JP5414830B2 - Sphingomyelin-containing medicine - Google Patents

Description

本発明は、スフィンゴミエリンを含有し、新規な用途を有する医薬に関する。さらに詳しく言うと、本発明は、スフィンゴミエリンを含有し、シアロムチンの分泌促進剤、悪酔い予防剤、抗アレルギー剤、抗酸化剤、感染防御剤、養毛剤、脱髄疾患治療剤、抗色素沈着剤、または抗炎症剤である医薬並びにこれらの剤を配合した飲食品または飼料に関する。   The present invention relates to a medicament containing sphingomyelin and having a novel use. More specifically, the present invention comprises sphingomyelin, a sialomucin secretion promoter, a sickness prevention agent, an antiallergic agent, an antioxidant, an infection defense agent, a hair nourishing agent, a demyelinating disease therapeutic agent, an antipigmentation agent, Or it is related with the pharmaceutical which is an anti-inflammatory agent, the food-drinks or feed which mix | blended these agents.

スフィンゴミエリンは、リン脂質の一種で、乳中に多く存在しており、牛乳中においては、リン脂質の約３０％を占めている。スフィンゴミエリンは、スフィンゴシンと脂肪酸からなるセラミド骨格にホスホコリンが結合した構造を有しており、脳や神経組織にもに存在することが知られている。また、卵黄等の食品中にも僅かに含まれることが報告されている。
スフィンゴミエリンは、生体内で情報伝達系を介して細胞の増殖や分化に影響を及ぼしていることが知られている。さらに、老化に伴う脂質の消化吸収機能改善作用を有することが知られているが（特許文献１）、その他の作用についてはあまり知られていない。そのため、スフィンゴミエリンを有効成分とする医薬、飲食品や飼料の開発が期待されている。 Sphingomyelin is a kind of phospholipid and is abundant in milk, and accounts for about 30% of phospholipid in milk. Sphingomyelin has a structure in which phosphocholine is bound to a ceramide skeleton composed of sphingosine and a fatty acid, and is known to exist in the brain and nerve tissues. It is also reported that it is slightly contained in foods such as egg yolk.
It is known that sphingomyelin influences cell proliferation and differentiation in vivo via an information transmission system. Furthermore, although it is known that it has an action to improve the digestion and absorption function of lipids accompanying aging (Patent Document 1), little is known about other actions. Therefore, development of medicines, foods and drinks and feeds containing sphingomyelin as an active ingredient is expected.

特開平１１−２６９０７４号公報JP-A-11-269074

本発明は、スフィンゴミエリンの新規の医薬用途を見出し、種々の疾患の予防剤または治療剤として有効な医薬並びにこれらの剤を配合した飲食品及び飼料を提供することを課題とする。   An object of the present invention is to find a novel pharmaceutical use of sphingomyelin, and to provide a pharmaceutical effective as a preventive or therapeutic agent for various diseases, and a food and drink and a feed containing these agents.

本発明者らは、課題を解決するために、スフィンゴミエリンの有する薬理的効果について種々調べたところ、スフィンゴミエリンが新たな用途として、シアロムチンの分泌促進効果、悪酔い予防効果、抗アレルギー効果、抗酸化効果、感染防御効果、養毛効果、脱髄疾患治療効果、抗色素沈着効果または抗炎症効果を有することを見出し、本発明を完成させた。   In order to solve the problem, the present inventors conducted various studies on the pharmacological effects of sphingomyelin. As a new use, sphingomyelin is a sialomucin secretion promoting effect, sickness prevention effect, antiallergic effect, antioxidant. The present invention was completed by finding that it has an effect, an infection-protecting effect, a hair-restoring effect, a demyelinating disease treatment effect, an anti-pigmentation effect or an anti-inflammatory effect.

すなわち、本発明は、スフィンゴミエリンを有効成分として含有し、下記のいずれかの剤である医薬：１）悪酔い予防剤、２）抗アレルギー剤、３）抗酸化剤、４）感染防御剤、５）養毛剤、６）脱髄疾患治療剤、７）抗色素沈着剤または８）抗炎症剤である。
本発明はまた、スフィンゴミエリンが乳由来であることを特徴とする前記医薬である。 That is, the present invention contains a sphingomyelin as an active ingredient, and is a pharmaceutical which is one of the following agents: 1) anti-drunk agent, 2) anti-allergic agent, 3) antioxidant, 4) anti-infective agent, 5 A hair nourishing agent, 6) a demyelinating agent, 7) an anti-pigmentation agent, or 8) an anti-inflammatory agent.
The present invention is also the above-mentioned pharmaceutical, wherein sphingomyelin is derived from milk.

本発明によれば、スフィンゴミエリンを、１）悪酔い予防剤、２）抗アレルギー剤、３）抗酸化剤、４）感染防御剤、５）養毛剤、６）脱髄疾患治療剤、７）抗色素沈着剤または８）抗炎症剤として用いることができる。   According to the present invention, sphingomyelin is converted into 1) an agent for preventing sickness, 2) an antiallergic agent, 3) an antioxidant, 4) an anti-infective agent, 5) a hair nourishing agent, 6) a therapeutic agent for demyelinating disease, and 7) an anti-pigment. It can be used as a deposition agent or 8) an anti-inflammatory agent.

本発明の密着結合形成試験の結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of the tight bond formation test of this invention.

本発明において用いることができるスフィンゴミエリンは、特に限定されず、化学的に合成されたものや、天然由来のもの、例えば、牛乳やヤギ乳等の乳由来のものの他、鶏卵等の卵黄由来のものが挙げられるが、乳由来のものがより好ましい。乳の中でも牛乳由来のスフィンゴミエリン原料は、スフィンゴミエリンの含量が２５％以上と高濃度であり、安価なものも上市されているので、特に好ましい。   The sphingomyelin that can be used in the present invention is not particularly limited, and is chemically synthesized, naturally derived, for example, derived from milk such as milk or goat milk, or derived from egg yolk such as chicken egg. Although the thing is mentioned, the thing derived from milk is more preferable. Among the milk, the sphingomyelin raw material derived from milk is particularly preferable because the sphingomyelin content is as high as 25% or more, and inexpensive ones are commercially available.

なお、スフィンゴミエリンは、精製して純度を高めたものを用いてもよく、スフィンゴミエリンを含有するリン脂質の形態で使用してもよい。
スフィンゴミエリンやスフィンゴミエリン含有リン脂質については、例えば、乳やホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）等の乳製品をエーテルやアセトンで抽出する方法（特開平３−４７１９２号公報）により得られる乳由来のスフィンゴミエリン含有リン脂質（リン脂質中スフィンゴミエリン約２８重量％含有）を使用することができる。また、バターを加温融解することにより得られるバターカードやバターセーラムを含む水性画分を、スフィンゴミエリン含有リン脂質（リン脂質中スフィンゴミエリン約９重量％含有）として使用することができる。さらに、バターミルクやバターセーラム中に含まれる乳脂肪球皮膜画分を、スフィンゴミエリン含有リン脂質（リン脂質中スフィンゴミエリン約９重量％含有）として使用することができる。そして、これらのスフィンゴミエリン含有リン脂質を透析、硫安分画、ゲルろ過、等電点沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、溶媒分画等の手法により精製することにより純度を高めたスフィンゴミエリンを使用してもよい。 The sphingomyelin may be purified and purified, or may be used in the form of a phospholipid containing sphingomyelin.
Regarding sphingomyelin and sphingomyelin-containing phospholipids, for example, milk-derived sphingos obtained by a method of extracting dairy products such as milk and whey protein concentrate (WPC) with ether or acetone (JP-A-3-47192). Myelin-containing phospholipids (containing about 28% by weight of sphingomyelin in phospholipids) can be used. Further, an aqueous fraction containing butter curd and butter serum obtained by heating and melting butter can be used as sphingomyelin-containing phospholipid (containing about 9% by weight of sphingomyelin in phospholipid). Furthermore, the milk fat globule membrane fraction contained in buttermilk or buttersarum can be used as sphingomyelin-containing phospholipids (containing about 9% by weight of sphingomyelin in phospholipids). And, using sphingomyelin with increased purity by purifying these sphingomyelin-containing phospholipids by methods such as dialysis, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, isoelectric precipitation, ion exchange chromatography, solvent fractionation, etc. Also good.

