JP5397991B2 - Determination method of vitamin B12 using lactic acid bacteria - Google Patents
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Description
本発明は、ビタミンB12のバイオアッセイに適用可能な乳酸菌を用いたビタミンB12の定量方法に関する。 The present invention relates to a method of quantifying vitamin B 12 using the applicable milk acid bacteria bioassays of vitamin B 12.
ビタミンB12は、我々ヒトを含めたすべての動物や一部の細菌、藻類が必要とする必須栄養素であり、生体内においてビタミンB12はメチル基の転位といった分子内転位反応の補酵素として重要な反応に関与している。供給源としては牛のレバー・貝類・青魚・乳製品・卵などの動物性食品が挙げられ、植物質中にはほとんど存在しないとされるため、菜食主義者にビタミンB12の欠乏症が多く、欠乏症としては、悪性貧血が挙げられる。この悪性貧血は骨髄による血球細胞の生産が減少し、致死的になる可能性もあり、悪性貧血から神経疾患をも引き起こすこともある。このような欠乏症を防止するために、食品中におけるビタミンB12の含有量を知り、栄養管理に役立てることが非常に重要である。 Vitamin B 12 is an essential nutrient required by all animals, including humans, some bacteria, and algae. Vitamin B 12 is important as a coenzyme for intramolecular rearrangement reactions such as methyl group rearrangement in vivo. Is involved in the reaction. Sources include animal foods such as beef liver, shellfish, blue fish, dairy products, eggs, etc., and it is said that they are hardly present in plant matter, so vegetarians often have vitamin B 12 deficiency, Deficiency includes pernicious anemia. This pernicious anemia reduces blood cell production by the bone marrow, can be fatal, and can also cause neurological disease from pernicious anemia. In order to prevent such deficiencies, it is very important to know the content of vitamin B 12 in foods and use it for nutritional management.
微量成分であるビタミンB12の定量法は、乳酸菌による微生物定量法、いわゆるバイオアッセイが、公的に認められた定量法として利用されており、日本食品標準成分表分析マニュアルにも記載されている。そして、指示菌として指定されている乳酸菌は、ラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830（分類学上はL. delbrueckii subsp. lactis）である（非特許文献１）。 Determination of vitamin B 12 is a minor component, microbial assay by lactic acid bacteria, so-called bioassays, are utilized as a quantitative method recognized publicly, it is also described in Standard Tables of Food Composition in Japan Analysis Manual . The lactic acid bacterium designated as the indicator bacterium is Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 (taxonically L. delbrueckii subsp. Lactis) (Non-patent Document 1).
また、特表２００８−５０７９６４号公報には、２００〜５００ｍＭトレハロース／スクロースを含有する凍結溶液中で−８０℃で急速凍結され、それから凍結乾燥された微生物が入った微小滴定プレートを使用して、ビタミンB12などの物質を微生物学的に定量する方法が開示されており、前記微生物としてLactobacillus delbrueckii subsp. lactisが使用されている（特許文献１）。 In addition, in Japanese translation of PCT publication No. 2008-507964, using a microtiter plate containing microorganisms rapidly frozen at −80 ° C. in a freezing solution containing 200 to 500 mM trehalose / sucrose and then freeze-dried, A method for microbiologically quantifying substances such as vitamin B 12 is disclosed, and Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis is used as the microorganism (Patent Document 1).
バイオアッセイに使用される他の定量用微生物としては原虫や大腸菌変異株などがあるが、それぞれ操作の煩雑さや低特異性等といった点で問題がある。機器分析が発達した現在ではHPLC法、放射性同位体希釈定量法、化学発光免疫測定法なども用いられるが、感度の不足や実験操作の難しさ、特殊な施設・設備を要するなどの問題点がある。 Other quantitative microorganisms used in bioassays include protozoa and Escherichia coli mutants, which have problems in terms of operational complexity and low specificity, respectively. Now that instrumental analysis has developed, HPLC methods, radioisotope dilution quantification methods, chemiluminescence immunoassay methods, etc. are also used, but there are problems such as insufficient sensitivity, difficulty in experimental operations, and the need for special facilities and equipment is there.
しかし、バイオアッセイによるビタミンB12の定量法は感度や簡便性に優れているが、検量線の安定性が十分でないという問題が以前から指摘されていた。この原因として、指示菌として指定されているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830（L. delbrueckii subsp. lactis）の生育がビタミンB12 制限下の合成培地中で安定せず、ビタミンB12 消費が菌の生育量へ正確に反映されていないことが考えられる。 However, determination of vitamin B 12 by bioassay is excellent in sensitivity and convenience, a problem that the stability of the calibration curve is not sufficient has been pointed out previously. This is because the growth of Lactobacillus leichmannii (Lactobacillus leichmannii) ATCC 7830 (L. delbrueckii subsp. Lactis), which is designated as the indicator bacterium, is not stable in the synthetic medium under vitamin B 12 restriction and vitamin B 12 consumption May not be accurately reflected in the growth of the fungus.
