JP5424505B2 - 8−イソプラスタンを精製する方法 - Google Patents
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Description
第四級アンモニウム塩が固定化されたイオン交換担体に、8−イソプラスタンを含む液体試料を接触させて、前記液体試料中の8−イソプラスタンを前記イオン交換担体に保持させるステップと、
水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第一溶出液を用いて、8−イソプラスタンを前記イオン交換担体から溶離するステップと、
を含む、8−イソプラスタンを精製する方法が提供される。
上記の8−イソプラスタンを精製する方法により精製された8−イソプラスタンを用いて8−イソプラスタンを分析する方法が提供される。
上記の8−イソプラスタンを精製する方法に用いられる、8−イソプラスタンを精製するためのキットが提供される。
上記の8−イソプラスタンを分析する方法に用いられる、8−イソプラスタンを分析するためのキットが提供される。
例えば、実施の形態では、尿中の8−イソプラスタンを精製する場合を例に説明したが、血清中の8−イソプラスタンを精製する場合は、8−イソプラスタンの正常値が尿中の100分の1程度であるため、定量前に、濃縮操作を行ってもよい。たとえば、血清サンプルを50℃のヒートブロックにセットし、窒素気流下で溶媒を除去するなど、100倍の濃縮操作を追加する。こうすることで、例えば、8−イソプラスタンを蛍光標識によりHPLC分析するとき、血清中の8−イソプラスタンのピークを明瞭に観察することができる。
逆相担体として、YMC社製ODS−AQの粒径50μm及び20μmを、50μm:20μm=90:10の重量比で、均質になるように混合して、逆相カラム充填材を調製した。粒径50μmは沈降法、粒径20μmはコールター法により測定した。調製した逆相カラム充填材は、フロー式粒子像分析装置(シスメックス社製FPIA−3000)で測定される円相当径0.5〜10μmの粒子径を粒子数として10累積%含み、上記装置で測定される円相当径20〜100μmの粒子を粒子数として90累積%含んでいた。この充填材を500mg充填した逆相カラムを準備し、エタノール、水の順で通液し、コンディショニングを行った。
この逆相カラムに、1.4mLの尿(産業技術総合研究所ボランティア(ヒト)、産業技術総合研究所倫理審査委員会承認番号15000−A−20081215−001)と、0.6mLの80mMリン酸緩衝液(pH7.0、4mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)含有)とを混ぜ合わせた合計2mLのサンプルを導入した。そして、洗浄液として、下記(i)、(ii)、(iii)を用い、順に洗浄した。
(i)2%(v/v)エタノール含有10mMリン酸緩衝液(pH7.0):6.0mL
(ii)30%(v/v)エタノール含有10mMリン酸緩衝液(pH7.0):4.0mL
(iii)50%(v/v)エタノール含有10mMリン酸緩衝液(pH7.0):0.8mL
その後、50%(v/v)エタノール含有10mMリン酸緩衝液(pH7.0)0.7mLを通液して得られるフラクションを8−イソプラスタンを含有するフラクションとして回収した。
ついで、イオン交換担体として、Varian製のSAX(イオン交換容量:0.8meq/g、充てん剤量0.5g、カラムサイズ3mL、カラム形状注射筒型、ポリプロピレン)を準備し、逆相担体から回収した8−イソプラスタンを含有するフラクションをコンディショニングしたSAXに導入した。SAXのコンディショニングは、エタノール及び純水を順に通液して行った。8−イソプラスタンが導入されたSAXは、0.4mLの50%(v/v)エタノール含有10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、50%(v/v)エタノール含有10mMリン酸緩衝液(pH7.0)0.8mLを通液して得られるフラクションを8−イソプラスタンを含有するフラクションとして回収した。
逆相担体から溶出した8−イソプラスタンを含有するフラクションをSAXに通さなかった以外は、実施例1と同様にした。
実施例1において、異なる検体から得られた尿サンプルを用いた以外は、同様にして行った。
逆相担体から溶出した8−イソプラスタンを含有するフラクションをSAXに通さなかった以外は、実施例2と同様にした。