本発明の医薬は、種々の剤型を有する製剤として用いることができ、剤型は特に限定されない。したがって、スフィンゴミエリン及び／またはスフィンゴミエリンを含有するリン脂質を、錠剤、カプセル剤、粉剤、液剤等種々の剤型の製剤に配合することができる。
また、本発明の飲食品の種類も特に限定されず、牛乳、加工乳、乳飲料、ヨーグルト、清涼飲料水、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食、さらには、栄養補給用組成物に配合することができる。また、本発明の飼料の種類も特に限定されるものではない。
なお、本発明の医薬、飲食品及び飼料は、スフィンゴミエリンを含有すること以外は、常法により製造することができる。 The medicament of the present invention can be used as a preparation having various dosage forms, and the dosage form is not particularly limited. Therefore, sphingomyelin and / or phospholipids containing sphingomyelin can be blended in various dosage forms such as tablets, capsules, powders, and liquids.
In addition, the type of food and drink of the present invention is not particularly limited, and food and drink such as milk, processed milk, milk drink, yogurt, soft drink, coffee drink, juice, jelly, wafer, biscuit, bread, noodle, sausage and the like It can mix | blend with a nutritional supplement and the composition for a nutritional supplement. Moreover, the kind of feed of this invention is not specifically limited.
In addition, the pharmaceutical of this invention, food-drinks, and feed can be manufactured by a conventional method except containing sphingomyelin.

本発明において、各薬理的効果を発揮させるためには、用途によって異なるが、スフィンゴミエリンとして、１日当たり一般的に０．１〜１００ｍｇ程度摂取できるように、医薬、飲食品や飼料への配合量等を調整すればよい。   In this invention, in order to exhibit each pharmacological effect, although it changes with uses, as a sphingomyelin, the compounding quantity to a pharmaceutical, food-drinks, and feed so that about 0.1-100 mg can generally be ingested per day. Etc. may be adjusted.

以下、実施例および試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。実施例および試験例における「％」は断らない限り「重量％」を意味するものとする。
（実施例１）
ホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）の１０％水溶液に、プロテアーゼを作用させて得られた反応液をクロロホルム−メタノール（２：１）溶液で抽出した後、濃縮し、さらにアセトン抽出して複合脂質画分を得た。次に、この複合脂質画分をフロリジルカラムクロマトグラフィーにて、クロロホルム−メタノール溶液で段階抽出してリン脂質画分を得た。このリン脂質画分をシリカゲルクロマトグラフィーにて、クロロホルム−メタノール溶液で段階抽出して得られた画分を凍結乾燥してスフィンゴミエリン原料を得た。このスフィンゴミエリン原料について、薄層クロマトグラフィーで処理した後、ディットマー試薬で発色し、デンシトメトリー法でスフィンゴミエリン含量を測定したところ、９５．２％であった。このスフィンゴミエリン原料はそのまま本発明の剤として利用可能である。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and test examples. “%” In Examples and Test Examples means “% by weight” unless otherwise specified.
Example 1
A reaction solution obtained by allowing protease to act on a 10% aqueous solution of whey protein concentrate (WPC) was extracted with a chloroform-methanol (2: 1) solution, concentrated, and further extracted with acetone to obtain a complex lipid fraction. Got. Next, this complex lipid fraction was step-extracted with a chloroform-methanol solution by Florisil column chromatography to obtain a phospholipid fraction. This phospholipid fraction was subjected to phase extraction with a chloroform-methanol solution by silica gel chromatography, and the fraction obtained was freeze-dried to obtain a sphingomyelin raw material. This sphingomyelin raw material was processed by thin layer chromatography, then developed with a Dittmer reagent, and the sphingomyelin content was measured by densitometry and found to be 95.2%. This sphingomyelin raw material can be used as it is as the agent of the present invention.

（試験例１）
スフィンゴミエリンのシアロムチン分泌促進作用を、特開２００１−２０６８４８公報の「試験例１」の方法を用いて、試験を行った。
すなわち、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にはＡＩＮ−９３Ｇの標準食を、スフィンゴミエリン投与群（ＳＰＭ）には前記標準食のショ糖の一部を本明細書の実施例１記載のスフィンゴミエリン原料で１％置換した飼料を、さらに、シアリルラクトース投与群（ＳＬ）には、標準食のショ糖の一部をシアリルラクトースで１％置換した飼料をそれぞれ投与した。
７週齢のＳＤ系雄ラット（日本チャールズリバー社製）を、湿度６０％、室温２４℃、ｌｉｇｈｔ−ｄａｒｋコントロール１２時間の条件下で飼育した。全てのラットは標準食で１週間予備飼育した後、１群１２匹からなる３群に分け、それぞれの実験食を自由に摂取させて、１週間飼育した。ラットの唾液は、実験食投与後７日目に採取し、唾液中のシアロムチン含量を高速液体クロマトグラフィーで測定した。各実験群の唾液中のシアロムチン含量の測定結果を表１に示す。表１に示される結果から明らかなように、スフィンゴミエリン投与群は、対照群と比較して、シアロムチン含量が著しく増加しており、シアリルラクトース投与群と比較しても増加していた。 (Test Example 1)
The effect of sphingomyelin on the promotion of sialomucin secretion was tested using the method of “Test Example 1” in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-206848.
That is, the control group (Control) is a standard diet of AIN-93G, and the sphingomyelin administration group (SPM) is a portion of the sucrose of the standard diet as a sphingomyelin raw material described in Example 1 of this specification. Further, the sialyl lactose-administered group (SL) was administered with a feed in which 1% of the sucrose in the standard diet was replaced with sialyl lactose.
Seven-week-old SD male rats (manufactured by Charles River Japan) were bred under conditions of 60% humidity, room temperature 24 ° C., and light-dark control for 12 hours. All rats were preliminarily raised on a standard diet for 1 week, divided into 3 groups of 12 animals per group, and allowed to freely feed each experimental diet for 1 week. Rat saliva was collected on the 7th day after administration of the experimental diet, and the sialomucin content in the saliva was measured by high performance liquid chromatography. Table 1 shows the measurement results of the sialomucin content in the saliva of each experimental group. As is clear from the results shown in Table 1, the sphingomyelin administration group had a markedly increased sialomucin content compared to the control group, and also increased compared to the sialyl lactose administration group.

（試験例２）
スフィンゴミエリンのシアロムチン分泌促進作用を、特開２００１−２０６８４８公報の「試験例２」のコレラトキシン結合阻止活性を試験する方法を用いて、試験を行った。
本明細書の試験例１の各実験群の唾液を用いて、コレラトキシンの結合阻止活性を調べた。０．１％ガングリオシドＧＭ１含有エタノール溶液（ｗ／ｖ）２００μｌを９６穴ＥＬＩＳＡ試験用プレートに添加した後、風乾してガングリオシドＧＭ１を吸着させた。各実験群の唾液は、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳで１０倍に希釈した後、ビオチン結合コレラトキシンを添加して１時間反応させた。反応液１００μｌを上述のＥＬＩＳＡ試験用プレートに添加して３０分間放置後、上清を除去した。ＥＬＩＳＡ試験用プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで数回洗浄し、ビオチン結合性のβガラクトシダーゼを添加して一定時間放置後、上清を除去した。また、ＥＬＩＳＡ試験用プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで数回洗浄し、４−メチルウンベリフェリルガラクトースを添加して３０分間反応させた後、生成した４−メチルウンベリフェリロンを蛍光光度計（励起波長３６０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍ）で測定した。そして、次式より阻止率を算出した。
阻止率（％）＝｛１−（Ａ／Ｂ）｝×１００
Ａ：スフィンゴミエリン投与群（ＳＰＭ）およびシアリルラクトース投与群（ＳＬ）の蛍光強度
Ｂ：対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の蛍光強度
結果を表２に示す。表２の結果から明らかなように、スフィンゴミエリン投与群のコレラトキシンの結合阻止活性は、対照群と比較して非常に高いことがわかった。さらに、スフィンゴミエリン投与群のコレラトキシンの結合阻止活性は、シアリルラクトース投与群と比較しても高いことがわかった。したがって、スフィンゴミエリンを経口摂取することにより唾液中のシアロムチン含量が増加し、その結果として毒素中和能も増強されることがわかった。 (Test Example 2)
The effect of sphingomyelin on promoting the secretion of sialomucin was tested using the method for testing the cholera toxin binding inhibitory activity of “Test Example 2” in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-206848.
The binding inhibition activity of cholera toxin was examined using the saliva of each experimental group of Test Example 1 of this specification. 200 μl of a 0.1% ganglioside GM1-containing ethanol solution (w / v) was added to a 96-well ELISA test plate, and then air-dried to adsorb ganglioside GM1. Saliva from each experimental group was diluted 10-fold with PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA), and then biotin-conjugated cholera toxin was added and allowed to react for 1 hour. 100 μl of the reaction solution was added to the above ELISA test plate and allowed to stand for 30 minutes, and then the supernatant was removed. The ELISA test plate was washed several times with PBS containing 0.05% Tween 20, biotin-binding β-galactosidase was added and allowed to stand for a certain time, and then the supernatant was removed. In addition, the ELISA test plate was washed several times with PBS containing 0.05% Tween 20, and 4-methylumbelliferyl galactose was added and reacted for 30 minutes. Measured with a fluorometer (excitation wavelength 360 nm, measurement wavelength 460 nm). And the rejection rate was computed from following Formula.
Blocking rate (%) = {1- (A / B)} × 100
A: Fluorescence intensity of sphingomyelin administration group (SPM) and sialyl lactose administration group (SL) B: Fluorescence intensity of control group (Control) The results are shown in Table 2. As is clear from the results in Table 2, it was found that the binding inhibition activity of cholera toxin in the sphingomyelin administration group was very high compared to the control group. Furthermore, it was found that the binding inhibition activity of cholera toxin in the sphingomyelin administration group was higher than that in the sialyl lactose administration group. Therefore, it was found that oral ingestion of sphingomyelin increases the content of sialomucin in saliva and, as a result, enhances the ability to neutralize toxins.

