JP5459399B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置に関する。
本願は、２０１０年６月３日に出願された日本特許出願２０１０−１２７９０６号に基づき優先権を主張しその内容をここに援用する。

従来から、超解像顕微鏡として、ＳＴＯＲＭ（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている（例えば特許文献１、２参照）。この顕微鏡では、観察試料として、蛍光物質又は蛍光物質を付着させたものが用いられる。この蛍光物質は、所定波長の活性化光を照射すると活性化し、後に活性化光とは異なる波長の励起光を照射すると蛍光を発して不活性化する特性を有する。観察試料に対して微弱な活性化光を照射することで低密度で蛍光物質が活性化する。その後に励起光を照射して活性化状態の蛍光物質のみを発光させることで蛍光画像を取得する。このようにして取得した蛍光画像では、低密度で発光する蛍光物質の像が個々に分離されたものとなるため、個々の像の重心位置を求めることができる。このような蛍光物質の位置を求めるステップを複数回、例えば数百回〜数万回以上繰り返し、蛍光物質の全ての像を各々の位置に配置した一枚の画像を作成することにより、高分解能の観察画像を得ることができる。

また、超解像顕微鏡装置として、試料面（ＸＹ平面）内での分解能だけではなく、試料の厚み方向（Ｚ方向）の分解能も向上させることが可能となる三次元方式のＳＴＯＲＭが知られている（例えば、非特許文献参照）。このような三次元方式のＳＴＯＲＭでは、結像光学系にシリンドリカルレンズを挿入して試料の像に所定の非点隔差を与えることで、蛍光物質の像を楕円形状とし、その楕円率からＺ方向の座標を求めることができる。

米国特許出願公開第２００８／００３２４１４号 米国特許出願公開第２００８／０１８２３３６号

Bo Huang,et.al.Science 319,810-813(2008)

しかしながら、上記三次元方式のＳＴＯＲＭでは、試料の画像取得条件に応じて対物レンズの倍率や開口数を変更すると、Ｚ位置の座標を良好に測定することができなくなる可能性がある。

本発明は、高分解能の観察画像を得ることができる顕微鏡装置を提供することを目的とする。

本発明の態様に従えば、倍率が互いに異なる複数の対物レンズと、蛍光物質を含む試料から発せられた光を前記対物レンズを介して受けるとともに、非点隔差が付与された前記試料の像を供給する結像系と、前記結像系からの前記試料の像を撮像する撮像装置と、を備え、前記結像系は、前記対物レンズの焦点深度に応じて前記非点隔差を変更する非点隔差変更装置を含む顕微鏡装置が提供される。

本発明の態様によれば、標本の画像取得条件に応じて非点隔差を最適化できる。

第一実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図。 本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図。 顕微鏡装置の結像光学系の概略構成を示す図。 １個の蛍光物質が撮像装置上に形成する像の形状を示す図。 蛍光物質のＺ座標と像のＸ，Ｙ方向各々の幅との関係を示すグラフ。 対物レンズの倍率及びシリンドリカルレンズの焦点距離と非点隔差との関係を示す図。 対物レンズの倍率及びシリンドリカルレンズの焦点距離と非点隔差との関係を示す図。 第ニ実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図。 本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図。 第三実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図。 本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図。 シリンドリカルレンズユニットを回転軸方向から視た構成を示す図。 各シリンドリカルレンズの位置関係を示す図。 各シリンドリカルレンズの位置関係を示す図。 第四実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの概略構成を示す図。

以下、図面を参照して本発明の顕微鏡装置の一実施形態に係る構成について説明する。なお、本実施形態は、発明の要旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。また、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各要請要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。

（第一実施形態）
図１は本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図である。顕微鏡装置１００は、図１に示されるように、照明系１０と、試料８を載置するステージ１２３と、ステージ１２３上の試料８に対向配置される対物レンズユニット１２Ａと、結像光学系（結像系）７と、結像光学系７により結像された試料８の像を撮像する撮像装置１４と、リレー光学系１５と、顕微鏡装置１００を総合的に制御する制御部２５と、を備えている。

本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、二次元方式或いは三次元方式に対応したＳＴＯＲＭ（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）である。顕微鏡装置１００では、蛍光物質を標識として付与された試料を用いる。この蛍光物質は、所定波長の活性化光を照射されると活性化する。また、この蛍光物質は、活性化状態で活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発して不活性化する。そして、励起光と活性光とを用いて試料中の一部の蛍光物質のみを発光させることで離散的に分布した蛍光を観察する動作を繰り返す。これにより取得した多数の蛍光画像を用いて試料画像を形成することができる。なお、蛍光物質はＣｙ５やＡｌｅｘａ６４７などの有機化合物を含むことができる。また、蛍光物質は、ＰＡ−ＧＦＰなどの蛍光タンパク質を含むことができる。

照明系１０は、レーザ台４０と、ファイバ９と、レンズ２，３と、エキサイタフィルター４と、を含む。レーザ台４０は、第１のレーザ光源４１ａと、第２のレーザ光源４１ｂとを有する。第１のレーザ光源４１ａは、試料に付与した蛍光物質を活性化するための活性化光Ｌ１を照射するものである。第１のレーザ光源４１ａは、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の活性化光Ｌ１を射出する。第１のレーザ光源４１ａとして、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などを用いることができる。

