JP5474355B2 - RNAiを利用する植物害虫のための遺伝子組換え植物系方法 - Google Patents
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Description
本発明は昆虫農作物害虫の制御における新規で非化合物、非タンパクによるアプローチを記載する。活性成分は核酸、2本鎖RNA(dsRNA)であり、これは殺虫剤として使用され得る。他の実施態様では、dsRNAは宿主植物、植物の部分、植物細胞または種子で恒常的に発現されて、食性昆虫、特にビートル(beetles)などの甲虫(colopterans)から植物を保護することができる。dsRNAの配列は必須昆虫遺伝子の部分または全体に対応し、RNA干渉(RNAi)を経て昆虫標的の下方制御を生じる。mRNAの下方制御の結果として、dsRNAは標的昆虫タンパクの発現を阻止し、それゆえ、昆虫の死、成長停止または不妊を生じる。
(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240〜247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、508〜513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066〜1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476または2481または2486のいずれかで示される配列、またはこれらの相補鎖
(ii)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240〜247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、508〜513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066〜1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、2481または2486のいずれかで示される配列、またはこれらの相補鎖と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列、
(iii)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240〜247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、508〜513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066〜1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、2481または2486で示される配列、またはこれらの相補鎖のいずれかの少なくとも17個の隣接したヌクレオチドを含む配列、
または、前記核酸配列は配列番号49〜158、275〜472、533〜575、621〜767、813〜862、908〜1040、1161〜1571、1730〜2039、2120〜2338、2384〜2460のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも17個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子のオルソログであり、
前記核酸配列は昆虫成長を制御するための本発明の2本鎖RNAを調製するために有用である。
(a)(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476または2481のいずれかによって示される配列、またはこれらの相補鎖と少なくとも75%同一である配列
(ii)1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476または2481、またはこれらの相補鎖のいずれかの少なくとも17個の隣接した配列を含む配列、および
(iii)(i)のヌクレオチオド配列を含むセンス鎖および(i)の前記ヌクレオチド配列の相補鎖を含むアンチセンス鎖を含む配列、ここで、前記ヌクレオチド配列がコードする転写物は2本鎖RNAを形成することが可能である;
からなる群から選択される、標的昆虫遺伝子のヌクレオチド配列;
または
(b)配列番号49〜158、275〜472、533〜575、621〜767、813〜862、908〜1040、1161〜1571、1730〜2039、2120〜2338、2384〜2460のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも17個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである、ヌクレオチド配列;
の少なくとも一部に相補的な配列に、操作可能に結合される少なくとも1つの制御配列を含む組み換え構築物で植物細胞を形質転換し、
形質転換植物細胞から植物を再生し;そして
組換え構築物の発現に適した条件下で形質転換植物を成長させ、前記成長させた形質転換植物は非形質転換植物に比べて植物病原性昆虫に対して抵抗性である。
co wireworm));フソリマエア属(Phthorimaea spp.)(例えば、P.オ ペルクレッラ(P. operculella)(ジャガイモガ, potato tuberworm));マクロシフム属(Macrosiphum spp.)(例えば、M.ユーフォルビアエ(M. euphorbiae)(チューリップヒゲナガアブラムシ,potato aphid));チアンタ属(Thyanta spp.)(例えば、T.パリドヴィレンス(T. pallidovirens)(レッドショルダード・スティンクバッグ,redshouldered stinkbug));フソリマエア属(Phthorimaea spp.)(例えば、P.オ ペルクレッラ(P. operculella)(ジャガイモガ,potato tuberworm));ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)(例えば、H.ゼア(H. zea)(トマト・フルーツウォーム, tomato fruitworm));ケイフェリア属(Keiferia spp.)(例えば、K.リコペリシセラ(K. lycopersicella)(トマト・ピンウォーム, tomato pinworm));リモニウス属(Limonius spp.)(ワイアウォーム, wireworms);マンデュカ属(Manduca spp.)(例えば、M.セクタ(M. sexta)(タバコ・ホーンウォーム, tobacco hornworm)、またはM.クウィンケウェマクラタ(M. quinquemaculata)(トマト・ホーンウォーム, tomato hornworm));リリオマイザ属(Liriomyza spp.)(例えば、L.サチヴァエ(L. stivae)、L.トリフォリ(L. trifolli)またはL.ウィドブレンシス(L. huidobrensis)(ハモグリバエ, leafminer));ドロソフィラ属(Drosophilla spp.)(例えば、D.メラノガスター(D. melanogaster)、D.ヤクバ(D. yakuba)、D.シュードオブスキューラ(D. pseudoobscura)またはD.シムランス(D. simulans);カラブス属(Carabus spp.)(例えば、C.グラヌラタス(C. granulatus);キロノムス属(Chironomus spp.)(例えば、C.テンタヌス(C. tentanus);クテノセファリデス属(Ctenocephalides spp.)(例えば、C.フェリス(C. felis)(ネコノミ, cat flea));ディアプレペス属(Diaprepes spp.)(例えば、D.アブレヴィアタス(D. abbreviatus) (ルート・ウィーヴィル, root weevil));アイプス属(Ips spp.)(例えば、I.ピニ(I. pini)(パイン・エングレーバー, pine engraver));トリボリウム属(Tribolium spp.)(例えば、T.カスタニュウム(T. castaneum)(コクヌストモドキ, red flour beetle));グロッシーナ属(Glossina spp.)(例えば、G.モルシタンス(G. morsitans)(ツェツェバエ, tsetse fly));アノフェレス属(Anopheles spp.)(例えば、A.ガムビアエ(A. gambiae)(マラリア蚊, malaria mosquito));ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)(例えば、H.アーミジェラ(H. armigera)(アフリカン・ボールウォーム, African Bollworm));アシルソシフォン属(Acyrthosiphon spp.)(例えば、A.ピスム(A. pisum)(ソラマメヒゲナガアブラムシ, pea aphid));アピス属(Apis spp.)(例えば、A.メリフェラ(A. melifera)( セイヨウミツバチ, honey bee));ホマロディスカ(Homalodisca spp.)(例えば、H.コーギュレーテ(H. coagulate)(グラッシーウイングド・シャープシューター, glassy-winged sharpshooter));エアデス属(Aedes spp.)(例えば、Ae.エアジプチ(Ae. Aegypti)(ネッタイシマカ, yellow fever mosquito));ボムビックス属(Bombyx spp.)(例えば、B.モリ(B. mori)(カイコ, silkworm));ロカスタ属(Locusta spp.)(例えば、L.ミグラトリア(L. migratoria)(トノサマバッタ, migratory locust));ブーフィラス属(Boophilus spp.)(例えば、B.ミクロプラス(B. microplus)(ウシマダニ, cattle tick));アカンソスクリア属(Acanthoscurria spp.)(例えば、A.ゴメシアナ(A. gomesiana)(レッドヘアード・チョコレート・バード・イーター, red-haired chololate bird eater));ディプロプテラ属(Diploptera spp.)(例えば、D.プンクタータ(D. punctata)(パシフィック・ビートル・コックローチ, pacific beetle cockroach));ヘリコニウス属(Heliconius spp.)(例えば、H.エラート(H. erato)(レッド・パッション・フラワー・バタフライ, red passion flower butterfly)またはH.メルポメネ(H. melpomene)(ポストマン・バタフライ, postman butterfly));クルクリオ属(Curculio spp.)(例えば、C.グランディウム(C. glandium)(アコーン・ウィーヴィル, acorn weevil));プルテッラ属(Plutella spp.)(例えば、P.キシロステッラ(P. xylostella)(コナガ, diamondback moth));アムブリオムマ属(Amblyomma spp.)(例えば、A.ヴァリエガツム(A. variegatum)(ウシマダニ, cattle tick));アンテラエア属(Anteraea spp.)(例えば、A.ヤママイ(A. yamamai)(カイコガ, silkmoth));およびアーミジェレス属(Armigeres spp.)(例えば、A.スバルバツス(A. subalbatus));などのような、しかしこれに限定されない植物害虫である昆虫からなる群から選択される。
(a)作物種、トマト(いくつかのリコペルシコン種(Lycopersicon species))、ナス(ソラヌム・メロンジェナ(Solanum melongena)、コショウ(いくつかのカプシクム種(Capsicum species))、タバコ(観賞植物を含むいくつかのニコチアーナ種(Nicotiana species))およびセンナリホウズキ(フィサリス種(Physalis species));
(b)ウィード/ハーブ種、ワルナスビ(S.カロリネンス(S. carolinense))、イヌホオズキ(S.デュルカマラ(S. dulcamara))、ベラドンナ(アスロパ種(Asropa species))、チョウセンアサガオ(ダツーラ種(Datura species))、ヒヨス(ヒオスシアムス種(Hyoscyamus species))およびバッファロー・バー(S.ロストラツム(S. rostratum))。
FPBはワルナスビに主に見られるが、イヌホオズキ、センナリホウズキ、およびショクヨウホウズキ(フィサリス種(Physalis species))にも生じる。
