JP5461008B2 - ベクター - Google Patents
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Description
WO 92/19636は、ヒトおよびウシのビタミンK依存性カルボキシラーゼのクローニングおよび配列同定を開示している。この出願は、ビタミンK依存性タンパク質を調製するため、適切なホスト細胞におけるビタミンK依存性カルボキシラーゼおよびビタミンK依存性タンパク質の共発現を示唆している。カルボキシラーゼおよびビタミンK依存性タンパク質の共発現は例証されていない。
発明の概要
本発明の第1の側面に従って、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、ならびにビタミンKエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、を包含するホスト細胞であって、ここでホスト細胞がさらにガンマ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する、前記ホスト細胞を提供する。
発明の詳細な説明
本発明の第1の側面に従って、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、ならびにビタミンKエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、を包含するホスト細胞であって、ここでホスト細胞がさらにγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する、前記ホスト細胞を提供する。
(i)ビタミンKエポキシド還元酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで前記ビタミンKエポキシド還元酵素タンパク質をコードする配列が、前記細胞によるビタミンKエポキシド還元酵素タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に、作動可能なように連結されている前記ポリヌクレオチド;および
(ii)前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に作動可能なように連結された、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(iii)ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、ここで前記ガンマ-グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードする配列が、前記細胞によるガンマ-グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に、作動可能なように連結されている前記ポリヌクレオチド、
を包含する前記ホスト細胞を提供する。
タンパク質の共発現を達成するための1つのやり方は、個々の発現コントロール配列の一部として異なるプロモーターを使用することである。当該技術には、異種のタンパク質を異なる程度または範囲に発現する能力のある、種々のクローニングベクター、プロモーター、およびその他の発現コントロール配列の例が多々ある。タンパク質発現技術における当業者が、カルボキシル化を必要とするタンパク質、ビタミンKエポキシド還元酵素、および所望によりγ−カルボキシラーゼの共発現を引き起こすためのプロモーターおよびその他のコントロール配列を選択することができるような、リコンビナント発現技術が適切に進歩している。どの特定のプロモーターおよびその他の発現コントロール配列を使用するかの選択は、個人個人の好みの問題である。
本発明のなおもう1つの側面に従って、上に記載した方法により得られた単離ガンマ-カルボキシル化タンパク質の医薬的有効量を、それを必要とする患者に投与することを包含する、被験者における増大または低減された凝固を促進する方法を提供する。
本発明を、以下の非限定的実施例によりさらに記載することにする。
本発明の実施は、他に指摘していなければ、当該技術の範囲内の分子生物学およびリコンビナントDNA技術の従来の方法を使用するものとする。
〔実施例1〕
カルボキシル化タンパク質の発現におけるVKORの重要性を調べるため、筆者らはCHO細胞においてヒト凝固因子X(FX)を発現させた。完全に機能的なFXは、Camire et al. 2000 (Biochemistry 39:14322-14329)(100万細胞および1日当たりおよそ1μgのカルボキシル化FXを得た)により、そしてHimmelspach et al 2000 (Thromb Res 97:51-67)(DHFR増殖を行ったCHO細胞を用いて、100万細胞および1日当たり25%(19.5μg)までの活性なFXを得たと主張した)により、より早期に発現されている。Himmelspachらは、リコンビナントFXの不完全なプロセシングを報告しており、実際に示された活性なFXの最大の生産性は5μg/ml培養液であった。双方の公開文献において、細胞は血清を含有する培地において接着細胞として成長させた。細胞は所望のコンフルエンスまで成長させ、培地を血清不含培地に交換し、インキュベーションを継続して産生物を蓄積させた。その後産生物の量を、この“血清不含”培地から見積もった。この培養法は、細胞が産生物を短期間のみ産生するにとどまるため、ラージスケールのタンパク質の製造には適さない。加えてこの産生物は血清タンパク質、例えばウシFXが混入されることになる。この混入物は、血清タンパク質として非常に望ましくなく、除去が困難であり、そしてもし患者に注射される産生物中に存在すれば、抗体形成を引き起こすと思われる。したがって得られた細胞株は、医薬用FXの商業的製造には適さないことが示された。
リコンビナントヒト第X因子を産生する安定な細胞株の確立
FXコード配列は、ヒト肝臓cDNAから以下のプライマー:
F10F1: 5’-CACACCATGGGGCGCCCACT-3’ (配列番号:2)
F10R1: 5’-GAGTGGGATCTCACTTTAATGGA-3’ (配列番号:3)
を用いてPCR増幅した。
VR1: 5’-GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT-3’ (配列番号:5)
