JP5424505B2

JP5424505B2 - ８−イソプラスタンを精製する方法

Info

Publication number: JP5424505B2
Application number: JP2012013211A
Authority: JP
Inventors: 哲小出; 憲二横山; 祥夫鈴木
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Tanita Corp
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Tanita Corp
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-01-25
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2032-01-25
Also published as: US20120220050A1; EP2492680A1; US8692047B2; JP2012194177A

Description

本発明は、８−イソプラスタンを精製する方法に関する。

８−イソプラスタンは、細胞膜やリポ蛋白に含まれるリン脂質がフリーラジカルで酸化されることによって生じるプロスタグランジン様の化合物である。尿や血清などの生体試料中に含まれる８−イソプラスタンを測定することにより、生体内における酸化ストレスを非浸襲的に評価することができ、免疫測定により８−イソプラスタンを測定するためのキットも市販されている。

生体試料中に含まれる８−イソプラスタンの分析では、分析精度を向上させるため、前処理により、蛋白質などの夾雑物を除去することが知られている。

例えば、特許文献１では、体液中に含まれる８−イソプラスタンの濃度を免疫測定により測定するため、除タンパク及び脱脂した検体をｎ−ヘキサンと２−プロパノールと酢酸とを特定の比率で配合した緩衝液に溶解してＮＨ_２カラムにかけ、洗浄及び溶出を行って前処理する技術が記載されている。

また、特許文献２には、固相容量の異なる固相抽出担体を用いた２ステップ固相抽出により、夾雑物質を除去すると共にＦ_２−イソプラスタン化合物を抽出する技術が記載されている。特許文献２において、かかる技術は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための溶媒交換、分析感度を高めるための濃縮ならびに試料の精製という３つのことを同時に短い時間で行うことを可能にするものとされている。

特開２００４−１５７１１９号公報国際公開第２００８／０６５８９５号パンフレット

しかしながら、上記文献記載の技術は、ヘキサン等の非極性溶媒を用いるため、毒性、環境への影響などを含めた安全性の点で問題がある。また、ディスポーザブルのプラスチック製の器具は、ヘキサンに耐性がないため、こうした手軽かつ清潔な器具を使用できないなど、作業の簡便性にも改善の余地があった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、安全でかつ簡便に８−イソプラスタンを精製できる技術を提供するものである。

本発明によれば、
第四級アンモニウム塩が固定化されたイオン交換担体に、８−イソプラスタンを含む液体試料を接触させて、前記液体試料中の８−イソプラスタンを前記イオン交換担体に保持させるステップと、
水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第一溶出液を用いて、８−イソプラスタンを前記イオン交換担体から溶離するステップと、
を含む、８−イソプラスタンを精製する方法が提供される。

また、本発明によれば、
上記の８−イソプラスタンを精製する方法により精製された８−イソプラスタンを用いて８−イソプラスタンを分析する方法が提供される。

また、本発明によれば、
上記の８−イソプラスタンを精製する方法に用いられる、８−イソプラスタンを精製するためのキットが提供される。

さらに、本発明によれば、
上記の８−イソプラスタンを分析する方法に用いられる、８−イソプラスタンを分析するためのキットが提供される。

この発明によれば、第四級アンモニウム塩が固定化されたイオン交換担体を用いることにより、８−イソプラスタンが第四級アンモニウムに保持されるため、液体試料中に含まれるカチオン性物質や非イオン性物質と８−イソプラスタンとを分離することができる。また、８−イソプラスタンは、毒性や環境への影響が少ない水溶性有機溶媒と水とを主成分とする溶出液により、該イオン交換担体から容易に溶離できるため、第四級アンモニウム塩に強固に吸着するアニオン性物質と８−イソプラスタンとを簡便に分離することができる。したがって、安全でかつ簡便に８−イソプラスタンを精製することができる。

本発明によれば、安全でかつ簡便に８−イソプラスタンを精製することができる。

実施の形態に係る８−イソプラスタンを精製する方法を説明するフローチャートである。実施の形態に係る８−イソプラスタンを精製する方法を説明するフローチャートである。実施例を示す図である。実施例を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。

