JP5435956B2 - 抗体の効率的な選択および/または成熟のためのベクターおよびその使用 - Google Patents
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Description
組換えDNA技術は、モノクローナル抗体産生に対する安価かつ有用な代替え法を提供する。ファージ提示として知られるバクテリオファージカプシドに対する組換え抗体の提示は、患者において有害な免疫応答を誘導しない治療のために有用な抗体を提供する特異的バインダーの選択のためにヒト抗体ライブラリーを生成出来るだけでなく、より高い親和性を有するクローンを与える変異体抗体ライブラリーの構築による抗体の親和性成熟を促進する。
我々は、従来のベクターの適切な修飾により、ファージ提示系を用いてライブラリー由来の組換え抗体の選択および/または成熟の効率を改善できることを見出した。従来のベクターは、即ち「抗体設計-実際の方法(McCafferty, J. Hoogenboom, H. & Chiswell D., eds),pp.325, Oxford University Press, 1996)」にあるようなファージミドベクターである。
a)リーダーペプチドまたは抗体コード配列のいずれかの内側の抑制されたストップコドン;
b)該抗体コード配列の転写を駆動する低効率プロモーター;
c)該抗体コード配列の転写を駆動するプロモーターの阻害剤、の群に属する。
a)組換え抗体コード配列を、pIIIタンパク質のC末端部分をコードする配列と融合させること;および/または
b)大腸菌(E. coli)のアルカリフォスファタ−ゼの組換え抗体リーダーペプチドを、組換え抗体のリーダーペプチドとして使用すること;および/または
c)組換え抗体コード配列およびpIIIコード配列の間にあるあらゆるアンバーコドンを排除すること、により得られる。
図1:図1は、scFv形態において可溶性抗体の産生に有用なpKM16 プラスミドの主なエレメント、およびファージ提示抗体の産生に有用なpKM17、pKM18およびpKM19プラスミドの主なエレメントを図示するものである。これらのプラスミドは、pLacプロモーターの制御下にある抗体発現を導く。独特のNcoIおよびNotIクローニング部位により、抗体遺伝子の挿入が可能となり、微生物ペリプラズム酵素、アルカリフォスファタ−ゼ(PhoAリーダー)のリーダーペプチドを有する一本鎖抗体を発現できる。プラスミドpKM17は、完全なタンパク質pIII(406 aa)をコードしており、プラスミドpKM18およびpKM19はpIII(197 aa)]のC末端部分をコードする。プラスミドpKM19は、PhoAリーダー中にアンバーコドンを含有する。
図5:ファージサンプルの濾過。約2x1011TU/各調製物のウェルまたは対応する濾液サンプルの量をELISAにおいて試験し、抗M13(パネルA)または抗FLAG(パネルB)二次抗体のいずれかを用いて発色した。報告したデータは、2回行ったアッセイの平均値である。データは、CEAに対する濾液の反応性を、非濾過サンプル(100%)の元の反応性のパーセントとして示す。
下記実施例は本発明を説明するものである。
導入
ここでの研究は、繊維状のファージ上での一本鎖抗体の提示のための新規pKM19ファージミドベクターの構築体を説明するものである。このベクターは、標準的な系と比較していくつかの違いを特徴とする。
古典的なファージミドは、scFvおよびgpIII遺伝子の間にアンバーコドンを含有する、即ち一般的にはファージ増幅に使用される抑制因子バクテリア、例えばTG1、DH5αF'またはXLl-Blue、において遊離scFvおよびscFv-pIII融合抗体の産生を導く。supE変異を担持しているこれらの微生物株は、コドンの後のTAGにより抑制効率を有するグルタミンを挿入する抑制因子である(J. MoL Biol. 1983 164(1):59-71; MoI. Gen. Genet. 1987 207(2-3):517-518)。かかる系において、産生した遊離の可溶性scFv 抗体は、ペリプラズム中に分泌され、その後ペリプラズムから培地中へと漏出される。PEG/NaClによる標準的なファージ精製プロトコール下で、遊離scFv抗体をファージ粒子と共に共沈殿した。結果として、ファージ懸濁液中の遊離抗体の濃度は、ファージ粒子中にアセンブリしたscFv-pIII-融合タンパク質の濃度よりも5〜10倍高いものであり得る。その後の選択において、十分な遊離抗体は、標的結合についてファージ提示型抗体と競合する。これは、パンニング効率と干渉し、選択プロセスを遅延させる、特に:i)抗原濃度が制限される場合(例えば、生存細胞、エキソビボ細胞に対するバイオパンニング)、ii)後者のパンニングラウンドにおいて、特異的ファージの濃度が比較的高い場合、またはiii)同じ特異性を有する多くの関連抗体を含有する成熟ライブラリーにおける場合。
(i)抗体発現の存在レベルが、アンバーコドンを含まないpKM18ファージと比べて、ELISA試験において類似シグナルを与える高反応性ファージ抗体を産生するのに十分であること;
(ii)特異的抗体が、たった2回の選択ラウンド後に標的タンパク質に対する抗体を用いて患者の末梢血リンパ球から構築したscFvライブラリーから容易に単離され得ること;
(iii)抗CEA抗体の成熟により、模範ベクター(BMC Cancer 2006 6:41)を用いて行った成熟と比較して、ストップコドンを含まない改善されたscFvクローンの単離がもたらされること、