本発明は、昆虫がレプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)(コロラドハムシ)であり、植物がジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、センナリホウズキまたはコメ、コーンまたはワタである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がファエドン・コクレアリアエ(Phaedon cochleariae)(マスタード・リーフ・ビートル)であり、植物がカラシナ、ハクサイ、カブの葉、コラード若葉または青梗菜である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がエピラクナ・バリヴェティス(Epilachna varivetis)(インゲンテントウ)であり、植物がマメ、フィールド・ビーン、ガーデン・ビーン、インゲンマメ、ライマメ、ヤエナリ、サヤインゲン、黒目豆、ベルベット・ビーン、ダイズ、ササゲ、キマメ、クローバーまたはアルファルファである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がアントノムス・グランディス(Anthonomus grandis)(ワタミハナゾウムシ)であり、植物がワタである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がトリボリウム・カスタニュウム(Tribolium castaneum)(コクヌストモドキ)であり、植物が小麦粉、穀物、食事、クラッカー、マメ、スパイス、パスタ、ケーキミックス、乾燥ペットフード、ドライフラワー、チョコレート、ナッツ、種子、およびイーブン・ドライド・ミュージアム・スペーシメンなどの貯蔵された穀物製品の形態である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)(モモアカアブラムシ)であり、植物が特にモモ、アプリコットおよびプラムなどのプラナス(Prunus)などの樹木;朝鮮アザミ、アスパラガス、マメ、ビーツ、ブロッコリ、芽キャベツ(Brussel sprouts)、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、カンタロープ、セロリ、コーン、キュウリ、ウイキョウ、ケイル、球茎甘藍、カブ、ナス、レタス、カラシナ、オクラ、パセリ、マメ、コショウ、ジャガイモ、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ、トマト、カブ、オランダガラシおよびスイカを含むがこれに限定されない、ソラナセアエ(Solanaceae)、ケノポディアセアエ(Chenopodiaceae)、コムポシタエ(Compositae)、クルシフェラエ(Cruciferae)およびククルビータアエ(Cucurbitaceae)科の野菜作物;タバコ、シュガービートおよびヒマワリなどの、しかしこれに限定されない畑作物;花作物または他の観賞用植物である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)であり、植物がイネである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がキロ・サプレッサリス(Chilo suppressalis)(ニカメイチュウ)であり、植物がイネ、オオムギ、ソルガム、トウモロコシ、コムギまたは草である、ここに記載された方法にまで及び。
本発明は、昆虫がプルテッラ・キシロステッラ(Plutella xylostella)(コナガ)であり、植物がキャベツ、ハクサイ、芽キャベツ、ケイル、アブラナ、ブロッコリ、カリフラワー、カブ、カラシナまたはダイコンなどの、しかしこれに限定されないブラッシカ種(Brassica species)である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がアチェタ・ドメスティカス(Acheta domesticus)(イエコオロギ)であり、植物はここに記載されるいかなる植物であるか、またはいかなる有機物である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
好ましい実施態様では、感受性を有する生物は植物であり、害虫は植物病原性昆虫である。この実施態様では、昆虫は植物病原性害虫に横行されるか、またはこの横行に対して感受性を有する植物、植物の部分、植物細胞または植物種子中でdsRNA分子を発現して、RNA分子に接触させる。
標的遺伝子はここに記載される標的遺伝子のすべてであり、例えば、害虫の生存、成長、発生または再生に必須である標的遺伝子である。本発明は下方制御され得る、昆虫において興味あるいかなる遺伝子(「標的遺伝子」としてここに引用される)にも関する。
さらに、昆虫標的遺伝子のRNAiを指図するまたはRNA−仲介遺伝子サイレンシングまたは阻害する能力を有するすべての好適な2本鎖RNA断片が、本発明の方法で使用される。
他の実施態様では、本質的に害虫の成長、発生および再生(昆虫としてなど)に関与する遺伝子が選択される。遺伝子の例としては、リボソーマルタンパクの構造サブユニットおよびCHD3遺伝子などのベータ−コータマー(beta-coatamer)が挙げられるが、これらに限定されない。S4(RpS4)およびS9(RpS9)などのリボソーマルタンパクは、タンパク生合成に関与するリボソームの構造上の成分であり、そして細胞内可溶質の小さなリボソーマルサブユニットの構成成分であり、L9およびL19などのリボソーマルタンパクはリボソームに局在化するタンパク生合成に関与するリボソームの構造上の成分である。C.エレガンス(C. elegance)のベータ−コートマー遺伝子は、膜小胞外皮を形成する多量複合体のサブユニットであるタンパクをコードする。同様な配列はアラビドプシス・サリアーナ(Arabidopsis thaliana)、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)、およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの種々の生物に見出されている。関連した配列はレピチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)、ファエドン・コクレアリアエ(Phaedon cochleariae)、エピラクナ・ヴァリヴェスティス(Epilachna variestis)、アンソノムス・グランディス(Anthonomus grandis)、トリボリウム・キャスタニュウム(Tribolium castaneum)、ミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)、ニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)、キロ・サプレッサリス(Chilo suppresssalis)、プルテッラ・キシロステッラ(Plutella xylostella)およびアチェタ・ドメスティカス(Acheta domesticus)などの種々の生物に見出されている。
本発明の方法では、dsRNAは昆虫の成長を阻害するか、または病原性または感染性を干渉するために使用される。
すなわち、本発明はアニールされた相補鎖を含む単離2本鎖RNAに関し、そのうちの1つは、昆虫の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する。標的遺伝子はここに記載される標的遺伝子のいずれかであってもいいし、あるいは同じ機能を発揮するその一部であってもいい。
(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、または2481のいずれかに示される配列、またはこれらの相補鎖と少なくとも75%同一であるか、および
(ii)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、または2481のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも17個の隣接したヌクレオチドによって示される配列、
または、前記昆虫標的遺伝子は、配列番号49〜158、275〜472、533〜575、621〜767、813〜862、908〜1040、1161〜1571、1730〜2039、2120〜2338、2384〜2460のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも17個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである。
標的昆虫遺伝子の「標的領域」または「標的ヌクレオチド配列」との表現は、遺伝子の好適な領域またはヌクレオチド配列である。標的領域は標的遺伝子の少なくとも17、少なくとも18または少なくとも19個の隣接したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも20または少なくとも21個のヌクレオチドおよびより好ましくは標的遺伝子の少なくとも22、23または24個のヌクレオチドを含むべきである。
dsRNAは標的遺伝子の標的領域に対応する配列を含むけれども、dsRNA全体が標的領域の配列に対応することを絶対的に必須としない。例えば、もしもこのような配列が物質(material extent)へのRNA阻害において、dsRNAの実行に影響を与えないなら、dsRNAは標的特異的配列に隣接する短い非標的領域を含んでいてもよい。
dsRNAはさらにDNA塩基、非天然塩基または非天然骨格連鎖または糖−リン酸骨格の修飾を、例えば、貯蔵中の安定性を増強するために、またはヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を増強するために含む。
1つの実施態様では、2本鎖RNA領域は標的遺伝子に相補的であるヌクレオチド配列の多数のコピーを含む。他方、dsRNAは同じ標的遺伝子の1つ以上の標的配列をヒットする。すなわち、本発明は昆虫標的のヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的である前記ヌクレオチド配列の少なくとも2つのコピーを含む単離された2本鎖RNA構築物を包含する。
「さらなる標的遺伝子」または「少なくとも1つの他の標的遺伝子」との表現は、例えば、第2番目、第3番目または第4番目などの標的遺伝子を意味する。
上記標的のうちの1つ以上をヒットするdsRNA、または上記標的の異なったものに対する異なったdsRNAの組み合わせが開発され、本発明の方法に使用される。
(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、または2481のいずれかによって示される配列、またはそれらの相補鎖と少なくとも75%同一である配列、および
(ii)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、または2481のいずれか、またはそれらの相補鎖の少なくとも17個の隣接したヌクレオチドを含む配列、
または、前記昆虫遺伝子は配列番号49〜158、275〜472、533〜575、621〜767、813〜862、908〜1040、1161〜1571、1730〜2039、2120〜2338、2384〜2460のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも17個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
a)1つの標的遺伝子を標的とする多数のdsRNA領域が結合される場合、それらはRNA構築物で元来の順(すなわち、その領域が標的遺伝子に現れる順)で結合される。
b)他方、断片の元来の順は無視されて、それらは2本鎖RNA構築物中へいかなる順序でもランダムまたは故意にごちゃ混ぜにされ、結合される。
c)他方、1つのシングル断片はdsRNA構築物中で数回、例えば、1〜10回、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回、繰り返される。または、
d)dsRNA領域(単一または異なった標的遺伝子を標的とする)はセンスまたはアンチセンス方向に結合される。
e)上記記載された「必須」遺伝子または「病原性遺伝子」とは、1つまたは複数の標的昆虫において生命維持に必要であり、サイレンスされると、致死的または重大な表現型(例えば、摂食、再生、成長)となる遺伝子を包含する。強力な致死的標的遺伝子の選択は、潜在的RNAi効果となる。本発明のRNA構築物では、同じまたは異なった(非常に有効な)致死的遺伝子を標的とする多数のdsRNA領域は、昆虫制御のRNAi効果の潜在性、効率性および速度をさらに増加するために結合される。
f)「弱い」遺伝子はここに記載される細胞経路の1つで特別に興味ある機能をもつ標的遺伝子を包含する。しかし、独立してサイレンシングされると弱い表現型効果となる。本発明のRNA構築物では、1つまたは異なった弱い遺伝子を標的とする多数のdsRNA領域はより強いRNAi効果を得るために結合される。
g)「昆虫特異的」遺伝子は、生命情報科学の相同性検索、例えば、BLAST検索によって決定されるように、非昆虫生物に実質的な相同性ある対応物を有しない遺伝子を包含する。昆虫特異的標的遺伝子の選択は、非標的生物において効果が全くないか、または実質的な(有害)効果を有しない種特異的RNAi効果となる。
h)「保存された遺伝子」は標的生物と非標的生物との間に(アミノ酸レベルで)保存される遺伝子を包含する。非標的種に可能性ある効果を減少させるために、このように有効であるが、保存された遺伝子が分析され、これらの保存された遺伝子の可変領域から得た標的配列は、RNA構築物のdsRNA領域によって標的化されるように選択される。ここで、保存とは核酸配列のレベルで利用される。すなわち、このような可変領域は核酸配列のレベルで保存標的遺伝子の最小の保存セクションを包含する。
i)「保存径路」遺伝子は、同じ生物学的径路または細胞過程に関与する遺伝子を包含するか、または特異的および潜在的RNAi効果となる異なった昆虫種において同じ機能性およびより有効な昆虫制御を有する遺伝子を包含する。
j)他方、本発明のRNA構築物は異なった生物学的径路から得た多数の遺伝子を標的とし、広い細胞性RNAi効果およびより有効な昆虫制御となる。
他の実施態様では、2本鎖RNA構築物の多数dsRNA領域はリンカーなしでも結合される。
本発明の特別な実施態様では、リンカーは害虫生物のより小さなdsRNA領域を連絡切断するために使用される。有利にも、この状況ではリンカー配列は特別な環境下により小さなdsRNA領域への長いdsRNAの分割を促進して、これらの環境下に分離したdsRNA領域の放出となり、これらのより小さなdsRNA領域によるより有効な遺伝子サイレンシングにつながる。好適な従来の自己切断リンカーの例としては、高pH条件で自己切断するRNA配列である。このようなRNA配列の好適な例としては、ボーダ(Borda)ら、(Nucleic Acids Res. 2003 May 15;31(10):2595-600)に記載される。この参考資料は本明細書中に参考として導入される。この配列はハンマーヘッド型リボソームHH16の触媒作用をもつ核部に由来する。