図１は、本実施の形態の８−イソプラスタン（８−ＩＰ）の精製方法を説明するフローチャートである。本実施の形態は、図１で示すように、８−イソプラスタンを含む液体試料を用意するステップ（Ｓ１０１）と、第四級アンモニウム塩が固定化されたイオン交換担体に、８−イソプラスタンを含む液体試料を接触させて、液体試料中の８−イソプラスタンをイオン交換担体に保持させるステップ（Ｓ１０２）と、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第一溶出液を用いて、８−イソプラスタンをイオン交換担体から溶離するステップ（Ｓ１０３）と、を含む。

Ｓ１０１において、８−イソプラスタンを含む液体試料は、８−イソプラスタンをイオン交換担体に保持できる組成であれば限定されないが、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする液体に８−イソプラスタンが溶解したものが好ましい。本明細書において、「水溶性有機溶媒と水とを主成分とする」という場合、液体中、水溶性有機溶媒の含有量と水の含有量との合計が、５０体積％以上であることが好ましく、８０体積％以上であることがより好ましく、９０体積％以上であることがさらに好ましい。

本実施の形態において、水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール及びアセトニトリルからなる群から選択される一種又は二種以上の水溶性有機溶媒を用いることができるが、安全性の観点からエタノールがより好ましい。液体試料中のエタノールの含有量は、８−イソプラスタンが溶解し、かつ、イオン交換担体に８−イソプラスタンを保持させることができればよいが、例えば、１０〜５０体積％とすることができる。

また、８−イソプラスタンを含む液体試料は、緩衝液を含むことが好ましい。緩衝液として、たとえばｐＨ５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５に調節された緩衝液が挙げられる。本明細書において、緩衝液は、所定の酸を水に溶解したものであり、その種類は、ｐＨによって適宜選択することができる。例えば、ｐＨ５．５〜５．６の範囲では酢酸緩衝液、ｐＨ５．５〜６．２の範囲ではクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．０の範囲では、クエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５．５〜８．５の範囲では、リン酸緩衝液、ｐＨ７．２〜８．５の範囲では、トリスリン酸緩衝液を用いることができる。

液体試料としては、中でも、エタノールとリン酸緩衝液との混合液に８−イソプラスタンを溶解させたものが好ましい。本明細書において、「リン酸緩衝液」とは、所定のｐＨを有する水とリン酸及び／又はリン酸塩との混合液であり、リン酸緩衝液のｐＨは、５．５〜８．５であることが好ましく、６．０〜８．０であることがより好ましく、６．５〜７．５がさらに好ましい。「リン酸緩衝液」中に含まれるリン酸塩は、リン酸のナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩の一種又はこれらの組み合わせとすることができる。特に、エタノールとリン酸緩衝液（ｐＨ７）との混合液に８−イソプラスタンを溶解させるとより好ましい。なお、本明細書において、ｐＨは、２５℃で測定したものをいう。

８−イソプラスタンを含む液体試料は、生体試料を前処理して用意することもできる。図２は、生体試料の前処理方法を説明するフローチャートである。この前処理方法は、８−イソプラスタン（８−ＩＰ）を含む生体試料を用意するステップ（Ｓ２０１）と、８−イソプラスタンを含む生体試料と逆相担体とを接触させて、逆相担体に８−イソプラスタンを保持させるステップ（Ｓ２０２）と、８−イソプラスタンを保持させた状態で、逆相担体を洗浄するステップ（Ｓ２０３）と、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第二溶出液を用いて、８−イソプラスタンを逆相担体から溶離させて、液体試料を得るステップと（Ｓ２０４）とを含む。

Ｓ２０１において用意される生体試料としては、尿、血液、唾液等の体液が挙げられるが、以下、試料が尿である場合を例に説明する。採取する尿の量は、測定をより確実に行う観点から、たとえば０．５〜５０ｍＬ、好適には１．０〜１０ｍＬ、より好適には１．５〜５．０ｍＬとする。採取された原尿そのものを使うことが可能である。また、尿を所定の緩衝液又は水で希釈して用いてもよいし、キレート剤等の添加剤を加えても良い。尿は採取後直ちに処理されることが好ましいが、数時間から数日後であってもよい。