を用いてPCR増幅した。
Glutamax Iおよび9%の加熱処理したFBSを含有するDMEM F12培地中で成長させた。CHO−Sへの形質移入は、本質的にはInvitrogenにより推奨されているように、Pvul消化(直線化)したF10nopA、SspI消化したVKORzero、およびリポフェクタミン2000にて行った。DNA形質移入混合物は、VKORzeroに比して1.6倍過剰モルのF10nopAを含有していた。形質移入後その日に形質移入した細胞を96ウェルプレートに、選択培地;成長培地 + 400μg/ml G418中に播種した。したがってVKORzeroコンストラクトは選択しなかったが、G418耐性形質移入体にランダムに組み込まれた。その後プレートを検査して、1ウェル当たり適切な数のクローン(5−10)が得られたことを確認した。形質移入後6日に選択培地を、ビタミンK(1μg/ml)を補充した成長培地に交換した。その翌日プレートからサンプリングし、FXをFXaに活性化するRussels’ Viper Venom(RVV−X)に基づいたアッセイを用いて、FX活性についてアッセイした。次にFXa活性を、発色基質(S2765, Chromogenix, Molndal, Sweden)を用いて測定した。RVV−Xアッセイは、同じ目的のためにHimmelspachらの使用したアッセイと均等である。最も高い活性を有するウェルを同定し、含有するクローンを拡大(expand)し、限界希釈クローニングを行った。限界希釈クローニングおよび最適クローンの選択の後、選ばれたクローンを拡大し、タンパク質不含培地(Invitrogenにより推奨されているように1μg/ml ビタミンKを加えて補充したCD−CHO)中での成長に移行させた。リコンビナントFXの生産性は、Tフラスコ培養から見積もった。VKORの発現は、リアルタイムPCR分析によりアッセイした。完全に活性なFXを発現する選択されたすべてのクローンは、VKORもまた発現することが見出された。このことから、VKORの共発現は完全に活性なヒト凝固因子Xの発現を改善すると結論した。得られた細胞株は、タンパク質および動物成分の不含培地中で十分に成長し、抗生物質の選択というプレッシャーなしにFXを産生する。それ故得られた細胞株は、ラージスケールのタンパク質の製造に適すると考えられ、大量の活性なFXを製造する能力がある。完全に活性なFXの占有率もまた、これまでに報告されたものより有意に高い。
〔実施例2〕
FX、VKORおよびGGCXの共発現に関する生産性およびmRNA比の分析
実施例1で得られたクローンを、抗生物質を含まないタンパク質不含の化学的に定義されたCHO培地(Invitrogen)中のTフラスコ内で成長させた。サンプルは、cDNAの調製用に培養4日から採集し、そして生産性の見積り用のサンプルは、ルーチンの分割後培養5日から採集した。コントロールサンプルもまた、同じ培地中で成長させた形質移入していない親CHO−S細胞株から調製し、コントロールサンプルの分析から予想される結果を得た。撹拌(スピナー)培養により、動物成分不含添加物を補充したまたは補充しないCD−CHO中で成長させた。活性なrhFXの量は、実施例1におけるようにRVV−Xに基づいたアッセイにより、精製した血漿由来ヒト第X因子を連続希釈したものをスタンダードとして見積もった(Haematologic Technologies Inc., Vermont, USA)。RNAは、販売元のInvitrogenより供給されたプロトコルに従って、Trizol(登録商標)を用いて単離した。単離したRNAを、AmbionからのDNA-free(登録商標)キットを用いてDNaseI処理した。cDNAの合成は、RT−PCR用のSuperscript(登録商標)First-Strand Synthesis System (Invitrogen)からのヘキサマープライマーおよびキットの内容物を用いて行った。リアルタイムRT−PCR用のプライマーおよびVic標識プローブは、Applied Biosystems からのソフトウェアPrimer Express(登録商標)を用いて選択した。
5´ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3´ フォワードプライマー (配列番号:8)
5´AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3´ リバースプライマー (配列番号:9)
5´CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3´ プローブ (配列番号:10)
[ヒト第X因子オリゴヌクレオチド]
プライマーはOperon/Qiagen により製造し、プローブはApplied Biosystemsに発注した。
5´CCGCAACAGCTGCAAGCT-3´ フォワードプライマー (配列番号:11)
5´TGTCGTAGCCGGCACAGA-3´ リバースプライマー (配列番号:12)
5´ CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG プローブ (配列番号:13)
[ヒトVKORオリゴヌクレオチド]
5´GCTGGGCCTCTGTCCTGAT-3´ フォワードプライマー (配列番号:14)
5´ ATCCAGGCCAGGTAGACAGAAC-3´ リバースプライマー (配列番号:15)
5´CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCG プローブ (配列番号:16)
げっ歯類GAPDHコントロールプライマーおよびプローブもまた使用した(Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan(登録商標) Rodent GAPDH Control Reagents Protocol)−単位複製配列の長さ177bp。リアルタイムRT−PCR反応は、Applied Biosystems の7500 Real Time PCR Systemにて行った。増幅されたPCR産物の予想される長さを、アガロースゲルで確認した。
総rhFXの濃度の見積りのためのBiacoreアッセイ
