JP5472068B2 - Mass spectrometry method and apparatus - Google Patents
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Description
本発明は、特定の質量電荷比(m/z)を持つイオンをプリカーサイオンとして選択して開裂させ、それにより生成したプロダクトイオンを質量分析するMSn型の質量分析方法及び質量分析装置に関する。 The present invention relates to an MS n type mass spectrometry method and mass spectrometer for selecting and cleaving ions having a specific mass-to-charge ratio (m / z) as precursor ions and mass-analyzing product ions generated thereby.
近年、ポストゲノム研究として生体組織中のタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質の構造・機能解析手法(プロテオーム解析)の一つとして、近年、質量分析装置を用いたタンパク質の発現解析や一次構造解析が広く行われるようになってきている。そうした手法の一つとして、特定のイオンの選別と開裂操作とを伴うMSn分析(n≧2)が可能な質量分析装置を用い、次のような手順でタンパク質のアミノ酸配列を決定する手法が知られている。 In recent years, as a post-genomic study, analysis of the structure and function of proteins in living tissues has been rapidly advanced. As one of such protein structure / function analysis methods (proteome analysis), protein expression analysis and primary structure analysis using mass spectrometers have been widely performed in recent years. One such technique is to determine the amino acid sequence of a protein using the following procedure using a mass spectrometer capable of MS n analysis (n ≧ 2) with specific ion selection and cleavage operations. Are known.
まず目的とするタンパク質を適当な酵素で消化しペプチド断片の混合物としてから、そのペプチド混合物を質量分析に供する。このとき、各ペプチドを構成する元素には質量の異なる安定同位体が存在するため、同一のアミノ酸配列から成るペプチドであっても、その同位体組成の相違によって質量電荷比の異なる複数のピークを生じる。その複数のピークは、天然存在比が最大の同位体のみで構成されたイオン(モノアイソトピックイオン)のピークと、それ以外の同位体を含むイオン(同位体イオン)のピークとから成り、これらは1価の場合には、1Daから数Da間隔で並んだ複数本のピークから成るピーク群、つまり同位体ピーククラスタを形成する。 First, the target protein is digested with an appropriate enzyme to obtain a mixture of peptide fragments, and then the peptide mixture is subjected to mass spectrometry. At this time, since stable isotopes having different masses exist in the elements constituting each peptide, a plurality of peaks having different mass-to-charge ratios due to differences in the isotopic composition of peptides having the same amino acid sequence. Arise. The multiple peaks consist of peaks of ions (monoisotopic ions) composed only of isotopes with the largest natural abundance ratio, and peaks of ions containing other isotopes (isotope ions). In the case of monovalent, a peak group consisting of a plurality of peaks arranged at intervals of 1 Da to several Da, that is, an isotope peak cluster is formed.
続いて、上記のようなペプチド混合物のマススペクトルデータの中から、単一のペプチドに由来する一組の同位体ピーククラスタをプリカーサイオンとして選択し、このプリカーサイオンを開裂させることで生成されたイオン(プロダクトイオン)の質量分析、つまりMS2(=MS/MS)分析を行う。マススペクトル中の一組の同位体ピーククラスタに含まれる各ピークの強度比は開裂により生じたプロダクトイオンピークでもほぼ保たれるため、この強度比情報を利用して、MS2スペクトルでノイズピークを除外しつつプリカーサイオン由来のプロダクトイオンを見つけることができる。以上のようにして得られたMS2スペクトルから、観測されるプロダクトイオンのピークを抽出してリスト化し、そのピークリストをタンパク質同定用データベースに照らして検索することにより、被検ペプチドのアミノ酸配列を決定しタンパク質を同定することができる(例えば特許文献1など参照)。 Subsequently, from the mass spectrum data of the peptide mixture as described above, a set of isotope peak clusters derived from a single peptide is selected as a precursor ion, and ions generated by cleaving this precursor ion Mass analysis of (product ion), that is, MS 2 (= MS / MS) analysis is performed. Since the intensity ratio of each peak included in a set of isotope peak clusters in the mass spectrum is almost maintained even in the product ion peak generated by cleavage, this intensity ratio information can be used to generate noise peaks in the MS 2 spectrum. Product ions derived from precursor ions can be found while excluding them. From the MS 2 spectrum obtained as described above, the observed product ion peaks are extracted and listed, and the peak list is searched against the protein identification database to determine the amino acid sequence of the test peptide. The protein can be identified and identified (see, for example, Patent Document 1).