Ｓ２０２において用いる逆相担体は、官能基として炭素数１〜３０の直鎖の炭化水素基をもつ材料により構成されていること好ましく、生体試料中の８−イソプラスタンをより効率的に処理する観点から、炭素数が８〜２２の直鎖の炭化水素基がより好ましく、炭素数が１０〜２０の直鎖の炭化水素基が特に好ましい。逆相担体の量は、尿量に対して０．１〜１０倍量とすることができる。

逆相担体の材料として、さらに具体的には、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）基を化学結合させたシリカゲルが挙げられる。このとき、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）基を化学結合させたシリカゲルにおけるシリル化剤の結合様式は、シリル化剤がシリカゲル中のシラノール基と１対１で結合している様式、つまりモノメリックな結合様式とするとよい。これにより、逆相系充填剤が過度に疎水性とならないようにすることができる。また、逆相担体は、さらに好適な疎水性を有するという観点から、担体表面の炭素（Ｃ）の含有量が、元素比で１８％以下が好ましく、１５％以下とするとより好ましい。

また、逆相担体は、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子を粒子数として１〜２０累積％含むことがより好ましい。また、さらに上記装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として６５〜９９累積％含んでいてもよく、より好ましくは、７８〜９９累積％含んでいてもよい。こうすることで、分子量や性質等の性状が８−イソプラスタンとわずかに異なる夾雑物が含まれている場合にも、これらを簡便で確実に分離することができる。この理由としては、粒子径が異なる粒子を特定の比率で配合することにより、大きな粒子の間に小さな粒子が入り込み、単位体積あたりの担体の表面積が最大となり、８−イソプラスタンの保持力が向上することが考えられる。

さらに、８−イソプラスタンの分離を効率よく行う観点から、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子を粒子数として含む割合は、好ましくは４〜１９累積％、さらに好ましくは４〜１３累積％、特に好ましくは６〜１３累積％である。また、上記装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として含む割合は、好ましくは６８〜９５累積％、さらに好ましくは７８〜９３累積％、特に好ましくは８５〜９１累積％である。

なお、フロー式粒子像分析装置は、測定対象の粒子を含む試料が流れるフローセルにストロボ光等の光を照射して、通過中の粒子の画像を取得し、画像解析により円相当径等の粒子形状を示すパラメータを算出する装置である。実際には隋円形などに崩れた粒子が存在するため、円相当径とは、実際に測定した粒子の粒子投影面積と同じ投影面積を持つ球を想定し、その球の直径と定義している。フロー式粒子像分析装置の具体例としては、シスメックス社製ＦＰＩＡ−３０００が挙げられる。

また、逆相担体は、沈降法で測定される粒径３５〜６０μｍの粒子と、コールター法で測定される粒径１０〜３０μｍの粒子とを含むことができ、粒径３５〜６０μｍの粒子と、粒径１０〜３０μｍの粒子との重量比を、８０：２０〜９５：５の範囲にすることができる。このようにすれば、８−イソプラスタンの回収率をさらに向上させることができる。粒径３５〜６０μｍの粒子と、粒径１０〜３０μｍの粒子との重量比は、８−イソプラスタンの回収率と分離時間とのバランスを向上させる観点から、好ましくは９０：１０とする。

生体試料は、予め水及びアルコールで十分にコンディショニングされた逆相担体と接触させることが好ましく、エタノールと純水（さらには緩衝液）でコンディショニングされているとより好ましい。生体試料と逆相担体との接触方法は特に限られず、バッチ法でもカラム法でもよいが、効率よく８−イソプラスタンを濃縮できるという観点から、カラム法が好適である。ステップＳ２０２では、逆相担体と移動相との組み合わせとして、例えばオクタデシル（ＯＤＳ）基を化学結合させたシリカゲルとリン酸緩衝液−エタノールの混合液との組み合わせが用いられる。

その後、所定の緩衝液等を洗浄液として逆相担体に流し、逆相担体に捕捉されない物質を洗い流す（Ｓ２０３）。Ｓ２０３における洗浄液は、例えば、ｐＨが５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５に調節された緩衝液を含むことが好ましく、中でもエタノールとリン酸緩衝液との混合液が好ましく、洗浄液中、０〜７０体積％、好ましくは０〜５０体積％、より好ましくは０〜３０体積％のエタノールを含有することがより好ましい。洗浄液の量は、１〜１００ｍＬ、好ましくは１〜５０ｍＬ、より好ましくは１〜２０ｍＬとすることができる。また、エタノールの含量を徐々に増加させるとより好ましく、０〜２０体積％含有エタノール／リン酸緩衝液で洗浄した後、２０〜４０体積％含有エタノール／リン酸緩衝液で洗浄し、さらに、４０〜６０体積％含有エタノール／リン酸緩衝液で洗浄するとより好ましい。