本発明の1つの特別な実施態様では、本発明のdsRNA構築物は昆虫によるdsRNAの摂取を促進するアプタマーを備えている。アプタマーは昆虫によって摂取される物質に結合するように設計される。このような物質は昆虫または植物起源に由来する。アプタマーの1つの具体的な例としては、膜貫通タンパク、例えば昆虫の膜貫通タンパクに結合するアプタマーである。他方、アプタマーは昆虫によって摂取される(植物)代謝産物または栄養素に結合する。
他方、リンカーはエンドソーム内で自己切断性である。これは、本発明の構築物がエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスを経て昆虫によって摂取される場合、有利であり、したがって、昆虫種のエンドソームにおいて区画化される。エンドソームは低pH環境を有し、リンカーの切断となる。
疎水条件で自己切断する上記リンカーは、1つの細胞から他の細胞へ細胞壁中の移行を経て移動するために使用される場合、例えば、害虫生物の細胞壁を横断する場合、本発明のdsRNA構築物において特に有用である。
約1塩基対から約10,000塩基対にわたる非相補的RNA配列もまたリンカーとして使用される。
昆虫細胞内で標的遺伝子の下方制御を達成するために、細胞壁の外部へ添加された2本鎖RNAは、細胞中へ摂取され、次いで、siRNAに細胞内で加工され得るdsRNAまたはdsRNA構築物であり、これは次いでRNAiを仲介するか、または細胞の外部へ添加されたRNAはそれ自体、細胞中に摂取され得るsiRNAであり、それによってRNAiを実施することができる。
siRNAは一般的に19〜25塩基対、または20〜24塩基対の範囲である長さを有する短い2本鎖RNAである。好ましい実施態様では、下方制御されるべき標的遺伝子に対応して、19、20、21、22、23、24または25塩基対、および特に21または22塩基を有するsiRNAが使用される。しかしながら、本発明はこのようなsiRNAの使用に限定されることを意図していない。
siRNAは2本鎖部分に隣接して、一方または両方の端に1本鎖の突出部を含む。特に好ましい実施態様では、siRNAは3'突出ヌクレオチド、好ましくは2つの3'突出チミジン(dTdT)またはウリジン(UU)を含む。3'TTまたはUU突出部は、もしもdsRNAの2本鎖部分に含まれる配列のすぐ上流の標的遺伝子の配列がAAであるなら、siRNAに含まれる。これはsiRNAのTTまたはUU突出部が標的遺伝子にハイブリダイズすることを可能とする。3'TTまたはUU突出部もまたsiRNAの他の末端に含まれるけれども、siRNAの2本鎖部分に含まれる配列の下流の標的配列がAAを有することは必須としない。この文脈では、RNA/DNAキメラであるsiRNAもまた予期される。これらのキメラは、例えば上記のようにDNA塩基(例えば、dTdT)の3'突出部を有する2本鎖RNAを含むsiRNAを含み、そして1つまたは複数のRNA塩基またはリボヌクレオチド、または全鎖が全てリボヌクレオチドであるポリヌクレオチドの2本鎖RNAは、DNA塩基またはデオキシヌクレオチドで代替される。
より具体的な実施態様では、本発明は配列番号49〜158、275〜472、533〜575、621〜767、813〜862、908〜1040、1161〜1571、1730〜2039、2120〜2338、2384〜2460のいずれかに示される配列からなる単離された核酸配列、またはそれらのうち、少なくとも17、好ましくは少なくとも18、19、20または21、より好ましくは少なくとも22、23または24ヌクレオチドの断片に関する。
当業者は、これらの標的遺伝子の相同体が見いだされ得ること、およびこれらの相同体は本発明の方法で有用であることを認識するであろう。
この文脈では、「植物」との用語は、昆虫の成長および/または昆虫横行を阻止または減少させるために処理することが望まれるいかなる植物材料をも包含する。これは、とりわけ、植物全体、種子などの播種、増殖または再生材料、切断片、移植片、外植体など、および植物細胞および組織培養物を含む。植物材料は昆虫の1つまたは複数の標的遺伝子に対応するdsRNAを発現すべきであるか、または発現する能力を有するべきである。
この実施態様では、昆虫はいかなる昆虫でもあるが、好ましくは植物病原性昆虫である。好ましい病原性昆虫としては上記のものが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法に使用される植物、または本発明の遺伝子組換え植物はいかなる植物も包含するが、好ましくは、植物病原性昆虫による横行に感受性を有する植物である。
(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476または2481のいずれかによって示される配列、またはこれらの相補鎖と少なくとも75%同一である配列;および
(ii)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476または2481のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも17個の隣接したヌクレオチドを含む配列、
からなる群から選択される核酸配列を含むか、
または前記核酸は配列番号49〜158、275〜472、533〜575、621〜767、813〜862、908〜1040、1161〜1571、1730〜2039、2120〜2338、2384〜2460のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも17個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである。
したがって、他の実施態様では、組換えDNA構築物は、少なくとも1つの制御配列に操作可能に結合された本発明のdsRNAまたはdsRNA構築物をコードするヌクレオチド配列を含んで提供される。好ましくは、制御配列は以下に説明される構成プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む群から選択される。
核酸の発現を活性化するか、または増強するプロモーターおよび核酸または合成融合分子またはそれらの誘導体も前記用語で包含され、いわゆるアクチベーターまたはエンハンサーである。ここに使用される「操作可能に結合される」との用語は、プロモーター配列と目的の遺伝子の間の機能的結合を呼び、プロモーター配列は目的の遺伝子の転写を開始することができる。
他方、2本鎖RNAをコードする導入遺伝子は、CaMV35Sプロモーター、2本鎖CAMV35Sプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、ルビスコプロモーター、GOS2プロモーター、ゴマノハグサ(Figwort)モザイクウイルス(FMV)34Sプロモーター、キャッサバ葉脈モザイクウイルス(CsVMV)プロモーター(Verdauger B. ら、Plant Mol Biol. 1998 37(6):1055-67)を含む群から選択されるいずれかのようなものなど、強い構成プロモーターの制御下に配置される。
他の実施態様では、2本鎖RNAをコードする導入遺伝子は、例えば、ジャガイモプロティナーゼ阻害剤II(PintII)プロモーター(Duan Xら、Nat. Biotechnol. 1996. 14(4):49408));または創傷誘導プロモーター、例えばジャスモン酸およびエチレン誘導プロモーター、PDF1.2プロモーター(Manners JMら、Plant Mol. Biol. 1998, 38(6): 1071-80) ;または防御関連プロモーター、例えば、サリチル酸誘導プロモーターおよび植物病原性関連タンパク(PRタンパク)プロモーター(PR1プロモーター(Cornelissen BJら、Nucleic Acids Res. 1987, 15(17): 6799-811);COMTプロモーター (Toquin Vら、Plant Mol. Biol. 2003, 52(3): 495-509) の、昆虫誘導プロモーターの制御下に配置される。
したがって、本発明はまた本発明の2本鎖RNAまたはRNA構築物のいずれかを生成する方法を包含する。この方法は、dsRNAまたはRNA構築物を生産するための前記核酸または組換えDNA構築物の転写を可能とする条件下で、
a.本発明の単離された核酸または組換えDNA構築物を無細胞成分に接触させ、また
b.本発明の単離された核酸または組換えDNA構築物を細胞中に導入(例えば、形質転換、形質移入または注入により)する工程を含む。
したがって、本発明はここに記載される少なくとも1つの2本鎖RNAまたは少なくとも1つの2本鎖RNA構築物;またはここに記載される少なくとも1つのヌクレオチド配列または少なくとも1つの組換えDNA構築物;またはここに記載される少なくとも1つの植物細胞を含む、植物(例えば、稲植物)、または種子(例えば、稲種子)、または細胞(例えば、細菌または植物細胞)を包含する。本発明はまた、ここに記載される少なくとも1つの2本鎖RNAまたは少なくとも1つの2本鎖RNA構築物、またはここに記載される少なくとも1つのヌクレオチド配列または少なくとも1つの組換えDNA構築物を含む植物(例えば、アルファルファ(alfalfa)、リンゴ(apple)、アプリコット(apricot)、朝鮮アザミ(artichoke)、アスパラガス(asparagus)、アボガド(avocado)、バナナ(banana)、オオムギ(barley)、マメ(beans)、ビート(beet)、ブラックベリー(blackberry)、ブルーベリー(blueberry)、ブロッコリ(broccoli)、芽キャベツ(brussel sprouts)、キャベツ(cabbage)、アブラナ(canola)、ニンジン(carrot)、キャッサバ(cassava)、カリフラワー(cauliflower)、穀物(a cereal)、セロリ(celery)、桜(cherry)、柑橘類(citrus)、クレメンタイン(clemintine)、コーヒー(coffee)、コーン(corn)、ワタ(cotton)、キュウリ(cucumber)、ナス(eggplant)、チコリ(endive)、ユーカリ(eucalyptus)、イチジク(figes)、ブドウ(grape)、グレープフルーツ(grapefruit)、落花生(groundnuts)、センナリホウズキ(ground cherry)、キウイフルーツ(kiwifruit)、レタス(lettuce)、ニラ(leek)、レモン(lemon)、ライム(lime)、パイン(pine)、トウモロコシ(maize)、マンゴー(mango)、メロン(melon)、キビ(millet)、マッシュルーム(mushroom)、ナット・オート(nut aot)、オクラ(okra)、タマネギ(onion)、オレンジ(orange)、観賞用植物または花または樹木(an ornamental plant or flower or tree)、パパイア(papaya)、パセリ(parsley)、エンドウマメ(pea)、モモ(peach)、ピーナッツ(peanut)、ピート(peat)、コショウ(pepper)、カキ(persimmon)、パイナップル(pineapple)、オオバコ(plantain)、プラム(plum)、ザクロ(pomegranate)、ジャガイモ(potato)、カボチャ(pumpkin)、ラディッキオ(radicchio)、ダイコン(radish)、ナタネ(rapeseed)、ラズベリー(raspberry)、コメ(rice)、ライ麦(rye)、サトウモロコシ(sorghum)、ダイズ(soy)、ダイズ(soy beans)、ホウレンソウ(spinach)、イチゴ(strawberry)、テンサイ(sugarbeet)、サトウキビ(sugargcane)、ヒマワリ(sunflower)、サツマイモ(sweet poatao)、タンジェリン(tangerine)、茶(tea)、タバコ(tobacco)、トマト(tomato)、ツルクサ(a vine)、スイカ(waetermelon)、コムギ(wheat)、トロロイモ(yams)およびズッキーニ(zucchini);好ましくはジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、センナリホウズキ、コメ、コーンまたはワタ植物)、