なお、唾液中のシアロムチン含量の測定法は次の通りとした。
（１）唾液の採取
２時間以上絶食させたラットに０．２ｍｌのネンブタール液を筋肉注射し、麻酔後、唾液分泌促進剤である塩酸ピロカルビン溶液を筋肉注射した。３分後からラット舌下に分泌された唾液をオートピペットによりマイクロチューブに採取し、この操作を正確に９分間行った。唾液採取終了後、唾液分泌抑制剤である０．１％硫酸アトロピンを０．１ｍｌ注射し唾液採取を終了させた。
（２）シアロムチン画分の回収
採取した唾液を速やかに０℃以下に冷蔵した後、４℃に冷却した遠心分離機で処理（１１，０００ｒｐｍ、６０分間）して上清を得た。上清を分子量分画１００，０００のマイクロ透析チューブにより生理的食塩水で３日間透析し、内容液を唾液中のシアロムチン画分として回収した。
（３）シアロムチン含量の定量
シアロムチン画分に含まれるシアロムチン含量は、シアル酸蛍光標識キット（Ｔａｋａｒａ社製）で定量した。シアロムチン画分の一定量を試験管に採取し、ロータリーエバポレーターで減圧乾固した後、２Ｎ−酢酸を加えて、８０℃、３時間加水分解した。遊離したＮ−アセチルシアル酸やＯ−アセチル化シアル酸については、蛍光ラベル化剤であるＤＭＢ試薬を加え、５５℃で２．５時間反応させた後、高速液体クロマトグラフィーで定量した。 In addition, the measuring method of the sialomucin content in saliva was as follows.
(1) Collection of saliva Rats fasted for 2 hours or more were intramuscularly injected with 0.2 ml of Nembutal solution, and after anesthesia, a pilocarbine hydrochloride solution, which is a salivary secretion promoter, was intramuscularly injected. After 3 minutes, saliva secreted under the rat tongue was collected into a microtube by an autopipette, and this operation was performed for exactly 9 minutes. After completion of saliva collection, 0.1 ml of 0.1% atropine sulfate, which is a saliva secretion inhibitor, was injected to terminate saliva collection.
(2) Collection of sialomucin fraction The collected saliva was rapidly refrigerated to 0 ° C. or lower, and then treated with a centrifuge cooled to 4 ° C. (11,000 rpm, 60 minutes) to obtain a supernatant. The supernatant was dialyzed against physiological saline with a microdialysis tube having a molecular weight fraction of 100,000 for 3 days, and the contents were collected as a sialomucin fraction in saliva.
(3) Quantification of sialomucin content The sialomucin content contained in the siaromutin fraction was quantified with a sialic acid fluorescent labeling kit (manufactured by Takara). A certain amount of sialomucin fraction was collected in a test tube and dried under reduced pressure using a rotary evaporator, and then 2N-acetic acid was added and hydrolyzed at 80 ° C. for 3 hours. The released N-acetyl sialic acid and O-acetylated sialic acid were quantified by high performance liquid chromatography after adding a DMB reagent as a fluorescent labeling agent and reacting at 55 ° C. for 2.5 hours.

（試験例３）
スフィンゴミエリンの悪酔い予防効果を、特開２００１−１９９８８０公報の「実施例１」の方法により、試験を行った。
Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットを１週間の予備飼育後、体重１１０〜１２０ｇで使用した。実験前一晩絶食し、実験中は絶食、絶水とした。ラットをアルコール単独投与群（対照群）、スフィンゴミエリン投与群に分け、１群５匹で行った。
アルコール単独投与群（対照群）には、４０（v/v）％エチルアルコール水溶液１０ｍｌ／ｋｇを、スフィンゴミエリン投与群には４０（v/v）％エチルアルコール水溶液１０ｍｌ／ｋｇと本明細書の実施例１のスフィンゴミエリン原料２ｍｇ／ｋｇを経口投与した。投与後、酔い症状が回復するまで観察を行った。
その結果、アルコール単独投与群（対照群）は、酔い症状が回復するまで５時間かかり、投与したときの症状が腹臥状態やよろめき歩行、握力低下がみられたのに対し、スフィンゴミエリン投与群は、１時間以内に酔い症状が回復し、投与したときの症状が軽いよろめき歩行程度であった。このことから、スフィンゴミエリンは、飲酒時の悪酔い症状の防止効果が顕著であることが確認された。 (Test Example 3)
The effect of sphingomyelin on the prevention of sickness was tested by the method of “Example 1” of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-199880.
Wistar male rats were used at a body weight of 110-120 g after 1 week of preliminary breeding. Fasted overnight before the experiment, and fasted and dehydrated during the experiment. Rats were divided into an alcohol-only administration group (control group) and a sphingomyelin administration group, and 5 rats per group were used.
The 40% (v / v)% aqueous ethyl alcohol solution was 10 ml / kg for the alcohol alone administration group (control group), and the 40% (v / v)% ethyl alcohol aqueous solution was 10 ml / kg for the sphingomyelin administration group. The sphingomyelin raw material 2 mg / kg of Example 1 was orally administered. After administration, observations were made until the symptoms of sickness recovered.
As a result, in the alcohol alone administration group (control group), it took 5 hours for the sickness symptoms to recover, and when administered, the symptoms were prone, staggered walking, and decreased grip strength, whereas the sphingomyelin administration group The symptoms of drunkenness recovered within 1 hour, and the symptoms were slightly staggered when administered. From this, it was confirmed that sphingomyelin has a remarkable effect of preventing sickness symptoms during drinking.

（試験例４：密着結合形成試験）
スフィンゴミエリンの抗アレルギー作用を、特開平８−１０９１３３号公報の「試験例１」の方法により試験を行った。
培地中のガングリオシドＧＭ３（シグマ社製）または本明細書の実施例１のスフィンゴミエリン原料の濃度がそれぞれ２μｇ／ｍｌとなるように、無血清培地Ｃｏｓｍｅｄｉｕｍ００１（コスモバイオ社製）に、ガングリオシドＧＭ３またはスフィンゴミエリンをそれぞれ添加した。２４穴マイクロタイタープレートに、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ（ミリポア社製；孔径０．４μｍ；０．６ｃｍ２）を設置し、膜表面をコラーゲン（高研社製）で処理した後、ヒト結腸腺癌細胞株Ｃａｃｏ−２を培養し、１０％ＦＣＳ添加培地（１０％ＦＣＳ）及び何も添加しないＣｏｓｍｅｄｉｕｍ００１（無添加）で培養した場合と、下記の点について比較した。即ち、電気抵抗測定器Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ（ミリポア社製）を用いて、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ内外の電気抵抗（Ｒ）値を培養１、４及び７日目に測定した。結果を図１に示す。図１に示される結果から明らかなように、スフィンゴミエリン添加培地（ＳＰＭ）では、ガングリオシドＧＭ３添加培地（ＧＭ３）や１０％ＦＣＳ添加培地と同様に、Ｒ値が上昇した。このことから、スフィンゴミエリン及びＧＭ３添加培地では、Ｃａｃｏ−２の密着結合が進み、細胞間の間隙が減少したと考えられる。これに対して、無添加培地では、Ｒ値が上昇しなかった。従って、スフィンゴミエリンには、腸管粘膜細胞を密着結合させる効果があり、体内へのアレルギー物質の進入を防ぐことによる抗アレルギー作用があることがわかった。 (Test Example 4: Tight bond formation test)
The antiallergic action of sphingomyelin was tested by the method of “Test Example 1” of JP-A-8-109133.
To the serum-free medium Cosmedium001 (manufactured by Cosmo Bio), ganglioside GM3 or sphingo so that the concentration of ganglioside GM3 (manufactured by Sigma) or the sphingomyelin raw material of Example 1 of the present specification is 2 μg / ml, respectively. Each myelin was added. Millicell-CM (manufactured by Millipore; pore size 0.4 μm; 0.6 cm 2) was placed on a 24-well microtiter plate, and the membrane surface was treated with collagen (manufactured by Koken), and then a human colon adenocarcinoma cell line Caco. -2 was cultured, and the following points were compared with the case of culturing in 10% FCS-added medium (10% FCS) and Cosmedium 001 (no addition) to which nothing was added. That is, the electrical resistance (R) value inside and outside of Millicell-CM was measured on days 1, 4 and 7 of culture using an electrical resistance measuring device Millicell-ERS (manufactured by Millipore). The results are shown in FIG. As is clear from the results shown in FIG. 1, in the sphingomyelin supplemented medium (SPM), the R value increased as in the ganglioside GM3 supplemented medium (GM3) and the 10% FCS supplemented medium. From this, it is considered that in the sphingomyelin and GM3-added medium, the tight binding of Caco-2 progressed and the gap between cells decreased. In contrast, the R value did not increase in the additive-free medium. Therefore, it was found that sphingomyelin has an effect of tightly binding intestinal mucosal cells and has an antiallergic action by preventing the entry of allergens into the body.