洗浄後、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第二溶出液を用いて、逆相担体に保持した８−イソプラスタンを逆相担体から溶離する（Ｓ２０４）。第二溶出液は、エタノール、アセトニトリル、メタノール等の水溶性有機溶媒を含有することができ、その濃度は、第二溶出液中、１０〜１００体積％、好ましくは、３０〜１００体積％とすることができる。第二溶出液は、緩衝液とすることが好ましく、第二溶出液のｐＨは、例えば、５．５〜８．５、好ましくは６〜８、より好ましくは６．５〜７．５とする。また第二溶出液は、エタノールとリン酸緩衝液との混合液がより好ましく、第二溶出液中、１０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％、より好ましくは５０〜１００体積％のエタノールを含有することがより好ましい。第二溶出液は、０．５〜１０ｍＬを通液させ、０．７〜１．７ｍＬにかけて溶出する約１ｍＬを回収する。なお、溶出液量及び回収液量は使用する逆相担体の大きさ、サンプル量等に応じて、増減可能である。このようにして、８−イソプラスタンを含む液体試料を用意することもできる（Ｓ１０１）。

ステップＳ１０２では、用意した８−イソプラスタンを含む液体試料を第四級アンモニウム塩が固定化されたイオン交換担体に導入する。第四級アンモニウム塩としては、式（１）で表されるテトラアルキルアンモニウム塩が好ましい。

〔式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３が炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが１〜５であり、Ｂが樹脂基材又はシリカゲルであり、Ｘ⁻が塩化物イオンである。〕

式（１）で表されるイオン交換担体としては、中でもＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３がメチル基であり、ｎが３のトリメチルアンモニウムプロピル基が固定化されたものが好ましい。また、式（１）中、Ｂは、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体等からなる樹脂基材又はシリカゲルであるが、シリカゲルがより好ましい。使用するイオン交換担体の量は、第四級アンモニウム塩の含量（ｅｑ）が、液体試料中に含まれる８−イソプラスタンの物質量に対して、１〜１０００００倍にすることが好ましいが、例えば、尿中の８−イソプラスタンを精製する場合、１ｍＬの尿に対して、０．０１〜１ｅｑとなる量にすることができる。

液体試料とイオン交換担体との接触方法は特に限られず、バッチ法でもカラム法でもよいが、生体試料中の８−イソプラスタンを精製する場合は、カラム法が好適である。イオン交換担体は、第四級アンモニウム塩の対イオンを塩化物イオンにしておくことが好ましい。塩酸や食塩水等をイオン交換担体に接触させることで、第四級アンモニウム塩の対イオンを塩化物イオンにすることができる。その後、充分な水及びアルコール、所定の緩衝液で平衡化しておく。緩衝液として、たとえばｐＨ５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５に調節されたリン酸緩衝液が挙げられる。また、この緩衝液は、０〜１００体積％、好ましくは１０〜８０体積％の水溶性有機溶媒（特に、エタノール）を含有することが好ましい。

カラム法の場合、コンディショニングされたイオン交換担体に液体試料を流し、８−イソプラスタンをイオン交換担体に保持させた後、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする洗浄液によって、イオン交換担体に捕捉されていないカチオン物質や非イオン物質を洗い流す。洗浄液として、たとえば液体試料の調製に用いられた溶液（第二溶出液を含む）と同じもの、または略同一のものを用いることができる。具体的には、Ｓ１０２における洗浄液は、エタノール、アセトニトリル、メタノール等の水溶性有機溶媒を含有することができ、その濃度は、洗浄液中、１０〜１００体積％、好ましくは、３０〜１００体積％とすることができる。Ｓ１０２における洗浄液もまた、緩衝液を含むことが好ましく、ｐＨが、例えば、５．５〜８．５、好ましくは６〜８、より好ましくは６．５〜７．５の緩衝液を用いることができる。また、エタノールとリン酸緩衝液との混合液がより好ましく、洗浄液中、０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％、より好ましくは５０〜１００体積％のエタノールを含有させることができる。洗浄液の量は、０．１〜１００ｍＬ、好ましくは０．１〜５０ｍＬ、より好ましくは０．１〜２０ｍＬとすることができる。