第２のレーザ光源４１ｂは、試料に付与した蛍光物質を発光させるための励起光Ｌ２を照射するものである。第２のレーザ光源４１ｂは、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の励起光Ｌ２を射出する。第２のレーザ光源４１ｂとして、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などを用いることができる。レーザ台４０は、レーザ光源４１ａ、４１ｂ各々の前に配置されたシャッター４２ａ、４２ｂと、レーザ光源４１ｂからの光Ｌ２を反射するミラー４３と、レーザ光源４１ａからの光Ｌ１は透過し、レーザ光源４１ｂからの光Ｌ２は反射するダイクロイックミラー４４と、入射したレーザ光の強度を調整する音響光学素子４５と、レーザ光をファイバ９の入射端に集光するためのカプラー４６と、を有する。なお、レーザ台４０には制御部２５が接続されている。制御部２５はシャッター４２ａおよびシャッター４２ｂの開閉を制御し、活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２の照射を切り替えるようになっている。また、同時に、制御部２５は音響光学素子４５を制御し、ファイバに入射するレーザ光の強度を調整する。

照明系１０と対物レンズユニット１２Ａとの光路の間には、ダイクロイックミラー５が配置されている。対物レンズユニット１２Ａは、焦点深度の浅い低倍率対物レンズ１２ａと、焦点深度の深い高倍率対物レンズ１２ｂと、を含む。以下、説明の都合上、低倍率対物レンズ１２ａと高倍率対物レンズ１２ｂとを総称して対物レンズ１２と呼ぶこともある。照明系１０からの照明光は、ダイクロイックミラー５により反射されることで対物レンズ１２の瞳面に集光する。これにより、対物レンズ１２から射出された照明光が試料８を照明する。

上述のようにして制御部２５は、レーザ光源４１ａ、４１ｂから活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を試料８に照射する。試料８から発せられた光は対物レンズ１２に入射し、平行光となって射出される。その光は、ダイクロイックミラー５、バリアフィルター６を透過した後、結像光学系７に入射する。結像光学系７は、結像レンズ２０と、プリズム２１と、アフォーカル光学系を構成するレンズ２２，２３と、これらレンズ２２，２３間に設けられたシリンドリカルレンズユニット（非点隔差変更装置）５０と、を含む。

プリズム２１には制御部２５が接続されている。また、プリズム２１には不図示の進退機構が設けられており、プリズム２１が光路に対して出し入れ可能とされている。すなわち、プリズム２１は光路中に挿入された場合、対物レンズ１２からの光を反射して撮像装置１４へと導くようになっている。

リレー光学系１５は、結像レンズ２０の後方に、ミラー１１、レンズ１３、ミラー１６、レンズ１７，１８、ミラー１９を配置することで構成される。上記プリズム２１が光路から退避することで、試料８からの光はリレー光学系１５によってリレーされ、接眼レンズ３７を介して観察者（観察眼）３８により試料８の像として観察される。

具体的に、結像レンズ２０からの光はミラー１１によって反射された後、一次像２４ａを形成する。また、一次像２４ａからの光はレンズ１３を通過した後ミラー１６によって反射され、レンズ１７，１８を通過し、ミラー１９によって反射され、二次像２４ｂを形成する。観察者３８は、接眼レンズ３７を通して二次像２４ｂを目視観察することができる。なお、リレー光学系１５は、例えば観察者３８が試料８における画像取得領域を設定する初期設定時に使用されるものである。

本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、結像光学系７による試料８の像に後述する非点隔差を付与し、この像を撮像装置１４により撮像することで試料８の三次元情報を取得可能となっている。撮像装置１４は、例えばＣＣＤカメラ等の撮像素子により構成されるものである。撮像装置１４には制御部２５が接続されている。

本実施形態においては、結像光学系７による試料８の像に非点隔差を付与すべく、結像光学系７がレンズ２２、２３間に図２に示すシリンドリカルレンズユニット５０を備えている。シリンドリカルレンズユニット５０には制御部２５が接続されている。シリンドリカルレンズユニット５０は、図２に示されるようにシリンドリカルレンズ１０１，１０２と、これらシリンドリカルレンズ１０１，１０２をレンズ２２、２３間に進退させるスライダ部（進退部）１０５と、を備えている。スライダ部１０５は、レンズ２２、２３間にシリンドリカルレンズ１０１，１０２をスライド可能に保持するスライド板１０５ａと、該スライド板１０５ａをスライドさせる駆動部１０５ｂとを含む。駆動部１０５ｂには制御部２５が接続されている。

スライド板１０５ａには、シリンドリカルレンズ１０１，１０２の保持部１０１ａ，１０２ａと、開口部１０６とが設けられている。これら保持部１０１ａ，１０２ａおよび開口部１０６は、スライド板１０５ａのスライド方向（水平方向）に沿って配置されている。開口部１０６は、レンズ２２を通過した光を遮ることなく通過させる大きさに設定されている。シリンドリカルレンズ１０１，１０２は、保持部１０１ａ，１０２ａに嵌合されることでスライド板１０５ａに保持されている。なお、シリンドリカルレンズ１０１、１０２は、それぞれが異なる焦点距離を有している。具体的に、シリンドリカルレンズ１０２はシリンドリカルレンズ１０１よりも焦点距離が短く設定されている。