一般的に、単一のペプチド(化合物)に由来する一組の同位体ピーククラスタは、マススペクトル上に並ぶピークの間隔と同位体の天然存在比による強度分布とに基づいて選択される。しかしながら、マススペクトル上で一組の同位体ピーククラスタが単一化合物由来のものに見える場合であっても、実際には、同位体イオンの質量電荷比範囲に別の化合物由来のイオンピークが重畳している場合がある。例えばMALDIイオン源のようにイオン化にマトリクスを用いた場合には、マトリクスの重合体を生じ易く、こうした化合物由来のピークが混じり易い傾向にある。このような夾雑ピークを含む同位体ピーククラスタをプリカーサイオンとして選択してMS2分析を実行してしまうと、得られたMS2スペクトルには、複数の化合物由来のプロダクトイオンの質量電荷比情報が混在することになる。こうしたプロダクトイオンのピークリストをデータベース検索に供すると、誤った同定結果を導出する可能性があり、信頼性の高い同定を行うことができない。 In general, a set of isotope peak clusters derived from a single peptide (compound) is selected based on the interval between peaks arranged on the mass spectrum and the intensity distribution according to the natural abundance of isotopes. However, even if a set of isotope peak clusters appear to be derived from a single compound on the mass spectrum, in reality, an ion peak derived from another compound is superimposed on the mass-to-charge ratio range of the isotope ions. May have. For example, when a matrix is used for ionization like a MALDI ion source, a polymer of the matrix is likely to be formed, and peaks derived from such compounds tend to be mixed. When an isotope peak cluster including such a contaminating peak is selected as a precursor ion and MS 2 analysis is performed, the obtained MS 2 spectrum includes mass-to-charge ratio information of product ions derived from a plurality of compounds. Will be mixed. If such a product ion peak list is used for database search, an erroneous identification result may be derived, and reliable identification cannot be performed.
本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、同位体ピーククラスタをプリカーサイオンとして選択する際に、目的とする化合物とは別の化合物由来のピークが混じることを回避することにより、化合物同定や構造解析の信頼性を高めることができる質量分析方法及び装置を提供することにある。 The present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems. The object of the present invention is to select a peak derived from a compound different from the target compound when selecting an isotope peak cluster as a precursor ion. An object of the present invention is to provide a mass spectrometry method and apparatus capable of improving the reliability of compound identification and structural analysis by avoiding mixing.
上記課題を解決するために成された第1発明は、MSn-1分析(nは2以上の整数)で得られるMSn-1スペクトルデータに基づいてプリカーサイオンを決定し、該プリカーサイオンを開裂させてMSn分析を行う質量分析方法であって、
a)目的試料について取得されたMSn-1スペクトルに対し所定の選択条件の下で選択されたプリカーサイオンを設定してMSn分析を行うことにより得られたMSnスペクトルデータにおいて、前記プリカーサイオンの質量電荷比と想定されるプロダクトイオンの質量電荷比との間にイオンピークが観測されるか否かを調べるピーク判定ステップと、
b)プリカーサイオンの質量電荷比と想定されるプロダクトイオンの質量電荷比との間にイオンピークが観測された場合に、前記選択条件を変更した上で該条件の下に選択されたプリカーサイオンを設定して目的試料に対するMSn分析を再度実行する再分析実行ステップと、
を有することを特徴としている。
First aspect of the present invention made to solve the above problem is to determine the precursor ion based on the MS n-1 spectrum data obtained by MS n-1 analysis (n is an integer of 2 or more), the precursor ion A mass spectrometry method for cleaving and performing MS n analysis,
a) In the MS n spectrum data obtained by performing MS n analysis by setting a precursor ion selected under a predetermined selection condition for the MS n-1 spectrum acquired for the target sample, the precursor ion A peak determination step for examining whether an ion peak is observed between the mass-to-charge ratio of the product ion and the assumed mass-to-charge ratio of the product ion;
b) When an ion peak is observed between the mass-to-charge ratio of the precursor ion and the assumed mass-to-charge ratio of the product ion, the precursor ion selected under the condition is changed after changing the selection condition. A re-analysis execution step for setting and executing MS n analysis on the target sample again;
It is characterized by having.
また第2発明に係る質量分析装置は、第1発明に係る質量分析方法を実施するための装置であって、試料をイオン化するイオン源と、該イオン源で生成された各種イオンの中で又は後記開裂手段により生成された各種プロダクトイオンの中で特定の質量電荷比のイオンをプリカーサイオンとして選択するイオン選択手段と、該イオン選択手段で選択されたプリカーサイオンを開裂させてプロダクトイオンを生成する開裂手段と、前記イオン源で生成された各種イオン又は前記開裂手段により生成されたプロダクトイオンを質量分析する質量分離手段及び検出器と、を具備し、MSn-1分析(nは2以上の整数)で得られるMSn-1スペクトルデータに基づいてプリカーサイオンを決定し、該プリカーサイオンを開裂させてMSn分析を行う質量分析装置において、
a)目的試料について取得されたMSn-1スペクトルに対し所定の選択条件の下で選択されたプリカーサイオンを設定してMSn分析を行うことにより得られたMSnスペクトルデータにおいて、前記プリカーサイオンの質量電荷比と想定されるプロダクトイオンの質量電荷比との間にイオンピークが観測されるか否かを調べるピーク判定手段と、
b)プリカーサイオンの質量電荷比と想定されるプロダクトイオンの質量電荷比との間にイオンピークが観測された場合に、前記選択条件を変更した上で該条件の下に選択されたプリカーサイオンを設定して目的試料に対するMSn分析を再度実行するべく前記イオン源、前記イオン選択手段、前記開裂手段、前記質量分離手段及び前記検出器を制御する分析制御手段と、
を備えることを特徴としている。
A mass spectrometer according to the second invention is an apparatus for carrying out the mass spectrometry method according to the first invention, and includes an ion source for ionizing a sample and various ions generated by the ion source or An ion selection means for selecting an ion having a specific mass-to-charge ratio as a precursor ion among various product ions generated by the cleavage means described later, and a precursor ion selected by the ion selection means is cleaved to generate a product ion. A mass separation means and a detector for mass-analysis of various ions generated by the ion source or product ions generated by the cleavage means, and MS n-1 analysis (n is 2 or more) A precursor ion is determined based on the MS n-1 spectral data obtained by (integer), and the precursor ion is cleaved to perform MS n analysis. In the analysis equipment,
a) In MS n spectrum data obtained by performing MS n analysis by setting a precursor ion selected under a predetermined selection condition with respect to an MS n-1 spectrum acquired for a target sample, the precursor ion Peak determination means for examining whether an ion peak is observed between the mass-to-charge ratio of the product ion and the assumed mass-to-charge ratio of the product ions;
b) When an ion peak is observed between the mass-to-charge ratio of the precursor ion and the assumed mass-to-charge ratio of the product ion, the precursor ion selected under the condition is changed after changing the selection condition. Analysis control means for controlling the ion source, the ion selection means, the cleavage means, the mass separation means and the detector to set and execute MS n analysis on the target sample again;
It is characterized by having.