を証明した。
pKM19ベクターは、削除された遺伝子IIIタンパク質のアミノ末端融合物としてscFvフラグメントのクローニングを可能とする。
pKM19 ベクターを担持するバクテリアにおいて、組換えタンパク質の合成後に、PhoA リーダーペプチドは膜転移に対するリーダーペプチダーゼにより解裂され、scFv−pIIIはファージ粒子中に会合される。この方法では、アルカリフォスファターゼ、E.coliの真のペリプラズムタンパク質の全ての解裂部位が、効率的かつ正確なプロセシングおよび抗体会合を保証するように保存されている。結果として、成熟タンパク質は、scFvのN末端で2つの追加のアミノ酸を含有する。記載した系において、可溶性抗体のその後の産物に対して適切なプラスミドにおいて抗体遺伝子を再度クローニングすることが必要である。この段階で、追加のアミノ酸は、特定の必要要件に従って保存または排除され得る。
微生物株およびファージ
微生物株DH5αF'(supE44 ΔlacUl69(φ80 lacZAMl5) hsdRU recAl endA1gyrA96 thi-l relAl F'[traD36 proAB+ lacqlacZΔM15])を、可溶性およびファージ抗体産生に使用した。ヘルパーファージMl3 KO7(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989)をファージ調製に使用した。
pC89プラスミド(J. MoI. Biol. 1991 222(2): 301-310)を、HindIIIおよびNotI部位(下線)を含有するKM161、KM162オリゴヌクレオチド(KM161 5'-GAGGAAGCTTCC ATTAAACGGGT AAAATAC-3'(配列番号78);KM162 5'-TGCAATGGCGGCCGCTAATATTGTTCTGGATATTACCAGC-3'[配列番号79])を用いて、インバースPCRにより増幅させた。インバースPCRにおいて、Pfu DNA ポリメラーゼと共にTaqポリメラーゼ混合物を使用して、DNA合成の忠実度を増加させた。25サイクル(95℃-30秒、55℃-30秒、72℃-20分)の増幅を行った。PCR産物を、HindIIIおよびNotI エンドヌクレアーゼを用いて消化し、FLAGペプチドおよびHisテイルをコードするKM163-KM164オリゴヌクレオチド(KM163 5'-AGCTTCCTC ATG TAG GCG GCC GCA GGA GAC TAC AAA GAC GAC GAC GAC AAA CAC CAC CAT CAC CAC CAT TAA-3'[配列番号80]; KM164 5'-GGCC TTA ATG GTG GTG ATG GTG GTG TTT GTC GTC GTC GTC TTT GTA GTC TCC TGC GGC CGC CTA CAT GAGGA-3'[配列番号81])二本鎖を用いて連結させた。クローンDNA二本鎖は、内部NotI部位、FLAGペプチドコード配列の上流を含有したが、二本鎖のクローニングに用いたNotI部位を修復しなかった。得られるpKM15プラスミドを、HindIII、NotIエンドヌクレアーゼを用いて新たに消化し、NotIクローニング部位を含有している、リーダー配列およびPhoA バクテリアタンパク質の最初の2つのアミノ酸をコードしているKM175-KM176(KM175 5'-AGC TTA TAA AGG AGG AAA TCC TCA TGA AAC AGA GCA CCA TCG CAC TGG CAC TGT TAC CGT TAC TGT TCA CCC CGG TTA CCA AAG CAC GTA CCA TGG TTT CCC TTGC-3' [配列番号82];KM176 5'-GGC CGC AAG GGA AAC CAT GGT ACG TGC TTT GGT AAC CGG GGT GAA CAG TAA CGG TAA CAG TGC CAG TGC GAT GGT GCT CTG TTT CAT GAG GAT TTC CTC CTT TATA-3' [配列番号83])二本鎖にて連結した。この新規pKM16プラスミドは、可溶性一本鎖抗体産物となる(図 1)。
一つのコロニーを、Ap(100 μg/mL)および2%グルコースを含有するLB(50 mL)中に接種した。該培養物を、O.D.=0.8まで37℃で2-3時間増殖させた。遠心分離により回収した細胞を、Apおよび1mM IPTGを含むLB(50 mL)に再懸濁し、30-32℃で一晩インキュベートした。細胞ペレットをPBS(500μL)に再懸濁した。凍結および溶解の3サイクルの後、細胞破砕物を遠心分離によりペレットにした。得られた上清を、ELISAまたはウェスタンブロットに使用した。
リンパ球を、製造者指示書に従って、Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)を用いて抗血液凝固薬を用いて患者EC23(乳癌の進行段階にある)由来の新規末梢血液(10 mL)から単離した。Dynabeads mRNA DIRECT Kit (Dynal, Norway)を用いて、リンパ球からmRNAを単離した。Dynabeads mRNA DIRECT Kit (Dynal, Oslo, Norway)を用いて、mRNAをリンパ球から単離した。リンパ球由来のポリ(A)+RNA(1μg)を用いて、SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech, Palo Alto, CA)を用いて、完全長cDNAを合成した。