シリンドリカルレンズ１０１，１０２の各矢印Ａ，Ｂは各レンズの母線方向を示し、本実施例においては、例えば共にスライド板１０５ａのスライド方向と直交する鉛直方向に設定されている。これにより、シリンドリカルレンズ１０１，１０２のいずれを用いた場合であっても、撮像装置１４上に形成される試料８の像の楕円方向が変化するのを防止している。代替的に、シリンドリカルレンズ１０１，１０２は、その母線方向が共に水平方向（スライド板１０５ａのスライド方向）となるように配置できる。

シリンドリカルレンズユニット５０のこのような構成において、制御部２５が駆動部１０５ｂを駆動してスライド板１０５ａをスライドする。これに伴い、シリンドリカルレンズユニット５０は、結像光学系７の光路中に挿入するシリンドリカルレンズ１０１，１０２を切り替え可能である。これにより、顕微鏡装置１００は後述のように三次元方式にて試料８の画像を取得することが可能となっている。また、顕微鏡装置１００は、スライド板１０５ａを駆動することで結像光学系７内の光路中に開口部１０６を挿入可能となっており、二次元方式にて試料８の画像を取得することも可能となっている。

図３は、顕微鏡装置１００の結像光学系の概略構成図であり、具体的にはスライド板１０５ａによりシリンドリカルレンズ１０１が光路中に挿入された状態を示している。なお、説明を分かりやすくするため、照明装置９、結像レンズ２０、プリズム２１、およびレンズ２２，２３等については図示を省略している。また、説明の都合上、図３においてＸＹＺ座標系を設定し、適宜このＸＹＺ座標系を用いて説明を行う。ＸＹＺ座標系は、例えば、水平面に沿ってＸ軸及びＹ軸が設定され、鉛直方向に沿って上向きにＺ軸が設定される。なお、このＸＹＺ座標系は図３内においてのみ有効なものとする。

試料８からの光は対物レンズ１２に入射して平行光束となり、結像レンズ２０に入射する。図３に示す状態では、結像レンズ２０と撮像装置１４との間にシリンドリカルレンズ１０１が配置された場合について説明する。シリンドリカルレンズ１０１は、母線方向がＹ方向となるように配置されている。シリンドリカルレンズ１０１はＸ方向には屈折力を持つが、Ｙ方向（母線方向）には屈折力を持たない状態とされている。

図４は試料８の表面に存在する１個の蛍光物質が撮像装置１４上に形成する像の形状を示す図である。通常、結像光学系の分解能より小さい蛍光物質は撮像装置１４上に円形の像を形成する。本実施形態では、シリンドリカルレンズ１０１を含む結像光学系７を用いることで、像はそのＺ座標によってＸ方向の幅（Ｗｘ）、Ｙ方向の幅（Ｗｙ）がそれぞれ変化する。像が円形（Ｗｘ＝Ｗｙ）となる蛍光物質のＺ座標をＺ＝０とすると、Ｚ＞０のとき、像はＸ方向に長軸を持った楕円（Ｗｘ＞Ｗｙ）となり、また、Ｚ＜０のとき、像はＹ方向に長軸を持った楕円（Ｗｘ＜Ｗｙ）となる。すなわち、試料８に付与した１個の蛍光物質が撮像装置１４上に形成する像は、後述のようにＺ座標によって、Ｘ方向の幅とＹ方向の幅がそれぞれ変化する。

図５は蛍光物質のＺ座標（横軸）と像のＸ，Ｙ方向各々の幅（縦軸）との関係を示すグラフである。Ｘ，Ｙ方向の幅Ｗｘ、ＷｙはそれぞれＺ＜０、Ｚ＞０に極小値を持つ。換言すると、Ｗｘは、０未満の、あるＺ位置で極小となる。Ｗｙは、０を超える、あるＺ位置で極小となる。Ｚ＝０においてＷｘ＝Ｗｙとなる。Ｗｘ，Ｗｙがそれぞれ極小となるＺ座標の差Δが非点隔差である。換言すると、非点隔差は、Ｗｘが極小となるＺ位置と、Ｗｙが極小となるＺ位置との差である。

顕微鏡装置１００における試料８の画像観察方法は、レーザ台４０内の第１のレーザ光源４１ａから試料８に対してパワーの弱い活性化光Ｌ１を照射するステップと、レーザ台４０内のシャッター４２ａ、４２ｂ及び音響光学素子４５を切り替えて第２のレーザ光源９ｂから試料８にパワーの強い励起光Ｌ２を照射して蛍光画像を取得するステップと、このようにして測定した蛍光画像を保存するステップとを含み、これらステップを数百回から数万回繰り返すことにより行われる。