（試験例５：分泌型ＩｇＡ産生促進試験）
スフィンゴミエリンの抗アレルギー作用を、特開平８−１０９１３３号公報の「試験例２」の方法により試験を行った。
無菌的に採取したヒト母乳５ｍｌを、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ；Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．２）で２倍に希釈した後、分離液〔３３．４％Ｃｏｎｒａｙ４００（第一製薬社製）と９％Ｆｉｃｏｌｌ（ファルマシア社製）とを５：１２で混合した溶液〕５ｍｌの入った試験管に重層した。４００×Ｇで３０分間遠心分離した後、リンパ球の集まっている中間層を、パスツールピペットで回収した。リンパ球を１０ｍｌのＰＢＳに分散して洗浄した後、１５０×Ｇで１０分間遠心分離した。この洗浄操作を３回繰り返した後、インシュリン（１０μｇ／ｍｌ）及びトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１２ｍｌを添加し、３ｍｌずつシャーレ３枚（Ａ；Ｂ；Ｃ）に分注した。シャーレＡには、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を０．３ｍｌ添加し、シャーレＢには、本明細書の実施例１のスフィンゴミエリン原料を３μｇ添加し、シャーレＣには何も添加しなかった。
７日後、培養液中のＩｇＡ含量は、シャーレＡで３．８９μｇ／ｍｌ、シャーレＢで３．１１μｇ／ｍｌ、シャーレＣで０．１μｇ／ｍｌ未満であった。シャーレＡとＢでは、ＩｇＡの生産量が高かったが、シャーレＣでは、ＩｇＡがほとんど産生されなかった。この結果より、スフィンゴミエリンには、リンパ球のＩｇＡ産生能を上昇させる効果があり、抗アレルギー作用があることがわかった。 (Test Example 5: Secretory IgA production promotion test)
The antiallergic action of sphingomyelin was tested by the method of “Test Example 2” of JP-A-8-109133.
5 ml of aseptically collected human breast milk was diluted 2-fold with a 10 mM phosphate buffer solution (PBS; Phosphate buffered saline, pH 7.2) containing 150 mM NaCl, and then the separated solution [33.4% Conray 400 (Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.). Solution prepared by mixing 5:12 with 9% Ficoll (manufactured by Pharmacia)] The test tube containing 5 ml was layered. After centrifugation at 400 × G for 30 minutes, the intermediate layer in which lymphocytes were collected was collected with a Pasteur pipette. Lymphocytes were dispersed in 10 ml of PBS and washed, and then centrifuged at 150 × G for 10 minutes. After this washing operation was repeated three times, 12 ml of RPMI-1640 medium containing insulin (10 μg / ml) and transferrin (5 μg / ml) was added, and 3 ml each was dispensed into three petri dishes (A; B; C). . In petri dish A, 0.3 ml of fetal calf serum (FCS) was added, in petri dish B, 3 μg of the sphingomyelin raw material of Example 1 of this specification was added, and nothing was added to petri dish C.
Seven days later, the IgA content in the culture broth was 3.89 μg / ml for Petri dish A, 3.11 μg / ml for Petri dish B, and less than 0.1 μg / ml for Petri dish C. In Petri dishes A and B, IgA production was high, but in Petri dish C, IgA was hardly produced. From this result, it was found that sphingomyelin has an effect of increasing IgA production ability of lymphocytes and has an antiallergic action.

（試験例６：アレルゲン侵入阻止効果試験）
スフィンゴミエリンの抗アレルギー作用を、特開平８−１０９１３３号公報の「試験例３」の方法により試験を行った。
乳児期のＷｉｓｔａｒ系ラット（１４日齢、体重２０ｇ前後、８匹、日本チャールズリバー社）を、対照群とスフィンゴミエリン投与群（ＳＰＭ投与群）とに分け、どちらもラット乳に近似させた組成の人工乳で飼育した。ＳＰＭ投与群には、１４〜２０日目に、本明細書の実施例１のスフィンゴミエリン原料から調製したスフィンゴミエリン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、マイクロピペットを使用して５０μｌずつ毎日経口投与した。２１日目には、β−Ｌｇ液（１０ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ経口投与し、１時間後と２週間後に血液を採取した。一方、β−Ｌｇ溶液とフロインド完全アジュバンドを混合して乳化させ、３カ月齢のウサギ（白色和種、雄、北山ラベス社製）の皮下３ヵ所（両背側部及び臀部）に注射して、抗β−Ｌｇ血清を得た。この抗血清を一次抗体とし、西洋ワサビパーオキシターゼ（ＰＯ）を標識した二次抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡ法で、１時間後の血液を使って、血中のβ−Ｌｇ量を測定した。また、２週間後の血液中の抗β−ＬｇＩｇＥは、β−ＬｇとＰＯ標識した抗ラットＩｇＥ抗体（ノルディク社製）を使って、ＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を下記表３に示す。表３に示される結果から明らかなように、スフィンゴミエリンを体重１ｋｇ当り０．１ｍｇ／日以上投与した群は、対照群に比較して、消化管におけるβ−Ｌｇの粘膜透過性の著しい低下が認められ、ＩｇＥ生産が抑制されることから、スフィンゴミエリンに抗アレルギー作用のあることがわかった。 (Test Example 6: Allergen invasion inhibitory effect test)
The antiallergic action of sphingomyelin was tested by the method of “Test Example 3” in JP-A-8-109133.
Infant Wistar rats (14 days old, body weight around 20g, 8 animals, Charles River Japan) were divided into a control group and a sphingomyelin administration group (SPM administration group), both of which approximated to rat milk Breeding with artificial milk. On the 14th to 20th days, the SPM administration group was orally administered daily with 50 μl of a sphingomyelin solution (1 mg / ml) prepared from the sphingomyelin raw material of Example 1 of this specification using a micropipette. On day 21, 100 μl of β-Lg solution (10 mg / ml) was orally administered, and blood was collected after 1 hour and 2 weeks. On the other hand, β-Lg solution and Freund's complete adjuvant are mixed and emulsified, and injected into three subcutaneous sites (both dorsal side and buttocks) of a 3-month-old rabbit (white Japanese breed, male, Kitayama Labes). Thus, anti-β-Lg serum was obtained. The amount of β-Lg in the blood was measured by sandwich ELISA using a secondary antibody labeled with horseradish peroxidase (PO) using this antiserum as a primary antibody, and using blood one hour later. Further, anti-β-LgIgE in blood after 2 weeks was measured by ELISA using an anti-rat IgE antibody (manufactured by Nordic) labeled with β-Lg and PO. The results are shown in Table 3 below. As is apparent from the results shown in Table 3, the group in which sphingomyelin was administered at a dose of 0.1 mg / day or more per kg of body weight had a marked decrease in the mucosal permeability of β-Lg in the gastrointestinal tract compared to the control group. It was recognized and IgE production was suppressed, and thus it was found that sphingomyelin has an antiallergic action.