抗体遺伝子レパートリーを、VHおよびVL抗体ドメインの増幅のために設計した一組のプライマーを用いて増幅させたが、完全なscFvフラグメントを、[Pope, A.R., Embleton, MJ. & Memaugh R. (1996) Construction and use of antibody gene repertoires. In: Antibody Engineering - A practical approach (McCafferty, J., Hoogeriboom, H. & Chiswell D.5 eds), pp.325, Oxford University Press]に記載のように、インビトロでアセンブルした。次いで、この後の物を、適切な伸張プライマーを用いてPCRにより増幅した、これはNcoI、Notl制限部位を組み込んでおり、scFv遺伝子をpKM19ベクター中にクローニングできる。得られるPCR産物を、1%の低融点アガロースゲル(NuSieve 3:1 アガロース, Rockl and ME)上で精製し、NcoI/NotIにて切断し、消化したプラスミド中に挿入した。形質転換したライブラリーscFvEC23は、完全長scFv挿入物を有する1.77x107の独立したクローンを含有した。scFvEC23ライブラリーは、乳癌の進行段階にある一人の患者EC23から獲得したPBLから得る。
抗CEA scFv についての成熟ライブラリーを、先に記載したとおりに構築した(BMC Cancer 2006 6:41)。要約すると、変異したscFv遺伝子フラグメントを、プライマー:KM144-KM143 (KM143, 5'-GTCATCGTCGGAATCGTCATCTGC-3'[配列番号91]; KM144, 5'-TGTGCGAAAAGTAATGAGTTTCTTTTTGACTACTGGGGC -3'[配列番号92]) および KM148-KM145 (KM148, 5'-CTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGA-3' [配列番号93]; KM145,5'-TCCGCCGAATACCACATAGGGCAACCACGGATAAGAGGAGTTACAGTAATAGT CAGCC-3' [配列番号94])を用いるPCR増幅によって生成し、低い頻度にて重鎖または軽鎖のCDR3領域中にランダム変異を導入する。KM144およびKM145オリゴヌクレオチドの各下線の塩基を、10%の頻度にてG/A/T/Cの混合物で置換した。欠失するscFv 抗体遺伝子部分を、各々HCおよびLCについてのKM148-KM157およびKM158-KM143プライマー(KMl57 5'-TTT CGC ACA GTA ATA TAC GG-3' [配列番号95]; KM158 5'-TAT GTG GTA TTC GGC GGA-3' [配列番号96])を用いて増幅した。全ての遺伝子を再構築するために、対応するフラグメントを組み合わせて、オリゴヌクレオチドプライマーを含まないPCRの様なプロセスで増幅させた。得られた産物を利用し、外部プライマーKM148、KM143を用いて全ての遺伝子を増幅させた。最終のDNAフラグメントを、アガロース精製し、制限酵素NcoIおよびNotIを用いて消化し、消化したプラスミドpKM19を用いて連結させた。得られたライブラリーは2.2xlO6 変異抗体クローンを含有した。
ELISA プレートを被覆し、ブロッキングし、上記のように洗浄した。ブロッキング緩衝液(100μL)中の抗CEA可溶性抗体MA39(BMC Cancer 2006 6: 41)の様々な量をウェルに添加し、30分間37℃でインキュベートした。次いで、MA39 ファージ上清の10μL(4.5x109 TU)または抗CEA/pKM19上清の5μL(3x108 TU)を該ウェルに添加し、さらに1時間37℃でインキュベートした。該プレートを洗浄し、結合ファージを抗M13 HRP-結合抗体によって検出した。無関係の可溶性抗SP2scFv(表5)を高濃度(400 ng/ウェル)にてネガティブコントロールとして使用した。MA39と比べて少量の抗CEA/pKM19ファージを使用して、このファージのELISA反応性を抑える。
ファージを、標準的なPEG/NaCl沈殿に従って精製した(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989)。ファージサンプル由来のタンパク質抽出物を、SDS-PAGEにより分画し、ニトロセルロース膜上に移した。この膜ストリップを抗FLAG AP結合抗体を用いて発色させた。