顕微鏡装置１００は、結像レンズ３と撮像装置１４との間にシリンドリカルレンズ１０１を配置した場合の像の変化率（Ｘ方向の幅とＹ方向の幅との比率；Ｗｙ／Ｗｘ）とＺ座標とを関連付けたデータでありかつ予め実験等により求められたデータを制御部２５に記憶している。顕微鏡装置１００において、試料８の表面に存在する蛍光物質の各々が撮像装置１４上に形成する像の形状を撮像したデータと、制御部２５内に記憶されているデータとを比較することで像（蛍光物質）のＺ座標を検出することが可能である。このように顕微鏡装置１００は非点隔差が付与された像を撮像装置１４で撮像し、各画像から蛍光物質の位置（Ｚ方向も含む）を求め、それらを一枚の画像中に配置する。したがって、顕微鏡装置１００を用いて三次元情報（Ｚ座標）を含む高解像度の試料８の画像を取得可能である。

ところで、上述の非点隔差は対物レンズの焦点深度に合わせて所定の量となるように調整する必要がある。図６Ａは対物レンズの焦点深度に対して非点隔差が比較的大きい場合の、ＺとＷｘ、Ｗｙの関係を示したグラフである。

対物レンズの焦点深度に対して非点隔差が比較的大きい場合には、図６Ａに示されるように、Ｚ＝０の位置からわずかにＺがずれただけでＷｘもしくはＷｙが非常に大きくなる。像が過度に大きくなると、撮像装置１４上における強度が下がり、Ｓ／Ｎが低下する。その結果、取得した画像から求められるＷｘ、Ｗｙの誤差が大きくなる傾向にあり、像のＺ座標を正しく求めることができない可能性がある。

一方、図６Ｂは対物レンズの焦点深度に対して非点隔差が比較的小さい場合の、ＺとＷｘ、Ｗｙの関係を示したグラフである。対物レンズの焦点深度に対して非点隔差が比較的小さい場合には、図６Ｂに示されるように、Ｚ＝０近辺における楕円率（Ｗｙ／Ｗｘ）の変化率が小さい。その結果、像から求めたＷｘ，Ｗｙに含まれるわずかに誤差が、Ｚ座標の算出結果では大きな誤差となる傾向にあり、像のＺ座標を正しく求めることができない可能性がある。

そこで、三次元方式の画像観察を行う場合、対物レンズ１２の焦点深度に合わせて適切な焦点距離のシリンドリカルレンズを使用することで、非点隔差を最適な範囲に調整することができる。

具体的には、非点隔差を対物レンズの焦点深度の２倍程度とすることが望ましい。対物レンズの開口数をＮＡ、対物レンズの標本側の面に接する媒質の屈折率をｎ、色素の蛍光波長をλとすると、焦点深度ＦＤは下記の式で表される。
FD＝（nλ）/（2NA^2） …（１）

一方、シリンドリカルレンズの焦点距離をｆ、シリンドリカルレンズから像面までの距離をｄとすると、シリンドリカルレンズによって生じる像側での非点隔差Δ’は下記の式で表される。
Δ’=（d^2）/（f+d） …（２）

また、対物レンズの倍率をβとすると、非点隔差を物体側に換算した値Δは下記の式で表される。
Δ=（nΔ’）/（β^2） …（３）

非点隔差を焦点深度の2倍とするためには、下記の条件式を満たせばよい。
Δ=2FD …（４）

式（１）〜（４）をfについて解くと、下記の式が得られる。
f=（d^2・NA^2） / （β^2・λ） …（５）

したがって、利用する対物レンズに合わせて、シリンドリカルレンズの焦点距離が式（５）を満たすように切り替えれば、適切な非点隔差が得られる。

例えば、倍率１００倍、ＮＡ１．４の対物レンズで蛍光波長５５０ｎｍの蛍光色素を観察する場合には、像面から５０ｍｍの位置に焦点距離841ｍｍのシリンドリカルレンズを配置すれば良い。また、倍率６０倍、ＮＡ１．４の対物レンズを用いる場合には、シリンドリカルレンズの焦点距離を２４２５ｍｍに切り替えればよい。また、倍率２０倍、ＮＡ０．７５の対物レンズを利用する場合には、シリンドリカルレンズの焦点距離を６３４２ｍｍに切り替えればよい。

本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、シリンドリカルレンズユニット５０が焦点深度の浅い対物レンズ１２ａに対応するシリンドリカルレンズ１０１と、焦点深度の深い対物レンズ１２ａに対応するシリンドリカルレンズ１０２とを含む。シリンドリカルレンズ１０１の焦点距離は、シリンドリカルレンズ１０２の焦点距離と異なる。すなわち、顕微鏡装置１００は、焦点距離が互いに異なる複数のシリンドリカルレンズ１０１，１０２を含み、使用される対物レンズ１２の焦点深度に合わせて適切な焦点距離のシリンドリカルレンズを選択するように構成されている。

顕微鏡装置１００において、低倍率対物レンズ１２ａを使用して三次元方式による画像取得を行う場合、制御部２５がシリンドリカルレンズユニット５０の駆動部１０５ｂを駆動し、スライド板１０５ａをスライドさせることで結像光学系７内の光路にシリンドリカルレンズ１０１を挿入する。一方、顕微鏡装置１００において、観察者３８によって高倍率対物レンズ１２ｂが選択されると、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット５０の駆動部１０５ｂを駆動し、スライド板１０５ａをスライドさせて結像光学系７からの光の光路にシリンドリカルレンズ１０２を挿入する。