第1発明に係る質量分析方法を実施可能な第2発明に係る質量分析装置は、例えば3次元四重極型イオントラップ若しくはリニア型イオントラップを備える質量分析装置、又は、コリジョンセルを備えた三連四重極型質量分析装置などである。前者の場合、イオントラップがイオン選択手段及び開裂手段の機能を果たし、質量分析手段の質量分離機能をイオントラップに持たせることもできる。後者の場合、コリジョンセルが開裂手段の機能を果たし、コリジョンセルの前段に配置された四重極マスフィルタがイオン選択手段の機能を果たし、コリジョンセルの後段に配置された四重極マスフィルタが質量分離手段の機能を果たす。 The mass spectrometer according to the second invention capable of carrying out the mass spectrometry method according to the first invention is, for example, a mass spectrometer equipped with a three-dimensional quadrupole ion trap or a linear ion trap, or three equipped with a collision cell. For example, a quadrupole mass spectrometer. In the former case, the ion trap functions as an ion selection means and a cleavage means, and the mass separation function of the mass analysis means can be provided to the ion trap. In the latter case, the collision cell functions as a cleaving means, the quadrupole mass filter arranged at the front stage of the collision cell serves as the ion selection means, and the quadrupole mass filter arranged at the rear stage of the collision cell It functions as a mass separation means.
また第1発明に係る質量分析方法及び第2発明に係る質量分析装置において、プリカーサイオンの選択条件とは、プリカーサイオンとして選択する質量電荷比の範囲を指定するためのものであり、例えば質量電荷比幅と質量電荷比軸上でその幅を設定する位置(例えば質量電荷比の中心値)とすることができる。又は、プリカーサイオンとして選択する質量電荷比の範囲の下限値及び上限値とすることもできる。 Further, in the mass spectrometry method according to the first invention and the mass spectrometer according to the second invention, the selection condition of the precursor ion is for designating a range of the mass-to-charge ratio selected as the precursor ion. It can be a position (for example, the center value of the mass-to-charge ratio) where the width is set on the specific width and mass-to-charge ratio axis. Or it can also be set as the lower limit and the upper limit of the range of the mass-to-charge ratio selected as the precursor ion.
第1発明に係る質量分析方法及び第2発明に係る質量分析装置において、想定されるプロダクトイオンの質量電荷比は目的試料の種類などよって相違する。例えば試料がタンパク質やペプチド或いは糖鎖である場合には、想定されるプロダクトイオンの質量電荷比とは、プリカーサイオンの質量電荷比から17[Da]を差し引いた値とすることができる。これはペプチド等が一般的に持つアンモニウム基(-NH3)が脱離したプロダクトイオンである。また、試料がタンパク質やペプチドである場合には、想定されるプロダクトイオンの質量電荷比とはプリカーサイオンの質量電荷比から57[Da]を差し引いた値とすることもできる。これは最も小さなアミノ酸であるグリシンが脱離したプロダクトイオンである。さらに、試料がタンパク質、ペプチド、糖鎖又は核酸である場合には、想定されるプロダクトイオンの質量電荷比とは、プリカーサイオンの質量電荷比から18[Da]を差し引いた値とすることもできる。これは水分子(−H2O)が脱離したプロダクトイオンである。 In the mass spectrometric method according to the first invention and the mass spectroscope according to the second invention, the mass-to-charge ratio of the product ions is different depending on the type of the target sample. For example, when the sample is a protein, peptide, or sugar chain, the assumed mass-to-charge ratio of product ions can be a value obtained by subtracting 17 [Da] from the mass-to-charge ratio of precursor ions. This is a product ion from which an ammonium group (—NH 3 ) generally possessed by a peptide or the like is eliminated. In addition, when the sample is a protein or peptide, the mass-to-charge ratio of the product ions that can be assumed can be a value obtained by subtracting 57 [Da] from the mass-to-charge ratio of the precursor ions. This is a product ion from which glycine, the smallest amino acid, has been eliminated. Furthermore, when the sample is a protein, peptide, sugar chain, or nucleic acid, the mass-to-charge ratio of the product ion that is assumed can be a value obtained by subtracting 18 [Da] from the mass-to-charge ratio of the precursor ion. . This is a product ion water molecule (-H 2 O) is eliminated.
