JP2013546002A - 抗体連結型免疫沈降剤およびそれを使用してサンプルから標的を単離する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2010年12月15日に出願された米国仮特許出願第61/423,391号の利益を主張する。上記出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。
開示の分野
本開示は、概して、標的(例えば、細胞および分子)を含む溶液からのその標的の単離に関する。より詳細には、本開示は、抗体連結型免疫沈降剤(antibody−linked immuno−sedimentation agent)(ALISA)を用いて溶液から標的を分離する新規方法に関する。さらに、本開示は、その抗体連結型免疫沈降剤自体に関する。
溶液から標的(例えば、細胞、分子など)を単離するための方法が多く存在する。標的(例えば、核酸(例えば、DNAおよびRNA)、タンパク質および他の分子)は、とりわけ、抽出、沈殿、クロマトグラフィーおよび免疫親和性によって単離され得る。免疫吸着などの手法は、ビーズおよび磁性粒子などの基材に連結された抗標的抗体を使用する。次いで、そのビーズを回収し、結合していない成分を除去することによって、ビーズに結合した標的がサンプルから単離される。
本開示は、概して、抗体連結型免疫沈降剤(ALISA)およびその抗体連結型免疫沈降剤を用いて標的を単離する方法に関する。より詳細には、1つの態様において、本開示は、少なくとも1つの沈降剤およびその沈降剤に連結された少なくとも1つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤に関し、ここで、その少なくとも1つの抗体は、非抗原結合領域によって沈降剤に連結されている。
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が、下記で説明される。
本開示の1つの態様は、抗体連結型免疫沈降剤(ALISA)に関する。ALISAは、少なくとも1つの沈降剤およびその少なくとも1つの沈降剤に連結された少なくとも1つの抗体を含み、ここで、その沈降剤に連結された抗体は、本明細書中の下記でさらに詳述されるように抗体の非抗原結合領域によって連結されている。あるいは、ALISAは、少なくとも1つの沈降剤およびその少なくとも1つの沈降剤に連結された少なくとも1つの抗体からなり得るか、またはそれらから本質的になり得、ここで、その沈降剤に連結された抗体は、本明細書中の下記でさらに詳述されるように抗体の非抗原結合領域によって連結されている。
本開示の方法において使用される抗体連結型沈降剤は、少なくとも1つの沈降剤およびそれに連結または付着された少なくとも1つの(または1つのタイプの)抗体を含む。他の態様において、ALISAは、2種以上の沈降剤を含む。その沈降剤の選択は、当業者が最適化し得る種々の変更可能な事項に依存する。変更可能な事項(例えば、とりわけ、沈降剤、標的およびRBCの濃度、沈降剤の分子量、温度、標的と抗体との比、沈降剤とRBCとの比、所望の沈降速度/時間、ルロー形成の所望の速度/時間、ならびに/またはルローネットワーク形成の所望の速度/時間)は、沈降剤を選択する際に当業者によって考慮され得る。
本開示の抗体連結型沈降剤は、少なくとも1つの沈降剤に連結された少なくとも1つの抗体を含み得る。いくつかの態様において、異なる抗原に指向する2つ以上の抗体(または異なるタイプの抗体)が、その少なくとも1つの沈降剤に連結され得る。別の態様において、異なる抗原に指向する少なくとも2つの抗体が、2つ以上の異なる沈降剤に連結され得る。
上記で先に述べたように、本開示のALISAでは、沈降剤に抗体が連結されるかまたは付着される。その抗体は、沈降剤に直接または間接的に連結され得る。付着の性質は、いくつかの潜在的に変更可能な事項(例えば、沈降剤および/または抗体自体の化学組成)に依存し得る。抗体は、Fc領域、ヒンジ領域、軽鎖定常(CL)領域、重鎖(CH 1)領域、軽鎖(CL)領域および重鎖(CH 1)領域、重鎖(CH 2)領域、重鎖(CH 3)領域またはそれらのいくつかの組み合わせ(例えば、いくつかの異なる抗体が使用される場合)によって、沈降剤に連結され得る。
本開示の1つの態様は、抗体連結型免疫沈降剤(ALISA)を用いてサンプルから標的を単離する方法を含む。その方法は、少なくとも1つの標的、ALISAおよび赤血球を含むサンプルを含む混合物を形成する工程ならびにその混合物から標的を回収する工程を包含する。ALISAは、少なくとも1つの沈降剤およびその沈降剤に連結または付着された少なくとも1つの抗体を含む。次いで、混合物は、ルローを形成するのに十分な条件下でインキュベートされる。本明細書中に記載される様々な方法によると、ルローは、そのルローの赤血球上への少なくとも1つの沈降剤の吸着によって形成される。インキュベーション後、当該分野で広く公知の方法および/または本明細書中の他の箇所にさらに記載されるような方法を用いて標的が回収される。
本方法の1つの態様において、混合物は、ルローを形成するのに十分かつALISA抗体がその抗原に結合するのに十分な条件下でインキュベートされる。本方法の別の態様において、混合物は、ルローネットワークを形成するのに十分かつALISA抗体がその抗原に結合するのに十分な条件下でインキュベートされる。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ルローまたはルローネットワークの形成のプロセスは、RBCの表面に吸着する沈降剤から開始すると考えられている。RBC上への沈降剤の吸着は、RBCが積み重なってルローを形成する可逆プロセスを誘導する。図4Aを参照のこと。次いで、ルローは、他のルローと架橋することにより、ルローネットワークを形成し得る。図4Bを参照のこと。図4Bは、他のルローと相互作用してルローネットワークを形成する個別のルローを示している。ルローおよびルローネットワークの形態のRBCは、懸濁液からのRBCの沈殿をもたらす。
本開示のプロセスにおいて使用されるサンプルは、サンプルからの単離が望まれている標的を有する任意の溶液または混合物であり得る。好適なサンプルは、例えば、血液、骨髄、末梢血幹細胞単離物、骨髄穿刺液、バフィーコート層、白血球アフェレーシス単離物、プラスマフェレーシス単離物、細胞懸濁液、細胞培養培地、細胞混合物、細胞ホモジネート、膵臓単離物、臓器ホモジネート(例えば、肝臓、脳、腎臓、膵臓、肺、筋肉、脂肪組織、脾臓、リンパ節、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、卵巣、精巣、子宮、心臓または腫瘍細胞)、食塩水、リンガー溶液、乳酸加リンガー溶液、リン酸緩衝化食塩水、ウイルス培養培地、卵母細胞、***、配偶子混合物またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。1つの態様において、血液は、例えば、全血、血漿、多血小板血漿、分画血液、濃厚赤血球(packed red blood cell)、臍帯血、骨髄、幹細胞血液単離物またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。細胞混合物または細胞懸濁液は、例えば、細胞培養物、細胞ホモジネート、細菌含有サンプル、多細胞生物含有サンプル、アメーバ含有サンプルならびに他の細胞含有混合物および懸濁液またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。サンプルは、例えば、無細胞混合物、例えば、タンパク質含有サンプル、ポリペプチド含有サンプル、ヌクレオチド含有サンプル、多糖含有サンプル、脂質粒子含有サンプル、ミセル含有サンプル、ウイルス含有サンプル、ウイロイド含有サンプル、血小板含有サンプル、分子含有サンプルまたはそれらのいくつかの組み合わせでもあり得る。