洗浄後、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第一溶出液を用いて、イオン交換担体に保持した８−イソプラスタンをイオン交換担体から溶離する（Ｓ１０３）。第一溶出液は、エタノール、アセトニトリル、メタノール等の水溶性有機溶媒を含有することができ、その濃度は、第一溶出液中、１０〜１００体積％、好ましくは、３０〜１００体積％とすることができる。第一溶出液は、緩衝液を含むことが好ましく、例えば、ｐＨ５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の緩衝液を含んでいてもよい。また、エタノールとリン酸緩衝液との混合液がより好ましく、第一溶出液中、０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％より好ましくは５０〜１００体積％のエタノールを含有することがより好ましい。第一溶出液は、０．１〜１０ｍＬを通液させ、１．５〜２．５ｍＬにかけて溶出する約１ｍＬを回収する。なお、溶出液量及び回収液量は、使用する担体の大きさ、サンプル量等に応じて、増減可能である。このようにして、８−イソプラスタンの精製をすることができる。

回収された液体中には、８−イソプラスタンが濃縮されており、８−イソプラスタンの測定に供することができる。なお、８−イソプラスタンの分析前に回収液中の溶媒を、適宜除去してもよい。

８−イソプラスタンの測定方法としては、免疫測定法、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等が挙げられる。また、８−イソプラスタンを蛍光標識し、液体クロマトグラフィーにより分析する方法を用いてもよい。蛍光標識には、カルボン酸の蛍光標識化剤を用いることができ、例えば、４−アシルアミノ−７−メルカプト−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（特開２００１−８１０８２号公報）、ベンゾトリアゾール誘導体（特開平１−３０８２６８号公報）、キノキサリン誘導体（特開平３−２９１２７２号公報）等を用いることができるが、中でも、温和に標識できるという観点から、２，３，４−テトラヒドロ−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−オキソキノキサリン−３−プロピオン酸ヒドラジド（ＤＭＥＱ−Ｈ）が好ましい。

上記本実施の形態に係る８−イソプラスタンを精製する方法に用いられる、８−イソプラスタンを精製するためのキットは、第四級アンモニウム塩が固定化されたイオン交換担体と、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第一溶出液とを含むものであればよいが、トリメチルアンモニウムプロピル基がシリカゲルに固定化されたイオン交換担体と、エタノールとリン酸緩衝液とを含むｐＨ６．５〜７．５の第一溶出液とを備えたものが好ましい。第一溶出液は、エタノールとリン酸緩衝液とを別々に包装し、ユーザにおいて調製する形態であってもよい。なお、こうしたキットには、本実施の形態に係る８−イソプラスタンを精製する方法が記載された使用説明書が添付されている。さらに、８−イソプラスタンを精製するための当該キットは、８−イソプラスタンを分析するためのキットとしてもよい。

また、生体試料中に含まれる８−イソプラスタンを分析するためのキットとしては、上記の８−イソプラスタンを精製するためのキットに加え、官能基として炭素数１〜３０の直鎖の炭化水素基を有し、担体表面の炭素含有量が元素比で１８％以下である材料により構成されている上記の逆相担体と、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第二溶出液とをさらに備えるものとすることができる。第二溶出液は、エタノールとリン酸緩衝液とを含むｐＨ６．５〜７．５のものが好ましい。第二溶出液もまた、第一溶出液と同様に、エタノールとリン酸緩衝液とを別々に包装し、ユーザにおいて調製する形態であってもよい。こうしたキットには、前述した生体試料中の８−イソプラスタンを精製する方法、及び、この方法により精製された８−イソプラスタンを分析する方法が記載された使用説明書が添付されている。