以上のように顕微鏡装置１００において、画像取得条件に応じて対物レンズ１２の倍率、開口数が変更される。また、顕微鏡装置１００において、焦点深度が変化した場合でも、対物レンズ１２に対応して最適な焦点距離を有するシリンドリカルレンズ１０１，１０２のいずれか一方が選択される。したがって、所定範囲の非点隔差を設定することができ、三次元方式による試料８の画像観察を精度良く行うことができる。

また、顕微鏡装置１００において、観察者３８が二次元方式による画像取得を希望した場合、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット５０の駆動部１０５ｂを駆動し、スライド板１０５ａをスライドさせて結像光学系７からの光の光路に開口部１０６を挿入する。このとき、試料８からの光は開口部１０６を通過するため、シリンドリカルレンズを通過する場合のように楕円状に像が変形することがなく、撮像装置１４上において円形の像となる。これにより、顕微鏡装置１００において、撮像装置１４が撮像した円形の像に基づき、試料８の二次元画像を取得することができる。

また、上述の実施形態では、シリンドリカルレンズ１０１，１０２と対物レンズ１２との対応関係が二種類の場合について説明したが、三種類以上のシリンドリカルレンズ及び対物レンズを組み合わせる場合についても本発明は適用可能である。例えば、シリンドリカルレンズの種類の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上にできる。この場合、各シリンドリカルレンズは、対応付けられた対物レンズ１２と組み合わされた際に最適な非点隔差を設定可能な焦点距離を有している。

（第二実施形態）
次に、本発明の顕微鏡装置の第二実施形態について説明する。なお、本実施形態に係る構成と第一実施形態に係る構成とは、対物レンズユニット及びシリンドリカルレンズユニットの構成のみが異なる。そのため、以下の説明ではシリンドリカルレンズユニットの構成を主に説明し、第一実施形態と同じ構成及び部材については同一の符号を付し、その詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。

図７は本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図であり、図８は本実施形態におけるシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図である。
本実施形態においては、図７に示すように対物レンズユニット１１２Ａが、第１の対物レンズ１１２ａ、第２の対物レンズ１１２ｂ、第３の対物レンズ１１２ｃ、第４の対物レンズ１１２ｄ、および第５の対物レンズ１１２ｅを含んでいる。これら第１〜第５の対物レンズ１１２ａ〜１１２ｅは、この順に焦点深度が深く設定されている。すなわち、第１対物レンズ１１２ａの焦点深度が最も浅く、対物レンズ１１２ｅの焦点深度が最も深く設定されている。以下、説明の都合上、第１〜第５の対物レンズ１１２ａ〜１１２ｅを総称して対物レンズ１１２と呼ぶこともある。

本実施形態に係る顕微鏡装置２００において、図７に示すように、結像光学系７におけるレンズ２２、２３間にシリンドリカルレンズユニット１５０が設けられている。本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニット１５０は、図７，８に示すように複数のシリンドリカルレンズ２０１〜２０５と、これらシリンドリカルレンズ２０１〜２０５をレンズ２２、２３間に進退させるターレット部（進退部）２１５と、を備えている。ターレット部２１５は、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５を保持する円板部材２１５ａと、該円板部材２１５ａの中心を通る回転軸Ｊ周りに回転させることでレンズ２２、２３間にシリンドリカルレンズ２０１〜２０５の各々を進退可能とする回転駆動部２１５ｂと、を含む。

円板部材２１５ａには、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５の保持部２０１ａ〜２０５ａと、開口部２０６とが設けられている。これら保持部２０１ａ〜２０５ａおよび開口部２０６は、円板部材２１５ａの周方向（回転方向）に沿って配置されている。開口部２０６は、レンズ２２を通過した光を遮ることなく通過させる大きさに設定されている。シリンドリカルレンズ２０１〜２０５は、例えば保持部２０１ａ〜２０５ａに嵌合されることで円板部材２１５ａに保持されている。

シリンドリカルレンズ２０１〜２０５内の矢印は各レンズの母線方向を示し、本実施例においては、例えばそれぞれが円板部材２１５ａの径方向に向かうように取り付けられている。すなわち、各レンズの母線方向は回転軸Ｊが通る円板部材２１５ａの中心に対して放射方向に設定されており、各シリンドリカルレンズ２０１〜２０５がレンズ２２、２３間に挿入された場合に、各々のレンズの母線が鉛直方向となるように配置されている。これにより、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５のいずれを用いた場合においても、撮像装置１４上に形成される試料８の楕円方向の向きが変化してしまうのを防止している。なお、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５は、その母線方向が共に円周方向（径方向と直交する方向）となるように配置されていても構わない。シリンドリカルレンズ２０１〜２０５は、それぞれが異なる焦点距離を有しており、具体的にシリンドリカルレンズ２０５からシリンドリカルレンズ２０１の順に焦点距離が短く設定されている。すなわち、シリンドリカルレンズ２０５の焦点距離が最も長く、シリンドリカルレンズ２０１の焦点距離が最も短く設定されている。