ALISAを用いる本開示の方法は、ルローおよびルローネットワークへのRBCの形成に依存し、ゆえに、RBCは、本方法において必須である。赤血球(Red blood cells)(または赤血球(erythrocytes))は、循環器系を貫流して酸素を体組織に送達する血液細胞の1タイプである。RBCは、例えば、血液などのサンプルが起源であり得る。ある特定の態様において、その血液は、全血、血漿、血液幹細胞単離物、多血小板血漿、分画血液、濃厚赤血球、臍帯血、骨髄、骨髄穿刺液およびバフィーコート層を含む。あるいはまたはさらに、RBCは、RBCの数を増加させるためにサンプルに加えられ得る(例えば、骨髄穿刺液)。あるいはまたはさらに、RBCは、RBCを欠いているかまたはRBCが不足している混合物に加えられ得る(例えば、細菌含有サンプルおよび膵臓ホモジネート)。
標的は、先に記載されたような、サンプルの他の成分からの単離または分離が望まれているかまたは求められている、そのサンプル中の目的の任意の分子、細胞などであり得る。その標的は、例えば、多細胞生物、単細胞生物、細胞、細胞内成分(subcellular component)、細胞フラグメント、ウイルスおよびウイルス様標的、膜結合粒子および脂質粒子、巨大分子、核酸ならびにタンパク質であり得る。多細胞生物は、例えば、虫、吸虫類および寄生生物であり得る。単細胞生物は、例えば、細菌、単細胞真核生物、原生動物、マラリア、トリパノソーマおよびアメーバであり得る。細胞収集物は、例えば、膵島、骨髄および幹細胞凝集物、肝細胞、腫瘍転移ならびに傍濾胞細胞(C細胞)であり得る。細胞内(Subcellar)成分は、例えば、ミトコンドリア、核、核小体、中心小体、葉緑体、リソソーム、キネトプラスト、エンドソーム、リボソームおよび貯蔵小胞であり得る。細胞フラグメントは、例えば、アポトーシス小体、血小板およびエキソソームであり得る。ウイルスおよびウイルス様標的は、例えば、DNAおよびRNAウイルス、ウイロイドならびにファージであり得る。膜結合粒子および脂質粒子は、例えば、リポソーム、リポタンパク質(キロミクロン、VLDL、IDL、LDL、HDL)およびミセルであり得る。巨大分子およびタンパク質は、例えば、抗体によって標的化され得る任意の化合物またはモチーフ(タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、多糖、DNA、RNA、核酸様巨大分子(例えば、ペプチド核酸、ロックト(locked)核酸および他の改変された核酸様分子)、合成ポリマー、オリゴマー、脂質、糖、グリコサミノグリカンおよびこれらの構成要素のヘテロ複合体を含む)であり得る。
本方法は、さらに、ブロッキング剤の添加を包含し得る。本明細書中で使用されるとき、「ブロッキング剤」とは、上記抗体の非特異的な結合を回避するかまたは防止するために使用される任意の物質のことを指す。ブロッキング剤は、例えば、タンパク質コロイド、例えば、ヒトアルブミン、ウシ血清アルブミンもしくはウシ胎仔血清、免疫グロブリン、抗CD16抗体、抗ヒトCD32(FcγRII)、Fcレセプター抗体またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。
求められているかまたは望まれている標的の不必要な成分からの回収は、ALISA−ルロー/ルローネットワーク複合体によって結合された標的を分離すること、または不必要な成分がALISA−ルロー/ルローネットワーク複合体によって結合されているときに混合物から標的を分離することを含み得る。分離は、種々の手法(そのすべてが当該分野で広く公知である)を用いて達成され得る。好適な手法は、例えば、重力(1×g)または混合物を遠心分離することによってもたらされる遠心力に応答した沈降であり得る(例えば、図3を参照のこと)。サンプルの沈降は、重力(1×g)および遠心分離によるものであり得る。したがって、本開示は、任意の重力または遠心力における分離を含むと意図される。
本方法は、ポジティブおよびネガティブセレクション法のために使用され得る。本明細書中で使用されるとき、「ポジティブセレクション」とは、標的がALISA法によって沈降されるように、その標的に指向する抗体を用いて標的が不必要な成分から分離される条件のことを指す。例えば、本開示のALISAを用いた、全血のポジティブセレクションでは、目的の標的細胞の表面抗原に指向する抗体が、ALISAの沈降剤に連結される。ルローおよび/またはルローネットワークが形成されると、目的の標的は、他の不必要な成分から離れてALISA−RBCルロー/ルローネットワーク層に沈降され、その他の不必要な成分は、バフィーコート/WBCまたは血漿層に残存する。所望であれば、次いで、ALISA−RBCルロー/ルローネットワーク層は、共沈した標的または不必要な成分から取り出され得るおよび/または分離され得る。ALISA−RBCルロー/ルローネットワークから標的または不必要な成分を分離する1つの方法は、RBCを溶解することである。RBCは、例えば、凍結融解の繰り返し(freeze−thaw cycling)、均質化、RBC溶解剤および当該分野で広く公知の他の手法を用いて、溶解され得る。
ALISAを調製するために使用される沈降剤の選択は、上で詳細に記載されたように、当業者が最適化し得る種々の変更可能な事項に依存する。
上で詳細に記載されたように、本開示の方法は、目的の標的に指向する少なくとも1つのタイプの抗体を含むALISAを使用する。したがって、この態様において、その抗体は、サンプル中の「標的抗原」に結合する。代替の実施形態において、本開示の方法は、サンプル中の標的抗原に指向する少なくとも1つのタイプの抗体からなるかまたはそれから本質的になるALISAを使用する。本開示の別の態様において、本開示の方法は、サンプル中に含まれる不必要な成分に指向する少なくとも1つのタイプの抗体を含むALISAを使用する。したがって、この態様において、その抗体は、サンプル中の「非標的抗原」に結合する。代替の実施形態において、本開示の方法は、サンプル中の非標的抗原に指向する少なくとも1つのタイプの抗体からなるかまたはそれから本質的になるALISAを使用する。