（試験例７）
スフィンゴミエリンの抗酸化作用について、特開平１１−２０９７５６号公報の「試験例１」の方法に準じて試験を行った。
スフィンゴミエリンの抗酸化活性について、大澤らの方法（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３５，ｐｐ．８０９−８１２，１９８７）により測定した。すなわち、ウサギ保存血液に等量の等張液（１０ｍＭリン酸緩衝液／１５２ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を混和し、４℃、１，５００×ｇ（３，５００ｒｐｍ）、２０分間遠心分離した。この操作を３回繰り返して洗浄した血球に等量の低張液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を混和し、４℃、２０，０００×ｇ（１１，０００ｒｐｍ）、４０分間遠心分離した。そして、この操作を４回繰り返して得られた緩い沈澱部分（赤血球膜ゴースト）を用いて抗酸化活性を調べた。本明細書の実施例1のスフィンゴミエリン原料を用いて、スフィンゴミエリンを各初発濃度（０ｍＭ，０．０１ｍＭ，０．１ｍＭ，１ｍＭ，１０ｍＭ）となるよう調製した後、赤血球膜ゴーストを混和し、さらに酸化剤を添加し酸化反応を行った。次いで、ＴＢＡ反応を行った後、５３２ｎｍで吸光度を測定して酸化生成物を定量した。そして、抗酸化活性は、スフィンゴミエリン無添加の場合の吸光度を１００％とし、各スフィンゴミエリンを添加した場合の吸光度から算出した。なお、吸光度が低い程、赤血球膜ゴーストの酸化が抑制され、抗酸化活性が高いことを示す。その結果を表４に示す。表４に示される結果から明らかなように、スフィンゴミエリンは抗酸化作用が高いことが分かった。 (Test Example 7)
The antioxidant effect of sphingomyelin was tested according to the method of “Test Example 1” in JP-A-11-209756.
Antioxidant activity of sphingomyelin was measured by the method of Osawa et al. (J. Agric. Food Chem., Vol. 35, pp. 809-812, 1987). That is, an equal amount of isotonic solution (10 mM phosphate buffer / 152 mM sodium chloride, pH 7.4) was mixed with rabbit blood, and centrifuged at 4 ° C., 1,500 × g (3,500 rpm) for 20 minutes. . This procedure is repeated three times, and an equal amount of hypotonic solution (10 mM phosphate buffer, pH 7.4) is mixed with the washed blood cells, and centrifuged at 4 ° C., 20,000 × g (11,000 rpm) for 40 minutes. did. And the antioxidant activity was investigated using the loose precipitation part (erythrocyte membrane ghost) obtained by repeating this operation 4 times. Using the sphingomyelin raw material of Example 1 of the present specification, sphingomyelin was prepared at each initial concentration (0 mM, 0.01 mM, 0.1 mM, 1 mM, 10 mM), and then mixed with an erythrocyte membrane ghost, Further, an oxidizing agent was added to carry out an oxidation reaction. Subsequently, after performing TBA reaction, the absorbance was measured at 532 nm to quantify the oxidized product. The antioxidant activity was calculated from the absorbance when each sphingomyelin was added with the absorbance when no sphingomyelin was added as 100%. In addition, it shows that oxidation of a erythrocyte membrane ghost is suppressed and antioxidant activity is so high that an light absorbency is low. The results are shown in Table 4. As is apparent from the results shown in Table 4, sphingomyelin was found to have a high antioxidant effect.

（試験例８）
スフィンゴミエリンの抗酸化作用について、特開平１１−２０９７５６号公報の「試験例２」の方法に準じて試験を行った。
スフィンゴミエリンの抗酸化活性について、中山らの方法（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２８１，ｐｐ．７７−８０，１９９２）により測定した。すなわち、チャイニーズハムスター肺線維芽細胞のＶ７９株を、１０％牛胎児血清を含むＭＥＭ培地（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ社製）で、シャーレ当たり２００個の細胞数となるよう播種し、５％二酸化炭素存在下、３７℃で５日間培養して試験用培養細胞とした。そして、スフィンゴミエリンの抗酸化活性については、過酸化水素によるコロニー形成率の低下を毒性の指標とし、スフィンゴミエリンを試験用培養細胞に添加することにより、コロニー形成率の低下がどの程度回復するかということで判定した。 (Test Example 8)
The antioxidant effect of sphingomyelin was tested according to the method of “Test Example 2” in JP-A-11-209756.
Antioxidant activity of sphingomyelin was measured by the method of Nakayama et al. (Mutation Research, vol. 281, pp. 77-80, 1992). That is, Chinese hamster lung fibroblast V79 strain was seeded in a MEM medium containing 10% fetal calf serum (manufactured by Flow Laboratories) so that the number of cells was 200 per petri dish, and in the presence of 5% carbon dioxide, The cells were cultured at 37 ° C. for 5 days to obtain test cultured cells. Regarding the antioxidant activity of sphingomyelin, how much reduction in colony formation rate is recovered by adding sphingomyelin to cultured cells for testing, with the decrease in colony formation rate caused by hydrogen peroxide as an indicator of toxicity That's why it was judged.

上記の試験用培養細胞をプレート上に播種し、２時間前培養（細胞接着）した後、本明細書の実施例1のスフィンゴミエリン原料を用いて、各初発濃度（０ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ）となるよう調製したスフィンゴミエリン溶液を添加し、４時間インキュベートして過酸化水素より先にスフィンゴミエリンを細胞に取り込ませた。次に、過酸化水素を添加し、３０分間反応させて細胞に障害を与えた。そして、反応後、血清入り培地で５日間培養を行った。なお、過酸化水素の濃度は、コロニー形成率が数％〜４０％位に低下する６０μＭに設定した。また、スフィンゴミエリンについても、それ自身の毒性を予め調べておき、それ自身の毒性でコロニー形成率が低下しないことを確認しておいた。抗酸化活性の評価は、５日間の培養後、コロニー形成を確認してギムザ染色を行って全コロニー数を計測し、対照であるスフィンゴミエリン無添加で過酸化水素無添加の場合の細胞生存率を１００％としたときのそれぞれの細胞生存率（％）で表した。なお、細胞生存率が高い程、添加したスフィンゴミエリンの抗酸化活性が高いことを示す。その結果を表５に示す。表５に示される結果から明らかなように、スフィンゴミエリンは抗酸化作用が高いことが分かった。   The above cultured cells for test are seeded on a plate, pre-cultured (cell adhesion) for 2 hours, and then each starting concentration (0 mM, 0.01 mM, 0 mM) using the sphingomyelin raw material of Example 1 of this specification. Sphingomyelin solution prepared to be 1 mM, 1 mM, 10 mM) was added and incubated for 4 hours to allow the cells to incorporate sphingomyelin prior to hydrogen peroxide. Next, hydrogen peroxide was added and allowed to react for 30 minutes to damage the cells. And after reaction, it culture | cultivated with the culture medium containing serum for 5 days. In addition, the density | concentration of hydrogen peroxide was set to 60 micromol which a colony formation rate falls to about several percent-40%. In addition, sphingomyelin was also examined in advance for its toxicity, and it was confirmed that the colony formation rate did not decrease due to its own toxicity. Antioxidant activity was evaluated after 5 days of culture, colony formation was confirmed, Giemsa staining was performed, the total number of colonies was counted, and cell viability when no sphingomyelin as a control was added but no hydrogen peroxide was added. The cell viability (%) with respect to 100%. In addition, it shows that the antioxidant activity of added sphingomyelin is so high that a cell viability is high. The results are shown in Table 5. As is apparent from the results shown in Table 5, sphingomyelin was found to have a high antioxidant effect.

（試験例９）
スフィンゴミエリンの感染防御作用について、特開昭６２−２０８２６１号公報に記載の方法により試験を行った。
・病原性大腸菌による下痢発生率抑制試験
試験動物として３０日齢のＳＤ系雄ラットを用い、このラット１０匹からなる各試験群に本明細書の実施例１のスフィンゴミエリン原料を用いて、スフィンゴミエリンを０（コントロール）、０．１、１．０、５．０、１０．０ｍｇ／日摂取するように調製した餌をそれぞれ給与し、各ラットに病原性大腸菌を一定量与え、下痢の発生率を調べた。結果を表６に示す。表６から明らかなように、スフィンゴミエリンを１日当たり１．０ｍｇ以上投与したラットでは、下痢発生率が著しく低下することが分かった。 (Test Example 9)
The sphingomyelin infection-protecting action was tested by the method described in JP-A-62-2208261.
Test for controlling incidence of diarrhea caused by pathogenic E. coli 30-day-old male SD rats were used as test animals, and the sphingomyelin raw material of Example 1 of the present specification was used for each test group consisting of 10 rats. Feeding myelin at 0 (control), 0.1, 1.0, 5.0, 10.0 mg / day and feeding each rat with a certain amount of pathogenic E. coli, causing diarrhea The rate was examined. The results are shown in Table 6. As can be seen from Table 6, it was found that the incidence of diarrhea was significantly reduced in rats administered with 1.0 mg or more of sphingomyelin per day.

（試験例１０）
スフィンゴミエリンの病原性大腸菌O−１５７感染防止作用について、特開平２００１−２７０４公報の「試験例１」の方法に準じて、試験した。
・病原性大腸菌O−１５７感染防止試験Ｉ
５週齢のＢＡＬＢ／ｃ系無菌マウス（２０匹）に、生理食塩水（対照群）、本明細書の実施例1のスフィンゴミエリン原料（ＳＰＭ群）を毎日経口摂取させた。スフィンゴミエリンの摂取量は、５ｍｇ／日であった。摂取開始から３日目に、マウス１匹当たり病原性大腸菌O−１５７を８．５×１０６ｃｆｕ経口投与して感染させた。感染後も、スフィンゴミエリンは毎日経口摂取させた。大腸菌投与後８日間生死を観察し、病原性大腸菌O−１５７投与後日数によるラットの生存率を表７に示す。表７の結果から明らかなように、無菌マウスの生存率は、スフィンゴミエリンの投与により高まった。 (Test Example 10)
The anti-pathogenic E. coli O-157 infection-preventing action of sphingomyelin was tested according to the method of “Test Example 1” of JP-A-2001-2704.
・ Pathogenic Escherichia coli O-157 infection prevention test I
A 5-week-old BALB / c-type sterile mouse (20 mice) was orally ingested daily with saline (control group) and the sphingomyelin raw material (SPM group) of Example 1 herein. The intake of sphingomyelin was 5 mg / day. On the third day from the start of ingestion, pathogenic E. coli O-157 per mouse was orally administered at 8.5 × 10 6 cfu for infection. Even after infection, sphingomyelin was orally taken daily. Survival was observed for 8 days after administration of E. coli, and the survival rate of rats according to the number of days after administration of pathogenic E. coli O-157 is shown in Table 7. As is clear from the results in Table 7, the survival rate of sterile mice was increased by administration of sphingomyelin.

