剤F(Medion Diagnostics)と混合する。100μlの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている(run dry)」場合には、300μlの希釈剤Fを適用する。
赤血球沈降物試験混合物:
50μlの赤血球沈降物(抗凝固処理全血を1500rpmで5分間遠心分離し、赤血球沈降物は、下部の赤い相中に位置する)を、400μlの希釈剤Fと混合する。100μlの得られた懸濁液を、供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合は、300μlの希釈剤Fを適用する。
試験ストリップを、実施例1と同様の方法で調製した。
抗D → 抗RBC
抗RBC → 抗D
抗K → 抗k
抗k → 抗K
抗C → 抗c
抗c → 抗C
抗E → 抗e
抗e → 抗E
抗Jka → 抗Jkb
抗Jkb → 抗Jka
抗Cw → 抗RBC
抗RBC → 抗Cw
50μlの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、200μlの希釈剤Fと混合する。100μlの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている(run dry)」場合には、300μlの希釈剤Fを適用する。
50μlの赤血球沈降物を、400μlの希釈剤Fと混合する。100μlの得られた懸濁液を、供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合は、300μlの希釈剤Fを適用する。
試験ストリップを、実施例1におけるように調製し、抗Dのみを適用する。抗体混合物よりも個々の抗体を適用することが好ましい。好ましい抗体:RUM−1(Millipore)、LDM−3(Alba Bioscience)またはESD1M(Alba Bioscience)、TH−28、MS−201、MS−26(Millipore)、LDM−1(Alba Bioscience)。
400μlの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、100μlの希釈剤Fと混合する。300μlの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合には、400μlの希釈剤Fを適用する。
3mlの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、1500rpmで3分間遠心分離する。その後、600μlの細胞沈降物を、第2の容器に移し、そこで、600μlの市販のブロメライン溶液(例えば、Medion Diagnostics製のブロメラーゼ(Bromelase))と混合し、37℃で15分間インキュベートする。これに続いて、0.9%NaClで3回洗浄する。
試験ストリップを、実施例3においてと同様に調製した。混合物よりもむしろ個々の抗体を適用することが好ましい。好ましい抗体:RUM−1(Millipore);LDM−3(Alba Bioscience)。
400μlの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、100μlの希釈剤Fと混合する。300μlの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが、「乾いてしまっている」場合は、400μlの希釈剤Fを適用する。
3mlの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、1500rpmで3分間遠心分離する。その後、600μlの細胞沈降物を、第2の容器に移し、そこで600μlの市販のブロメライン溶液(例えば、Medion Diagnostics製のブロメラーゼ(Bromelase))と混合し、37℃で15分間インキュベートする。これに続いて、0.9%NaClで3回洗浄する。
試験ストリップを、実施例1においてと同様に調製し、各場合において、同一抗体(抗RBC)の少なくとも2の(好ましくは5の)アリコートを連続適用する。変形1:抗体の濃度は、近位から遠位に向けて低下する:変形2:複数のフロートラックがあり、各場合において、2(5)の抗体スポットを有し、抗体濃度はフロートラックからフロートラックへと低下する;変形3:変化1および変化2の組み合わせ;変形4:近位抗体適用はライン、続いて、複数のスポットである:
フロートラック1 抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC(c=「1.0」)
フロートラック1:抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC(c=「0.8」)
フロートラック1:抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC(c=「0.6」)
フロートラック1:抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC(c=「0.4」)
フロートラック1:抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC 抗RBC(c=「0.2」)
50μlの抗凝固処理全血または新たに採取した未変性血を、200μlの希釈剤Fと混合する。100μlの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合には、300μlの希釈剤Fを適用する。
結果は、約5分後に読み取ることができる。
50μlの赤血球沈降物を、400μlの希釈剤Fと混合する。100μlの得られた懸濁液を供給ゾーンに適用する。供給ゾーンに適用する。供給ゾーンが「乾いてしまっている」場合は、300μlの希釈剤Fを適用する。
結果は、約5分後に読み取ることができる。
Claims (20)
- 不均一な赤血球細胞集団中の小さな赤血球細胞集団を定量するため、赤血球細胞上に低濃度で存在する分析物を検出するために、ヘマトクリット値を決定するため、および/またはmixed−field反応において赤血球の細胞結合分析物(cellularly bound analytes)を同時に決定するための方法であって、
a)一定量の血液サンプルと、該血液サンプルの量よりも少ない量の希釈剤とを混合して液体サンプルを調製するステップと、
b)ステップa)の、細胞を含有する液体サンプルを200μl〜500μl前記供給ゾーンに適用するステップと、
c)希釈剤を適用するステップと、
d)アッセイを実施するステップであって、適用されたサンプルが供給ゾーンから指標ゾーンを通って吸収領域まで移動するように、ステップa)の液体サンプルをテスト装置でインキュベートすることを含むステップと、