以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
例えば、実施の形態では、尿中の８−イソプラスタンを精製する場合を例に説明したが、血清中の８−イソプラスタンを精製する場合は、８−イソプラスタンの正常値が尿中の１００分の１程度であるため、定量前に、濃縮操作を行ってもよい。たとえば、血清サンプルを５０℃のヒートブロックにセットし、窒素気流下で溶媒を除去するなど、１００倍の濃縮操作を追加する。こうすることで、例えば、８−イソプラスタンを蛍光標識によりＨＰＬＣ分析するとき、血清中の８−イソプラスタンのピークを明瞭に観察することができる。

実施例１
逆相担体として、ＹＭＣ社製ＯＤＳ−ＡＱの粒径５０μｍ及び２０μｍを、５０μｍ：２０μｍ＝９０：１０の重量比で、均質になるように混合して、逆相カラム充填材を調製した。粒径５０μｍは沈降法、粒径２０μｍはコールター法により測定した。調製した逆相カラム充填材は、フロー式粒子像分析装置（シスメックス社製ＦＰＩＡ−３０００）で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子径を粒子数として１０累積％含み、上記装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として９０累積％含んでいた。この充填材を５００ｍｇ充填した逆相カラムを準備し、エタノール、水の順で通液し、コンディショニングを行った。
この逆相カラムに、１．４ｍＬの尿（産業技術総合研究所ボランティア（ヒト）、産業技術総合研究所倫理審査委員会承認番号１５０００−Ａ−２００８１２１５−００１）と、０．６ｍＬの８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、４ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）含有）とを混ぜ合わせた合計２ｍＬのサンプルを導入した。そして、洗浄液として、下記（i）、（ii）、（iii）を用い、順に洗浄した。
（i）２％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：６．０ｍＬ
（ii）３０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：４．０ｍＬ
（iii）５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：０．８ｍＬ
その後、５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．７ｍＬを通液して得られるフラクションを８−イソプラスタンを含有するフラクションとして回収した。
ついで、イオン交換担体として、Ｖａｒｉａｎ製のＳＡＸ（イオン交換容量：０．８ｍｅｑ／ｇ、充てん剤量０．５ｇ、カラムサイズ３ｍＬ、カラム形状注射筒型、ポリプロピレン）を準備し、逆相担体から回収した８−イソプラスタンを含有するフラクションをコンディショニングしたＳＡＸに導入した。ＳＡＸのコンディショニングは、エタノール及び純水を順に通液して行った。８−イソプラスタンが導入されたＳＡＸは、０．４ｍＬの５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍＬを通液して得られるフラクションを８−イソプラスタンを含有するフラクションとして回収した。

比較例１
逆相担体から溶出した８−イソプラスタンを含有するフラクションをＳＡＸに通さなかった以外は、実施例１と同様にした。

実施例２
実施例１において、異なる検体から得られた尿サンプルを用いた以外は、同様にして行った。

比較例２
逆相担体から溶出した８−イソプラスタンを含有するフラクションをＳＡＸに通さなかった以外は、実施例２と同様にした。

［評価］
実施例１、２、比較例１、２の各フラクションを１５０μＬとり、７５μＬの試薬Iと、６０μＬの試薬IIと、１５μＬの試薬IIIとに混合し、７０℃で２０分間反応させた。その後、１０分間流水で冷却した。Ｖａｒｉａｎ製のＳＣＸ（イオン交換容量：０．８ｍｅｑ／ｇ、充てん剤量０．２５ｇ、カラムサイズ３ｍＬ、カラム形状注射筒型、ポリプロピレン）をエタノール及び純水の順でコンディショニングして準備し、冷却した反応液を導入した。８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬで洗浄した後、８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬを通液して得られるフラクションを８−イソプラスタンの分析サンプルとして回収した。回収した分析サンプルは、そのままＨＰＬＣに注入した。
＜試薬＞
・試薬I：１０ｍＭ１，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐プロピオン酸ヒドラジド（ＤＭＥＱ−Ｈ）／ジメチルホルムアミド
・試薬II：１０％（ｖ／ｖ）ピリジン／２０ｍＭ塩酸含有エタノール
・試薬III：０．５Ｍ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミド塩酸塩／精製水
＜ＨＰＬＣ条件＞
流速１．２ｍＬ／分
カラムオーブン５０℃
分析カラムＤｉｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳＭＧ５（２５０ｍｍ、φ４．６ｍｍ）
注入量１０μＬ
蛍光検出器Ｅｘ：３６７ｎｍ、Ｅｍ：４４５ｎｍ
移動相メタノール：２５ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）＝５５：４５（アイソクラティック）