本実施形態において、対物レンズ１１２のうち、最も焦点深度の浅い第１の対物レンズ１１２ａと、シリンドリカルレンズユニット１５０のうち最も焦点距離の長いシリンドリカルレンズ２０５とが対応付けられている。一方、最も焦点深度の深い第５の対物レンズ１１２ｅと、シリンドリカルレンズユニット１５０のうち最も焦点距離の短いシリンドリカルレンズ２０１とが対応付けられている。また、第２の対物レンズ１１２ｂとシリンドリカルレンズ２０４とが対応付けられており、第３の対物レンズ１１２ｃとシリンドリカルレンズ２０３とが対応付けられており、第４の対物レンズ１１２ｄとシリンドリカルレンズ２０２とが対応付けられている。

このような構成に基づいて、顕微鏡装置２００は、観察者３８によって選択された対物レンズ１１２の種類に応じて、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット１５０の回転駆動部２１５ｂを駆動し、円板部材２１５ａを回転させて結像光学系７の光路中に対応するシリンドリカルレンズ２０１〜２０５を挿入する。これにより、顕微鏡装置２００において、観察者３８が希望する画像取得条件に応じて対物レンズ１１２の倍率、開口数を変更した場合でも、対物レンズ１１２に対応する最適なシリンドリカルレンズ２０１〜２０５を設定することができ、三次元方式による試料８の画像観察を精度良く行うことができる。

また、顕微鏡装置２００において、観察者３８が二次元方式による画像取得を希望した場合、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット１５０の回転駆動部２１５ｂを駆動し、円板部材２１５ａを回転させて結像光学系７の光路に開口部２０６を挿入する。このとき、試料８からの光は開口部２０６を通過するため、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５を通過する場合のように楕円状に像が変形することがなく、撮像装置１４上において円形の像となる。これにより、顕微鏡装置２００において、撮像装置１４が撮像した円形の像に基づき、二次元方式で試料８の二次元画像を取得することができる。

また、上述の実施形態では、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５と対物レンズ１１２との対応関係が五種類の場合について説明したが、それ以下、或いは六種類以上の場合についても本発明は適用可能である。例えば、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５と対物レンズ１１２との対応関係の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上にできる。

（第三実施形態）
次に、本発明の顕微鏡装置の第三実施形態について説明する。なお、本実施形態に係る構成と第一、第二実施形態に係る構成とは、シリンドリカルレンズユニットの構成のみが異なる。そのため、以下の説明ではシリンドリカルレンズユニットの構成を主に説明し、上記実施形態と同じ構成及び部材については同一の符号を付し、その詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。

図９は本実施形態に係る顕微鏡装置３００の概略構成を示す図であり、図１０は本実施形態におけるシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図である。
本実施形態に係る顕微鏡装置３００は、図９に示すように、結像光学系７におけるレンズ２２、２３間にシリンドリカルレンズユニット２５０が設けられている。本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニット２５０は、一対のシリンドリカルレンズ３０１，３０２と、これらシリンドリカルレンズ３０１，３０２を保持する回転シリンダー部３１５と、を含む。回転シリンダー部３１５は、一対のシリンドリカルレンズ３０１，３０２の各々が所定の回転軸Ｋ周りに回転可能な状態で保持している。ここで、シリンドリカルレンズ３０１，３０２における所定の回転軸Ｋは、結像光学系７内の像の光線束の中心軸と平行な軸により規定される。これらシリンドリカルレンズ３０１，３０２が互いに回転することで非点隔差を連続的に変化させることが可能となっている。

シリンドリカルレンズ３０１，３０２は互いの焦点距離の正負が異なり、絶対値が等しい関係となっている。具体的に本実施形態では、図１０に示すようにシリンドリカルレンズ３０１として凹型シリンドリカルレンズを用い、シリンドリカルレンズ３０２として凸型シリンドリカルレンズを用いた。

図１１はシリンドリカルレンズユニット２５０を回転軸Ｋの軸方向から視た図である。図１１における矢印Ａはシリンドリカルレンズ３０１の母線方向を示し、図１１における矢印Ｂはシリンドリカルレンズ３０２の曲率方向（母線方向と垂直な方向）を示しており、矢印Ａ，Ｂがなす角度をθとする。なお、図１１においては、説明を分かり易くするため、シリンドリカルレンズ３０１，３０２の形状を円形で簡略化して示している。図１２Ａは矢印Ａ，Ｂのなす角度θが０度の場合におけるシリンドリカルレンズ３０１，３０２の状態を示す平面図であり、図１２Ｂは矢印Ａ，Ｂのなす角度θが９０度の場合におけるシリンドリカルレンズ３０１，３０２の状態を示す平面図である。

シリンドリカルレンズ３０１，３０２は、２本の矢印Ａ，Ｂの中線Ｃ（合成母線）を常に鉛直方向に保ちつつ、θが変化するように互いが回転するようになっている。すなわち、シリンドリカルレンズ３０１，３０２は、各々が反対方向に同じ角度ずつ回転するようになっており、矢印Ａ及びＢと中線Ｃとのなす角度はそれぞれθ／２となっている。このようにシリンドリカルレンズユニット２５０は、矢印Ａ，Ｂの中線Ｃを常に鉛直方向に保つことで撮像装置１４上に形成される試料８の像の楕円方向が回転してしまうのを防止している。