この問題を解決するために過去に様々検討されてきたが、いまだ解決には至っていない。乳酸菌の中にはまだビタミンB12を要求するものが多くあるのでその中から新たな指示菌を見つけるのも解決策のひとつではないかと考えられる。 Various studies have been made in the past to solve this problem, but it has not yet been solved. Because some of the lactic acid bacteria still there are many things that require vitamin B 12 is considered or not is also one of the solutions to find a new indicator strain from among them.
そこで本発明は、安定した検量線を作成するためにラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830株より優れた株を探索し、より安定したビタミンB12定量法を確立することを目的とする。 The present invention is a stable Lactobacillus Raihimani (Lactobacillus leichmannii) to prepare a calibration curve to explore better strains from ATCC 7830 strain, and to establish a more stable vitamin B 12 assay.
本発明者らは、供試菌株としてラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830株に相当する乳酸菌を漬物から分離し、分離した乳酸菌についてビタミンB12 定量用培地とシアノコバラミンを用いる常法により要求性を調べたところ、分離した乳酸菌はビタミンB12の要求性が高く、かつ生育がビタミンB12濃度に依存的である乳酸菌であることが判明した。そこで、分離した乳酸菌の検量線の精度や再現性、さらに添加回収試験により確度を検討したところ、日本食品標準成分表分析マニュアルで指定されている濃度範囲でラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830株よりも検量線が安定しており、精度が高いとの知見を得た。 The present inventors have provided the lactic acid bacteria corresponding to Lactobacillus Raihimani (Lactobacillus leichmannii) ATCC 7830 strain was separated from pickles as fungus strain, auxotrophic by a conventional method using a vitamin B 12 quantitative medium and cyanocobalamin for isolated lactic acid bacteria Examination of the separated lactic acid bacteria is highly auxotrophic vitamin B 12, and the growth was found to be a lactic acid bacteria is dependent on vitamin B 12 concentrations. Therefore, we examined the accuracy and reproducibility of the isolated lactic acid bacteria calibration curve and the accuracy of addition and recovery tests, and found that the concentration range specified in the Japanese Food Standards Composition Analysis Manual was within the concentration range specified in the Lactobacillus leichmannii ATCC 7830. It was found that the calibration curve was more stable than the strain and the accuracy was high.
本発明はかかる知見に基づくものであり、乳酸菌を使用してビタミンB12を定量するためのビタミンB12定量用乳酸菌であって、前記乳酸菌が、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）であることを特徴とする、ビタミンB12定量用乳酸菌を提供するものである。 The present invention is based on such findings, a vitamin B 12 for quantification lactobacillus for quantifying vitamin B 12 using lactic acid bacteria, the lactic acid bacteria, Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp . characterized in that it is a delbrueckii), there is provided a vitamin B 12 for quantification lactobacillus.
また、本発明は、乳酸菌を使用するビタミンB12の定量方法において、前記乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）を使用することを特徴とする、ビタミンB12の定量方法を提供するものである。 The present invention also provides a method of quantifying vitamin B 12 to use the lactic acid bacteria, as the lactic acid bacteria, characterized by the use of Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii), vitamin B 12 A quantitative method is provided.
本発明のビタミンB12の定量方法によれば、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指示菌として使用されているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830株と比較して、検量線が安定して精度が高いビタミンB12の定量が可能となる。 According to method of quantifying vitamin B 12 of the present invention, as compared with conventional Lactobacillus have been used as indicator strain bioassays of vitamin B 12 Bacillus Raihimani (Lactobacillus leichmannii) ATCC 7830 strain, a calibration curve is stable This makes it possible to quantify vitamin B 12 with high accuracy.
１．ビタミンB12定量用乳酸菌
本実施形態のビタミンB12定量用乳酸菌は、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）である。
1. Vitamin B 12 Vitamin B 12 for quantification of lactic acid bacteria for the determination lactic acid bacteria present embodiment is a Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii).
ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）の中でも、特にラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）NRIC 0705株（受託番号：NITE P-727）、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）NRIC 0755株（受託番号：NITE P-728）、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）NRIC 0756株（受託番号：NITE P-729）のいずれかを選択することが好ましい。 Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki Among the (. Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii), especially Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii.) NRIC 0700 shares (consignment number: NITE P -726), Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (. Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii) NRIC 0705 shares (consignment number: NITE P -727), Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (. Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii) NRIC 0755 shares (trustee number: NITE P -728), Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii) NRIC 0756 strain (fiduciary ID:. it is preferred to select one of the NITE P -729).