或る選択条件の下でプリカーサイオンを選択したとき、目的化合物のモノアイソトピックイオンピークとその同位体イオンピークのみが選択された場合には、それに対しMSn分析を実行して得られるMSnスペクトルでは、上記想定されるプロダクトイオンの質量電荷比とプリカーサイオンの質量電荷比との間以外にはイオンピークは出現しない筈である。換言すれば、そうしたピークが観測される場合には、選択されたプリカーサイオンの中に目的化合物の同位体ピークではない夾雑ピークが混じっている又は重なっている可能性が高いと考えられる。そこで、第1発明に係る質量分析方法において、ピーク判定ステップはMSnスペクトル上で上記の出現しない筈のイオンピークの有無を調べ、そうしたピークがあった場合には、再分析実行ステップはプリカーサイオンの選択条件を変更し、その変更後の条件の下に選択されたプリカーサイオンを設定して目的試料に対するMSn分析を再度実行する。 When selecting precursor ions under certain selection conditions, MS n when only monoisotopic ion peak and its isotopic ion peak of the target compound is selected, the contrast obtained by executing MS n analysis In the spectrum, no ion peak should appear except between the mass-to-charge ratio of the product ion and the mass-to-charge ratio of the precursor ion. In other words, when such a peak is observed, it is considered that there is a high possibility that the selected precursor ion is mixed or overlapped with a non-isotopic peak of the target compound. Therefore, in the mass spectrometric method according to the first invention, the peak determination step checks the presence or absence of the above-mentioned soot ion peak on the MS n spectrum, and if there is such a peak, the reanalysis execution step is the precursor ion. Then, the selected precursor ion is set under the changed condition, and the MS n analysis for the target sample is executed again.
プリカーサイオン選択条件を変更する目的は、目的化合物のモノアイソトピックイオンピークに対する同位体質量電荷比範囲に混じっている夾雑ピークを排除することであるから、選択条件の変更は選択する質量電荷比の範囲を狭める及び/又はその範囲を低い側に移動させることを意味する。ただし、MSn-1スペクトル上で目的化合物のモノアイソトピックイオンピークの質量電荷比よりも低い側に近接して別のイオンピークが存在している場合には、選択する質量電荷比の範囲を低い側に移動させるとその別のイオンピークが含まれてしまうおそれがある。したがって、目的化合物のモノアイソトピックイオンピークの周囲のピークの密集具合を判断し、それに応じて選択する質量電荷比範囲の移動が可能か否かを判定するとよい。一方、選択する質量電荷比の範囲を狭めた場合、一般にその範囲内のイオンの選択効率は落ちるため、プロダクトイオンの信号強度が低下する。したがって、もともとイオンピークの信号強度があまり高くないような場合には、選択する質量電荷比範囲をあまり狭めずに、該質量電荷比範囲の移動を行うほうがよい。 The purpose of changing the precursor ion selection condition is to eliminate the impurity peak mixed in the isotope mass-to-charge ratio range with respect to the monoisotopic ion peak of the target compound. It means to narrow the range and / or move the range to the lower side. However, if another ion peak exists close to the lower side of the mass-to-charge ratio of the monoisotopic ion peak of the target compound on the MS n-1 spectrum, the range of the mass-to-charge ratio to be selected is If moved to a lower side, another ion peak may be included. Therefore, it is preferable to determine the density of peaks around the monoisotopic ion peak of the target compound, and to determine whether or not the mass-to-charge ratio range selected in accordance with it can be moved. On the other hand, when the range of the mass-to-charge ratio to be selected is narrowed, the selection efficiency of ions within that range generally decreases, so the signal intensity of product ions decreases. Therefore, when the signal intensity of the ion peak is not so high originally, it is better to move the mass-to-charge ratio range without narrowing the selected mass-to-charge ratio range.
上記のようなプリカーサイオン選択条件の変更によってプリカーサイオンから夾雑ピークが排除されれば、MSnスペクトル上に現れるプロダクトイオンが目的化合物由来のもののみとなる。それにより、MSnスペクトルデータを用いたデータベース検索による化合物同定の信頼性を向上させることができる。 If the impurity ions are excluded from the precursor ions by changing the precursor ion selection conditions as described above, the product ions appearing on the MS n spectrum are only derived from the target compound. Thereby, the reliability of compound identification by database search using MS n spectrum data can be improved.
本発明に係る質量分析装置の一実施例であるイオントラップ質量分析装置について、図1〜図3を参照して説明する。図1は本実施例のイオントラップ質量分析装置の概略構成図である。 An ion trap mass spectrometer which is an embodiment of a mass spectrometer according to the present invention will be described with reference to FIGS. FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an ion trap mass spectrometer of the present embodiment.