上で詳細に記載されたように、抗体は、本開示のALISAを調製するために、沈降剤に連結されるかまたは付着される。それらの抗体は、沈降剤に直接または間接的に連結され得る。抗体を沈降剤に付着する作用は、先に記載されたような当該分野で広く公知の方法または手法を用いて行われ得る。
本明細書中では、可能性のある沈降剤、抗体、標的、分離方法などの様々な列挙が例証のために提供され、ゆえに、限定の意味とみなされるべきでないことに注意されたい。当業者は、本開示のALISAおよび方法において使用され得るいくつかの他の公知の沈降剤、抗体、標的、分離方法などを認識するだろう。さらに、沈降剤、抗体、標的、分離方法などの効果的なまたは所望の組み合わせの選択は、当業者によっておよそ通例の実験によって認識され得るかまたは判断され得る。しかしながら、例示的な組み合わせは、例えば、以下であり得る:
本開示はさらに、サンプルから標的を単離するためのキットに関する。そのキットは、少なくとも1つの容器に、沈降剤およびその沈降剤に連結された少なくとも1つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤を備える。そのキットは、例えば、標的および/または不必要な成分のポジティブおよび/またはネガティブセレクションについての詳細、分離の方法、沈降のための方法、層から標的を分離する方法などを含む、そのキットを使用する方法についての指示書も備える。指示書は、キットとともに含められる書面の指示書および別個に提供される指示書を含み得る。別個の指示書は、例えば、インターネットウェブサイト上に提供され得る。
実施例1
トリクロロ(Tricholor)−s−トリアジンを用いたALISAの調製
この実施例では、トリクロロ−s−トリアジンを用いてALISAを調製する。無水炭酸ナトリウム(1g)を、200mlの無水有機溶媒(例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは1,4−ジオキサン)に加える。次いで、0.55gのトリクロロ−s−トリアジン(TsT)をその炭酸ナトリウム溶液に溶解する。沈降剤(1mmol)(およそ20gのポリエチレングリコール−PEG−20,000、70gのデキストラン−Dextran−70または180gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)をその炭酸ナトリウム溶液に加える。次いで、その溶液を、室温で一晩撹拌する。次いで、その溶液を濾過する。次いで、濾液を十分量の無極性有機溶媒(例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル)(500ml)に加えることにより、濾過によって回収される、活性化された沈降剤の沈殿物が得られる。この活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。その活性化された沈降剤に連結される抗体(100mg,0.67μmol(ea))を、5mg/mlの濃度で、20mlの緩衝液(例えば、pH9.4の0.1Mホウ酸ナトリウム)に溶解する。上記の活性化された沈降剤(10μmol/抗体,およそ0.2gのPEG−20K、0.7gのDextran−70または1.8gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、氷浴内(約4℃の温度)の上記反応溶液にゆっくり加える。その反応溶液を4℃で1時間撹拌する。最終的なALISAを単離または濃縮する(例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって)。
N−スクシンイミジルクロロホルメートを用いたALISAの調製
この実施例では、N−スクシンイミジルクロロホルメートを用いてALISAを調製する。沈降剤(1mmol)(およそ20gのポリエチレングリコール−PEG−20,000、70gのデキストラン−Dextran−70または180gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、室温の200mlの無水有機溶媒(例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは1,4−ジオキサン)に加える。別個で、N−スクシンイミジルクロロホルメート(6mmol)を10mlの乾燥アセトンに溶解する。別個で、4−(ジメチルアミノ)ピリジンを10mlの乾燥アセトンに溶解する。そのスクシンイミジルクロロホルメート溶液を、沈降剤溶液に撹拌しながら加える。次に、4−(ジメチルアミノ)ピリジン溶液を、合わせたスクシンイミジルクロロホルメート/沈降剤反応溶液に加える。その溶液を、室温で2時間撹拌する。その溶液を濾過して、沈殿した4−(ジメチルアミノ)ピリジンハイドロクロライド副産物を除去する。無極性有機溶媒(例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル)(500ml)を濾液に加えることにより、スクシンイミジルカーボネートによって活性化された沈降剤を沈殿させる。その活性化された沈降剤を濾過により回収する。その活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。その沈降剤に連結される抗体(100mg,0.67μmol(ea))を、5mg/mlの濃度で、20mlの緩衝液(例えば、pH7.5の0.1Mリン酸ナトリウム)に溶解する。上記の活性化された沈降剤(10μmol/抗体)(およそ0.2gのPEG−20K、0.7gのDextran−70または1.8gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、氷浴内(約4℃の温度)の上記反応溶液にゆっくり加える。その溶液を、4℃で1時間撹拌する。最終的なALISAを単離または濃縮する(例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって)。
N,N’−カルボニルジイミダゾールを用いたALISAの調製