シリンドリカルレンズユニット２５０は、図１２Ａに示されるようにθが０度の時、鉛直方向と水平方向でのレンズの屈折力の差が最大となるため、非点隔差が最大となる。一方、図１２Ｂに示されるようにθが９０度の時、鉛直方向と水平方向でのレンズの屈折力の差が無くなるため、非点隔差は０となる。このようにシリンドリカルレンズユニット２５０は、θを０度から９０度の間で調整することで、非点隔差を連続的に変化させることが可能となっている。なお、顕微鏡装置３００は、予め実験等により求めた、対物レンズ１１２の焦点深度と、この焦点深度に対応した非点隔差を発生させるレンズ３０１，３０２の回転角度θとを関連付けたデータを制御部２５内に記憶している。

顕微鏡装置３００において、観察者３８によって選択された対物レンズ１１２の種類に応じて、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット２５０の回転シリンダー部３１５を駆動し、一対のシリンドリカルレンズ３０１，３０２の所定角度だけ回転させる。これにより、顕微鏡装置３００において、観察者３８が希望する画像取得条件に応じて対物レンズ１１２の倍率、開口数を変更した場合でも、対物レンズ１１２の焦点深度に対応した最適な非点隔差を設定することができ、精度の高い三次元方式による試料８の画像観察を提供できる。

また、顕微鏡装置３００において、観察者３８が二次元方式による画像取得を希望した場合、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット２５０の回転シリンダー部３１５を駆動し、一対のシリンドリカルレンズ３０１，３０２の角度θを９０度とする。このとき、試料８からの光はシリンドリカルレンズ３０１，３０２を通過する際に非点隔差が生じないため、像が変形することがなく、撮像装置１４上において円形の像となる。これにより、顕微鏡装置３００において、撮像装置１４が撮像した円形の像に基づき、二次元方式で試料８の画像を取得することができる。

（第四実施形態）
次に、本発明の顕微鏡装置の第四実施形態について説明する。なお、本実施形態に係る構成は、上記第二、第三実施形態に係る構成とは、シリンドリカルレンズユニットの構成のみが異なる。そのため、以下の説明ではシリンドリカルレンズユニットの構成を主に説明し、第一実施形態と同じ構成及び部材については同一の符号を付し、その詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。

図１３は本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図である。本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットは、第一実施形態のシリンドリカルレンズユニットの一部構成と第三実施形態のシリンドリカルレンズユニットの一部構成とを組み合わせたものである。
具体的に、本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニット３５０は、図１３に示すように、一対のシリンドリカルレンズ４０１，４０２を保持した回転シリンダー部４１５と、スライダ部（進退部）４０５と、を備えている。スライダ部４０５は、回転シリンダー部４１５をスライド可能に保持するスライド板４０５ａと、該スライド板４０５ａをスライドさせる駆動部４０５ｂとを含む。

スライド板４０５ａには、回転シリンダー部４１５の保持部４１５ａと、開口部３０６とが設けられている。これら保持部３１５ａおよび開口部３０６は、スライド板４０５ａのスライド方向（水平方向）に沿って配置されている。開口部３０６は、レンズ２２を通過した光を遮ることなく通過させる大きさに設定されている。回転シリンダー部４１５は、保持部４１５ａに嵌合されることでスライド板４０５ａに保持されている。

本実施形態においては、シリンドリカルレンズ４０１、４０２のいずれも凸型シリンドリカルレンズを用いた。そのため、凸型凹型のシリンドリカルレンズを組み合わせた第三実施形態のように非点隔差を０にすることができないものの、本実施形態では上記開口部３０６を組み合わせることで非点隔差が０の状態（二次元方式による画像観察）を可能としている。

本実施形態に係る顕微鏡装置において、三次元方式による画像取得を行う場合、制御部２５によってシリンドリカルレンズユニット３５０の駆動部４０５ｂを駆動し、スライド板４０５ａをスライドさせて結像光学系７内の光路に回転シリンダー部４１５を挿入する。このとき、制御部２５は観察者３８によって選択された対物レンズ１１２の種類に応じて、回転シリンダー部４１５を駆動し、一対のシリンドリカルレンズ４０１，４０２の所定角度だけ回転させる。これにより、顕微鏡装置において、観察者３８が希望する画像取得条件に応じて対物レンズの倍率、開口数を変更した場合でも、対物レンズの焦点深度に対応した最適な非点隔差を設定することができ、三次元方式による試料８の画像観察を精度良く行わせることができる。

また、本実施形態に係る顕微鏡装置において、観察者３８が二次元方式による画像取得を希望した場合、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット３５０の駆動部４０５ｂを駆動し、スライド板４０５ａをスライドさせて結像光学系７からの光の光路に開口部３０６を挿入する。このとき、試料８からの光は開口部３０６を通過するため、シリンドリカルレンズを通過する場合のように楕円状に像が変形することがなく、撮像装置１４上において円形の像となる。これにより、顕微鏡装置は、撮像装置１４が撮像した円形の像に基づき、二次元方式にて試料８の画像を取得することができる。