BIAcore3000(登録商標)分析システム、ランニングバッファー(10mM HEPES、0.15M NaCl、3.4mM EDTAおよび0.05% P20、pH7.4)0.15M NaCl中のウサギ抗マウスFc(RAM Fc、ロット番号610)、およびCM5センサーチップは、Biacore AB (Uppsala, Sweden)より購入した。本方法は、5μl/分、25℃で通過させた。25℃での標準化されたアミンカップリング法(35μl活性化時間)を用いて、CM5チップのチャネル4に11000RUのキャプチャリング(capturing)用抗体RAM Fc(35μl、30μg/ml 10mM 酢酸ナトリウム中、pH5.0)を共有結合によりカップルさせた。固定化後、表面を5μlの10mMグリシンバッファー pH1.8で再生し、さらにランニングバッファーで平衡化した。マウス抗FXモノクローナルIgG抗体 N77121M(Biodesign, Maine, USA)(ランニングバッファー中に1/100希釈)を20μl流して、660RUをキャプチャリングさせた。培地中のFXの結合は、解離を無視できる非常に安定な複合体が得られた。新規FXサンプル毎に、複数回のサンドイッチ実験用にRAM Fc表面を再現性よく再生した。カップルしたRAM Fcを有するチャネル4、およびクリーンな表面のチャネル3との間のRU差を用いて、5μlのFXの結合を定量した。Haematologic Technologies Inc. (Vermont, USA) からのpdFXのスタンダード(2、4、6、8、10、15および20μg/ml 培地中)を通過させ、RUの差異をphFXの濃度に対してプロットし、1結合部位に関する式をデータに当てはめた。未知のサンプルのRU差を使用して、標準曲線からrhFXの濃度を算出した。
〔実施例3〕
ヒトプロトロンビン、GGCX、およびVKORの共発現
高レベルの完全に活性なヒトプロトロンビン(hFII)を産生する能力のある細胞株を得るため、筆者らはより早期に、ビタミンK依存性修飾酵素であるγ−グルタミルカルボキシラーゼ(GGCX)およびhFIIの共発現を行った。この戦略を用いて筆者らはP1E2クローンを得た。P1E2は、rhFIIを発現する高度に生産的なクローンであるが、正しく修飾されたrhFIIの発現は、他のFII産生クローンに比較して大きく改善されているものの、産生されたこのrhFIIの総量のわずか20−60%(培養条件に依存する)が、完全にγ−カルボキシル化されているに過ぎない。完全にγ−カルボキシル化されたrhFIIのレベル、およびこれ故rhFIIのより低い製造コストをさらに改善する試みにおいて、ビタミンKエポキシド還元酵素(VKOR)を用いる、新規発現戦略を検討した。2つの異なるプロモーターのコントロール下での2つの異なるベクター(pHygoベクターにおいてはpCMV、およびpZeoベクターにおいてはpSV40)中に、VKORをクローン化した。CHO細胞において、pCMVプロモーターはpSV40プロモーターより〜6倍高いプロモーター活性を有すると見積もられている。rhFII産生細胞株を得るため、双方のコンストラクトを2つの別個の同時形質移入において使用した。
細胞株の開発および生産性の見積り
細胞株の開発は、PP6コンストラクト(hFIIおよびhGGCXをコードする)(配列番号:20)、およびVKORコンストラクト(図1−2)のいずれかを用いて、CHO−Sに同時形質移入することにより開始した。形質移入に使用したモル比は2:3(PP6:VKOR)であった。播種および96ウェルプレートにおける形質移入体の選択の後、1つの形質移入当たり総計5500−8500のクローンを、発色アッセイに基づいたエカリンを使用してスクリーニングした。最初のスクリーニングの後、18クローンのプールを選択した。第2のスクリーニング後、9クローンのプールを選択し、拡大して第3のスクリーニングアッセイを行った。各形質移入について、最良の産生クローンのプールを限界希釈用に選択した。6枚の96ウェルプレートに、0.5細胞/ウェルにて播種した。24クローンを選択し、スクリーニング後スケールを拡大(upscale)した。VKORをコードするベクターを選択しなかったので、VKOR発現を評価するためTaqman分析を行った。選択した3つの最良のクローン:A3F4(PP6/pZeoVKOR)、B11E8およびB9A12(PP6/pHygroVKOR)において、VKOR mRNAが検出された。4回のスピナーでの実験を行って、P1E2クローンと比較してのPP6/VKORクローンに関するrhFIIの生産性を評価および比較した。
〔実施例4〕
VKORを用いてのスーパー形質移入(supertransfection)により改善されたγ−カルボキシル化
rhFII産生の改善のためVKORを使用する第2の試みにおいて、P1E2クローン(実施例3)をVKORと共発現するように修飾した。このケースにおいてはpHygroVKOコンストラクト(配列番号:22)を使用して、P1E2(添付の図1を参照のこと)に形質移入し、プロトロンビン活性アッセイにより改善された生産性について、クローンをスクリーニングした。総計7000−8000クローンを、96ウェルフォーマットに適合させたエンドポイントのプロトロンビナーゼアッセイを使用してスクリーニングした。16クローンのプールを最初のスクリーニング後に選択した。選択したクローンのプールを拡大し、活性なrhFIIの占有率を見積もるため、エカリンアッセイおよびプロトロンビナーゼアッセイの双方によりスクリーニングした。このスクリーニングの後、6クローンのプールを選択し、拡大した。3つの最良の産生クローンのプールを、限界希釈クローニング用に選択した。3つのすべてのプールに由来する28クローンを選択し、最初のプロトロンビナーゼスクリーニング後スケールを拡大した。第2のスクリーニング後、8クローンを選択し、スケールを拡大した。Taqmanアッセイを行い、各クローンのプールからの1つのクローンにおけるVKOR発現を検証した。すべての中で、3つの最良のクローン;M3F6、P4A4、およびO3G3を選択し、VKORmRNAを検出した。震盪培養または撹拌培養を3回行い、親P1E2クローンと比較してのP1E2/VKORクローンについてrhFIIの生産性を評価した。
〔実施例5〕
至適mRNA発現比率の確立
実施例4および5の細胞株から調製したメッセンジャーRNAを、実施例3と同様にリアルタイムPCRにより分析した。GGCXおよびVKORに関して、実施例3と同じオリゴヌクレオチドを使用した。