（試験例１１）
スフィンゴミエリンの病原性大腸菌O−１５７感染防止作用について、特開平２００１−２７０４公報の「試験例2」の方法に準じて、試験を行った。
・病原性大腸菌O−１５７感染防止試験II
スフィンゴミエリンの摂取量を1日あたり０．１〜１０ｍｇとして、試験例１０と同様に大腸菌投与後８日目のマウスの生存率を測定した。結果を表８に示す。表８に示される結果から明らかなように、スフィンゴミエリンを１．０ｍｇ／日以上摂取した群では、生存率が著しく向上した。 (Test Example 11)
The sphingomyelin was tested for its pathogenic E. coli O-157 infection-preventing action according to the method of “Test Example 2” of JP-A-2001-2704.
・ Pathogenic Escherichia coli O-157 Infection Prevention Test II
The survival rate of mice on the 8th day after administration of Escherichia coli was measured in the same manner as in Test Example 10 with the intake of sphingomyelin being 0.1 to 10 mg per day. The results are shown in Table 8. As is clear from the results shown in Table 8, the survival rate was remarkably improved in the group ingesting 1.0 mg / day or more of sphingomyelin.

（試験例１２）
４週齢のヘアレスマウス（ＣＤ−１（ＩＣＲ）−ｎｕ／ｎｕ）を１週間予備飼育した後、表９に示す飼料で３週間飼育した。その結果、スフィンゴミエリンを１５％含む牛乳由来のリン脂質画分を４０ｍｇ／日投与した群（ＳＰＭ群）で、７匹／１０匹の割合で毛が生えてきた。それに対して、スフィンゴミエリンを１５％含む牛乳由来のリン脂質画分を投与しない対照群においては、１匹／１０匹の割合でしか毛が生えなかった。

(Test Example 12)
A 4-week-old hairless mouse (CD-1 (ICR) -nu / nu) was bred for 1 week and then bred for 3 weeks with the feed shown in Table 9. As a result, in a group (SPM group) administered with 40 mg / day of a milk-derived phospholipid fraction containing 15% sphingomyelin, hair grew at a rate of 7/10 animals. On the other hand, in the control group to which the milk-derived phospholipid fraction containing 15% sphingomyelin was not administered, hair grew only at a ratio of 1/10 animals.

（試験例１３：スフィンゴミエリンによるＥＡＥラットに対する効果）
スフィンゴミエリンの脱髄疾患治療効果について、特開平２−２５０８３４号公報の「実施例３」の方法に準じて試験を行った。
脱髄疾患の１種、多発性硬化症モデルであるＥＡＥラットの治療効果を示す。
Ｌｅｗｉｓラット（雌６週齢）を１群５匹とし、ＥＡＥ誘発の抗原として同系ラットの脳ホモジュネートをフロインド完全アジュバンド（ディフコ社製）と同量混合したものを脳ホモジュネート８０ｍｇ換算となるようにラットの後肢足蹠に免疫した。
免疫当日より１８日間、表９に示す量でスフィンゴミエリンを腹腔内に投与し、毎日体重測定とＥＡＥ症状観察を行った。ＥＡＥの症状としては６段階評価した。すなわち、０：異常なし、１：尾麻痺、２：尾麻痺を伴う後肢衰弱、３：尾麻痺を伴う後肢麻痺、４：後肢麻痺を伴う前肢衰弱、５：四肢麻痺または前瀕死として、各症状の累積症状度により効果を判定した。
スフィンゴミエリンの投与は、本明細書の実施例1のスフィンゴミエリン原料を滅菌済みの０．５％メチルセルロースナトリウム水溶液に1ｍｇ／ｍｌまたは2ｍｇ／ｍｌの濃度になるように懸濁し、これを腹腔内投与した。対照として生理食塩水のみを投与した。結果を、下記表１０に示す。表１０の結果から明らかなように、スフィンゴミエリンは、生理食塩水のみを用いた対照に比べて著しくＥＡＥの発症を抑制した。この結果、多発性硬化症の治療や予防に有用に利用できることがわかった。 (Test Example 13: Effect of sphingomyelin on EAE rats)
The effect of sphingomyelin on the treatment of demyelinating diseases was tested according to the method of “Example 3” of JP-A-2-250834.
The therapeutic effect of one type of demyelinating disease, EAE rat which is a multiple sclerosis model is shown.
A group of 5 Lewis rats (6 weeks old female), and a mixture of the same amount of brain homogenate from Freund's complete adjuvant (manufactured by Difco) as an EAE-induced antigen, converted to 80 mg brain homogenate. Rats were immunized with their hind footpads.
Sphingomyelin was administered intraperitoneally in the amount shown in Table 9 for 18 days from the day of immunization, and body weight measurement and EAE symptom observation were performed every day. EAE symptoms were rated on a 6-point scale. That is, 0: no abnormality, 1: tail paralysis, 2: hind limb weakness with tail paralysis, 3: hind limb paralysis with tail paralysis, 4: forelimb weakness with hind limb paralysis, 5: limb paralysis or front dying The effect was judged by the cumulative symptom degree.
Sphingomyelin is administered by suspending the sphingomyelin raw material of Example 1 in this specification in a sterilized 0.5% aqueous solution of sodium methylcellulose to a concentration of 1 mg / ml or 2 mg / ml and administering it intraperitoneally. did. Only saline was administered as a control. The results are shown in Table 10 below. As is apparent from the results in Table 10, sphingomyelin significantly suppressed the onset of EAE compared to the control using only physiological saline. As a result, it was found that it can be used effectively for the treatment and prevention of multiple sclerosis.

（試験例１４：スフィンゴミエリンの抗体産生抑止効果）
スフィンゴミエリンの脱髄疾患治療効果について、特開平２−２５０８３４号公報の「実施例４」の方法に準じて試験を行った。
スフィンゴミエリンのＥＡＥ発症阻止機構について検討を行った。すなわち、試験例１３に示した生理食塩水、スフィンゴミエリン２ｍｇ／ｋｇを投与したラットに対し、１４日目に５０％羊赤血球（ＳＲＢＣ）０．２ｍｌを腹腔内に投与し、１８日目に各ラットから脾臓を摘出し、単細胞浮遊液を無菌的に調節した。赤血球を溶血法により除去した後、ＲＰＭＩ‐１６４０培地で洗浄し、２×１０９個／ｍｌの細胞密度の細胞浮遊液を調製した。
ヤーン（Ｊｅｒｎｅ）の方法による羊赤血球を対するプラーク形成細胞を数え、ＩｇＭＰＦＣ数とした。結果を表１１に示す。表１１に示される結果から、スフィンゴミエリンが抗体産生抑制活性を有することが確認され、その活性に基づいてＥＡＥ発症阻止をするものと考えられる。 (Test Example 14: Sphingomyelin antibody production inhibitory effect)
The effect of sphingomyelin on the treatment of demyelinating diseases was tested according to the method of “Example 4” of JP-A-2-250834.
The sphingomyelin EAE onset prevention mechanism was examined. That is, 0.2 ml of 50% sheep erythrocytes (SRBC) was intraperitoneally administered on the 14th day to rats administered with the physiological saline and sphingomyelin 2 mg / kg shown in Test Example 13, and on the 18th day, The spleen was removed from the rat and the single cell suspension was aseptically adjusted. Red blood cells were removed by hemolysis, and then washed with RPMI-1640 medium to prepare a cell suspension with a cell density of 2 × 10 9 cells / ml.
Plaque-forming cells against sheep erythrocytes by the method of Jerne were counted and used as IgMPFC numbers. The results are shown in Table 11. From the results shown in Table 11, it is confirmed that sphingomyelin has an antibody production inhibitory activity, and it is considered that EAE onset is inhibited based on the activity.