マルチプレート(Immunoplate Maxisorb, Nunc, Roskilde, Denmark)を、50 mM NaHCO3(pH-9.6)中の10 mg/mL濃度でのタンパク質溶液を用いて4℃で被覆した。被覆溶液を捨てた後、プレートをELISAブロッキング緩衝液(5% 無脂肪乾燥ミルク、PBS中で0.05% Tween-20)を用いて37℃で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄緩衝液(PBS中で0.05%;Tween-20)で数回洗浄した。ブロッキング緩衝液(1:1)中のPEG-精製したファージを各ウェルに添加し、1時間37℃でインキュベートした。該プレートを洗浄し、結合したファージを、抗M13 HRP標識二次抗体(27-9421-01, Amershani Biosciences, Uppsala, Sweden)、または抗FLAG HRP標識二次抗体(A9044, Sigma, St. Louis, MO)または抗FLAG AP標識二次抗体(A9469, Sigma)により検出した。HRP標識の場合には、免疫反応をTMB液体基質(Sigma)との15分間のインキュベーションにより行い、2M H2SO4(25μL)の添加により停止した。該結果を自動ELISA読み取り機により検出した450と620nmとの吸光度の差違として表した。AP標識抗体を、基質緩衝液(10%ジエタノールアミン緩衝液、0.5 mM MgC12, pH 9.8)中のp-ニトロフェニルリン酸塩溶液(1 mg/mL)と共に60分間のインキュベーションにより検出した。該結果を、450および620nmの間の吸光度の差違として表した。抗体を表5に明示した。
scFv構造における可溶性抗体の産生に使用したpKM16プラスミド(図1)を上記のように構築した。このプラスミドは、lacPプロモーターのコントロールの下でのタンパク質発現を目的とする。特別なNcoIおよびNotIクローニング部位により、バクテリアペリプラズム酵素であるアルカリフォスファタ−ゼ(AP)のリーダーペプチドを有し、および該抗体のアミノ末端でこの成熟APタンパク質の最初の2つのアミノ酸および抗体のカルボキシ末端でFLAG/His-テイルを有する、一本鎖抗体を発現できる抗体遺伝子の挿入が可能となる。プラスミドの実際の特性を確認するために、既知の特異性に関する一本鎖抗体の遺伝子、抗CEA MA39を、PCRにより増幅し、pKM16ベクター中にクローニングした。その後、我々は、抗FLAG二次抗体を用いて発色させたウェスタンブロットにおいて凍結溶解にて精製したペリプラズムタンパク質を分析した(図3)。一本鎖抗体バンドは、予想分子量を有するタンパク質として移動した。エドマン分解によるN末端タンパク質配列決定により、リーダーペプチドの正しいプロセシングを確認する。
抗CEA一本鎖抗体を提示する典型的なファージミド(pDN322)であるMA39を、ファージ粒子産生および提示効率について、同一抗体を提示するpKM17、pKM18およびpKM19ベクターと比較した。pKM17およびpKM18プラスミド(図1)は、各々の完全なpIII(1-406 aa)または該タンパク質のC末端ドメイン(210-406 aa)のみとの融合により、ファージ粒子上での抗体フラグメントの提示を可能にする。pKM19プラスミド、pKM18の誘導体は、リーダー配列中のアンバーコドンを担持しており、そのためpKM18と比べてscFv-pIII融合タンパク質の低い産生をもたらす。これは、supEバクテリアにおいて、ヌクレオチド含量に依存するこのTAGコドンの抑制効率が約10-15%であることを示すデータ(J. MoI. Biol. 1983 164(1): 59-71; MoI. Gen. Genet. 1987 207(2-3): 517-518)と一致する。
ファージ調製物をELISAで試験した。この試験での発色を抗M13または抗FLAG二次抗体を用いて行った。ELISAウェルあたりにファージの様々な量を加えると、pKM17と比べるとpKM18およびpKM19ファージに対する高い提示効率を示し、またMA39と比べるとさらに高い提示効率を示した(図4)。興味深いことに、抗FLAG抗体を用いる発色により示されるように(図4B)、抗CEA/pKM17よりも高いレベルの抗体を産生するMA39クローンは、ELISAが抗M13二次抗体にて発色される場合には弱いシグナルを示す(図4A)。
(i)MA39およびpKM19両方からの濾液は、実際には予測したようにファージ粒子上に提示された抗体を失う;
(ii)該遊離抗体は両調製物中に存在する(図5)。
(i)MA39および抗CEA/pKM17ファージの場合にはscFv-pIII融合物および抗CEA/pKM18または抗CEA/pKM19の場合にはscFv-ΔpIIIに対応する各サンプル中の上部バンド;
(ii)MA39サンプル中の遊離抗体の顕著な存在;
(iii)先に記載されたような(Gene 1995 155(1):61-65)ファージサンプル中の分解産物の存在、を検出する。
リーダー配列中にアンバーコドンを担持するpKM19プラスミド、即ちpKM18由来物を、scFvライブラリーの作成に使用して、融合抗体の低産生により、標的分子に対する特異的抗体を効率的に選択出来るかどうかを試験した。
成熟ライブラリーからの親和性選択を、BMC Cancer 2006 6:41に記載のとおりに行った。図10は、CEAタンパク質に対するファージ反応性は、各成功した選択ラウンドにおいては高いことを示す。改善した反応性を有する一つのファージクローンを単離した(図10)。我々は、選択の第2ラウンド後のファージプール由来の19のランダムクローンを配列決定した。高い親和性を有するファージプールの配列決定したクローンは、その配列中にストップコドンを示したものは全くないが(19のうち0)、典型的なファージミド系クローンの70%(13のうち9)はこのような変異を含有した(P=0.00002、カイ二乗試験に従って計算した)。このように、抗CEA抗体の成熟のためのpKM19ベクターの使用により、選択結果が有意に改善された。