この実施例では、N,N’−カルボニルジイミダゾール(CDI)を用いてALISAを調製する。沈降剤(1mmol)(およそ20gのポリエチレングリコール−PEG−20,000、70gのデキストラン−Dextran−70または180gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、室温の200mlの無水有機溶媒(例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは1,4−ジオキサン)に加える。別個で、CDI(6mmol)を10mlの上記有機溶媒に溶解する。そのCDI溶液を、沈降剤溶液に撹拌しながら加える。合わせた反応溶液を37℃で2時間撹拌する。次いで、その反応溶液を、無極性有機溶媒(例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル)(500ml)に加えることにより、CDIによって活性化された沈降剤を沈殿させる。その活性化された沈降剤を濾過により回収する。その活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。沈降剤に連結される抗体(100mg,0.67μmol(ea))を、5mg/mlの濃度で、20mlの緩衝液(例えば、pH9〜10の0.1M炭酸ナトリウム)に溶解する。上記の活性化された沈降剤(1抗体あたり10μmol)(およそ0.2gのPEG−20K、0.7gのDextran−70または1.8gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、氷浴内(約4℃の温度)の上記反応溶液にゆっくり加える。その溶液を、4℃で48時間撹拌する。最終的なALISAを単離または濃縮する(例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって)。
Moffatt酸化に続く還元的アミノ化を用いたALISAの調製
この実施例では、Moffatt酸化に続く還元的アミノ化を用いてALISAを調製する。沈降剤1mmol(およそ20gのポリエチレングリコール−PEG−20,000、70gのデキストラン−Dextran−70または180gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、室温の100〜200mlの無水ジメチルスルホキシドに加える。沈降剤を溶解するためにその溶液を加熱してもよいが、溶解したら、室温に冷却し戻す。別個で、その溶液に無水酢酸(3ml,30mmol)を滴下した後、5mlのトリエチルアミンを添加する。合わせた反応溶液を、室温で24時間撹拌する。次いで、その反応溶液を、無極性有機溶媒(例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル)(500ml)に加えることにより、アルデヒドによって活性化された沈降剤を沈殿させる。その活性化された沈降剤を濾過により回収する。この活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。沈降剤に連結される抗体(100mg,0.67μmol(ea))を、5mg/mlの濃度で、20mlの緩衝液(例えば、pH7.5の0.1M 4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES))に溶解する。別個で、その反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム(10mM,0.628mg)を添加する。上記の活性化された沈降剤(10μmol/抗体)(およそ0.2gのPEG−20K、0.7gのDextran−70または1.8gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、4℃の上記反応溶液にゆっくり加える。その反応溶液を、4℃で24時間撹拌する。エタノールアミン(10mM,0.611mg)を加え、2時間撹拌することによって、その反応をクエンチする。最終的なALISAを単離または濃縮する(例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって)。
トリクロロ−s−トリアジンを用いた(ストレプト)アビジン−沈降剤の調製
この実施例では、トリクロロ−s−トリアジンを用いて、(ストレプト)アビジン−沈降剤を調製する。無水炭酸ナトリウム(1g)を、200mlの無水有機溶媒(例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは1,4−ジオキサン)に加える。次いで、0.55gのトリクロロ−s−トリアジン(TsT)をその反応溶液に溶解する。沈降剤(1mmol)(およそ20gのポリエチレングリコール−PEG−20,000、70gのデキストラン−Dextran−70または180gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)をその反応溶液に加える。次いで、その反応溶液を室温で一晩撹拌する。次いで、その反応溶液を濾過する。次いで、濾液を、十分量の無極性有機溶媒(例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル)(500ml)に加えることにより、濾過により回収される沈殿物を得る。この活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。沈降剤に連結される(ストレプト(Strep))アビジン(100mg)を、5mg/mlの濃度で、20mlの緩衝液(例えば、pH9.4の0.1Mホウ酸ナトリウム)に溶解する。上記の活性化された沈降剤(10μmol)(およそ0.2gのPEG−20K、0.7gのDextran−70または1.8gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、氷浴内(温度4℃)の上記反応溶液にゆっくり加える。その反応溶液を、4℃で1時間撹拌する。最終的な(ストレプト)アビジン−沈降剤を単離または濃縮する(例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって)。
N−スクシンイミジルクロロホルメートを用いた(ストレプト)アビジン沈降剤の調製
この実施例では、N−スクシンイミジルクロロホルメートを用いて、(ストレプト)アビジン沈降剤を調製する。沈降剤(1mmol)(およそ20gのポリエチレングリコール−PEG−20,000、70gのデキストラン−Dextran−70または180gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、室温の200mlの無水有機溶媒(例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは1,4−ジオキサン)に加える。別個で、N−スクシンイミジルクロロホルメート(6mmol)を10mlの乾燥アセトンに溶解する。別個で、4−(ジメチルアミノ)ピリジンを10mlの乾燥アセトンに溶解する。スクシンイミジルクロロホルメート溶液を、沈降剤溶液に撹拌しながら加える。次に、4−(ジメチルアミノ)ピリジン溶液を、合わせた反応溶液に加える。合わせた反応溶液を、室温で2時間撹拌する。その反応溶液を濾過することにより、沈殿した4−(ジメチルアミノ)ピリジンハイドロクロライド副産物を除去する。無極性有機溶媒(例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル)(500ml)を濾液に加えることにより、スクシンイミジルカーボネートによって活性化された沈降剤を沈殿させる。その活性化された沈降剤を濾過により回収する。その活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。沈降剤に連結される(ストレプト)アビジン(100mg)を、5mg/mlの濃度で、20mlの緩衝液(例えば、pH7.5の0.1Mリン酸ナトリウム)に溶解する。上記の活性化された沈降剤(10μmol)(およそ0.2gのPEG−20K、0.7gのDextran−70または1.8gのヒドロキシエチルデンプン−Hetastarch)を、氷浴内(温度4℃)の上記反応溶液にゆっくり加える。その反応溶液を、4℃で1時間撹拌する。最終的な(ストレプト)アビジン−沈降剤を単離または濃縮する(例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって)。