または種子または塊茎(例えば、アルファルファ(alfalfa)、リンゴ(apple)、アプリコット(apricot)、朝鮮アザミ(artichoke)、アスパラガス(asparagus)、アボガド(avocado)、バナナ(banana)、オオムギ(barley)、マメ(beans)、ビート(beet)、ブラックベリー(blackberry)、ブルーベリー(blueberry)、ブロッコリ(broccoli)、芽キャベツ(brussel sprouts)、キャベツ(cabbage)、アブラナ(canola)、ニンジン(carrot)、キャッサバ(cassava)、カリフラワー(cauliflower)、穀物(a cereal)、セロリ(celery)、桜(cherry)、柑橘類(citrus)、クレメンタイン(clemintine)、コーヒー(coffee)、コーン(corn)、ワタ(cotton)、キュウリ(cucumber)、ナス(eggplant)、チコリ(endive)、ユーカリ(eucalyptus)、イチジク(figes)、ブドウ(grape)、グレープフルーツ(grapefruit)、落花生(groundnuts)、センナリホウズキ(ground cherry)、キウイフルーツ(kiwifruit)、レタス(lettuce)、ニラ(leek)、レモン(lemon)、ライム(lime)、パイン(pine)、トウモロコシ(maize)、マンゴー(mango)、メロン(melon)、キビ(millet)、マッシュルーム(mushroom)、ナット・オート(nut aot)、オクラ(okra)、タマネギ(onion)、オレンジ(orange)、観賞用植物または花または樹木(an ornamental plant or flower or tree)、パパイア(papaya)、パセリ(parsley)、エンドウマメ(pea)、モモ(peach)、ピーナッツ(peanut)、ピート(peat)、コショウ(pepper)、カキ(persimmon)、パイナップル(pineapple)、オオバコ(plantain)、プラム(plum)、ザクロ(pomegranate)、ジャガイモ(potato)、カボチャ(pumpkin)、ラディッキオ(radicchio)、ダイコン(radish)、ナタネ(rapeseed)、ラズベリー(raspberry)、コメ(rice)、ライ麦(rye)、サトウモロコシ(sorghum)、ダイズ(soy)、ダイズ(soy beans)、ホウレンソウ(spinach)、イチゴ(strawberry)、テンサイ(sugarbeet)、サトウキビ(sugargcane)、ヒマワリ(sunflower)、サツマイモ(sweet poatao)、タンジェリン(tangerine)、茶(tea)、タバコ(tobacco)、トマト(tomato)、ツルクサ(a vine)、スイカ(waetermelon)、コムギ(wheat)、トロロイモ(yams)およびズッキーニ(zucchini);好ましくはジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、センナリホウズキ、コメ、コーンまたはワタ種子または塊茎)、または細胞(例えば、細菌または植物細胞)を包含する。好ましくは、これらの植物または種子または細胞は組換え構築物であり、本発明のdsRNAまたはdsRNA構築物をコードするヌクレオチド配列は上記のように少なくとも1つの制御要素に操作可能に結合されている。
1つの特定の実施態様では、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240〜247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、508〜513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066〜1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、2481または2486に開示される配列、もしくは少なくとも14、15、16、17、18、19、20、21、22などを含むヌクレオチドの全てまで、または異なった標的種からのオルソログ核酸分子の配列のヌクレオチドの全てまで、少なくとも14、15、16、17、18、19、20、21、22などのヌクレオチドを含む核酸分子に操作可能に結合される少なくとも1つの制御配列を含む植物または植物細胞でRNA分子の発現のための組換え(発現)構築物が提供される。多くのベクターはこの目的で入手可能であり、適当なベクターの選択は主にベクター中に挿入される核酸の大きさおよびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。
他方、dsRNAは植物細胞および植物によって植物の外部へ分泌される。それ自体では、dsRNAは植物表面上に保護層を形成する。
したがって、本発明はまた前記RNA分子を発現する前記植物細胞または植物は、パタチン、バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)、殺虫性タンパク、クセノラブズス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブズス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリクス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択される殺虫性製剤を含むか、または発現する、ここに記載される方法または植物細胞および植物に関する。好ましくは、前記バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパクはCry1、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二成分殺虫性タンパクCryET33およびCryET34、二成分殺虫性タンパクCryEt80およびCryEt76、二成分殺虫性タンパクTIC100およびTIC101、および二成分性殺虫性タンパクPS149B1からなる群から選択される。
あるいは、前記昆虫標的遺伝子は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160〜163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240〜247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、508〜513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066〜1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、2481または2486のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも17個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである。
なおも別な実施態様では、本発明はここに記載されるヌクレオチド配列または組換えDNA構築物のいずれかを植物に発現可能な形態で導入することを含む、植物の収穫を増加させる方法にまで及ぶ。
本発明はさらに以下の非限定的な例を参考にして理解されるであろう。
C.エレガンスのゲノムワイドライブラリーを、2つの同一のT7プロモーターとターミネーターーとの間で、pGN9Aベクター(WO01/88121)において調製した。それは、IPTGにより誘導されたT7ポリメラーゼの発現時に、センスおよびアンチセンス方向でのその発現を駆動する。
−pGN29=陰性コントロール、野生型
−pGZ1=unc−22=トゥイッチャー(twitcher)表現型
−pGZ18=キチン合成酵素=胚致死
−pGZ25=pos−1=胚致死
−pGZ59 =bli−4D=急性致死
−ACC=アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ=急性致死
C.エレガンスdsRNAを与えた線虫の表現型を、空ベクターを与えたC.エレガンスnuc−1(e1392)線虫の表現型と比較した。
実施例1にて上述したとおり、多数のC.エレガンス致死性配列が同定され、他の種および属においてオルソログを同定するために用いられ得る。例えば、C.エレガンスの致死性配列は、オルソログD.メラノガスター配列を同定するために用いられ得る。つまり、各々のC.エレガンス配列は、D.メラノガスターにおけるオルソログ配列について、GenBankのような公的データベースに対して探し出され得る。高い配列相同性を有する(E値は好ましくは、1E−30より小さいか等しい)潜在的なD.メラノガスターオルソログが選択され、配列はblast reciprocal best hitsであり、後者は異なる生物由来の配列(例えばC.エレガンスとD.メラノガスター)がお互いのトップブラストヒットであることを意味する。例えば、C.エレガンス由来の配列Cが、BLASTを用いてD.メラノガスターにおける配列と比較される。もし、配列CがD.メラノガスターの配列Dをベストヒットとして持ち、そして、DがC.エレガンスの全ての配列と比較されると、結局のところ配列Cに到達し、そしてDとCがreciprocal best hitsとなる。この基準はしばしばオルソロジーを定義するの使われ、異なる種の同様の配列を意味し、同様の機能を有するものである。D.メラノガスター配列のアイデンティファーは、表1Aに提示されている。
A.レプチノタルサ・デセムリネアータの部分遺伝子配列のクローニング
高品質の無傷RNAを、TRIzol試薬(Cat.No.15596−026/15596−018,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を用いて、製造者の指示に従って、レプチノタルサ・デセムリネアータ(コロラドハムシ;入手元:Jeroen van Schaik,Entocare CVBiologische Gewasbescherming,Postbus 162,6700 AD Wageningen,the Netherlands)の4つの異なる幼虫段階から単離した。RNA調製物に存在するゲノムDNAは、製造者の指示(Cat.No.1700,Promega)に従ってDNase処理により除去した。cDNAは市販のキット(Superscript(商標)3 Reverse Transcriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を用いて、製造者の指示に従って生成した。
市販のT7 Ribomax(商標)Express RNAi Systemキット(Cat.No.P1700,Promega)を用いて、ミリグラム量でdsRNAを合成した。まず、2つの別個の単一5'T7RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を、2つの別個のPCRで生成し、各反応物はT7プロモーターに対して異なる向きで標的配列を含む。
RNA干渉の機構はdsRNAフラグメントを介して操作するので、上記のとおり選択された標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列を、アンチセンスおよびセンス方向で、イントロン−CmR−イントロンによって分けてクローン化された。CmRはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであり、dsRNAヘアピン構造を形成する。これらのヘアピン構造は、attL含有エントリークローン(実施例1参照)およびattR含有デスティネーションベクター(=pK7GWIWG2D(2))との間のLR組み換え反応を用いて生成した。植物ベクターpK7GWIWG2D(2)は、Material Transfer AgreementによるVIB/Plant Systems Biologyから得た。LR組み換え反応は、LR Clonase(商標)2 enzyme mix(Cat.No.11791−020,Invitrogen)を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、LD002、LD006、LD007、LD010、LD011、LD014およびLD016遺伝子の各々のヘアピン構造を生じ、それらはプロモーター−センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス方向あるいは、プロモーター−アンチセンス−イントロン−CmR−イントロン−センス方向のいずれかを有し、プロモーターは、植物作動可能な35Sプロモーターである。35Sプロモーターを有するバイナリーベクターpK7GWIWG2D(2)がA.ツメガシエンス(A.tumefaciens.)への形質転換に好適である。
−LD002(アンチセンス−イントロン−CmR−イントロン−センス)が配列番号240の前に配置されている;
−LD006(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)が配列番号241の前に配置されている;
−LD007(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)が配列番号242の前に配置されている;
−LD010(アンチセンス−イントロン−CmR−イントロン−センス)が配列番号243の前に配置されている;
−LD011(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)が配列番号244の前に配置されている;
−LD014(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)が配列番号245の前に配置されている;
−LD016(アンチセンス−イントロン−CmR−イントロン−センス)が配列番号246の前に配置されている;
−LD027(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)が配列番号2486の前に配置されている。
表9−LDは、各ヘアピン構造の完全配列を示す。
コロラドハムシ用の人工食餌を以下のように作製した(Gelman et al.,2001,J.Ins.Sc,vol.1,no.7,1−10から採用):水と寒天をオートクレーブし、残りの成分(下記表Aに示す)を、温度が55℃まで下がったら添加した。この温度で、食餌を1ウェルごとの食餌1mlの量で24穴プレート(Nunc)に食餌を等分する前に、成分をよく混合した。人工食餌を、室温に冷ますことによって凝固させた。食餌は、3週間まで4℃で保存した。
成分 1Lに対する容量
水 768ml
寒天 14g
ひいたコムギ 40g
トルラ酵母 60g
ラクトアルブミンハイドロライセート 30g
カゼイン 10g
フルクトース 20g
Wesson塩混合物 4g
トマト果実粉末 12.5g
ジャガイモ葉粉末 25g
b−シトステロール 1g
ソルビン酸 0.8g
メチルパラベン 0.8g
Vanderzantビタミン混合物 12g
ネオマイシン硫酸物 0.2g
オーロマイシン 0.130g
リファムピシン 0.130g
クロラムフェニコール 0.130g
ニスタチン 0.050g
ダイズ油 2ml
コムギ胚芽油 2ml