（試験例１５）
スフィンゴミエリンの抗色素沈着作用について、特開平１−１６３１１２号公報に記載の方法に準じて試験を行った。
色素沈着を促進させる物質である８ＭＯＰ処理光毒性色素沈着Ｗｅｉｓｔｅｒ Ｍａｐｌｅ ＧＰを用いて、ＩＣＲ系雌マウス（６週齢、１群５匹）の毛刈りした背部に５０μｌのサンプルを１日１回約４ｃｍ２の範囲に８週間塗布し、抗色素沈着効果及び副作用としてあらわれた表１２に示す色素沈着の程度を４点評価法にて（＋は脱色効果、−は副作用を示す）評価した。サンプルは本明細書の実施例1のスフィンゴミエリン原料を５％となるように溶解して使用した。また、何も塗布しないものを対照とした。結果を表１３に示す。表１３の結果から明らかなように、スフィンゴミエリンは、副作用がなく、抗色素効果に優れていることが分かった。 (Test Example 15)
The anti-pigmenting action of sphingomyelin was tested according to the method described in JP-A-1-163112.
Using 8MOP-treated phototoxic pigmented Wester Maple GP, a substance that promotes pigmentation, 50 μl of sample was cut once a day on the shaved back of ICR female mice (6 weeks old, 5 mice per group). It was applied to a range of 4 cm 2 for 8 weeks, and the degree of pigmentation shown in Table 12 as anti-pigmentation effects and side effects was evaluated by a 4-point evaluation method (+ indicates decolorization effect, − indicates side effects). The sample was used by dissolving the sphingomyelin raw material of Example 1 of this specification to 5%. Moreover, the thing which does not apply | coat anything was made into the control | contrast. The results are shown in Table 13. As is clear from the results in Table 13, it was found that sphingomyelin has no side effects and is excellent in anti-pigment effect.

（試験例１６）
スフィンゴミエリンの経口投与による抗色素沈着作用について試験を行った。
Ａ−１系雌モルモット（体重約４００ｇ）の背部を除毛し、背部に紫外線照射（ＵＶＡ（ｍａｘ．３６０ｎｍ）３０．３ｋＪ／ｍ^２、ＵＶＢ（ｍａｘ．３１２ｎｍ）４．８ｋＪ／ｍ^２）を、１日１回４日間行った。その後、スフィンゴミエリンを投与せず、生理食塩水をモルモット体重１ｋｇあたり１０ｇ投与する群（Ａ群）、実施例１のスフィンゴミエリン原料をスフィンゴミエリンとして、モルモット体重１ｋｇあたり２ｍｇ投与する群（Ｂ群）、実施例１のスフィンゴミエリン原料をスフィンゴミエリンとして、モルモット体重１ｋｇあたり５ｍｇ投与する群（Ｃ群）、実施例１のスフィンゴミエリン原料をスフィンゴミエリンとして、モルモット体重１ｋｇあたり１０ｍｇ投与する群（Ｄ群）の４試験群（各群１０匹ずつ）にわけた。それぞれを毎日１回ゾンデで経口投与して４週間飼育した。実施例１のスフィンゴミエリン原料は、１０ｇの生理食塩水に懸濁して、それぞれＢ〜Ｄ群に経口投与した。試料投与開始時と試料投与終了時に、モルモット背部皮膚の色素沈着への影響を、それぞれＭＩＮＯＬＴＡ社製の色差計（ＣＨＲＯＭＡ ＭＥＴＥＲ ＣＲ−２００）で測定し、試料投与開始時からの明度回復率を算出した。結果を表１４に示す。 (Test Example 16)
The anti-pigmentation effect by oral administration of sphingomyelin was tested.
A-1 female guinea pig (weight approximately 400 g) is removed from the back, and the back is irradiated with ultraviolet rays (UVA (max. 360 nm) 30.3 kJ / m ² , UVB (max. 312 nm) 4.8 kJ / m ² ). The test was performed once a day for 4 days. Thereafter, a group (group A) in which 10 g / kg of guinea pig body weight is administered without administration of sphingomyelin, and a group (group B) in which 2 mg / kg of guinea pig body weight is administered using the sphingomyelin raw material of Example 1 as sphingomyelin. A group (group C) in which 5 mg / kg of guinea pig body weight is administered with the sphingomyelin raw material of Example 1 as sphingomyelin, and a group (group D) in which 10 mg / kg of guinea pig body weight is administered with the sphingomyelin raw material of Example 1 as sphingomyelin. Were divided into 4 test groups (10 animals in each group). Each was orally administered once a day with a sonde and reared for 4 weeks. The sphingomyelin raw material of Example 1 was suspended in 10 g of physiological saline and orally administered to groups B to D, respectively. At the start of sample administration and at the end of sample administration, the effect on the pigmentation of the guinea pig dorsal skin was measured with a MINOLTA color difference meter (CHROMA METER CR-200), and the brightness recovery rate from the start of sample administration was calculated. did. The results are shown in Table 14.

表１４に示される結果より、４週間経口投与した後の明度回復率は、Ａ群では３１％と低かったが、Ｂ群では４８％、Ｃ群では６２％、Ｄ群では７８％と、Ａ群に比べ最大２．５倍にまで上昇した。
このことから、スフィンゴミエリンの経口投与により、明度回復率が高くなることがわかった。すなわち、スフィンゴミエリンの経口投与に、抗色素沈着効果があることが認められた。なお、投与量としては、スフィンゴミエリンをモルモット体重１ｋｇあたり２ｍｇ以上経口投与することにより当該効果が認められ、５ｍｇ以上経口投与するとその効果が顕著であることがわかった。 From the results shown in Table 14, the brightness recovery rate after oral administration for 4 weeks was as low as 31% in Group A, but 48% in Group B, 62% in Group C, and 78% in Group D. It rose up to 2.5 times compared to the group.
From this, it was found that the lightness recovery rate was increased by oral administration of sphingomyelin. That is, it was confirmed that oral administration of sphingomyelin has an anti-pigmentation effect. As for the dose, it was found that the effect was observed when 2 mg or more of sphingomyelin was orally administered per kg of guinea pig body weight, and the effect was remarkable when 5 mg or more was orally administered.

（試験例１７）
スフィンゴミエリンの抗炎症作用について、特開平１−１６３１２５号公報に記載の方法により試験を行った。
スフィンゴミエリンの抗炎症作用は、カラゲニン足蹠浮腫法により試験を行った。
すなわち、ウィンターらの方法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１１巻、５５４頁、１９６２）に従い、Ｗｉｓｔａｒ系雄ラット（体重、１１０〜１３０ｇ、１群８匹）に０．５％カルボキシメチルセルロース水溶液に懸濁させた、表１５に示す被験物質を経口投与（１００ｍｇ／ｋｇ）した。１時間後に起炎物質として１％λ−カラゲニン／生理食塩液を当該ラット片側後肢足蹠に０．１ｍｌ皮下投与して浮腫を惹起させた。起炎物質投与前および投与後の一定時間にそれぞれの足蹠体積を測定し、足蹠用量の増加率（Ｖ１)を求めた。対照群として、被験物質を含有しない０．５％カルボキシメチルセルロース水溶液を投与したラットに、同様にλ−カラゲニンを注入した際の足容量の増加率（Ｖ０）を測定し、（Ｖ０−Ｖ１）×１００／Ｖ０の計算式により、カラゲニン浮腫抑制率（％）を算出し、被験物質の抗炎症活性とした。この値が大きい程、抗炎症活性が高いことを示す。λ−カラゲニン注入後５時間後の測定値を表１５に示す。表１５に示される結果から明らかなように、スフィンゴミエリンは、インドメタシンやシアル酸以上に強い浮腫抑制率を示し、抗炎症作用が強いことが分かった。 (Test Example 17)
The anti-inflammatory action of sphingomyelin was tested by the method described in JP-A-1-163125.
The anti-inflammatory effect of sphingomyelin was tested by the carrageenan footpad edema method.
That is, according to the method of Winter et al. (Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine, Vol. 111, pp. 554, 1962), a Wistar male rat (weight, 110-130 g, 8 per group) was added to 0.5% carboxymethylcellulose aqueous solution. The suspended test substance shown in Table 15 was orally administered (100 mg / kg). One hour later, 0.1 ml of 1% λ-carrageenan / physiological saline solution as a pro-inflammatory substance was subcutaneously administered to the rat's hindlimb footpad to induce edema. Each footpad volume was measured before and after the administration of the inflammatory substance, and the increase rate (V1) of the footpad dose was determined. As a control group, the rate of increase in paw volume (V0) when λ-carrageenin was similarly injected into rats administered with a 0.5% carboxymethylcellulose aqueous solution containing no test substance was measured, and (V0-V1) × The carrageenin edema suppression rate (%) was calculated by the calculation formula of 100 / V0, and was defined as the anti-inflammatory activity of the test substance. It shows that anti-inflammatory activity is so high that this value is large. Table 15 shows the measured values 5 hours after λ-carrageenin injection. As is clear from the results shown in Table 15, sphingomyelin showed an edema suppression rate stronger than indomethacin and sialic acid, and was found to have a strong anti-inflammatory effect.

（実施例２）
表１６に示す配合で原料を混合後、常法により１ｇに成型、打錠して本発明の医薬を錠剤として製造した。 (Example 2)
After mixing the raw materials with the formulation shown in Table 16, it was molded into 1 g by a conventional method and tableted to produce the medicament of the present invention as a tablet.