導入部
癌患者のリンパ節から得た提示ライブラリー由来の腫瘍特異的組換え抗体の同定が記載されている[Clin. Exp. Immunol. 1997 109(1): 166-74; Int. J. MoI. Med. 2004 14(4):729-35; World J. Gastroenterol. 2004 10(18):2619-23]。
組織および血液サンプル
乳癌患者(B81-B96, EC23)由来の乳癌腫および新規末梢血液の試料を、M. G. Vannini Hospital , Romeから得た。全てのヒトの生物学的サンプルをインフォームドコンセントにより得た。
乳癌腫細胞系MCF-7(ATCC Number: HTB-22)、MDA-MB-468(ATCC Number: HTB-132)およびSkBr3 (ATCC Number: HTB-30)、および大腸腺癌腫細胞系LoVo(ATCC Number: CCL-229)を、製造指示書に従って維持した。ヒト***線維芽細胞(HFF)を、10%FBSおよび1%Lグルタミンを添加したDMEM中で培養した。不死***上皮細胞MCF10-2A (ATCC number CRL-10781) [Cancer Res. 1990 50(18):6075-86]を、製造指示書に従って増殖させ、ELISA試験におけるネガティブコントロールとして使用した。
大腸癌腫および肝臓癌転移から精製したヒトCEAタンパク質を、USBiological (#C1300-16, United States Biological, Swampscott, MA)から購入した。
リンパ球を、製造者指示書に従ってFicoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)を用いることによって、抗血液凝固薬と混合したあらたな末梢血液(10 mL)から単離した。mRNAを、Dynabeads mRNA DIRECT Kit (Dynal, Norway)を用いることによってリンパ球から単離した。
乳癌腫患者由来の約200 mgの腫瘍試験片を、手術廃棄サンプルとして獲得し、液体窒素中で直ぐに凍結させた。全RNAを、Total RNA Isolation System (Promega, Madison, WI)により調製し、PolyATract mRNA Isolation Systems(Promega)によりpolyA+RNAに精製した。乳癌腫由来のポリ(A)+RNA(500ng)またはリンパ球由来のポリ(A)+RNA(1μg)を使用して、SMART cDNA ライブラリー構築キット(Clontech, Palo Alto, CA)を用いることによって全長cDNAを合成した。
Hansenおよびcolleagues [Proc Natl Acad Sci U S A 2001 98(22):12659-64]による試験において設計した部位特異的プライマー5 '-GGACACGGCTCG/QTGTATTACTG-3' [配列番号101]および 5'-GCTGAGGAGACGGTGACC-3'[配列番号102]を用いることにより、超可変V(D)J抗体領域を、cDNAテンプレートからPCRによって増幅した。IgG1、IgG2およびIgAサブクラスの決定を、IgGl、IgG2およびIgA遺伝子(CG1d、CG2aおよびCA1の各々)に対する定常領域の特異的プライマー、一組の可変重鎖プライマー: VHl 35、VH3a、VH3f、VH4、VH4bを個々に組み合わせることによって、[J Immunol. 2002 169(5):2701-l l]に記載したように行った。これらのプライマーを、ヒトFabライブラリーの構築のために設計した[Barbas CF III, Burton DR (1994) Monoclonal antibodies from combinatorial libraries. Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual]。
抗体遺伝子レパートリーを、VHおよびVL抗体ドメインの増幅のために設計した一組のプライマーを用いて増幅し[Pope, A.R., Embleton, MJ. & Mernaugh R. (1996) Construction and use of Antibody gene repertoires. In: Antibody Engineering - A practical approach (McCafferty, J., Hoogenboom, H. & Chiswell D., eds), pp.325, Oxford University Press]、scFv フラグメントを先に記載したように[Pope AR et al., 1996]インビトロでアセンブルした。次いで、scFvフラグメントを、pKM19ベクターへのscFv遺伝子のクローニングを可能にするNcoI、NotI制限部位を導入する適切な伸張プライマーを用いてPCRにより増幅した。得られるPCR産物を、1%低融点アガロースゲル(NuSieve 3:1 アガロース、Rockland ME)上で精製した。DNAフラグメントを、NcoI/NotIを用いて消化し、pKM19ベクター中に挿入した。連結したDNAを使用して、電気穿孔法によりコンピテントバクテリア細胞 DH5αF'(supE44 ΔlacU169(φ80 lacZΔM15)hsdR17 recAl endA1gyrA96 thi-1 relA1 F' [traD36 proAB+ lacqlacZΔMl5])を形質転換した。形質転換細胞を、LBアガー、100μg/mL アンピシリンおよび1%グルコースを含有する20枚のアガーディッシュ(φ15 cm)上に播種した。一晩37℃でインキュベーションした後、バクテリアコロニーを、プレートから擦り取り、10%のグリセロールを含有するLB中に再懸濁した。この細胞懸濁液のアリコートを-80℃で貯蔵し、ファージ増幅に使用した。