本実施例のイオントラップ質量分析装置は、目的試料をイオン化するイオン源1と、イオンを一時的に保持し、特定質量電荷比を有するイオンの選別、選別されたイオンの開裂、質量電荷比に応じたイオンの分離などを実行する3次元四重極型のイオントラップ2と、イオントラップ2から排出されたイオンを検出する検出部3と、を備える。
The ion trap mass spectrometer of the present embodiment includes an ion source 1 that ionizes a target sample, temporarily holding ions, selecting ions having a specific mass-to-charge ratio, cleaving selected ions, and adjusting the mass-to-charge ratio. It includes a three-dimensional
イオン源1はMALDI(マトリクス支援レーザ脱離イオン化)イオン源であり、パルス状のレーザ光を出射するレーザ照射部11、目的試料成分を含むサンプルSが付着されたサンプルプレート12、レーザ光の照射によってサンプルSから放出されたイオンを引き出すとともにその引き出し方向を限定するアパーチャ13、引き出されたイオンを案内するイオンレンズ14、などを含む。もちろん、MALDI以外の他のレーザイオン化法やレーザ光を用いないイオン化法を用いても構わない。
The ion source 1 is a MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization) ion source, a laser irradiation unit 11 that emits a pulsed laser beam, a
イオントラップ2は、円環状の1個のリング電極21と、これを挟むように対向して配置された一対のエンドキャップ電極22、24とからなり、これら3個の電極21、22、24で囲まれた空間がイオン捕捉領域となる。入口側エンドキャップ電極22の略中央にはイオン入射口23が穿設され、イオン源1から出射したイオンはイオン入射口23を通過してイオントラップ2内に導入される。一方、出口側エンドキャップ電極24の略中央にはイオン出射口25が穿設され、イオン出射口25を通ってイオントラップ2内から排出されたイオンは検出部3に到達して検出される。
The
検出部3は、イオンを電子に変換するコンバージョンダイノード31と、コンバージョンダイノード31から到来する電子を増倍して検出する二次電子増倍管32とからなり、入射したイオンの量に応じた検出信号をデータ処理部4に送る。データ処理部4は、イオントラップ2において質量分離されつつ順次排出されるイオンに対して検出部3で得られる検出信号に基づいて、マス(MS1)スペクトルを作成する機能を有する。さらに、このデータ処理部4に含まれる本実施例に特徴的なイオンピーク判定部41は、マススペクトルデータから特定のイオンピークの存在を識別する。
The
主電源部6及び補助電源部7は制御部5からの指示に基づいて、イオントラップ2でのイオンの捕捉やイオン選別、質量分離などを行うべく電極21、22、24へ所定の電圧を印加する。各部の動作を制御する制御部5は本実施例に特徴的なプリカーサ選択条件設定部51を含む。プリカーサ選択条件設定部51はプリカーサイオン選択のための条件を設定するものであり、イオンピーク判定部41による判定結果に応じて条件を適宜変更する機能を有する。
The main
なお、データ処理部4及び制御部5はパーソナルコンピュータをハードウエアとし、該パーソナルコンピュータに予めインストールされた制御/処理プログラムを実行することにより、その機能が達成されるものとすることができる。
The functions of the data processing unit 4 and the
次に、本実施例の質量分析装置における特徴的な質量分析動作を図3に従って説明する。ここでは一例として、測定対象の試料がタンパク質のトリプシン消化物、即ち、様々な消化断片(ペプチド)が混在したものであるとする。 Next, a characteristic mass analysis operation in the mass spectrometer of the present embodiment will be described with reference to FIG. Here, as an example, it is assumed that the sample to be measured is a tryptic digest of protein, that is, a mixture of various digested fragments (peptides).
分析者は試料にマトリクスを混合して調製したサンプルSをサンプルプレート12上に用意し、このサンプルSに対するMS2分析の開始を指示する。この指示を受けて制御部5はまず、通常の質量分析(MS分析)を実行するように各部を制御する。即ち、イオン源1において、レーザ照射部11から短時間レーザ光を出射しサンプルSに当てる。レーザ光照射によりサンプルS中のマトリクスは急速に加熱され、目的成分を伴って気化する。この際に目的成分はイオン化される。発生したイオンはイオンレンズ14により形成される静電場によって収束され、イオン入射口23を経てイオントラップ2内に導入され、一旦捕捉される。その後、主電源部6及び補助電源部7から各電極21、22、24に印加する電圧を適宜走査することにより、捕捉されているイオンを質量電荷比の順に共鳴励起させてイオン出射口25を通して排出する。データ処理部4はこのときに検出部3から出力される検出信号に基づいてマススペクトルを作成する(ステップS1)。
The analyst prepares the sample S prepared by mixing the matrix with the sample on the
マススペクトルが取得されると、制御部5は、プリカーサ選択条件設定部51により設定される条件に従ってマススペクトルからプリカーサイオンを選択する(ステップS2)。例えば、マススペクトル中の多数のピークの中で信号強度の大きいピークを選択し、該ピークを含む近傍の複数のピークが同位体ピーククラスタを構成すると仮定し、それらピークの信号強度の比に基づいて同位体ピーククラスタである可能性をチェックする。同位体ピーククラスタである可能性が高いと判定されると、予め定められた中心質量電荷比Mc及び質量電荷比幅ΔMを持つ選択窓を設定し、該選択窓内に存在するピークを一組の同位体ピーククラスタであるとみなしてプリカーサイオンとして抽出する。
When the mass spectrum is acquired, the
次に、制御部5は各部を制御することにより、上記のように選択されたプリカーサイオン(クラスタ)を分析条件としたMS2分析を実行し、MS2スペクトルを取得する(ステップS3)。即ち、MS分析時と同様にイオントラップ2内にサンプルS由来のイオンを保持した後、電極21、22、24に所定の電圧を印加することで、プリカーサイオン(クラスタ)のみをイオントラップ2内に選択的に残す。そして、図示しないガス源からイオントラップ2内にCID(衝突誘起解離)ガスを導入し、さらにプリカーサイオンを共鳴励振させることにより該イオンをCIDガスに衝突させて開裂を促す。そうして生成されたプロダクトイオンを質量電荷比の順に共鳴励起させてイオン出射口25を通して排出し、データ処理部4はこのときに検出部3から出力される検出信号に基づいてMS2スペクトルを作成する。
Next, the
次いでデータ処理部4においてイオンピーク判定部41が、MS2スペクトル上でプリカーサイオンピークとそのプリカーサイオンピークの質量電荷比Mpから57[Da]を差し引いた間の範囲Xに何らかのイオンピークがあるか否かを判定する(ステップS4、S5)。このときのプリカーサイオンピークとは同位体ピーククラスタ中で質量電荷比が最小であるモノアイソトピックイオンピークとすればよい。また、57[Da]という質量電荷比差は最も小さなアミノ酸であるグリシンに相当する。即ち、タンパク質やペプチドを分析対象とした場合、Mp−57[Da]の位置にはプロダクトイオンピークが現れることは当然予想される(当然のことながら、必ずしも現れるとは限らない)。そこで、この位置をプロダクトイオンピークが現れる上限として定めている。