ビオチン化された抗体および(ストレプト)アビジン−沈降剤を用いたALISAの調製
この実施例では、ビオチン化された抗体に連結された(ストレプト)アビジン−沈降剤を用いてALISAを調製する。実施例5または6に従って合成された(ストレプト)アビジン−沈降連結型沈降剤を、リン酸緩衝化食塩水(PBS)(pH7.4;280〜300mosMという容量オスモル濃度)に溶解する。その(ストレプト)アビジン−沈降剤の濃度は、ALISAにおいて使用される抗体に対して過剰である(1.5〜10倍)。選択されたビオチン化された抗体を、1抗体あたり約0.125μg/ml〜約20μg/mlという最終濃度が達成されるように、ALISA溶液に加える。この抗体濃度は、高価な抗体試薬の使用量を最小にする滴定実験によって最適化される。その(ストレプト)アビジン−沈降剤およびビオチン化された抗体を、0℃〜37℃で10〜60分間インキュベートする。過剰なビオチンがさらに加えられ、インキュベートされることにより、(ストレプト)アビジン−沈降剤上の非占有で残っている部位がブロッキングされ得る。最終的な(ストレプト)アビジン−ALISAを単離または濃縮する(例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって)。
ポジティブセレクションによるリンパ球の単離
この実施例では、ポジティブセレクション法における方法に従って、全血からリンパ球を単離する。全血(10ml)を患者から採取し、ラベンダー色のキャップのVACUTAINER回収チューブに回収する(K2EDTA 1.8mg/ml血液)。他の抗凝固薬(例えば、3.2%クエン酸ナトリウムまたは15USPナトリウムヘパリン/ml血液)を同様に使用してもよい。直接的な注射器への採血システムおよび血液バッグ回収システムを含む他の回収システムも使用され得る。上記の実施例1〜4に記載されたように、PEG20Kに連結された抗CD3(クローンUCHT−1)およびPEG20Kに連結された抗CD19(クローンAE1)を付着することによってALISAを別個に調製する。約0.125μg/ml〜約20μg/mlという最終的な抗体濃度が得られるように上記ALISA溶液を添加する。その抗体濃度は、滴定実験によって最適化される。この実施例では、抗CD3および抗CD19試薬の各々のALISA(50μg)(各20μlの1mg抗体/mlの原液)を全血サンプルに加える。さらに、60μlの未標識沈降剤(この実施例ではPEG20K)を添加することにより、0.6%という沈降剤の総濃度を得る。その混合物を30秒間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で20分間インキュベートし、次いで、1000×g、室温で10分間遠心分離する。不必要な成分(血小板、血漿および好中球)は、バフィーコート/WBC層および血漿層に残存し、標的にされているリンパ球は、ALISA−ルロー/ルローネットワークRBC層内に沈降する。不必要な上層を除去し、RBCを溶解し(例えば、塩化アンモニウム溶解緩衝液)、洗浄後に、標的にされているリンパ球を回収する。
ポジティブセレクションによる膵ランゲルハンス島の単離
この実施例では、ポジティブセレクション法において、膵腺房細胞/外分泌細胞および間質細胞から膵ランゲルハンス島の細胞を分離する。コラゲナーゼ処理および可能なトリプシン阻害を含むRicordi法によって、膵臓組織を調製する。この実施例では、抗インスリン抗体のALISA(800μg)(320μlの1mg抗体/mlの原液)を、20mlの膵臓消化溶液に加える。抗グルカゴンおよび抗ソマトスタチンのALISAも使用してよい。未標識沈降剤(この実施例ではPEG20K)(240μl)を添加することにより、0.6%という沈降剤の総濃度を得る。さらに20mlの自己の濃縮RBCを混合物に加える。その混合物を30秒間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で20分間インキュベートし、次いで、1000×g、室温で10分間遠心分離する。不必要な成分(腺房細胞/外分泌細胞および間質細胞)は、バフィーコート/WBC層および血漿層に残存し、標的にされている島は、ALISA−ルロー/ルローネットワークRBC層内に沈降する。不必要な上層を除去し、RBCを溶解し(例えば、塩化アンモニウム溶解緩衝液)、洗浄後に、標的にされているランゲルハンス島を回収する。
ポジティブセレクションによる骨髄単離物または末梢血幹細胞単離物からのCD34+幹細胞の単離
この実施例では、ポジティブセレクション法において、骨髄単離物または末梢血幹細胞単離物からCD34+幹細胞を単離する。PBSで100mlの出発体積に調整された骨髄または末梢血幹細胞単離物にALISAを添加する。この実施例では、抗CD34抗体のALISA(4mg)(4mlの1mg抗体/mlの原液)およびさらなる100mlの自己の濃縮RBCを上記幹細胞単離物溶液に加える。未標識沈降剤(この実施例ではPEG20K)(1.2ml)を添加することにより、0.6%という沈降剤の総濃度を得る。その混合物を2分間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で30分間インキュベートし、次いで、1000×g、室温で15分間遠心分離する。不必要な成分は、バフィーコート/WBC層および血漿/PBS層に残存し、標的にされているCD34+幹細胞は、ALISA−ルロー/ルローネットワークRBC層内に沈降する。不必要な上層を除去し、RBCを溶解し(例えば、塩化アンモニウム溶解緩衝液)、洗浄して遊離ヘモグロビンを除去した後に、標的にされているCD34+幹細胞を回収する。
ネガティブセレクションによるCD8+T細胞の単離