擦り取ったバクテリア細胞(40μL)を、アンピシリンおよび1%グルコースを含有するLB(40 mL)中で、O.D.=0.2までインキュベートした。バクテリアを、遠心分離により回収し、グルコースを含まずにアンピシリンを含むLB(40 mL)中に再懸濁した。ヘルパーM13K07の約6x109pfuを、細胞懸濁液の各mLに添加し、シェイカー内で攪拌せずに37℃で15分間、さらに2時間インキュベートした。カナマイシンを、終濃度20μg/mLまで添加し、細胞を32℃でインキュベートした。ファージを、標準的なPEG/NaCl沈殿に従って精製した[Sambrook J, Fritsch EF5 Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989]。
MCF-7の半分の密集細胞(約 2x107)を、3回PBS緩衝液で洗浄し、2 mM EDTAのPBS溶液(2 mL)と共に15分間37℃でインキュベートした。10 mM MgCl2を含有するPBS(10mL)を細胞に加え、それらをピペットにより正確に取り出した。遠心分離により回収した細胞を、PBS/MgCl2(10 mL)で1回洗浄し、最終的に、新たに調製したブロッキング緩衝液(1 mL)[4% 無脂肪乾燥ミルク、0.05% Tween 20、5x1011 pfuのfl UV殺傷ファージ]に再懸濁した。該細胞を、回転ホイール上で30分間室温にてブロッキングし、次いで回収して、ホイール上で1時間37℃にてブロッキング緩衝液(1mL)中の新たに増幅したscFv 抗体ライブラリーの約5x1011 TUと共にインキュベートした。該細胞を5回PBS/Tweenで洗浄した。結合したファージを、0.1 M HCl(400 μL,pH 2.2)(グリシンにより調整した)を添加することによって溶出した。細胞懸濁液を、溶出溶液と共に10分間室温でインキュベートし、2M Tris-HCl(pH 9.6, 40μL)によって中和し、バクテリア細胞の感染に使用した。バクテリアを、アンピシリン(100μg/mL)および1% グルコースを含有する2枚のLBアガーディッシュ(φ15 cm)上に播種した。擦り取ったバクテリアをファージ増幅に使用した。
CEAおよびMUClを、[Harlow E. & Lane D. Antibody: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988]に記載したようにビオチン化した。約5xlO11 TU の新たに増幅したscFv抗体ライブラリーを、ブロッキング緩衝液中のAD202 バクテリア抽出物(50 μL)と共に30分間37℃でプレインキュベーションした。ビオチン化タンパク質の20γを該反応混合物に添加し、穏やかな攪拌下でさらに一時間37℃でインキュベートした。結合したファージを、製造者指示書に従ってストレプトアビジン被覆化 Dynabeads M-280 (112.05, Dynal, Oslo, Norway)を用いて捕捉し、PBS/Tweenで5-10回洗浄し、次いで溶出し、上記のとおり増幅させた。
細胞を、96ウェルプレートで大部分が密集するまで増殖させた。増殖培地を廃棄した後、新たに調製したPBS中4%パラホルムアルデヒド(#15710, Electron Microscopy Science, Hatfield, PA)(100μL)を、すぐに10分間添加した。固定化溶液をピペットにより取り除き、細胞をブロッキング緩衝液と共に30分間室温でインキュベートした(5%ミルク, PBS中で0.05% Tween 20)。ブロッキング緩衝液中のPEG精製ファージ(1:1)を細胞に添加し、穏やかな攪拌下に1時間37℃でインキュベートした。該細胞を3回洗浄し、抗M13 HRP標識抗体(Pharmacia)をこの反応を発色するために使用した。全てのアッセイを3回行った。
細胞を細胞培養のために24ウェルプレート中で増殖させ(Nunc, Roskilde, Denmark)、上記のとおりに固定し、1時間室温でPBS中の3% BSAを用いてブロッキングした。1% BSA/PBS中のPEG精製ファージを該細胞に添加し、穏やかな攪拌下に37℃で1時間インキュベートした。該細胞を1%BSA/PBSにより3回洗浄し、抗M13マウスモノクローナル抗体(27-9420-01, Amersham Biosciences)を30分間37℃でインキュベートした。該細胞を上記のとおり洗浄し、次いでFITC標識抗マウスヤギポリクローナル抗体(554001, BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA)と共に5μg/mLの濃度で穏やかな攪拌下に37℃30分間インキュベートした。最終のインキュベーション後、細胞を5回洗浄し、暗所で乾燥させ、Vectashield培地(Vector Laboratories, Lie. Burlingame, CA)およびカバーガラスを用いて標本とし、倒立型蛍光顕微鏡を用いて分析した。全ての抗体を表5に明示する。