Next, in the data processing unit 4, whether the ion
上記質量電荷比範囲Xにイオンピークが存在しない場合には、プリカーサイオンクラスタは単一化合物由来のイオンピークからなるものと推測できる。したがって、ステップS5からS11へと進み、取得されたMS2スペクトルデータからプロダクトイオンのピークリストを作成し(ステップS11)、そのピークリストをタンパク質同定用データベースに照らしてMS/MSイオンサーチを実行し、元の単一化合物のペプチドを同定する(ステップS12)。 When no ion peak exists in the mass to charge ratio range X, it can be estimated that the precursor ion cluster is composed of an ion peak derived from a single compound. Accordingly, the process proceeds from step S5 to S11, a peak list of product ions is created from the acquired MS 2 spectrum data (step S11), and the MS / MS ion search is executed by checking the peak list against the protein identification database. The original single compound peptide is identified (step S12).
ステップS5で質量電荷比範囲Xにイオンピークがあると判定された場合には、次にそのイオンピークの質量電荷比がMp−17[Da]又はMp−18[Da]であるか否かを判定する(ステップS6)。17[Da]という質量電荷比差はアンモニウム基(−NH3)に相当し、18[Da]という質量電荷比差は水分子(−H2O)に相当するものであり、これらはプリカーサイオンから容易に脱離する。したがって、質量電荷比範囲X内であっても、Mp−17[Da]又はMp−18[Da]の位置に存在するイオンピークは夾雑物由来ではなく、目的化合物由来のものであると推測できる。そこで、これらの位置にピークが存在してもこれは無視し、ステップS6からS11へと進んで、上述した処理を遂行する。 If it is determined in step S5 that there is an ion peak in the mass to charge ratio range X, whether or not the mass to charge ratio of the ion peak is Mp-17 [Da] or Mp-18 [Da] is determined next. Determination is made (step S6). The mass to charge ratio difference of 17 [Da] corresponds to an ammonium group (—NH 3 ), and the mass to charge ratio difference of 18 [Da] corresponds to a water molecule (—H 2 O), which are precursor ions. Easily detached from Therefore, even within the mass to charge ratio range X, it can be estimated that the ion peak existing at the position of Mp-17 [Da] or Mp-18 [Da] is not derived from impurities but derived from the target compound. . Therefore, even if there is a peak at these positions, it is ignored and the process proceeds from step S6 to S11 to perform the above-described processing.
これに対し、ステップS5で質量電荷比範囲Xにあると判定されたイオンピークが、Mp−17[Da]、Mp−18[Da]の位置でない場合(ステップS6でNo)には、このイオンピークは目的化合物由来のプリカーサイオンから生成されたものでない可能性が高い。即ち、選択されたプリカーサイオンクラスタ中に別の化合物、つまり夾雑物に由来するイオンが混じっている可能性が高い。そこで、このようなイオンピーク判定結果を受けた制御部5は、まずプリカーサ選択条件を変更した再分析を所定回数実行したか否かを判定し(ステップS7)、未だ再分析を所定回数実行していなければ、プリカーサ選択条件設定部51が、プリカーサ選択条件、つまり上記選択窓の幅と位置との両方又は一方を変更する(ステップS8)。そして、ステップS2に戻り、MS2分析を再度実行する。
On the other hand, if the ion peak determined to be in the mass-to-charge ratio range X in step S5 is not at the position of Mp-17 [Da] or Mp-18 [Da] (No in step S6), this ion It is highly possible that the peak is not generated from a precursor ion derived from the target compound. That is, there is a high possibility that another compound, that is, an ion derived from a contaminant is mixed in the selected precursor ion cluster. Therefore, the
例えば図2の例では、当初設定した選択窓(中心質量電荷比Mc、幅ΔM)内に目的化合物由来の同位体ピーク以外に夾雑物由来のピークが重畳していると(図2(a)参照)、MS2スペクトル上で質量電荷比範囲X内に異常ピークが観測される場合がある(図2(b)参照)。このような異常ピークが観測された場合、選択窓を変更するが、図2(c)に示すように適切に選択窓(中心質量電荷比Mc’、質量電荷比幅ΔM’)が変更されれば、夾雑ピークがプリカーサイオンクラスタから除外されるので、目的化合物由来のプロダクトイオンピークのみが現れるMS2スペクトルを取得することが可能となる。 For example, in the example of FIG. 2, when a peak derived from a contaminant is superimposed in addition to an isotope peak derived from the target compound in an initially set selection window (central mass-to-charge ratio Mc, width ΔM) (FIG. 2A). In some cases, an abnormal peak is observed in the mass-to-charge ratio range X on the MS 2 spectrum (see FIG. 2B). When such an abnormal peak is observed, the selection window is changed. However, as shown in FIG. 2C, the selection window (central mass-to-charge ratio Mc ′, mass-to-charge ratio width ΔM ′) is appropriately changed. For example, since the contaminating peak is excluded from the precursor ion cluster, it is possible to acquire an MS 2 spectrum in which only the product ion peak derived from the target compound appears.