選択的なバイオアッセイ法を、CPBの食糧源として人工食餌ではなくジャガイモ葉材料を用いて行った。直径約1.1cmの円盤状組織(または0.95cm2)を2〜3週齢のジャガイモ植物の葉から、好適な大きさの穿孔器を用いて、切り取った。処理された葉の円盤状組織を、10ng/μl溶液の標的LD002 dsRNAまたはgfpコントロール dsRNA 20μlを、向軸葉表面に添加することにより調製した。葉の円盤状組織を乾燥させ、個別に24穴マルチプレート(Nunc)の24ウェルに置いた。単一の第2幼虫段階CPBを、各ウェルに置き、その後ティッシュペーパとマルチウェルプラスチック蓋により覆った。昆虫と葉の円盤状組織を含むプレートを、28℃、16:8時間の明暗光周期の昆虫室に保持した。昆虫を2日間、葉円盤状組織上で飼育し、その後昆虫を新鮮な処理した葉の円盤状組織を含む新しいプレートに移動させた。その後、昆虫を7日まで毎日、未処理の葉の円盤状組織を含むプレートに移動させた。昆虫の致死率と重量スコアを記録した。
この実施例は、より短い(60または100pb)dsRNAフラグメントのそれ自体またはコンカテマー構築体が、コロラドハムシに対する毒性を引き起こすのに十分であることの発見を例示する。
100塩基対フラグメント、LD014_F1、配列番号15の位置195−294(配列番号159)と、60塩基対フラグメント、LD014_F2、配列番号15の位置235−294(配列番号160)をさらに選択した。表7−LDも参照されたい。
標的LD014とコンカテマーの短い配列は、図4−LDに示すとおり、レプチノタルサ・デセムリネアータで致死を誘導することが可能であった。
1μg/μlから0.01ng/μlへの連続した10倍希釈濃度(0.1μg/μlからの標的LD027のために)のdsRNA溶液50μlを、24穴プレート(Nunc)のウェル上の固体の人工食餌へ局所的に添加した。食餌を層流室で乾燥させた。処理ごとに、24のコロラドハムシ幼虫(第2段階)を、ウェル毎に2昆虫で試験した。プレートを、25±2℃、60%相対湿度、16:8時間の明暗光周期での昆虫飼育室に保存した。昆虫を14日まで、一定の間隔で生もしくは死を評価した。7日後、食餌を同じ濃度でdsRNAの局所添加された新鮮な食餌と交換した。dsRNA標的を、食餌のみと比較した。
デセムリネアータ幼虫に対して異なる標的のインタクトな裸のdsRNAsを含む人工食餌を与えることは、図5−LDに示すように、0.1〜10ngのdsRNA/μlと同程度の低い濃度で、高い幼虫の致死率をもたらした。
下記の例は、成虫(および幼虫の段階の昆虫のみならず)は、標的遺伝子に対応するdsRNAの経口摂取に極端に敏感であるとの発見を強調する。
以下に提供された実施例は、CPB遺伝子特異的ヘアピンRNAを発現する遺伝子組み換えジャガイモ植物がコロラドハムシに悪影響を及ぼすことを見出した例示である。
安定的に形質転換したジャガイモ植物が、NSF Potato Genome Project(http://www.potatogenome.org/nsf5).におけるJulie Gilbertを介して受け取られた適合したプトロコルを用いて得られた。感受性の2倍体Solanumtuberosum6487−9から由来するジャガイモ“LineV”(Laboratory of Plant Breeding at PRI Wageningen,the Netherlandsから得た)の茎節間の外植片が、形質転換のための開始材料として用いられた。
遺伝子組み換えジャガイモ植物を、以下の条件で植物生育室の8〜12の折りたたまれていない葉の段階まで生育させた:23±2℃,60%相対湿度,16:8時間の明暗光周期。植物を、鉢の土中にしっかりと置いた瓶の首で、植物を覆うようにさかさまに500ml瓶を置くことにより閉じ込め、底を切断して開けて、吸気をさせるために細かいナイロンメッシュにより覆い、中の結露を減少させて、幼虫が逃げるのを防いだ。
A.ファミリーPCRを介したファエドン・コクレアリアエ(マスタード・リーフ・ビートル)PC001,PC003,PC005,PC010,PC014,PC016およびPC027遺伝子の部分配列のクローニング
高品質、インタクトなRNAを、ファエドン・コクレアリアエの第3段階の幼虫(マスタード・リーフ・ビートル;source:Dr.Caroline Muller,Julius−von−Sachs−lnstitute for Biosciences,Chemical Ecology Group,University of Wuerzburg,Julius−von−Sachs−Platz 3,D−97082 Wuerzburg,Germany)からTRIzol Reagent(Cat.No.15596−026/15596−018,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を用いて、製造者の指示に従って、単離した。RNA調製物に存在するゲノムDNAは、DNase(Cat.No.1700,Promega)処理により製造者の指示に従って除去した。cDNAを、市販のキット(Superscript(商標)3 ReverseTranscriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を用いて、製造者の指示に従って生成した。
dsRNAを、市販のキットT7 Ribomax(商標); Express RNAi System (Cat.No.P1700,Promega).を用いてミリグラム量で合成した。まず、二つの別個のシングル5'T7 RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を、二つの別個のPCR反応で生成し、各反応物はT7プロモーターに対して異なる向きで標的配列を含む。
RNA干渉の機構が、dsRNAフラグメントを介して操作するので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記で選択されたように、アンチセンスとセンスの向きでクローン化され、intron−CmR−intronにより分けられ、それによりCmRはクロラムフェニコール耐性マーカーとなり、drRNAヘアピン構築物を形成する。
これらのヘアピン構築物を、attLを含む−エントリークローン(実施例4A参照)およびattRを含む−目的ベクター(=pK7GWIWG2D(2))との間でLR組み換え反応を用いて生成した。植物ベクターpK7GWIWG2D(2)を、Material Transfer Agreementを用いてVIB/Plant Systems Biologyから得た。LR組み換え反応を、LR Clonase(商標) 2 enzyme mix(Cat.No.11791−020,Invitrogen)を用いて製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、PC001,PC010,PC014,PC016およびPC027遺伝子の各々に対して、プロモーター−sense−intron−CmR−intron−アンチセンスの向きを有するヘアピン構築物を生じ、プロモーターは、植物操作可能な35Sプロモーターである。35Sプロモーターを有するバイナリーベクターpK7GWIWG2D(2)は、A.tumefaciensへの形質転換に好適である。
−PC001(sense−intron−CmR−intron−antisense)は、配列番号508に示されている。
−PC010(sense−intron−CmR−intron−antisense)は、配列番号509に示されている。
−PC014(sense−intron−CmR−intron−antisense)は、配列番号510に示されている。
−PC016(sense−intron−CmR−intron−antisense)は、配列番号511に示されている。
−PC027(sense−intron−CmR−intron−antisense)は、配列番号512に示されている。
表9PCは、それぞれのヘアピン構築物についての配列を提供する。
下記に提供される実施例は、マスタード・リーフ・ビートル(MLB)幼虫が、自身の標的遺伝子に対する経口摂取したdsRNAに対して感受性があることを見出した例である。
その後、バイオアッセイ開始後4日に、各レプリケートからの昆虫を回収し、未処理の新鮮なアブラナ葉を含むペトリ皿に移動させた。幼虫の致死率および平均重量を、2,4,7,9,11日に記録した。
標的PC010またはPC027からのdsRNAの25μlの溶液を、0.1μg/μlから0.1ng/μlまで連続して10倍希釈したものを、上述の実施例4Dに記載のように、アブラナ葉の円盤状組織に局所的に添加した。陰性コントロールとしては、0.05%TritonX−100のみを、葉円盤状組織に添加した。処理ごとに、24マスタード・リーフ・ビートル新生幼虫を、1ウェル毎に2匹の昆虫を用いて、試験した。プレートを25±2℃,60±5%相対湿度、16:8時間明暗光周期の昆虫生育室に保持した。2日目に、幼虫を新鮮なdsRNAで処理した葉円盤状組織を含む新しいプレートに移動させた。標的PC010については4日目に、標的PC027については5日目に、各レプリケートから昆虫を、豊富な未処理葉材料を含むペトリディッシュに移動させた。幼虫は、生死について、標的PC010については2,4,7,8,9,11日目に評価し、PC027については2,5,8,9,12日目に評価した。
アラビドプシス・サリアーナ植物を、floral dip method(Clough and Bent(1998)Plant Journal16:735−743)を用いて形質転換した。植物の気生部分を、5%sucroseを含む溶液中で数秒間インキュベートし、一晩培養したAgrobacterium tumefaciens strain C58C1 Rif細胞と、0.03%の界面活性剤Silwet L−77に再懸濁した。接種後、植物を、湿度を保つために、透明なプラスチックで16時間覆った。形質転換効率を上昇させるために、この手順を、1週間後に繰り返した。水やりを、種が成熟したら停止し、乾燥した種を回収し、2日間冷処理した。滅菌後、種子を形質転換植物の選択のために、カナマイシン含有生育培地に播いた。
選択した植物を、最適なT2種子生産のために土壌に移した。
形質転換アラビドプシス・サリアーナ植物を、分離T2種子を、適切な選択培地に発芽させることにより選択した。これら遺伝子組み換え植物の根が、うまく定着したら、その後、それらを新鮮な人工生育培地もしくは土壌に移し、最適な条件で生育させた。遺伝子組み換え植物全体を、モモアカアブラムシ(M.ペルシカエ)の幼虫に対して試験すると、(1)食べる幼虫によって植物損害に対する有意な抵抗性、(2)幼虫の致死率の増大、および/または(3)生存する幼虫の重量の減少(または他の異常な昆虫の発生)を示した。
A.エピラクナ・バリヴェティス部分遺伝子配列のクローニング
高品質、インタクトなRNAを、エピラクナ・バリヴェティス(インゲンテントウ;source:Thomas Dorsey,Supervising Entomologist,New Jersey Department of Agriculture,Division of Plant Industry,Bureau of Biological Pest Control,Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory, PO Box 330,Trenton,New Jersey08625−0330,USA)の4つの異なる幼虫段階から、TRIzol Reagent(Cat.No.15596−026/15596−018,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を用いて、製造者の指示に従って単離した。RNA調製物中に存在するゲノムDNAを、製造者の指示に従って(Cat.No.1700,Promega).、DNasa処理により除去した。cDNAを、市販のキット(Superscript(商標) 3 ReverseTranscriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を用いて、製造者の指示に従って、生成した。
dsRNAを、市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(Cat.No.P1700,Promega).を用いてミリグラム量で合成した。最初の二つの別個のシングル5'T7RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を、二つの別個のPCR反応において生成し、それぞれの反応物は、標的配列をT7プロモーターに対して異なる向きで含む。
RNA干渉の機構が、dsRNAフラグメントを介して操作するので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記で選択されたように、アンチセンスとセンスの向きでクローン化され、intron−CmR−intronにより分けられ、それによりCmRはクロラムフェニコール耐性マーカーとなり、drRNAヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、attLを含む−エントリークローン(実施例5A参照)およびattRを含む−目的ベクター(=pK7GWIWG2D(2))との間でLR組み換え反応を用いて生成した。植物ベクターpK7GWIWG2D(2)を、Material Transfer Agreementを用いてVIB/Plant Systems Biologyから得た。LR組み換え反応を、LR Clonase(商標)2 enzyme mix(Cat.No.11791−020,Invitrogen)を用いて製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、標的遺伝子の各々に対して、プロモーター−sense−intron−CmR−intron−アンチセンスの向きを有するヘアピン構築物を生じ、プロモーターは、植物操作可能な35Sプロモーターである。35Sプロモーターを有するバイナリーベクターpK7GWIWG2D(2)は、A.tumefaciensへの形質転換に好適である。
下記に提供される実施例は、インゲンテントウ(MBB)幼虫が、自身の標的遺伝子に対する経口摂取したdsRNAに対して感受性があることを見出した例である。