e)指標ゾーンに結合させることによって小さな赤血球細胞集団を濃縮し、他の赤血球細胞集団の量を指標ゾーンにおいて減少させるステップと、
f)赤血球細胞が指標ゾーンと結合しているかどうかを決定することによって前記アッセイを評価するステップと、を含み、
−液体サンプルを適用するための、少なくとも1つの供給ゾーン(5)と、
−細胞成分が透過するのに適しており、少なくとも1つの指標ゾーンを膜上に含み、前記指標ゾーンが、細胞結合分析物と相互作用でき、細胞結合分析物に対する少なくとも1種の結合要素を含む、多孔質膜(2)と、
−液体が前記指標ゾーンを通過した後に液体を吸収する、膜上の少なくとも1つの吸収領域(3)とを含んでなり、
−少なくとも1つの指標ゾーンが、前記供給ゾーン(5)と前記吸収領域(3)の間に位置する、装置を用いて実施される方法。 - 前記不均一な細胞集団が胎児母体間出血(FMH)またはキメラに起因する請求項1記載の方法。
- 胎児母体間出血(FMH)を決定するために実施され、前記サンプルが赤血球を含み、指標ゾーンが抗体または抗体混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞上に低濃度で存在する分析物を決定するために実施され、前記分析物がDELであり、前記指標ゾーンが、抗体または抗体混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)の前に、血液サンプルを遠心分離することによって赤血球沈降物を調製するステップと、沈降物をブロメライン、パパインまたはフィシン溶液とともにインキュベートするステップと、酵素処理した沈降物を再懸濁するステップとをさらに含んでなる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 100μl〜200μlの希釈剤が、ステップc)で適用される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 抗D抗体が、RUM−1、LDM−3、ESD1M、TH−28、MS−201、MS−26およびLDM−1から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装置が、前記液体サンプルが各フロートラックにおいて2以上指標ゾーンを通過するような方法でフローの方向に縦に並んで配置される少なくとも2つの指標ゾーンを含み、前記指標ゾーンが、細胞結合分析物に対する結合要素を含み、
a)一定量の血液サンプルと、該血液サンプルの量よりも少ない量の希釈剤とを混合して液体サンプルを調製するステップと、
b)ステップa)の、細胞を含有する液体サンプルを200μl〜500μl前記供給ゾーンに適用するステップと、
c)希釈剤を適用するステップと、
d)アッセイを実施するステップであって、適用されたサンプルが供給ゾーンから指標ゾーンを通って吸収領域まで移動するように、ステップa)の液体サンプルをテスト装置でインキュベートすることを含むステップと、
e)指標ゾーンに結合させることによって小さな赤血球細胞集団を濃縮し、他の赤血球細胞集団の量を指標ゾーンにおいて減少させるステップと、
f)赤血球細胞が指標ゾーンと結合しているかどうかを決定することによって前記アッセイを評価するステップと、
を含んでなり、
胎児母体間出血(FMH)の場合に細胞結合分析物を同時に決定するために、Mixed−field反応において決定するために、同種血輸血を検出するために、またはヘマトクリット値を決定するために実施される、請求項1に記載の方法。 - ヘマトクリット値を決定するために実施され、前記指標ゾーンが、抗体または抗体混合物を含み、ステップf)において赤血球が前記指標ゾーンに結合されている全体パターンが決定される、請求項8に記載の方法。
- 前記装置が、単一のフロートラック中に配置される少なくとも2つの指標ゾーンを含み、前記指標ゾーンが、赤血球の同じ細胞結合分析物に対する同一の結合要素を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記装置が、少なくとも2つの指標ゾーンを含有する少なくとも2つのフロートラックを有し、結合要素の濃度が、前記供給ゾーンに関して近位から遠位に増加または減少する、請求項9または10に記載の方法。
- 前記装置が、少なくとも2つの指標ゾーンを含有する少なくとも2つのフロートラックを有し、第1のフロートラック中の抗体の濃度が、第2のフロートラック中の濃度と異なる、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
- mixed−field反応において細胞結合分析物を同時に決定するために、または同種血輸血を検出するために実施され、前記装置が、サンプル液体が各フロートラックにおいて2以上指標ゾーンを通過するような方法でフローの方向に縦に並んで配置される少なくとも2つの指標ゾーンを含み、前記指標ゾーンが異なる細胞結合分析物に対する結合要素を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞結合分析物が、A、B、AB、D、C、c、E、e、Cw、K、k、Jkaおよび/またはJkbなどの血液型抗原から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液型抗原が、反応対A,B;D+,D−;K,k;C,cおよび/またはE,eによって決定される、請求項14に記載の方法。
- 前記分析物に対する結合要素が、抗体、抗体フラグメント、レクチン、レクチン断片またはそれらの混合物から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜または複数の膜(2)が、ポリエチレン、ニトロセルロースまたはナイロンからなる、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの密閉要素(4)が、前記供給ゾーン(5)の下流かつ前記膜(2)上の指標ゾーンの上流に配置されている、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装置の構成要素が、機械補強のために支持層(1)に適用される、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装置の構成要素が、ハウジングに組み込まれている、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
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