なお、第二実施形態に係るターレット部を用いて、回転シリンダーと開口部とを切り替える構成を採用するようにしてもよい。また、上記第四実施形態では、一対のシリンドリカルレンズ４０１、４０２として、凸型シリンドリカルレンズと凸型シリンドリカルレンズとの組み合わせを用いたが、凹型シリンドリカルレンズと凹型シリンドリカルレンズとの組み合わせを用いるようにしてもよい。

以上の実施例では、活性化用と励起用に波長の異なる２つのレーザを用いる顕微鏡装置について説明してきた。一方、励起用のレーザのみを用いた顕微鏡として、ｄＳＴＯＲＭ（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている。ｄＳＴＯＲＭにおいては、従来のＳＴＯＲＭのように活性化用のレーザを照射することなく、蛍光物質の自発的な明滅を元に、少数の蛍光色素のみの画像を取得する。本発明の非点隔差変更装置は、ｄＳＴＯＲＭにも適用可能である。

一実施形態において、顕微鏡装置は、各々の倍率が異なる複数の対物レンズと、所定波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料に前記励起光が照射されることで前記試料から発せられて前記対物レンズから射出される光を受けて前記試料の像に非点隔差を付与した状態で結像させる結像系と、前記結像系を経た前記試料の像を撮像する撮像装置と、を備え、前記結像系は、前記対物レンズの焦点深度に応じて前記非点隔差を変更する非点隔差変更装置を含む。

一実施形態において、顕微鏡装置は、各々の倍率が異なる複数の対物レンズと、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質を含む試料に前記励起光が照射されることで前記試料から発せられて前記対物レンズから射出される光を受けて前記試料の像に非点隔差を付与した状態で結像させる結像系と、前記結像系を経た前記試料の像を撮像する撮像装置と、を備え、前記結像系は、前記対物レンズの焦点深度に応じて前記非点隔差を変更する非点隔差変更装置を含む。

７…結像光学系（結像系）、１２，１１２…対物レンズ、１４…撮像装置、５０，１５０，２５０，３５０…シリンドリカルレンズユニット（非点隔差変更装置）、１００，２００，３００…顕微鏡装置、１０１，１０２、２０１〜２０５…シリンドリカルレンズ、１０５，４０５…スライダ部（進退部）、２１５…ターレット部（進退部）

Claims (12)

1. 複数の蛍光物質を含む試料に、前記複数の蛍光物質のうち一部を活性化し、励起するために、活性化光と励起光を照射する照明光学系と、
   前記複数の蛍光物質のうちの一部から発せられた蛍光を前記対物レンズを介して受けるとともに、非点隔差が付与された像を形成する結像系と、
   前記非点隔差が付与された前記像を撮像する撮像装置と、
   前記照明光学系を介して、前記試料に、前記活性化光と前記励起光を繰り返して照射させるとともに、前記非点隔差が付与された像を撮像した複数の画像に基いて、前記複数の蛍光物質の３Ｄ空間であるｘ、ｙ、ｚの位置を決定する制御部と、を備え、
   前記結像系は、該結像系の光軸上に、切り換え可能に配置される、倍率が互いに異なる複数の対物レンズを含み、
   前記対物レンズが切り換ったとしても、前記ｚの位置精度が所定範囲内となるように、前記光軸に配置される前記対物レンズの焦点深度に応じて前記非点隔差を変更する非点隔差変更装置を含む顕微鏡装置。
2. 前記非点隔差変更装置は、前記試料の像に異なる非点隔差を各々が付与可能な複数のシリンドリカルレンズと、前記複数のシリンドリカルレンズを前記対物レンズから射出される光の光路に対して進退させる進退部と、を備える請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記進退部は周方向に回転可能な円板部材を含み、前記複数のシリンドリカルレンズが前記円板部材における周方向に沿って配置される請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記複数のシリンドリカルレンズは、各々の母線方向が前記円板部材の径方向に向かって配置される請求項３に記載の顕微鏡装置。
5. 前記進退部は前記対物レンズから射出される光の光路に対してスライド移動するスライド板を含み、前記複数のシリンドリカルレンズが前記スライド板のスライド方向に沿って配置されている請求項２に記載の顕微鏡装置。
6. 前記複数のシリンドリカルレンズは、各々の母線方向が前記スライド方向に直交する方向に配置される請求項５に記載の顕微鏡装置。
7. 前記進退部は、前記試料の像に前記非点隔差を付与せずに取得する二次元画像用の開口部を有する請求項２〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
8. 前記結像系は、アフォーカル光学系を含み、前記非点隔差変更装置は、前記アフォーカル光学系中に配置されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
9. 前記非点隔差は、前記対物レンズの焦点深度の約２倍であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
10. 前記非点隔差変更装置は、一対のシリンドリカルレンズを含み、各々のシリンドリカルレンズが所定の回転軸周りに互いに回転可能である請求項１〜９のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
11. 前記一対のシリンドリカルレンズの各々は、反対方向に同じ角度ずつ回転する請求項１０に記載の顕微鏡装置。
12. 前記一対のシリンドリカルレンズを回転させる制御部は、前記対物レンズの焦点深度と前記角度とを関連付けたデータに基づいて、前記一対のシリンドリカルレンズを制御する請求項１１記載の顕微鏡装置。

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