この実施例では、ネガティブセレクション法における方法に従って、全血から細胞傷害性CD8+T細胞を単離する。全血(10ml)を患者から採取し、ラベンダー色のキャップのVACUTAINER回収チューブに回収する(K2EDTA 1.8mg/ml血液)。他の抗凝固薬(例えば、3.2%クエン酸ナトリウムまたは15USPナトリウムヘパリン/ml血液)を同様に使用してもよい。直接的な注射器への採血システムおよび血液バッグ回収システムを含む他の回収システムも使用され得る。上記の実施例1〜4に記載されたように、抗CD4、抗CD14、抗CD16、抗CD19、抗CD20、抗CD36、抗CD56、抗CD123、抗TCRγ/δおよび抗グリコホリンAをPEG20Kに付着することによってALISAを別個に調製する。そのALISA溶液を添加することにより、各抗体につき約0.125μg/ml〜20μg/mlという最終的な抗体濃度を得る。その抗体濃度は、滴定実験によって最適化される。この実施例では、各試薬抗体のALISA(2.5μg〜50μg)(各抗体について、各40μlの0.1〜1mg/mlの組み合わされた9抗体原液)を、全血サンプルに加える。さらに、60μlの未標識沈降剤(この実施例ではPEG20K)を添加することにより、0.6%という沈降剤の総濃度を得る。その混合物を30秒間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で20分間インキュベートし、次いで、1000×g、室温で10分間遠心分離する。標的にされていて求められているCD8+細胞傷害性T細胞は、バフィーコート/WBC層に残存し、不必要な細胞(CD4、CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ、グリコホリンA表面マーカーによって標的化される)は、ALISA−ルロー/ルローネットワークRBC層内に沈降する。
ポジティブセレクションによるHIV−1ビリオンの単離
この実施例では、ポジティブセレクション法によって、サンプルからHIV−1ビリオンを単離する。全血(10ml)をHIV感染患者から採取し、ラベンダー色のキャップのVACUTAINER回収チューブに回収する(K2EDTA 1.8mg/ml血液)。上記の実施例1〜4に記載されたように、PEG20Kに連結された抗GP120を付着することによって、ALISAを別個に調製する。その抗体濃度は、滴定実験によって最適化される。この実施例では、上記抗体のALISA(50μg)(20μlの1mg抗体/mlの原液)を全血サンプルに加える。さらに、60μlの未標識沈降剤(この実施例ではPEG20K)を添加することにより、0.6%という沈降剤の総濃度を得る。その混合物を30秒間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で20分間インキュベートし、次いで、1000×g、室温で10分間遠心分離する。不必要な成分(血小板、血漿およびWBC)は、バフィーコート/WBC層および血漿層に残存し、標的にされているHIVビリオンは、ALISA−ルロー/ルローネットワークRBC層内に沈降する。不必要な上層を除去する。HIVビリオンおよびRBCは、溶解され得(例えば、塩化アンモニウム溶解緩衝液)、標的にされているHIVビリオンは、リアルタイム定量的PCRによって定量され得る。
Claims (64)
- サンプルから標的を単離する方法であって、該方法は:
a)サンプル、抗体連結型免疫沈降剤および赤血球を含む混合物を形成する工程であって、ここで、該抗体連結型免疫沈降剤は、
1)少なくとも1つの沈降剤および
2)抗体の非抗原結合領域によって該少なくとも1つの沈降剤に連結された少なくとも1つの抗体
を含む、工程;
b)ルローを形成するのに十分であり、かつ該抗体が該混合物中に存在する抗原に結合可能であるのに十分な条件下で該混合物をインキュベートする工程;ならびに
c)該混合物から標的を回収する工程
を包含する、方法。 - 前記ルローの前記赤血球上への前記少なくとも1つの沈降剤の吸着によって、該ルローが形成される、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの抗体が、前記混合物の形成前に、前記少なくとも1つの沈降剤に連結されている、請求項1または2に記載の方法。
- 前記抗体が、前記サンプル中の標的抗原または非標的抗原に結合する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- ルローネットワークを形成するのに十分な条件下で前記混合物をインキュベートする工程をさらに包含する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルが、全血、血漿、血液幹細胞単離物、多血小板血漿、分画血液、濃厚赤血球、臍帯血、骨髄、骨髄穿刺液、バフィーコート層、白血球アフェレーシス単離物、プラスマフェレーシス単離物、細胞懸濁液、細胞培養培地、細胞混合物、細胞ホモジネート、膵臓単離物、臓器ホモジネート、食塩水、リンガー溶液、乳酸加リンガー溶液、リン酸緩衝化食塩水、ウイルス培養培地、卵母細胞混合物、***、配偶子混合物およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合物が、内因性赤血球、外来性赤血球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される赤血球を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記外来性赤血球が、同種の赤血球、自己の赤血球、異種の赤血球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記標的が、多細胞生物、単細胞生物、細胞、細胞内成分、細胞フラグメント、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様標的、膜結合粒子、脂質粒子、巨大分子、DNA、RNA、核酸様巨大分子、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの沈降剤が、可溶性の沈降剤、部分的に可溶性の沈降剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの沈降剤が、不溶性の沈降剤を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの沈降剤が、ポリマーを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマーが、生体高分子、合成ポリマー、改変された生体高分子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記生体高分子が、多糖、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記多糖が、デンプン、デキストラン、セルロース、キチン、キサンタンガム、グリコサミノグリカンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、アルブミン、コラーゲン、フィブリノゲン、免疫グロブリンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記合成ポリマーが、