プリカーサイオンを選択する際に、質量電荷比が最も小さなモノアイソトピックイオンピークを外すことはできないから、実際上、選択窓の変更は、質量電荷比幅を狭める、又は、中心質量電荷比を低質量電荷比側にずらす、のいずれか一方、又は両方である。質量電荷比幅を狭めると、夾雑ピークを除外できる可能性は高まるが、選択されるイオンの信号強度が低下する。これは、イオントラップ2におけるイオン選択の性能限界によるもので、選択窓の質量電荷比幅を狭めるほどその選択窓内の質量電荷比を持つイオンの損失も大きくなることによる。したがって、質量電荷比幅には下限があり、特にマススペクトル上でのイオンピークの強度が比較的低い場合にはその下限を上げることが好ましい。
When selecting a precursor ion, the monoisotopic ion peak with the smallest mass-to-charge ratio cannot be removed, so in practice changing the selection window will reduce the mass-to-charge ratio width or reduce the central mass-to-charge ratio. Either one or both of shifting to the mass-to-charge ratio side. When the mass-to-charge ratio width is narrowed, the possibility of removing the impurity peak increases, but the signal intensity of the selected ions decreases. This is due to the limit of ion selection performance in the
一方、中心質量電荷比を下げることで選択窓の位置をずらすと、高質量電荷比側に重畳している夾雑ピークを除外できる可能性は高まる。しかしながら、低質量電荷比側に近接して別のイオンピークが存在している場合には、そのイオンピークが選択窓に掛かることを避ける必要がある。こうしたことから、例えば、モノアイソトピックイオンピークから低質量電荷比側のピークの近接具合を判断し、その近接ピークに選択窓が掛からない範囲で中心質量電荷比を下方向にずらし、そのずらしでは不十分な場合に質量電荷比幅を狭めるようにするとよい。 On the other hand, if the position of the selection window is shifted by lowering the central mass-to-charge ratio, the possibility that the impurity peak superimposed on the high mass-to-charge ratio side can be eliminated increases. However, when another ion peak is present close to the low mass-to-charge ratio side, it is necessary to avoid that ion peak from entering the selection window. Therefore, for example, the proximity of the peak on the low mass-to-charge ratio side from the monoisotopic ion peak is judged, and the center mass-to-charge ratio is shifted downward within the range where the selection window does not cover the adjacent peak. If this is insufficient, the mass-to-charge ratio width should be narrowed.
ただし、夾雑ピークの重なり状況によっては、選択窓の位置や幅を許容範囲で最大限変更しても夾雑ピークを除外できない場合がある。その場合、所定回数MS2分析を再試行しても質量電荷比範囲Xに異常ピークが検出されるから、そのときにはステップS7でYesと判定されてステップS9へと進む。この場合には、そのプリカーサイオンの選択をあきらめ、選択したピークをプリカーサイオンピークリストから除外する(ステップS9)。そして、別のプリカーサイオンを選択したMS2分析の実行の要否を判定し(ステップS10)、実行の必要があればステップS2へと戻り、実行の必要がなければ処理を終了する。 However, depending on the overlap state of the contamination peaks, the contamination peaks may not be excluded even if the position and width of the selection window are changed within the allowable range. In that case, even if the MS 2 analysis is retried a predetermined number of times, an abnormal peak is detected in the mass-to-charge ratio range X, so at that time it is determined Yes in step S7 and the process proceeds to step S9. In this case, the selection of the precursor ion is given up and the selected peak is excluded from the precursor ion peak list (step S9). Then, it is determined whether or not the MS 2 analysis in which another precursor ion is selected is necessary (step S10). If necessary, the process returns to step S2, and if not necessary, the process is terminated.
以上のようにして、本実施例によるイオントラップ質量分析装置では、MS2スペクトル上で観測されるイオンピークに、目的化合物に由来しないイオンピークが混入することを回避することができる。それによって、MS/MSイオンサーチの際の同定精度が向上する。 As described above, in the ion trap mass spectrometer according to the present example, it is possible to avoid mixing an ion peak not derived from the target compound into an ion peak observed on the MS 2 spectrum. Thereby, the identification accuracy in the MS / MS ion search is improved.