5´TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3´ フォワードプライマー (配列番号:17)
5´ CATCCGAGCCCTCCACAA 3´ リバースプライマー (配列番号:18)
5´ CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3´ プローブ (配列番号:19)
〔配列表〕
配列番号1
VKOR CDS
//ATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCTGGCTGGGTGCGGCTCGCTCTTTGCCTGACGGGCTTAGTGCTCTCGCTCTACGCGCTGCACGTGAAGGCGGCGCGCGCCCGGGACCGGGATTACCGCGCGCTCTGCGACGTGGGCACCGCCATCAGCTGTTCGCGCGTCTTCTCCTCCAGGTGGGGCAGGGGTTTCGGGCTGGTGGAGCATGTGCTGGGACAGGACAGCATCCTCAATCAATCCAACAGCATATTCGGTTGCATCTTCTACACACTACAGCTATTGTTAGGTTGCCTGCGGACACGCTGGGCCTCTGTCCTGATGCTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCGCTGGTTCTGTCTACCTGGCCTGGATCCTGTTCTTCGTGCTCTATGATTTCTGCATTGTTTGTATCACCACCTATGCTATCAACGTGAGCCTGATGTGGCTCAGTTTCCGGAAGGTCCAAGAACCCCAGGGCAAGGCTAAGAGGCACTGA//
配列番号2
CACACCATGGGGCGCCCACT
配列番号3
GAGTGGGATCTCACTTTAATGGA
配列番号4
CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA
配列番号5
GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT
配列番号6
F10nopA constructの配列
//gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattctgcagatcacaccatggggcgcccactgcacctcgtcctgctcagtgcctccctggctggcctcctgctgctcggggaaagtctgttcatccgcagggagcaggccaacaacatcctggcgagggtcacgagggccaattcctttcttgaagagatgaagaaaggacacctcgaaagagagtgcatggaagagacctgctcatacgaagaggcccgcgaggtctttgaggacagcgacaagacgaatgaattctggaataaatacaaagatggcgaccagtgtgagaccagtccttgccagaaccagggcaaatgtaaagacggcctcggggaatacacctgcacctgtttagaaggattcgaaggcaaaaactgtgaattattcacacggaagctctgcagcctggacaacggggactgtgaccagttctgccacgaggaacagaactctgtggtgtgctcctgcgcccgcgggtacaccctggctgacaacggcaaggcctgcattcccacagggccctacccctgtgggaaacagaccctggaacgcaggaagaggtcagtggcccaggccaccagcagcagcggggaggcccctgacagcatcacatggaagccatatgatgcagccgacctggaccccaccgagaaccccttcgacctgcttgacttcaaccagacgcagcctgagaggggcgacaacaacctcaccaggatcgtggggggccaggaatgcaaggacggggagtgtccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaaccattctgagcgagttctacatcctaacggcagcccactgtctctaccaagccaagagattcaaggtgagggtaggggaccggaacacggagcaggaggagggcggtgaggcggtgcacgaggtggaggtggtcatcaagcacaaccggttcacaaaggagacctatgacttcgacatcgccgtgctccggctcaagacccccatcaccttccgcatgaacgtggcgcctgcctgcctccccgagcgtgactgggccgagtccacgctgatgacgcagaagacggggattgtgagcggcttcgggcgcacccacgagaagggccggcagtccaccaggctcaagatgctggaggtgccctacgtggaccgcaacagctgcaagctgtccagcagcttcatcatcacccagaacatgttctgtgccggctacgacaccaagcaggaggatgcctgccagggggacagcgggggcccgcacgtcacccgcttcaaggacacctacttcgtgacaggcatcgtcagctggggagagggctgtgcccgtaaggggaagtacgggatctacaccaaggtcaccgccttcctcaagtggatcgacaggtccatgaaaaccaggggcttgcccaaggccaagagccatgccccggaggtcataacgtcctctccattaaagtgagatcccactcatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcaccttcgaccccaaaaaacttgattagggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgccctttccgcagagcaatggcggtgtctgccgggtccgcgcggacctcgcccagctcagataaagtacagaaagacaaggctgaactgatctcagggcccaggcaggacagccgaatagggaaactcttgggttttgagtggacagatttgtccagttggcggaggctggtgaccctgctgaatcgaccaacggaccctgcaagcttagctgtctttcgttttctttttgggttcttgatggtgctagacattccccaggagcgggggctcagctctctggaccggaaataccttgatgggctggatgtgtgccgcttccccttgctggatgccctacgcccactgccacttgactggatgtatcttgtctacaccatcatgtttctgggggcactgggcatgatgctgggcctgtgctaccggataagctgtgtgttattcctgctgccatactggtatgtgtttctcctggacaagacatcatggaacaaccactcctatctgtatgggttgttggcctttcagctaacattcatggatgcaaaccactactggtctgtggacggtctgctgaatgcccataggaggaatgcccacgtgcccctttggaactatgcagtgctccgtggccagatcttcattgtgtacttcattgcgggtgtgaaaaagctggatgcagactgggttgaaggctattccatggaatatttgtcccggcactggctcttcagtcccttcaaactgctgttgtctgaggagctgactagcctgctggtcgtgcactggggtgggctgctgcttgacctctcagctggtttcctgctcttttttgatgtctcaagatccattggcctgttctttgtgtcctacttccactgcatgaattcccagcttttcagcattggtatgttctcctacgtcatgctggccagcagccctctcttctgctcccctgagtggcctcggaagctggtgtcctactgcccccgaaggttgcaacaactgttgcccctcaaggcagcccctcagcccagtgtttcctgtgtgtataagaggagccggggcaaaagtggccagaagccagggctgcgccatcagctgggagctgccttcaccctgctctacctcctggagcagctattcctgccctattctcattttctcacccagggctataacaactggacaaatgggctgtatggctattcctgggacatgatggtgcactcccgctcccaccagcacgtgaagatcacctaccgtgatggccgcactggcgaactgggctaccttaaccctggggtatttacacagagtcggcgatggaaggatcatgcagacatgctgaagcaatatgccacttgcctgagccgcctgcttcccaagtataatgtcactgagccccagatctactttgatatttgggtctccatcaatgaccgcttccagcagaggatttttgaccctcgtgtggacatcgtgcaggccgcttggtcaccctttcagcgcacat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配列番号7
VKOR zeo constructの配列
//ggatcgatccggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgcccttcaccatgggcagcacctgggggagccctggctgggtgcggctcgctctttgcctgacgggcttagtgctctcgctctacgcgctgcacgtgaaggcggcgcgcgcccgggaccgggattaccgcgcgctctgcgacgtgggcaccgccatcagctgttcgcgcgtcttctcctccaggtggggcaggggtttcgggctggtggagcatgtgctgggacaggacagcatcctcaatcaatccaacagcatattcggttgcatcttctacacactacagctattgttaggttgcctgcggacacgctgggcctctgtcctgatgctgctgagctccctggtgtctctcgctggttctgtctacctggcctggatcctgttcttcgtgctctatgatttctgcattgtttgtatcaccacctatgctatcaacgtgagcctgatgtggctcagtttccggaaggtccaagaaccccagggcaaggctaagaggcactgaacaagggcaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagcatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttccattcgccattcaggctgaactagatctagagtccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacggaccgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacactcgacctcgaaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtct//
配列番号8
ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT
配列番号9
AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT
配列番号10
CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC
配列番号11
CCGCAACAGCTGCAAGCT
配列番号12
TGTCGTAGCCGGCACAGA
配列番号13
CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG
配列番号14
GCTGGGCCTCTGTCCTGAT
配列番号15
ATCCAGGCCAGGTAGACAGAAC
配列番号16
CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCG
配列番号17
TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA
配列番号18
CATCCGAGCCCTCCACAA
配列番号19
CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC
配列番号20
PP6:
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配列番号21
PN32:
//gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgcccttattcctcagtgacccaggagctgacacactatggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagccagcatgtgttcctggctcctcagcaagcacggtcgctgctccagcgggtccggcgagccaacaccttcttggaggaggtgcgcaagggcaacctggagcgagagtgcgtggaggagacgtgcagctacgaggaggccttcgaggctctggagtcctccacggctacggatgtgttctgggccaagtacacagcttgtgagacagcgaggacgcctcgagataagcttgctgcatgtctggaaggtaactgtgctgagggtctgggtacgaactaccgagggcatgtgaacatcacccggtcaggcattgagtgccagctatggaggagtcgctacccacataagcctgaaatcaactccactacccatcctggggccgacctacaggagaatttctgccgcaaccccgacagcagcaccacgggaccctggtgctacactacagaccccaccgtgaggaggcaggaatgcagcatccctgtctgtggccaggatcaagtcactgtagcgatgactccacgctccgaaggctccagtgtgaatctgtcacctccattggagcagtgtgtccctgatcgggggcagcagtaccaggggcgcctggcggtgaccacacatgggctcccctgcctggcctgggccagcgcacaggccaaggccctgagcaagcaccaggacttcaactcagctgtgcagctggtggagaacttctgccgcaacccagacggggatgaggagggcgtgtggtgctatgtggccgggaagcctggcgactttgggtactgcgacctcaactattgtgaggaggccgtggaggaggagacaggagatgggctggatgaggactcagacagggccatcgaagggcgtaccgccaccagtgagtaccagactttcttcaatccgaggacctttggctcgggagaggcagactgtgggctgcgacctctgttcgagaagaagtcgctggaggacaaaaccgaaagagagctcctggaatcctacatcgacgggcgcattgtggagggctcggatgcagagatcggcatgtcaccttggcaggtgatgcttttccggaagagtccccaggagctgctgtgtggggccagcctcatcagtgaccgctgggtcctcaccgccgcccactgcctcctgtacccgccctgggacaagaacttcaccgagaatgaccttctggtgcgcattggcaagcactcccgcaccaggtacgagcgaaacattgaaaagatatccatgttggaaaagatctacatccaccccaggtacaactggcgggagaacctggaccgggacattgccctgatgaagctgaagaagcctgttgccttcagtgactacattcaccctgtgtgtctgcccgacagggagacggcagccagcttgctccaggctggatacaaggggcgggtgacaggctggggcaacctgaaggagacgtggacagccaacgttggtaaggggcagcccagtgtcctgcaggtggtgaacctgcccattgtggagcggccggtctgcaaggactccacccggatccgcatcactgacaacatgttctgtgctggttacaagcctgatgaagggaaacgaggggatgcctgtgaaggtgacagtgggggaccctttgtcatgaagagcccctttaacaaccgctggtatcaaatgggcatcgtctcatggggtgaaggctgtgaccgggatgggaaatatggcttctacacacatgtgttccgcctgaagaagtggatacagaaggtcattgatcagtttggagagtagaagggcaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcaccttcgaccccaaaaaacttgattagggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgccctttccgcagagcaatggcggtgtctgccgggtccgcgcggacctcgcccagctcagataaagtacagaaagacaaggctgaactgatctcagggcccaggcaggacagccgaatagggaaactcttgggttttgagtggacagatttgtccagttggcggaggctggtgaccctgctgaatcgaccaacggaccctgcaagcttagctgtctttcgttttctttttgggttcttgatggtgctagacattccccaggagcgggggctcagctctctggaccggaaataccttgatgggctggatgtgtgccgcttccccttgctggatgccctacgcccactgccacttgactggatgtatcttgtctacaccatcatgtttctgggggcactgggcatgatgctgggcctgtgctaccggataagctgtgtgttattcctgctgccatactggtatgtgtttctcctggacaagacatcatggaacaaccactcctatctgtatgggttgttggcctttcagctaacattcatggatgcaaaccactactggtctgtggacggtctgctgaatgcccataggaggaatgcccacgtgcccctttggaactatgcagtgctccgtggccagatcttcattgtgtacttcattgcgggtgtgaaaaagctggatgcagactgggttgaaggctattccatggaatatttgtcccggcactggctcttcagtcccttcaaactgctgttgtctgaggagctgactagcctgctggtcgtgcactggggtgggctgctgcttgacctctcagctggtttcctgctcttttttgatgtctcaagatccattggcctgttctttgtgtcctacttccactgcatgaattcccagcttttcagcattggtatgttctcctacgtcatgctggccagcagccctctcttctgctcccctgagtggcctcggaagctggtgtcctactgcccccgaaggttgcaacaactgttgcccctcaaggcagcccctcagcccagtgtttcctgtgtgtataagaggagccggggcaaaagtggccagaagc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配列番号22
VKORhygro:
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Claims (22)
- ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、ならびにビタミンKエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、を包含するホスト細胞であって、
ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第1のプロモーターを包含し、そしてビタミンKエポキシド還元酵素をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第2のプロモーターを包含し、
第1のプロモーターが第2のプロモーターより十分に強く、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とビタミンKエポキシド還元酵素遺伝子が、mRNA比で少なくとも5:1の比率で発現され、
ここでホスト細胞が、γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列をさらに包含し、
ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号6であり、ビタミンKエポキシド還元酵素をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号7であるか;または、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号20であり、ビタミンKエポキシド還元酵素をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号7または配列番号22であり;そしてホスト細胞がCHO細胞である、前記ホスト細胞。 - 第1のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス(hCMV)即時型初期プロモーターであり、第2のプロモーターがSV40初期プロモーターである、請求項1に記載のホスト細胞。
- γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列が、さらに第3のプロモーターを包含し、第1のプロモーターが第3のプロモーターより十分に強く、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とγ−グルタミルカルボキシラーゼ遺伝子が、mRNA比で少なくとも5:1の比率で発現される、請求項1または2に記載のホスト細胞。
- 第3のプロモーターがSV40初期プロモーターである、請求項3に記載のホスト細胞。
- ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする前記核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子が、1つの発現ベクター内に位置する、請求項1〜4のいずれかに記載のホスト細胞。
- (i)ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質、(ii)ビタミンKエポキシド還元酵素、および(iii)γ−グルタミルカルボキシラーゼを発現するように操作されている細胞であって、ここでタンパク質(i)の発現を制御するプロモーターが、タンパク質(ii)の発現を制御するプロモーターより十分に強く、タンパク質(i)と(ii)をコードする遺伝子がmRNA比で少なくとも5:1の間の比率で発現される、前記細胞。
- ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が、以下:凝固因子VII、凝固因子IX、凝固因子II、凝固因子X、第X因子様蛇毒プロテアーゼ、プロテインC、プロテインS、およびプロテインZから成る群より選択される、請求項6に記載の細胞。
- ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質がビタミンK依存性の凝固因子である、請求項7に記載の細胞。
- ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が第IX因子である、請求項8に記載の細胞。
- ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が第X因子である、請求項8に記載の細胞。
- ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が第X因子様蛇毒プロテアーゼである、請求項8に記載の細胞。
- ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が凝固因子IIである、請求項8に記載の細胞。
- ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が第VII因子である、請求項8に記載の細胞。
- 細胞が哺乳類細胞である、請求項7〜13のいずれか1項に記載の細胞。
- 遺伝的に改変された真核ホスト細胞であって、以下:
(i)ビタミンKエポキシド還元酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで前記ビタミンKエポキシド還元酵素タンパク質をコードする配列が、前記細胞によるビタミンKエポキシド還元酵素タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に、作動可能なように連結されている前記ポリヌクレオチド;
(ii)γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に作動可能なように連結されている前記ポリヌクレオチド;および
(iii)ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
を包含し、
ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とビタミンKエポキシド還元酵素遺伝子を、mRNA比で少なくとも5:1の比率で発現する能力があり、
ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号6であり、ビタミンKエポキシド還元酵素をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号7であるか;または、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号20であり、ビタミンKエポキシド還元酵素をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号7または配列番号22であり;そして
ホスト細胞がCHO細胞である、前記ホスト細胞。 - γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列をさらに包含する、請求項15に記載の遺伝的に改変された真核ホスト細胞。
- ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、およびビタミンKエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、を包含するベクター、並びに、γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含するベクター、を含むベクターのセットであって、
ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第1のプロモーターを包含し、そしてビタミンKエポキシド還元酵素をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第2のプロモーターを包含し、
第1のプロモーターが第2のプロモーターより十分に強く、宿主細胞に導入した際にガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とビタミンKエポキシド還元酵素遺伝子が、mRNA比で少なくとも5:1の比率で発現される、前記ベクターのセット。 - ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、ビタミンKエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、並びにγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含するベクターであって、
ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第1のプロモーターを包含し、そしてビタミンKエポキシド還元酵素をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第2のプロモーターを包含し、
第1のプロモーターが第2のプロモーターより十分に強く、宿主細胞に導入した際にガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とビタミンKエポキシド還元酵素遺伝子が、mRNA比で少なくとも5:1の比率で発現される、前記ベクター。 - 第1のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス(hCMV)即時型初期プロモーターであり、第2のプロモーターがSV40初期プロモーターである、請求項17に記載のベクターのセット又は請求項18に記載のベクター。
- ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が、以下:凝固因子VII、凝固因子IX、凝固因子II、凝固因子X、第X因子様蛇毒プロテアーゼ、プロテインC、プロテインS、およびプロテインZから成る群より選択される、請求項17から19のいずれか1項に記載のベクターのセットまたはベクター。
- 以下:
(i)請求項1に記載された細胞を培養すること、ここで、前記細胞は、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子およびビタミンKエポキシド還元酵素遺伝子を、mRNA比で少なくとも5:1の比率で発現する、および
(ii)ガンマ−カルボキシル化タンパク質を単離すること、
を包含するガンマ−カルボキシル化タンパク質を製造するための方法。 - 請求項21に記載の方法に従って活性なカルボキシル化タンパク質を製造、精製し、そして精製されたカルボキシル化タンパク質を、1つまたはそれより多くの医薬的に受容可能な担体または賦形剤と共に混合する工程を包含する、血液凝固を誘発する、または血液凝固を増大させるために適する医薬組成物を製造する方法。
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