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリジオキサノンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記改変された生体高分子が、加水分解されたコラーゲン−ゼラチン、FICOLL、エチレンオキシド修飾デンプンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記改変された生体高分子が、ヨウ化造影剤を含み、該ヨウ化造影剤は、ジアトリゾアート、イオパミドール、イオヘキソール、イオキシラン、イオプロミド、イオジキサノールおよびイオキサグレートからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記エチレンオキシド修飾デンプンが、ヒドロキシエチルデンプン、ペンタスターチおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体が、抗体フラグメント、キメラ抗体、二機能性抗体および二重特異性抗体のうちの少なくとも1つを含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体フラグメントが、抗原結合ドメイン、Fab、F(ab’)2、F(ab’)を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記サンプルが、血液を含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血液が、全血、血漿、血液幹細胞単離物、多血小板血漿、分画血液、濃厚赤血球、臍帯血、骨髄、骨髄穿刺液およびバフィーコート層を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記インキュベートする工程が、約10分間〜約120分間である、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、約0℃〜約45℃の温度で行われる、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、約5.4〜約9.4のpHで行われる、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合物から標的を回収する工程が、該混合物から前記ルローを分離する工程を包含する、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合物から標的を回収する工程が、該混合物から前記ルローネットワークを分離する工程を包含する、請求項5に記載の方法。
- 前記混合物から標的を回収する工程が、沈降、遠心分離、密度勾配遠心分離、磁場、電場、細胞溶解、化学的架橋、抽出、相転移、凍結融解の繰り返し、蒸発、煮沸、昇華、融解、結晶化、可塑化、濾過およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つに該混合物を供する工程を包含する、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的が、ポジティブセレクションまたはネガティブセレクションによって単離される、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的が、多細胞生物、単細胞生物、細胞、細胞内成分、細胞フラグメント、ウイルス、ウイルス様標的、膜結合粒子、脂質粒子、巨大分子、DNA、RNAおよびタンパク質のうちの少なくとも1つを含む、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体連結型免疫沈降剤が、少なくとも2つの異なる抗原に指向する抗体を含み、該抗体は、非抗原結合領域によって該沈降剤に連結されている、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体連結型免疫沈降剤が、少なくとも2つの異なる沈降剤を含む、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合物にブロッキング剤を添加する工程をさらに包含する、請求項1〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ブロッキング剤が、ヒトアルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ胎仔血清、免疫グロブリン、抗CD16抗体、抗ヒトCD32(FcγRII)、Fcレセプター抗体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項37に記載の方法。
- サンプルから標的を単離する方法であって、該方法は:
a)サンプル、抗体連結型免疫沈降剤および赤血球を含む混合物を形成する工程であって、ここで、該抗体連結型免疫沈降剤は、
1)ポリエチレングリコール、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンからなる群より選択される少なくとも1つの沈降剤;および
2)抗体の非抗原結合領域によって該少なくとも1つの沈降剤に連結された少なくとも1つの抗体
を含み、ここで、該抗体は、抗CD3抗体、抗CD19抗体、抗インスリン抗体、抗CD34抗体、抗CD4抗体、抗CD14抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD36抗体、抗CD56抗体、抗CD123抗体、抗TCRγ/δ抗体、抗グリコホリンA抗体および抗GP120抗体からなる群より選択される、工程;
b)ルローを形成するのに十分であり、かつ該抗体が該混合物中に存在する抗原に結合可能であるのに十分な条件下で該混合物をインキュベートする工程;ならびに
c)該混合物から標的を回収する工程
を包含する、方法。 - 少なくとも1つの沈降剤および該少なくとも1つの沈降剤に連結された少なくとも1つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤であって、ここで、該少なくとも1つの抗体は、非抗原結合領域によって該少なくとも1つの沈降剤に連結されている、抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記少なくとも1つの沈降剤に連結された前記少なくとも1つの抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項40に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記少なくとも1つの抗体が、キメラ抗体、二機能性抗体、二重特異性抗体、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、インタクトな抗体および抗体フラグメントのうちの少なくとも1つを含む、請求項40〜41のいずれか1項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記抗体フラグメントが、抗原結合領域、抗体超可変領域、抗体パラトープ、抗体軽鎖、抗体重鎖、対形成した抗体重鎖および軽鎖、Fab、F(ab’)2ならびにF(ab’)のうちの少なくとも1つを含む、請求項42に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記少なくとも1つの沈降剤に連結された前記少なくとも1つの抗体が、Fc領域、ヒンジ領域、軽鎖定常(CL)領域、重鎖(CH 