実施例1、2、比較例1、2の各フラクションを150μLとり、75μLの試薬Iと、60μLの試薬IIと、15μLの試薬IIIとに混合し、70℃で20分間反応させた。その後、10分間流水で冷却した。Varian製のSCX(イオン交換容量:0.8meq/g、充てん剤量0.25g、カラムサイズ3mL、カラム形状注射筒型、ポリプロピレン)をエタノール及び純水の順でコンディショニングして準備し、冷却した反応液を導入した。8%(v/v)エタノール含有10mMリン酸緩衝液(pH7.0)0.2mLで洗浄した後、8%(v/v)エタノール含有10mMリン酸緩衝液(pH7.0)0.2mLを通液して得られるフラクションを8−イソプラスタンの分析サンプルとして回収した。回収した分析サンプルは、そのままHPLCに注入した。
<試薬>
・試薬I:10mM 1,2,3,4‐テトラヒドロ‐6,7‐ジメトキシ‐1‐メチル‐2(1H)‐オキソキノキサリン‐3‐プロピオン酸ヒドラジド(DMEQ−H)/ジメチルホルムアミド
・試薬II:10%(v/v)ピリジン/20mM塩酸含有エタノール
・試薬III:0.5M 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミド塩酸塩/精製水
<HPLC条件>
流速 1.2mL/分
カラムオーブン 50℃
分析カラム Divelosil ODS MG5(250mm、φ4.6mm)
注入量 10μL
蛍光検出器 Ex:367nm、Em:445nm
移動相 メタノール:25mM 酢酸/酢酸ナトリウム(pH4.5)=55:45(アイソクラティック)
Claims (11)
- 第四級アンモニウム塩が固定化されたイオン交換担体に、8−イソプラスタンを含む液体試料を接触させて、前記液体試料中の8−イソプラスタンを前記イオン交換担体に保持させるステップと、
水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第一溶出液を用いて、8−イソプラスタンを前記イオン交換担体から溶離するステップと、
を含む、8−イソプラスタンを精製する方法。 - 8−イソプラスタンを含む生体試料と逆相担体とを接触させて、前記逆相担体に8−イソプラスタンを保持させるステップと、
8−イソプラスタンを前記逆相担体に保持させた状態で、前記逆相担体を洗浄するステップと、
水溶性有機溶媒と水とを主成分とする第二溶出液を用いて、8−イソプラスタンを前記逆相担体から溶離させて、前記液体試料を得るステップと、
をさらに含み、
前記逆相担体が、官能基として炭素数1〜30の直鎖の炭化水素基を有し、担体表面の炭素含有量が元素比で18%以下である材料により構成されている、請求項1又は2に記載の8−イソプラスタンを精製する方法。 - 前記逆相担体が、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径0.5〜10μmの粒子を粒子数として1〜20累積%含む、請求項3に記載の8−イソプラスタンを精製する方法。
- 前記逆相担体が、さらに、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径20〜100μmの粒子を粒子数として65〜99累積%含む、請求項4に記載の8−イソプラスタンを精製する方法。
- 前記逆相担体の材料が、オクタデシルシリル基を有するシリカゲルである、請求項3乃至5いずれか1項に記載の8−イソプラスタンを精製する方法。
- 前記逆相担体が、沈降法で測定される粒径35〜60μmの粒子と、コールター法で測定される粒径10〜30μmの粒子とを含み、粒径35〜60μmの前記粒子と、粒径10〜30μmの前記粒子との重量比が、80:20〜95:5の範囲である、請求項3乃至6いずれか1項に記載の8−イソプラスタンを精製する方法。
- 前記生体試料が尿、唾液又は血液である、請求項3乃至7いずれか1項に記載の8−イソプラスタンを精製する方法。
- 前記水溶性有機溶媒がエタノールである、請求項1乃至8いずれか1項に記載の8−イソプラスタンを精製する方法。
- 前記第一溶出液のpHが6.5〜7.5である、請求項1乃至9いずれか1項に記載の8−イソプラスタンを精製する方法。
- 前記第一溶出液がリン酸緩衝液を含む、請求項10に記載の8−イソプラスタンを精製する方法。
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