その後、バイオアッセイ開始後4日に、昆虫を10日目まで、毎日未処理の新鮮なマメ葉を含むペトリ皿に移動させた。未処理の新鮮なアブラナの葉を含むペトリ皿に移動させた。昆虫の致死率を、2日目と、その後一日おきに記録した。
下記に提供される実施例は、Mexican bean beetle(MBB)成虫が、自身の標的遺伝子に対する経口摂取したdsRNAに対して感受性があることを見出した例である。
A.アントノムス・グランディス部分配列のクローニング
TRIzolReagent (Cat.No.15596−026/15596−018, Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示にどおりに使用し、3齢幼虫のアントノムス・グランディス(ワタミハナゾウムシ;供給源:Dr.Gary Benzon,Benzon Research Inc.,7 Kuhn Drive,Carlisle,Pennsylvania 17013,USA)から、高品質で、インタクトなRNAを単離した。製造者の指示に従ったDNase処理(Cat.No.1700,Promega)により、RNA調製物中に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(Superscript(商標)3 Reverse Transcriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従い使用し、cDNAを生成した。
dsRNAを、市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(Cat.No.P1700,Promega)を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に2つの単一5'T7RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な2つのPCR反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はT7プロモーターに対して別な向きで含んでいる。
RNA干渉のメカニズムがdsRNAフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−CmR−イントロンによって分離されており、CmRはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、dsRNAヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、エントリークローン(実施例6A参照)を含むattLと、目的ベクター(=pK7GWIWG2D(2))含有attRとの間でLR組換え反応を用いて作製した。植物ベクターpK7GWIWG2D(2)は、VIB/Plant Systems Biology with a Material Transfer Agreementから取得した。LR組換え反応を、LR Clonase(商標)2 enzyme mix(Cat.No.11791−020, Invitrogen)を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、それぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な(operable)35Sプロモーターである。35Sプロモーターを用いたバイナリーベクターpK7GWIWG2D(2)は、アグロバクテリウム(A.tumefaciens)への形質転換に好適である。
植物ベースのバイオアッセイ
植物にCBWを与える前に、化学的に誘導したdsRNAを発現する細菌を懸濁液により植物全体に噴射した。それらを、植物生育室で生育させた。鉢の土中にしっかりと置いた瓶の首で植物を覆うように、さかさまに500mlプラスチック瓶を置くことにより、閉じ込め、底を切断して開けて、吸気できるように細かいナイロンメッシュで覆い、内側の結露を減少させて、昆虫が逃げるのを防いだ。CBWを、かごの中のそれぞれ処理した植物においた。植物を、pGXXX0XXプラスミドまたはpGN29プラスミドを持つ大腸菌AB301−105(DE3)の懸濁液により処理した。異なる量の細菌が、植物に適用されている:例えば、66、22および7ユニット、ここで1ユニットは、600nm波長での光学密度値で、細菌の懸濁液の1ml中に109細菌細胞として定義する。それぞれの場合に、噴霧器の補助により、植物に1〜10mlの全量が噴霧される。1つの植物はこの試験の各処理に使用された。生存数を計数し、各生存虫の重量を記録した。
A.トリボリウム・カスタニュウム部分配列のクローニング
TRIzol Reagent(Cat.No.15596−026/15596−018,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示にどおりに使用し、異なる全ての昆虫ステージのトリボリウム・カスタニュウム(コクヌストモドキ;供給源:Dr.Lara Senior,Insect Investigations Ltd.,Capital Business Park,Wentloog,Cardiff,CF3 2PX,Wales,UK)から、高品質で、インタクトなRNAを単離した。製造者の指示に従ったDNase処理(Cat.No.1700,Promega)により、RNA調製物中に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(Superscript(商標)3 Reverse Transcriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従い使用し、cDNAを生成した。
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表2−TCに示す。これらのプライマーは、それぞれのPCR反応において、以下の条件により用いられた:95℃で10分、続いて95℃で30秒、50℃で1分、そして72℃で1分30秒を40サイクル、続いて72℃で7分;AG010に関しては、95℃で10分、続いて95℃で30秒、54℃で1分、そして72℃で2分30秒を40サイクル、続いて72℃で7分(TC001、TC014、TC015);95℃で10分、続いて95℃で30秒、54℃で1分、そして72℃で30秒を40サイクル、続いて72℃で7分を行った(TC010);95℃で10分、続いて95℃で30秒、53℃で1分、そして72℃で1分を40サイクル、続いて72℃で7分を行った(TC002)。得られたPCRフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し(QIAquick Gel Extraction kit,Cat.No.28706,Qiagen)、pCR8/GW/TOPOベクター(Cat.No.K2500−20,Invitrogen)にクローニングし、配列を決定した。得られたPCR産物の配列を、それぞれ配列番号により表2−TCに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表3−TCに表す。
dsRNAを、市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(Cat.No.P1700,Promega)を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に2つの単一5'T7RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な2つのPCR反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をT7プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
RNA干渉のメカニズムがdsRNAフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−CmR−イントロンによって分離されており、CmRはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、dsRNAヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、attLを含む−エントリークローン(実施例7A参照)と、attRを含む−目的ベクター(=pK7GWIWG2D(2))との間でLR組換え反応を用いて作製した。植物ベクターpK7GWIWG2D(2)は、VIB/Plant Systems Biology with a Material Transfer Agreementから取得した。LR組換え反応を、LR Clonase(商標)2 enzyme mix(Cat.No.11791−020,Invitrogen)を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、それぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な(operable)35Sプロモーターである。35Sプロモーターを用いたバイナリーベクターpK7GWIWG2D(2)は、アグロバクテリウム(A.tumefaciens)への形質転換に好適である。
以下に与える実施例は、コクヌストモドキ(redflour beetle(RFB))幼虫が、自身の標的遺伝子に対応するdsRNAの経口摂取に感受性があることを見いだした例示である。
標的TC014dsRNAにより処理された人工食餌による長期のトリボリウム・カスタニュウムの幼虫の生存は、図1−TCに示すように、コントロールのみを与えたのに比較すると、有意に減少した。
A.ミズス・ペルシカエ部分配列のクローニング
TRIzol Reagent (Cat.No.15596−026/15596−018,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従って使用し、ミズス・ペルシカエ(モモアカアブラムシ); 供給源:Dr.Rachel Down,Insect & Pathogen Interactions, Central ScienceLaboratory, Sand Hutton,York,YO41 1 LZ,UK)の若虫から、高品質で、インタクトなRNAを単離した。製造者の指示に従って、DNase処理(Cat.No.1700,Promega)により、RNA調製物中に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(Superscript(商標)3 Reverse Transcriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従い使用し、cDNAを生成した。
dsRNAを、市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(Cat.No.P1700,Promega)を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に2つの単一5'T7RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な2つのPCR反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をT7プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
RNA干渉のメカニズムがdsRNAフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−CmR−イントロンによって分離されており、CmRはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、dsRNAヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、attLを含む−エントリークローン(実施例6A参照)と、attRを含む−目的ベクター(=pK7GWIWG2D(2))との間でLR組換え反応を用いて作製した。植物ベクターpK7GWIWG2D(2)は、VIB/Plant Systems Biology with a Material Transfer Agreementから取得した。LR組換え反応を、LR Clonase(商標)2 enzyme mix(Cat.No.11791−020, Invitrogen)を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、MP001,MP002、MP010、MP016およびMP026のそれぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な(operable)35Sプロモーターである。35Sプロモーターを用いたバイナリーベクターpK7GWIWG2D(2)は、アグロバクテリウム(A.tumefaciens)への形質転換に好適である。
ヘアピン構造の完全配列:
− MP001(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)配列番号1066に示されている;
− MP002(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)配列番号1067に示されている;
− MP010(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)配列番号1068に示されている;
− MP016(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)配列番号1069に示されている;
− MP027(センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンス)配列番号1070に示されている.