1)領域、軽鎖(CL)領域および重鎖(CH 1)領域、重鎖(CH 2)領域ならびに重鎖(CH 3)領域によって該少なくとも1つの沈降剤に連結されている、請求項40〜43のいずれか1項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記少なくとも1つの沈降剤に連結された前記少なくとも1つの抗体が、該少なくとも1つの沈降剤に直接連結されている、請求項40〜44のいずれか1項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記少なくとも1つの沈降剤に連結された前記少なくとも1つの抗体が、該少なくとも1つの沈降剤に間接的に連結されている、請求項40〜44のいずれか1項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記少なくとも1つの沈降剤が、可溶性の沈降剤、部分的に可溶性の沈降剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項40〜46のいずれか1項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記少なくとも1つの沈降剤が、不溶性の沈降剤を含む、請求項40〜47のいずれか1項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記少なくとも1つの沈降剤が、ポリマーを含む、請求項40〜48のいずれか1項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記ポリマーが、生体高分子、合成ポリマー、改変された生体高分子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項49に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記生体高分子が、多糖およびポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む、請求項50に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記生体高分子が、多糖を含む、請求項50または51に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記多糖が、デンプン、デキストラン、セルロース、キチン、キサンタンガムおよびグリコサミノグリカンのうちの少なくとも1つを含む、請求項51または52に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパリン硫酸およびコンドロイチン硫酸のうちの少なくとも1つを含む、請求項53に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記ポリペプチドが、アルブミン、コラーゲン、フィブリノゲンおよび免疫グロブリンのうちの少なくとも1つを含む、請求項51に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記ポリマーが、合成ポリマーを含む、請求項50に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記合成ポリマーが、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリジオキサノンのうちの少なくとも1つを含む、請求項50または56に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記改変された生体高分子が、加水分解されたコラーゲン−ゼラチン、FICOLLおよびエチレンオキシド修飾デンプンのうちの少なくとも1つを含む、請求項50に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記改変された生体高分子が、ヨウ化造影剤を含み、該ヨウ化造影剤は、ジアトリゾアート、イオパミドール、イオヘキソール、イオキシラン、イオプロミド、イオジキサノールおよびイオキサグレートからなる群より選択される、請求項50に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 前記エチレンオキシド修飾デンプンが、ヒドロキシエチルデンプンおよびペンタスターチのうちの少なくとも1つを含む、請求項58に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 少なくとも2つの異なる抗原に指向する抗体を含む、請求項40〜60のいずれか1項に記載の抗体連結型免疫沈降剤であって、該少なくとも2つの異なる抗体は、非抗原結合領域によって該沈降剤に連結されている、抗体連結型免疫沈降剤。
- 少なくとも2つの異なる抗原に指向する前記抗体が、非抗原結合領域によって少なくとも2つの異なる沈降剤に連結されている、請求項61に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- 少なくとも2つの異なる沈降剤を含む、請求項40〜62のいずれか1項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
- ポリエチレングリコール、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンからなる群より選択される少なくとも1つの沈降剤ならびに該少なくとも1つの沈降剤に連結された少なくとも1つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤であって、該少なくとも1つの抗体は、非抗原結合領域によって該少なくとも1つの沈降剤に連結されており、該少なくとも1つの抗体は、抗CD3抗体、抗CD19抗体、抗インスリン抗体、抗CD34抗体、抗CD4抗体、抗CD14抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD36抗体、抗CD56抗体、抗CD123抗体、抗TCRγ/δ抗体、抗グリコホリンA抗体および抗GP120抗体からなる群より選択される、抗体連結型免疫沈降剤。
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