なお、上記実施例では、試料がペプチド混合物であるため、ステップS4、S5でプリカーサイオンピークとMp−57[Da]との間のイオンピークの有無を調べるようにしていたが、試料が糖鎖や核酸である場合には、ステップS4、S5でプリカーサイオンピークとMp−18[Da]との間のイオンピークの有無を調べるようにすればよい。 In the above example, since the sample is a peptide mixture, the presence or absence of an ion peak between the precursor ion peak and Mp-57 [Da] was examined in steps S4 and S5. If it is a nucleic acid, the presence or absence of an ion peak between the precursor ion peak and Mp-18 [Da] may be examined in steps S4 and S5.
また上記説明では、本発明に係る質量分析方法をMSスペクトルからプリカーサイオンを選択してMS2分析を行う際に適用していたが、2以上の任意のnについて、MSn-1スペクトルからプリカーサイオンを選択してMSn分析を行う際に適用可能であることは明白である。 In the above description, the mass spectrometry method according to the present invention has been applied when MS 2 analysis is performed by selecting a precursor ion from the MS spectrum. However, for any two or more n, the precursor from the MS n-1 spectrum is used. It is obvious that the method can be applied when selecting ions and performing MS n analysis.
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜、変形、追加、修正を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。 It should be noted that the above embodiment is merely an example of the present invention, and it should be understood that modifications, additions, and modifications as appropriate within the spirit of the present invention are included in the scope of the claims of the present application.
1…イオン源
11…レーザ照射部
12…サンプルプレート
13…アパーチャ
14…イオンレンズ
2…イオントラップ
21…リング電極
22…入口側エンドキャップ電極
23…イオン入射口
24…出口側エンドキャップ電極
25…イオン出射口
3…検出部
31…コンバージョンダイノード
32…二次電子増倍管
4…データ処理部
41…イオンピーク判定部
5…制御部
51…プリカーサ選択条件設定部
6…主電源部
7…補助電源部
S…サンプル
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Ion source 11 ...
Claims (6)
a)目的試料について取得されたMSn-1スペクトルに対し所定の選択条件の下で選択されたプリカーサイオンを設定してMSn分析を行うことにより得られたMSnスペクトルデータにおいて、前記プリカーサイオンの質量電荷比と想定されるプロダクトイオンの質量電荷比との間にイオンピークが観測されるか否かを調べるピーク判定ステップと、
b)プリカーサイオンの質量電荷比と想定されるプロダクトイオンの質量電荷比との間にイオンピークが観測された場合に、前記選択条件を変更した上で該条件の下に選択されたプリカーサイオンを設定して目的試料に対するMSn分析を再度実行する再分析実行ステップと、
を有することを特徴とする質量分析方法。 A mass spectrometry method for determining a precursor ion based on MS n-1 spectrum data obtained by MS n-1 analysis (n is an integer of 2 or more), cleaving the precursor ion, and performing MS n analysis,
a) In the MS n spectrum data obtained by performing MS n analysis by setting a precursor ion selected under a predetermined selection condition for the MS n-1 spectrum acquired for the target sample, the precursor ion A peak determination step for examining whether an ion peak is observed between the mass-to-charge ratio of the product ion and the assumed mass-to-charge ratio of the product ion;
b) When an ion peak is observed between the mass-to-charge ratio of the precursor ion and the assumed mass-to-charge ratio of the product ion, the precursor ion selected under the condition is changed after changing the selection condition. A re-analysis execution step for setting and executing MS n analysis on the target sample again;
A mass spectrometric method characterized by comprising:
a)目的試料について取得されたMSn-1スペクトルに対し所定の選択条件の下で選択されたプリカーサイオンを設定してMSn分析を行うことにより得られたMSnスペクトルデータにおいて、前記プリカーサイオンの質量電荷比と想定されるプロダクトイオンの質量電荷比との間にイオンピークが観測されるか否かを調べるピーク判定手段と、
b)プリカーサイオンの質量電荷比と想定されるプロダクトイオンの質量電荷比との間にイオンピークが観測された場合に、前記選択条件を変更した上で該条件の下に選択されたプリカーサイオンを設定して目的試料に対するMSn分析を再度実行するべく前記イオン源、前記イオン選択手段、前記開裂手段、前記質量分離手段及び前記検出器を制御する分析制御手段と、
を備えることを特徴とする質量分析装置。 An ion source for ionizing a sample, and an ion selection means for selecting, as a precursor ion, ions having a specific mass-to-charge ratio among various ions generated by the ion source or various product ions generated by cleavage means described later And a separation means for cleaving the precursor ions selected by the ion selection means to generate product ions, and various types of ions generated by the ion source or mass analysis of product ions generated by the cleavage means Means and a detector, determining a precursor ion based on MS n-1 spectral data obtained by MS n-1 analysis (n is an integer of 2 or more), and cleaving the precursor ion to obtain MS n In a mass spectrometer that performs analysis,
a) In the MS n spectrum data obtained by performing MS n analysis by setting a precursor ion selected under a predetermined selection condition for the MS n-1 spectrum acquired for the target sample, the precursor ion Peak determination means for examining whether an ion peak is observed between the mass-to-charge ratio of the product ion and the assumed mass-to-charge ratio of the product ions;
b) When an ion peak is observed between the mass-to-charge ratio of the precursor ion and the assumed mass-to-charge ratio of the product ion, the precursor ion selected under the condition is changed after changing the selection condition. Analysis control means for controlling the ion source, the ion selection means, the cleavage means, the mass separation means and the detector to set and execute MS n analysis on the target sample again;
A mass spectrometer comprising:
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