表9−MPは、それぞれのヘアピン構築物の完全な配列を提供する。
モモアカアブラムシ(ミズス・ペルシカエ)に対する液体人工食餌は、Febvay et al. (1988)[Influence of the amino acid balance on the improvement of an artificial diet fora biotype of Acyrthosiphon pisum(Homoptera:Aphididae).Can.J.Zool.66:2449−2453]に記載のソラマメヒゲナガアブラムシ(アシルソシフォン ピスム(Acyrthosiphon pisum))に適した食餌に多少の変更を加えて作製した。食餌のアミノ酸成分を、以下の通り調製した:アラニン178.71、ベータアラニン6.22、アルギニン244.9、アスパラギン298.55、アスパラギン酸 88.25、システイン29.59、グルタミン酸149.36、グルタミン445.61、グリシン166.56、ヒスチジン136.02、イソロイシン164.75、ロイシン231.56、塩酸リジン351.09、メチオニン72.35、オルニチン(HCl)9.41、フェニルアラニン293、プロリン129.33、セリン124.28、スレオニン127.16、トリプトファン42.75、チロシン38.63、L−バリン190.85(mg/100ml)。チロシンは、アミノ酸混合物に添加する前に1M HClを2,3滴落とした後に溶解し、チロシン以外のアミノ酸は、30mlのMilli−Q H2Oに溶解した。食餌中のビタミン混合物の成分を、以下の通り5×濃縮ストックとして調製した:アミノ安息香酸100、アスコルビン酸1000、ビオチン1、パントテン酸カルシウム50、塩化コリン500、葉酸10、ミオイノシトール420、ニコチン酸100、塩酸ピリドキシン25、リボフラビン5、チアミン塩酸塩25(mg/L)。リボフラビンは、50℃で1mlのH2O中に溶解した後、ビタミン混合物ストックに添加した。ビタミン混合物を、一定分量20mlに分注し、−20℃で貯蔵した。ビタミン混合物の一定分量1つを、アミノ酸溶液に添加した。スクロースとMgSO4・7H2Oを、それぞれ20gおよび242mgの量で混合物に添加した。微量金属ストック溶液を以下の通り作製した:CuSO4・5H2O 4.7、FeCl3・6H2O 44.5、MnCl2・4H2O 6.5、NaCl 25.4、ZnCl2 8.3(mg/100ml)。微量金属溶液10mlと、KH2PO4 250mgを、食餌に添加し、Milli−Q水を加え、最終液体食餌容量が100mlになるようにした。食餌のpHを、1M KOH溶液で7に調整した。溶液試料を、0.22μmのfilter disc(Millipore)を通してろ過滅菌した。
遺伝子組み換え植物の作製
アラビドプシス・サリアーナ植物に対して、floral dip method (Clough and Bent(1998)Plant Journal 16:735−743)を用いて形質転換を行った。植物の空中部分を、5%ショ糖、一晩培養物からのアグロバクテリウム(A.tumefaciens)C58C1 Rif株の細胞の再懸濁液、0.03%の界面活性剤Silwet L−77を含む溶液で、数秒間インキュベートした。接種後、湿度を保つために、植物を透明なプラスチックで16時間覆った。形質転換効率を上昇させるために、この手順を1週間後に繰り返した。水やりを、種が成熟したら停止し、乾燥した種を回収し、2日間冷処理した。滅菌後、種子を形質転換植物の選択のために、カナマイシン含有生育培地に播いた。
選択した植物を、最適なT2種子生産のために土壌に移した。
形質転換アラビドプシス・サリアーナ植物を、分離T2種子を適切な選択培地に発芽させることにより、選択した。これら遺伝子組み換え物の根が、うまく定着したら、その後、それらを新鮮な人工生育培地もしくは土壌に移し、最適な条件で生育させた。遺伝子組み換え植物全体を、モモアカアブラムシ(ミズス・ペルシカエ)の若虫に対して試験すると、(1)食べる若虫による植物損害に対する有意な抵抗性、(2)若虫の致死率の増大、および/または(3)生存若虫重量の減少(または他の異常な昆虫の発生)を示した。
A.ニラパルヴァータ・ルーゲンス部分配列のクローニング
市販のキット(Superscript(商標)3 Reverse Transcriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従う使用方法で、ニラパルヴァータ・ルーゲンス(供給源:Dr.J.A.Gatehouse,Dept. Biological Sciences,Durham University,UK)の高品質全RNAからcDNAを作製した。
市販のキット(Superscript(商標)3 Reverse Transcriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従う使用方法で、ニラパルヴァータ・ルーゲンス(供給源:Dr.J.A.Gatehouse,Dept.Biological Sciences, Durham University,UK)の高品質全RNAから、cDNAを作製した。
dsRNAを、市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(Cat.No.P1700,Promega)を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に2つの単一5'T7RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な2つのPCR反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をT7プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
トビイロウンカ(ニラパルヴァータ・ルーゲンス)のための液体人工食餌(MMD−1)をKoyama(1988)[Artificial rearing and nutritional physiology of theplanthoppers and leafhoppers(Homoptera: Delphacidae and Deltocephalidae)on aholidic diet. J/ARQ 22:20−27]に記載のとおり調製したが、食餌成分のスクロースの終濃度に変更を加え、14.4%(容量分の重量)とし、使用された。食餌成分を別個の濃度で調製した:10xミネラルストック(4℃保存)、2xアミノ酸ストック(−20℃保存)、10xビタミンストック(−20℃保存)。各ストック成分を、試験dsRNA溶液(4x濃縮)を用いて希釈するために、バイオアッセイの開始直前に混合して4/3x濃縮とし、pH6.5に調節し、約500μlアリクォートでフィルタ滅菌した。
異なる濃度の標的NL002 dsRNAを添加した液体人工食餌50μl、すなわち1、0.2、0.08および0.04mg/ml(最終濃度)を、トビイロウンカ餌室に与えた。dsRNAを添加した食餌は、一日置きに新たにし、昆虫の生存を毎日評価した。処理ごとに5バイオアッセイ餌室(レプリケート)を、同時に設定した。餌室を、27±2℃、相対湿度80%、16:8時間の明暗光周期に維持した。昆虫の生存データを、Kaplan−Meier生存曲線モデルを用いて解析し、群間の生存を、logrank test(Prism version 4.0)を用いて比較した。
A.ファミリーPCRを介したキロ・サプレッサリス遺伝子の部分配列のクローニング
TRIzol Reagent (Cat.No.15596−026/15596−018, Invitrogen, Rockville,Maryland, USA)を製造者の指示に従って使用し、キロ・サプレッサリス(ニカメイチュウ)の4つの異なる幼虫段階から高品質で、インタクトなRNAを単離した。製造者の指示に従ったDNase処理(Cat.No.1700,Promega)により、RNA調製物中に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(Superscript(商標)3 Reverse Transcriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従い使用し、cDNAを生成した。
dsRNAを、市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(Cat.No.P1700,Promega)を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に2つの単一5'T7RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な2つのPCR反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をT7プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
RNA干渉のメカニズムがdsRNAフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−CmR−イントロンによって分離されており、CmRはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、dsRNAヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、attLを含む−エントリークローン(実施例10A参照)と、attRを含む−目的ベクター(=pK7GWIWG2D(2))との間でLR組換え反応を用いて作製した。植物ベクターpK7GWIWG2D(2)は、VIB/Plant Systems Biology with a Material Transfer Agreementから取得した。LR組換え反応を、LR Clonase(商標)2 enzyme mix(Cat.No.11791−020, Invitrogen)を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、各々の標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な(operable)35Sプロモーターである。35Sプロモーターを用いたバイナリーベクターpK7GWIWG2D(2)は、アグロバクテリウム(A.tumefaciens)への形質転換に好適である。
ニカメイチュウ(キロ・サプレッサリス)(供給源:Syngenta,Stein,Switzerland)を、Kamano and Sato,1985(Handbook of Insect Rearing.Volumes I&II. P Singh and RFMoore,eds.,Elsevier Science Publishers,Amsterdam and New York,1985,pp448)の記載に基づいて変更を加えた人工食餌で維持した。簡単にいうと、1リットルの食餌を、以下の通り作製した:20gの寒天を、980mlのMilli−Q水に添加し、オートクレーブした;該寒天溶液を、約55℃まで冷まし、残りの成分を添加し、完全に混合した:トウモロコシ粉(ポレンタ)40g、セルロース20g、スクロース30g、カゼイン30g、小麦胚芽(あぶった)20g、ウェッソン(Wesson)混合塩8g、Vanderzant混合ビタミン12g、ソルビン酸1.8g、nipagin(メチルパラベン)1.6g、オーレオマイシン0.3g、コレステロール0.4gおよびL−システイン0.6g。食餌を約45℃まで冷やし、食餌やりトレーかカップに注いだ。食餌を、水平積層フローキャビンに取り付けて放置した。産み付けられた卵のあるコメの葉部分を、成虫蛾を収容するケージから除去し、餌やりカップもしくはトレーに固体餌にピン止めした。卵は、放置して孵化させ、新生幼虫は、バイオアッセイおよび昆虫飼育の維持が利用可能となった。試験と飼育中、28±2℃および80±5%相対湿度、16:8時間の明暗光周期の環境条件とした。
A.プルテッラ キシロステッラ遺伝子の部分配列のクローニング
TRIzol試薬(Cat.No.15596−026/15596−018,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示にどおりに使用し、異なる全ての幼虫段階のプルテッラ キシロステッラ(コナガ;供給源:Dr.Lara Senior,Insect InvestigationsLtd.,Capital Business Park, Wentloog,Cardiff,CF3 2PX,Wales,UK)から高品質で、インタクトなRNAを単離した。RNA調製物において存在するゲノムDNAは、製造者の指示に従ったDNase処理(Cat.No.1700,Promega)により、除去した。市販のキット(Superscript(商標)3 Reverse Transcriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従い使用し、cDNAを生成した。
dsRNAを、市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(Cat.No.P1700,Promega)を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に2つの単一5'T7RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な2つのPCR反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をT7プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
RNA干渉のメカニズムがdsRNAフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−CmR−イントロンによって分離されており、CmRはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、dsRNAヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、attLを含む−エントリークローン(実施例11A参照)と、attRを含む−目的ベクター(=pK7GWIWG2D(2))との間でLR組換え反応を用いて作製した。植物ベクターpK7GWIWG2D(2)は、VIB/Plant Systems Biology with a Material Transfer Agreementから取得した。LR組換え反応を、LR Clonase(商標)2 enzyme mix(Cat.No.11791−020,Invitrogen)を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、それぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な(operable)35Sプロモーターである。35Sプロモーターを用いたバイナリーベクターpK7GWIWG2D(2)は、アグロバクテリウム(A.tumefaciens)への形質転換に好適である。
コナガ(プルテッラ キシロステッラ)を、Insect Investigations Ltd.(供給源:Newcastle University, Newcastle−upon−Tyne,UK)で維持した。昆虫を、キャベツの葉で飼育した。一齢幼虫、雌雄混合幼虫(約1日齢)を、試験に使用するために選択した。昆虫を、エッペンドルフチューブ(1.5ml容量)にいれて、維持した。市販のコナガ食餌(Bio−Serv, NJ,USA)を、製造者の指示に従って調製し、各チューブの蓋に乗せた(0.25ml容量、8mm直径)。液体状態において、食餌の過剰分を取り除くことにより滑らかにし、平らな表面を作る。
A.アチェタ ドメスティカスの部分遺伝子配列のクローニング