ＨＰＬＣチャートを図３、４に示す。図３中、Ａが実施例１、Ｂが比較例１である。図４中、Ａが実施例２、Ｂが比較例２である。実施例１，２は２回行い、図３（ａ）のＡは、１回目に行った実施例１のチャート図を示し、図３（ｂ）のＡは、２回目に行った実施例１のチャート図を示した。また、図４（ａ）のＡは、１回目に行った実施例２のチャート図を示し、図４（ｂ）のＡは、２回目に行った実施例２のチャート図を示した。図３、４中、Ｃは、８−イソプラスタンの標準品（Ｃａｙｍａｎ社製）２ｎｇを８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬに溶解して、各実施例及び比較例と同様に評価したものである。また、図３、４中、Ｄは、Ａの実施例１で用いた検体中に８−イソプラスタンの標準品溶液（１０ｎｇ／ｍＬ）を始めに混合し、カラム処理を実施したものである。図３（ａ）のＤが１回目に行った実施例１の検体と上記８−イソプラスタンの標準品溶液を混合したものであり、図３（ｂ）のＤが２回目に行った実施例１の検体と上記８−イソプラスタンの標準品溶液を混合したものである。図４（ａ）のＤが１回目に行った実施例２の検体と上記８−イソプラスタンの標準品溶液を混合したものであり、図４（ｂ）のＤが２回目に行った実施例２の検体と上記８−イソプラスタンの標準品溶液を混合したものである。図３中、Ｃのチャートが示すように、８−イソプラスタンの保持時間は、約１９分である。比較例は、８−イソプラスタンのピークが夾雑物のピークに隠れてしまうが、実施例では、８−イソプラスタンのピークを確認することができる。

Claims

第四級アンモニウム塩が固定化されたイオン交換担体に、８−イソプラスタンを含む液体試料を接触させて、前記液体試料中の８−イソプラスタンを前記イオン交換担体に保持させるステップと、
水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第一溶出液を用いて、８−イソプラスタンを前記イオン交換担体から溶離するステップと、
を含む、８−イソプラスタンを精製する方法。
前記イオン交換担体が下記一般式（１）で表されるテトラアルキルアンモニウム塩が固定化されたものである、請求項１に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。

〔式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３が炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが１〜５であり、Ｂが樹脂基材又はシリカゲルであり、Ｘ⁻が塩化物イオンである。〕
８−イソプラスタンを含む生体試料と逆相担体とを接触させて、前記逆相担体に８−イソプラスタンを保持させるステップと、
８−イソプラスタンを前記逆相担体に保持させた状態で、前記逆相担体を洗浄するステップと、
水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第二溶出液を用いて、８−イソプラスタンを前記逆相担体から溶離させて、前記液体試料を得るステップと、
をさらに含み、
前記逆相担体が、官能基として炭素数１〜３０の直鎖の炭化水素基を有し、担体表面の炭素含有量が元素比で１８％以下である材料により構成されている、請求項１又は２に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。
前記逆相担体が、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子を粒子数として１〜２０累積％含む、請求項３に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。
前記逆相担体が、さらに、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として６５〜９９累積％含む、請求項４に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。
前記逆相担体の材料が、オクタデシルシリル基を有するシリカゲルである、請求項３乃至５いずれか１項に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。
前記逆相担体が、沈降法で測定される粒径３５〜６０μｍの粒子と、コールター法で測定される粒径１０〜３０μｍの粒子とを含み、粒径３５〜６０μｍの前記粒子と、粒径１０〜３０μｍの前記粒子との重量比が、８０：２０〜９５：５の範囲である、請求項３乃至６いずれか１項に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。
前記生体試料が尿、唾液又は血液である、請求項３乃至７いずれか１項に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。
前記水溶性有機溶媒がエタノールである、請求項１乃至８いずれか１項に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。
前記第一溶出液のｐＨが６．５〜７．５である、請求項１乃至９いずれか１項に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。
前記第一溶出液がリン酸緩衝液を含む、請求項１０に記載の８−イソプラスタンを精製する方法。