***腫瘍サンプル中のリンパ血漿細胞の特徴付け
V(D)J 抗体セグメント(CDR3)のPCR増幅により、およびIgGおよびIgA抗体クラスの発現量の比較により、TIL-Bの存在および性質について乳癌患者由来の10人の腫瘍試験片(47-79年齢)を試験した。
我々は、V(D)J試験において最も強い一本のバンドを示す2つのcDNAサンプル(B92、B93)を配列分析のために選択した。各々B92およびB93cDNAから得られるγ抗体遺伝子を含有するクローンを無作為に選抜した17および13のヌクレオチド配列を決定し、そのアミノ酸配列を推定した。フレーム内にコードされた全ての30のクローンは重鎖を正しく編成した。高頻度で、単離抗体(B92-AおよびB93-A1)は、図13B(B92およびB93サンプルを有する列)で先に観察された強力なバンドに対応するこの正確な長さのV(D)J領域を含有した(図15)、即ち可変重鎖プライマーを用いるPCR増幅およびクローニング工程の両方は、構築したライブラリーにおいて重鎖頻度と干渉するいずれの特定の偏りをも組み込まないということを示す。
4つのscFv抗体ライブラリーを、免疫応答のオリゴクローン性を特徴とするテンプレートとして7つのcDNAを用いて構築した(表2に記載のライブラリーのリストを参照されたい)。ライブラリーscFvEC23(実施例1に記載)のみを、乳癌の進行段階にある一人の患者から得た末梢血リンパ球から構築した。
フィブロネクチンのED-Bドメイン[EMBO J. 1987 6(8):2337-42]、MUCl[Cancer Res. 1992 52(22): 6365-70; Hum Pathol. 1995 26(4):432-9]、およびCEA[J. Clin. Lab. Anal. 5: 344-366; Semin Cancer Biol. 1999 9:67-81; Cancer Res. 2002 62:5049-5057]を含む、共通の癌抗原に対するファージライブラリーからの特異的抗体フラグメントを選択する可能性を直接試験した。材料および方法に記載した条件下で、mixTILライブラリー(表2)と呼ぶ4つのTIL由来scFv抗体提示ライブラリー(scFvB87、scFvB95、scFvB96およびscFvmix)の混合物およびscFvEC23ライブラリーを、数ラウンドにおいて3つのタンパク質の標的に対して別々に選抜した。各ケースで、我々は、ファージプールが、パンニングの第2および第3ラウンドの後の選択抗原に対して既に陽性であったことを観察した(図16)。無作為に選抜したクローンを、抗原に対する結合反応性について試験した。第3ラウンドのファージプールからのランダムファージクローンの試験結果を表3にまとめた。陽性クローンを、HaeIIIおよびAluIの二重消化を用いるフィンガープリントによって分析し、特異な抗体クローンを配列決定した。図17は、精製抗原で選択した一つのscFv-ファージのELISAを示す。分析した一つのクローンは、各抗原を強力に結合し、無関係のタンパク質とは反応しない。この結果から、pKM19ベクターは、TILおよびPBL由来ライブラリーからの抗腫瘍抗体の選択のための適切なツールであることが示された。
我々は、MCF-7乳癌腫細胞系で細胞を基にしたパンニングにより乳癌特異的抗体を選択することによって、一つのTIL由来ライブラリー(scFvB96)の機能性を試験した。scFvB87、scFvB95、scFvmixおよびscFvEC23を包含する4つのライブラリーを一緒にプールし(mixLIBと称するライブラリー、表2)、同じタイプの細胞に対してパンニングした。MCF-7細胞に対する第4または第5の選択ラウンドは、特異的な細胞バインダーについてファージプールを多く含むために(図18)、mixLIBまたはscFvB96ライブラリー各々に必要であった。従って、ランダムに選抜したクローンを、全てのscFv抗体の存在について分析した。完全長scFv-ファージクローンを、細胞を基にしたELISAにより試験し、フィンガープリントにより分析し、様々な陽性クローンを配列決定した。アミノ酸配列をDNA配列から推定し、正しいフレーム内の抗体構造を確認した。クローン分析データを表4にまとめた。
mixl l、mixl2、mixl7、mix23およびmix39 scFv 抗体(表4)を、PBLおよびTIL由来ライブラリーの混合物から選択した。我々は、このタイプのライブラリーが同等の選択条件において良好に働くことを理解するために、これらの抗体の起源を調べた。各増幅ライブラリー(1μL)を、各抗体に特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR増幅のためのテンプレートとして使用した(図20)。この分析により、ライブラリーの混合物から単離したこの5つの試験したscFv抗体は、TIL-由来抗体に属することであるということが示される。mix7およびmix25抗体(mixl2と同一重鎖を有する、表5)およびmix8(mix39に類似、表5)の抗体遺伝子は、同様の起源を有すると考えられる。scFvEC23ライブラリーから選択された無関係の抗SP2抗体について、PBL由来ライブラリーからその起源を確認した。4つのTIL由来ライブラリーの混合物(mixTIL)から選択された抗MUCl MB5および抗CEA CB37抗体は、各々scFvmixおよびscFvB96ライブラリーから得られることが示された。