TRIzol試薬(Cat.No.15596−026/15596−018, Invitrogen, Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従って使用し、アチェタ ドメスティカス(イエコオロギ;供給源:Dr.Lara Senior,Insect Investigations Ltd.,Capital Business Park,Wentloog,Cardiff,CF3 2PX,Wales,UK)の全ての異なる幼虫段階から高品質で、インタクトなRNAを単離した。製造者の指示に従ったDNase処理(Cat.No.1700,Promega)により、RNA調製物中に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(Superscript(商標)3 Reverse Transcriptase,Cat.No.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)を製造者の指示に従い使用し、cDNAを生成した。
dsRNAを、市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(Cat.No.P1700,Promega)を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に2つの単一5'T7RNAポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な2つのPCR反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をT7プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
RNA干渉のメカニズムがdsRNAフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−CmR−イントロンによって分離されており、CmRはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、dsRNAヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、attLを含む−エントリークローン(実施例12A参照)と、attRを含む−目的ベクター(=pK7GWIWG2D(2))との間でLR組換え反応を用いて作製した。植物ベクターpK7GWIWG2D(2)は、VIB/Plant Systems Biology with a Material Transfer Agreementから取得した。LR組換え反応を、LR Clonase(商標)2 enzyme mix(Cat.No.11791−020,Invitrogen)を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、それぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−CmR−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な(operable)35Sプロモーターである。35Sプロモーターを用いたバイナリーベクターpK7GWIWG2D(2)は、アグロバクテリウム(A.tumefaciens)への形質転換に好適である。
イエコオロギ(アチェタ ドメスティカス)を、Insect Investigations Ltd.(供給源:BladesBiological Ltd.,Kent,UK)で維持した。昆虫を、ペレット状の糠とキャベツ葉で飼育した。大きさが同じ雌雄混合幼虫と、5日齢以上でない昆虫を、試験使用のために選択した。2本鎖RNAを、コムギベースのペレット状げっ歯類食餌(rat and mouse standard diet,B&K Universal Ltd.,Grimston,Aldbrough,Hull,UK)と混合した。食餌BK001Pは、重量順に以下の成分を含む:コムギ、ダイズ、小麦餌、オオムギ、ペレット結合剤、げっ歯類5ビタミン、脂質混合物、 第二リン酸カルシウム、成形炭水化物。ペレット状げっ歯類食餌を、細かく磨砕し、いかなる酵素成分をも不活性化するために混合前に電子レンジで熱処理した。全てのげっ歯類食餌は、同一性を確保するために、同じバッチからとられた。磨砕後の食餌およびdsRNAを、完全に混合し、等重量の小さなペレットに製剤化し、室温で一晩乾燥させた。
Claims (24)
- 互いに相補的な配列の2つの相補鎖を含む2本鎖RNAを発現する植物細胞であって、該相補鎖のうち1つが以下の(i)〜(iii)からなる群から選択される1つのポリリボヌクレオチドを含むものであり、
(i)配列番号1、25、49〜55、163または166のいずれかで示される標的遺伝子の少なくとも21個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、
(ii)配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする標的遺伝子の少なくとも21個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、および
(iii)(i)または(ii)のポリリボヌクレオチドと少なくとも90%同一であるポリリボヌクレオチド、
前記2本鎖RNAが前記標的遺伝子の発現を阻害する植物細胞。 - 互いに相補的な配列の2つの相補鎖を含む2本鎖RNAを発現する植物であって、該相補鎖のうち1つが以下の(i)〜(iii)からなる群から選択される1つのポリリボヌクレオチドを含むものであり、
(i)配列番号1、25、49〜55、163または166のいずれかで示される標的遺伝子の少なくとも21個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、
(ii)配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする標的遺伝子の少なくとも21個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、および
(iii)(i)または(ii)のポリリボヌクレオチドと少なくとも90%同一であるポリリボヌクレオチド、
前記2本鎖RNAが前記標的遺伝子の発現を阻害する植物。 - 2本鎖RNAがコロラドハムシの生物学的活性を阻止する、請求項1記載の植物細胞または請求項2記載の植物。
- 標的遺伝子はコロラドハムシの遺伝子である、請求項2記載の植物。
- 植物は細胞質雄性不稔である、請求項2〜4のいずれかに記載の植物。
- 植物はさらに、パタチン、バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパク、キセノラブドゥス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブダス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリカス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択される殺虫剤を含むかまたは発現する、請求項2〜4のいずれかに記載の植物。
- バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis) 殺虫性タンパクは、Cry1、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二成分殺虫性タンパクCryET33およびCryET34、二成分殺虫性タンパクCryET80およびCryET76、二成分殺虫性タンパクTIC100およびTIC101、および二成分殺虫性タンパクPS149B1からなる群から選択される、請求項6記載の植物。
- 植物は、アルファルファ(alfalfa)、リンゴ(apple)、アプリコット(apricot)、朝鮮アザミ(artichoke)、アスパラガス(asparagus)、アボガド(avocado)、バナナ(banana)、オオムギ(barley)、マメ(beans)、ビート(beet)、ブラックベリー(blackberry)、ブルーベリー(blueberry)、ブロッコリ(broccoli)、芽キャベツ(brussel sprouts)、キャベツ(cabbage)、アブラナ(canola)、ニンジン(carrot)、キャッサバ(cassava)、カリフラワー(cauliflower)、穀物(cereal)、セロリ(celery)、桜(cherry)、柑橘類(citrus)、クレメンタイン(clementine)、コーヒー(coffee)、コーン(corn)、ワタ(cotton)、キュウリ(cucumber)、ナス(eggplant)、チコリ(endive)、ユーカリ(eucalyptus)、イチジク(figes)、ブドウ(grape)、グレープフルーツ(grapefruit)、落花生(groundnuts)、センナリホウズキ(ground cherry)、キウイフルーツ(kiwifruit)、レタス(lettuce)、ニラ(leek)、レモン(lemon)、ライム(lime)、パイン(pine)、トウモロコシ(maize)、マンゴー(mango)、メロン(melon)、キビ(millet)、マッシュルーム(mushroom)、ナット・オート(nut aot)、オクラ(okra)、タマネギ(onion)、オレンジ(orange)、観賞用植物または花または樹木(an ornamental plant or flower or tree)、パパイア(papaya)、パセリ(parsley)、エンドウマメ(pea)、モモ(peach)、ピーナッツ(peanut)、ピート(peat)、コショウ(pepper)、カキ(persimmon)、パイナップル(pineapple)、オオバコ(plantain)、プラム(plum)、ザクロ(pomegranate)、ジャガイモ(potato)、カボチャ(pumpkin)、ラディッキオ(radicchio)、ダイコン(radish)、ナタネ(rapeseed)、ラズベリー(raspberry)、コメ(rice)、ライ麦(rye)、サトウモロコシ(sorghum)、ダイズ(soy)、ダイズ(soy beans)、ホウレンソウ(spinach)、イチゴ(strawberry)、テンサイ(sugarbeet)、サトウキビ(sugarcane)、ヒマワリ(sunflower)、サツマイモ(sweet potato)、タンジェリン(tangerine)、茶(tea)、タバコ(tobacco)、トマト(tomato)、ツルクサ(a vine)、スイカ(watermelon)、コムギ(wheat)、トロロイモ(yams)およびズッキーニ(zucchini)を含む群から選択される、請求項2〜7のいずれかに記載の植物。
- 植物は、コロラドハムシによる摂取に対して抵抗性を有する、請求項2〜8のいずれかに記載の植物。
- 種子は、請求項2に記載の2本鎖RNAを含む、請求項2〜9のいずれかに記載の植物の種子。
- 再生もしくは増殖材料が、請求項2に記載の2本鎖RNAを含む、請求項2〜9のいずれかに記載の植物のための再生もしくは増殖材料。
- 生成物は、請求項2に記載の2本鎖RNAを含む、請求項2〜9のいずれかに記載の植物、請求項10に記載の種子または請求項11に記載の再生もしくは増殖材料から産生される生成物。
- 生成物は、食物、飼料、繊維、紙、食事、タンパク、デンプン、小麦粉、貯蔵生牧草、コーヒー、茶および油からなる群から選択される、請求項12記載の生成物。
- 請求項2〜9のいずれかに記載の植物、請求項10記載の種子、請求項11記載の再生もしくは増殖材料、請求項12もしくは13記載の生成物を含む殺虫剤であって、請求項2に記載の2本鎖RNAを含む、コロラドハムシに対する殺虫剤。
- 請求項2に記載の2本鎖RNAを含む、請求項2〜9のいずれかに記載の植物、請求項10記載の種子、請求項11記載の再生もしくは増殖材料、請求項12もしくは13記載の生成物から誘導された植物材料を、コロラドハムシに与えることを含むコロラドハムシの成長を制御または阻止する方法。
- コロラドハムシに対する抵抗性を植物に獲得させる方法であって、
制御配列に操作可能に連結された請求項1に記載の2本鎖RNAをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に形質転換し、
前記植物細胞から植物を再生し、そして
2本鎖RNAを発現するのに適した条件下で前記植物を成長させることにより、成長した植物は、非形質転換植物に比べてコロラドハムシに対して抵抗性を有することを含む、方法。 - 植物の収穫量を改善する方法であって、
制御配列に操作可能に連結された請求項1に記載の2本鎖RNAをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に形質転換し、
前記植物細胞から植物を再生し、そして
2本鎖RNAを発現するのに適した条件下で前記植物を成長させることにより、コロラドハムシによる植物の摂取およびコロラドハムシの横行による植物の収穫量の減少を阻止することを含む、方法。 - 2本鎖RNAを発現する植物の一部を経口摂取したコロラドハムシは2本鎖RNAにより標的遺伝子の発現が抑制されるものであり、前記標的遺伝子は、コロラドハムシによる摂取、コロラドハムシの生存、コロラドハムシの細胞アポトーシス、コロラドハムシまたはコロラドハムシ細胞の分化および発達、コロラドハムシによる有性生殖、筋肉形成、筋肉痙攣、筋肉収縮、幼若ホルモン形成および/または低下、幼若ホルモン制御、イオン制御および輸送、潜在的細胞膜の維持、アミノ酸合成、アミノ酸分解、***形成、フェロモン合成、フェロモン・センシング、アンテナ形成、羽形成、脚形成、卵形成、幼虫成熟、消化酵素形成、血リンパ合成、血リンパ維持、神経伝達、幼虫段階移行、蛹態期、蛹態期からの出現、細胞分割、エネルギー代謝、呼吸、細胞骨格の構造合成および維持、ヌクレオチド代謝、窒素代謝、水使用、水保持、および感覚性知力からなる群から選択される少なくとも1つの本質的機能を達成する、請求項15〜17のいずれかに記載の方法。
- 請求項1に記載の2本鎖RNAを含む、コロラドハムシに抵抗性を有する遺伝子組換え植物。
- パタチン、バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパク、クセノラブデュス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブデュス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリカス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択された殺虫剤をさらに含むかまたは発現する、請求項19に記載の遺伝子組換え植物。
- バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパクは、Cry1、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二成分殺虫性タンパクCryET33およびCryET34、二成分殺虫性タンパクCryET80およびCryET76、二成分殺虫性タンパクTIC100およびTIC101、および二成分殺虫性タンパクPS149B1からなる群から選択される、請求項20記載の遺伝子組換え植物。
- 植物でのコロラドハムシの成長を阻止するための、請求項1記載の細胞、請求項2〜9のいずれかに記載の植物、請求項10記載の種子、請求項11に記載の再生もしくは増殖材料、請求項12または13記載の生成物、請求項19〜21のいずれかに記載の遺伝子組換え植物の使用。
- 植物でのコロラドハムシの横行を阻止するための、請求項1記載の細胞、請求項2〜9のいずれかに記載の植物、請求項10記載の種子、請求項11に記載の再生もしくは増殖材料、請求項12または13記載の生成物、請求項19〜21のいずれかに記載の遺伝子組換え植物の使用。
- 植物の収穫量を改良するための、請求項1記載の細胞、請求項2〜9のいずれかに記載の植物、請求項10記載の種子、請求項11に記載の再生もしくは増殖材料、請求項12または13記載の生成物、請求項19〜21のいずれかに記載の遺伝子組換え植物の使用。
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