(実施例３)
スフィンゴミエリン含量２５％のスフィンゴミエリン原料（リン脂質７００、Ｆｏｎｔｅｒｒａ社製）５０ｇを本発明の剤として４９５０ｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫ ＲＯＢＯ ＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６０００ｒｐｍで３０分間撹拌混合してスフィンゴミエリン含量２５０ｍｇ／１００ｇのスフィンゴミエリン溶液を得た。このスフィンゴミエリン溶液４．０ｋｇに、カゼイン５．０ｋｇ、大豆タンパク質５．０ｋｇ、魚油１．０ｋｇ、シソ油３．０ｋｇ、デキストリン１８．０ｋｇ、ミネラル混合物６．０ｋｇ、ビタミン混合物１．９５ｋｇ、乳化剤２．０ｋｇ、安定剤４．０ｋｇ、香料０．０５ｋｇを配合し、２００ｍｌのレトルトパウチに充填し、レトルト殺菌機（第１種圧力容器、ＴＹＰＥ：ＲＣＳ−４ＣＲＴＧＮ、日阪製作所社製）で１２１℃、２０分間殺菌して、本発明の剤を配合した液状栄養組成物５０ｋｇを製造した。なお、この液状栄養組成物には、１００ｇあたり、スフィンゴミエリンが２０ｍｇ含まれていた。 Example 3
50 g of sphingomyelin raw material (phospholipid 700, manufactured by Fonterra) having a sphingomyelin content of 25% is dissolved in 4950 g of deionized water as an agent of the present invention, heated to 50 ° C., and then TK homomixer (TK ROBO MICS; specialized machine) Manufactured by Kogyo Co., Ltd.) and stirred and mixed at 6000 rpm for 30 minutes to obtain a sphingomyelin solution having a sphingomyelin content of 250 mg / 100 g. 4.0 kg of this sphingomyelin solution, 5.0 kg of casein, 5.0 kg of soy protein, 1.0 kg of fish oil, 3.0 kg of perilla oil, 18.0 kg of dextrin, 6.0 kg of mineral mixture, 1.95 kg of vitamin mixture, emulsifier 2 0.0 kg, stabilizer 4.0 kg, and fragrance 0.05 kg were mixed, filled in a 200 ml retort pouch, and retort sterilizer (type 1 pressure vessel, TYPE: RCS-4CRTGN, manufactured by Nisaka Manufacturing Co., Ltd.) at 121 ° C. And sterilized for 20 minutes to produce 50 kg of a liquid nutritional composition containing the agent of the present invention. This liquid nutritional composition contained 20 mg of sphingomyelin per 100 g.

（実施例４）
スフィンゴミエリン含量１０％のスフィンゴミエリン原料（リン脂質５００、Ｆｏｎｔｅｒｒａ社製）１０ｇを本発明の剤として７００ｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ Ｔ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。この溶液に、ソルビトール４０ｇ、酸味料２ｇ、香料２ｇ、ペクチン５ｇ、乳清タンパク質濃縮物５ｇ、乳酸カルシウム１ｇ、脱イオン水２３５ｇを添加して、撹拌混合した後、２００ｍｌのチアパックに充填し、８５℃、２０分間殺菌後、密栓し、本発明の剤を配合したゲル状食品５袋（２００ｇ入り）を調製した。このようにして得られたゲル状食品は、すべて沈殿等は認められず、風味に異常は感じられなかった。なお、このゲル状食品には、１００ｇあたり、スフィンゴミエリンが１００ｍｇ含まれていた。 Example 4
10 g of sphingomyelin raw material having a sphingomyelin content of 10% (phospholipid 500, manufactured by Fonterra) was dissolved in 700 g of deionized water as an agent of the present invention, heated to 50 ° C., and then treated with an ultradisperser (ULTRA-TURRAX T-25). And manufactured by IKA Japan) at 9500 rpm for 30 minutes. To this solution, 40 g of sorbitol, 2 g of acidulant, 2 g of fragrance, 5 g of pectin, 5 g of whey protein concentrate, 1 g of calcium lactate and 235 g of deionized water were added and mixed with stirring. After sterilizing at 20 ° C. for 20 minutes, the bottle was sealed and 5 gel bags (200 g) containing the agent of the present invention were prepared. The gel-like foods thus obtained were not found to have any precipitation or the like, and no abnormal flavor was felt. The gel food contained 100 mg of sphingomyelin per 100 g.

（実施例５）
酸味料２ｇを７００ｇの脱イオン水に溶解した後、スフィンゴミエリン含量２５％のスフィンゴミエリン原料（リン脂質７００、Ｆｏｎｔｅｒｒａ社製）１０ｇを本発明の剤として溶解し、５０℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ Ｔ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。マルチトール１００ｇ、還元水飴２０ｇ、香料２ｇ、脱イオン水１６６ｇを添加した後、１００ｍｌのガラス瓶に充填し、９０℃、１５分間殺菌後、密栓し、本発明の剤を配合した飲料１０本（１００ｍｌ入り）を調製した。このようにして得られた飲料は、すべて沈殿は認められず、風味に異常は感じられなかった。なお、この飲料には、１００ｇあたり、スフィンゴミエリンが２５０ｍｇ含まれていた。 (Example 5)
After dissolving 2 g of acidulant in 700 g of deionized water, 10 g of sphingomyelin raw material having a sphingomyelin content of 25% (phospholipid 700, manufactured by Fonterra) was dissolved as an agent of the present invention, heated to 50 ° C., Ultradis The mixture was stirred and mixed at 9500 rpm for 30 minutes with a parser (ULTRA-TURRAX T-25; manufactured by IKA Japan). After adding 100 g of maltitol, 20 g of reduced starch syrup, 2 g of fragrance and 166 g of deionized water, it is filled into a 100 ml glass bottle, sterilized at 90 ° C. for 15 minutes, sealed, and 10 drinks (100 ml) containing the agent of the present invention Prepared). In all of the beverages obtained in this way, no precipitation was observed and no abnormal flavor was felt. In addition, this drink contained 250 mg of sphingomyelin per 100 g.

（実施例６）
スフィンゴミエリン含量４％のスフィンゴミエリン原料（ＳＭ−４、Ｃｏｒｍａｎ社製）２ｋｇを本発明の剤として９８ｋｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫII １６０型；特殊機化工業社製）にて、３６００ｒｐｍで４０分間撹拌混合してスフィンゴミエリン含量８０ｍｇ／１００ｇのスフィンゴミエリン溶液を得た。このスフィンゴミエリン溶液１０ｋｇに大豆粕１２ｋｇ、脱脂粉乳１４ｋｇ、大豆油４ｋｇ、コーン油２ｋｇ、パーム油２３．２ｋｇ、トウモロコシ澱粉１４ｋｇ、小麦粉９ｋｇ、ふすま２ｋｇ、ビタミン混合物５ｋｇ、セルロース２．８ｋｇ、ミネラル混合物２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間殺菌して、本発明の剤を配合したイヌ飼育用飼料１００ｋｇを製造した。なお、このイヌ用飼料には、１００ｇあたり、スフィンゴミエリンが８ｍｇ含まれていた。 (Example 6)
2 kg of sphingomyelin raw material (SM-4, manufactured by Corman) having a sphingomyelin content of 4% was dissolved in 98 kg of deionized water as an agent of the present invention, heated to 50 ° C., and then TK homomixer (MARK II 160 type; special machine) (Manufactured by Kogyo Co., Ltd.) and stirring and mixing at 3600 rpm for 40 minutes to obtain a sphingomyelin solution having a sphingomyelin content of 80 mg / 100 g. 10 kg of this sphingomyelin solution, 12 kg of soybean meal, 14 kg of nonfat dry milk, 4 kg of soybean oil, 2 kg of corn oil, 23.2 kg of palm oil, 14 kg of corn starch, 9 kg of wheat flour, 2 kg of bran, 5 kg of vitamin mixture, 2.8 kg of cellulose, 2 kg of mineral mixture Was sterilized at 120 ° C. for 4 minutes to produce 100 kg of dog breeding feed formulated with the agent of the present invention. The dog feed contained 8 mg of sphingomyelin per 100 g.

本発明のスフィンゴミエリンを有効成分とする種々の疾患の予防剤または治療剤である医薬またはこれらの剤を配合した飲食品もしくは飼料は、それぞれの疾患の予防または治療、症状の改善等に用いることができ、非常に有用である。   The medicament which is a preventive or therapeutic agent for various diseases comprising the sphingomyelin of the present invention as an active ingredient, or a food or drink or feed containing these agents should be used for the prevention or treatment of each disease, improvement of symptoms, etc. Can be very useful.

Claims (2)

スフィンゴミエリンを有効成分として含有する悪酔い予防用医薬組成物。 A pharmaceutical composition for preventing sickness, comprising sphingomyelin as an active ingredient. スフィンゴミエリンが乳由来であることを特徴とする請求項１記載の悪酔い予防用医薬組成物。 2. The pharmaceutical composition for preventing sickness according to claim 1, wherein sphingomyelin is derived from milk.

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