mix17、mix7(図21)、抗Mucl抗体MB5および抗CEA CB37(図22)を包含するいくつかのクローンの結合特異性を、ファージ上に提示されたscFv抗体との直接的な腫瘍細胞の免疫蛍光染色によってアッセイした。この実験において、Mix17scFvは大部分の非浸潤性MCF7 乳癌腫細胞を認識し(図21 A)、mix7は低割合にて細胞、おそらくアポトーシス細胞を染色する。
腫瘍特異的抗体CB37およびMB5の親和性を増強するために、我々はインビトロで抗体の親和性成熟を行った。新規成熟ライブラリーを、CB37およびMB5各々から得た一本のVH鎖の遺伝子と、腫瘍患者のTILおよびPBLから得たVL鎖の様々な遺伝子とを組み合わせて構築した。該ライブラリーを、実施例1および2に記載したとおりに構築した。
親和性選択
親和性選択を、親和性選択の第1ラウンドに対して、我々はタンパク質を10μg使用し、第2ラウンドでは50ngのみを使用するという違いを用いて、実施例2に記載したようにビオチン化タンパク質を用いて行った。ELISAにおいて陽性であることが判ったクローンを、制限酵素AluIおよびHaeBIを用いるPCRおよびフィンガープリントによりスクリーニングし、様々なクローンを同定した。該クローンのDNA配列を決定した。標的タンパク質に対して元々の抗体よりも高い反応性を示すクローンからの抗体遺伝子を、pKM16中にクローニングし、実施例1に記載したように可溶性形態でscFvを産生した。
成熟した抗体フラグメントを抗原結合について特徴付けた。
可溶性形態にある、新規抗MUC1抗体 MB5/C'1およびMB5/C'3および抗CEA成熟抗体CB37/3BおよびCB37/9C(表5)を、BMC Cancer 2006 6:41に記載したように表面プラスモン共鳴(Biacore)により特徴分析した。結果を表6に示す。
表5. 選択された抗体。MixTILおよびMixLIBは表2に規定したライブラリーの混合物である。
親の抗CEA抗体CB37は、可溶性形態では安定でない。成熟した一本鎖抗体はナノモルの親和性を示す。Ka=結合定数、Kd=解離定数、KD=Ka/Kd、SE=標準誤差。データはモル表示である。
表6は、親のおよび親和性成熟したscFvの反応速度的値を報告するものである。成熟した抗MUCl抗体MB5/C'1およびMB5/C'3は、MB5と比較して、抗原に対して各々42倍および17倍以上高い親和性を有する。成熟した抗CEA抗体CB37/3BおよびCB37/9Cは、ナノモルの親和性を示す。さらに、成熟した抗体は、可溶性形態においては反応性でなかった元々のCB37よりもより安定である。これらの結果は、pKM19ベクターがscFv抗体の成熟に適切なツールであることを示す。
Claims (10)
- 組換え抗体の発現レベルを低下させることができる少なくとも1つのエレメントを含有すること、および該組換え抗体の提示に関する改善された効率を有することを特徴とする、ScFv、Abの活性フラグメントまたはAbのヒト化配列を包含する組換え抗体の効率的な選択および/または成熟に適切なベクターであって、
i)該エレメントが、
a)アンバーコドンを有するリーダーペプチドコード配列であり、
ii)組換え抗体の提示に関する改善された効率が、
a)組換え抗体コード配列を、pIIIタンパク質のC末端部分をコードする配列と融合させること;および
c)組換え抗体コード配列およびpIIIコード配列の間のあらゆるアンバーコドンを排除することによって、または
a)組換え抗体コード配列を、pIIIタンパク質のC末端部分をコードする配列と融合させること;および
b)大腸菌のアルカリフォスファタ−ゼのリーダーペプチドを、組換え抗体のリーダーペプチドとして使用すること;および
c)組換え抗体コード配列およびpIIIコード配列の間のあらゆるアンバーコドンを排除することによって得られ、
pIIIタンパク質のC末端部分をコードする配列を含有する、前記ベクター。 - ベクターが、プラスミド、ファージミドまたはファージである、請求項1記載のベクター。
- 配列番号1のヌクレオチド配列を有する、請求項2記載のファージミドベクター。
- 請求項1〜3いずれか記載のベクターおよび該ベクター中にクローニングしたcDNA、合成または半合成抗体配列、または抗体の親和性成熟について変異したcDNAまたは合成または半合成抗体配列からなる、ファージ提示抗体ライブラリー。
- cDNAが抗体産生細胞から抽出される、請求項4記載のライブラリー。
- 抗体産生細胞が腫瘍浸潤リンパ球(TIL)または末梢血リンパ球(PBL)である、請求項5記載のライブラリー。
- 抗体産生細胞が腫瘍罹患対象から単離される、請求項6記載のライブラリー。
- 腫瘍罹患対象が乳癌罹患対象である、請求項7記載のライブラリー。
- 請求項1〜3いずれか記載のベクターにより形質転換されている、宿主細胞。
- 請求項1〜3いずれか記載のベクター中にcDNA、合成または半合成抗体配列、または抗体の親和性成熟について変異したcDNAまたは合成または半合成抗体配列をクローニングして発現させる工程を含む、組換え抗体の選択および/または成熟を改善するための方法。
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