これらの乳酸菌は、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830株と比較して、適切な検量線が得られるため、精度の高いビタミンB12の定量を行うことができる。特に、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）については、ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌としての適格性に優れているため好ましい。 These lactic acid bacteria, since as compared with conventional Lactobacillus known as specified bacterial bioassays of vitamin B 12 Bacillus Raihimani (Lactobacillus leichmannii) ATCC 7830 strain, appropriate calibration curve is obtained, accurate vitamins B 12 can be quantified. In particular, Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii.) NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726) for, excellent qualify as specified bacterial bioassays of vitamin B 12 Therefore, it is preferable.
現在、ビタミンB12の指示菌として使用されているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830は、分類学上はラクトバチルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・ラクティス（L. delbrueckii subsp. lactis）に分類されている。従って、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）とは多くの類似点を有している。 Lactobacillus leichmannii ATCC 7830, currently used as an indicator for vitamin B 12 , is classified as L. delbrueckii subsp. Lactis on taxonomics. Yes. Therefore, it has many similarities with Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii.
NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）、NRIC 0705株（受託番号：NITE P-727）、NRIC 0755株（受託番号：NITE P-728）及びNRIC 0756株（受託番号：NITE P-729）の４株は、ATCC 7830株と比較して、形態学的性質、培養的性質、化学分類学的性質に関しては特に差異は認められない。但し、表１に示すように、生理学的性質において、生育温度範囲とラクトース発酵能が異なる。ラクトース発酵能については、上記４株がラクトース発酵能がないのに対して、ATCC 7830株は発酵能を有している。 NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726), NRIC 0705 strain (consignment number: NITE P -727), NRIC 0755 strain (consignment ID: NITE P -728) and NRIC 0756 strain (commissioned Number: The 4 strains of NITE P- 729) are not particularly different from the ATCC 7830 strain in terms of morphological properties, culture properties, and chemical taxonomic properties. However, as shown in Table 1, the growth temperature range and lactose fermentability are different in physiological properties. Regarding the lactose fermentation ability, the above four strains have no lactose fermentation ability, whereas the ATCC 7830 strain has fermentation ability.
また、NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）、NRIC 0705株（受託番号：NITE P-727）、NRIC 0755株（受託番号：NITE P-728）及びNRIC 0756株（受託番号：NITE P-729）の４株は、16S rDNA配列は全く同じである（配列番号：１）。ATCC 7830株の16S rDNA配列（配列番号：２）と比較した場合、前記４株とATCC 7830株相同性は99.1％である。 Further, NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726), NRIC 0705 strain (consignment number: NITE P -727), NRIC 0755 strain (consignment number: NITE P -728) and NRIC 0756 strain (trustee No .: NITE P- 729) has the same 16S rDNA sequence (SEQ ID NO: 1). When compared with the 16S rDNA sequence of the ATCC 7830 strain (SEQ ID NO: 2), the homology between the 4 strains and the ATCC 7830 strain is 99.1%.
図１は、ATCC 7830株（上段）とNRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）（下段）の対応する塩基配列を比較した結果を示す図である。図中、黒く反転させた箇所の塩基が相違していることを意味している。 1, ATCC 7830 strain (top) and NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726) is a graph showing the results of comparing the corresponding nucleotide sequence of (lower). In the figure, it means that the bases of the portions inverted in black are different.
NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）、NRIC 0705株（受託番号：NITE P-727）、NRIC 0755株（受託番号：NITE P-728）及びNRIC 0756株（受託番号：NITE P-729）の培地は、公知の乳酸菌培地を使用することができ、培養条件も、生育温度以外については一般のラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）と同じ条件で培養することができる。 NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726), NRIC 0705 strain (consignment number: NITE P -727), NRIC 0755 strain (consignment ID: NITE P -728) and NRIC 0756 strain (commissioned Number: As the medium for NITE P- 729), a known lactic acid bacteria medium can be used, and the culture conditions can also be cultured under the same conditions as general Lactobacillus delbrueckii except for the growth temperature.
２．ビタミンB12の定量方法
（１）試料の調製
図２は、本実施形態のビタミンB12の定量方法に供される試料の調製方法の概要を説明した図である。ビタミンB12の定量に供される試料の調製方法は、日本食品標準成分表の分析マニュアルに基づき実施することができる。
2. Vitamin B 12 Quantification Method (1) Sample Preparation FIG. 2 is a diagram illustrating an outline of a sample preparation method used in the vitamin B 12 quantification method of the present embodiment. Method of preparing a sample subjected to the determination of vitamin B 12 can be carried out based on the Standard Tables of Food Composition in Japan analysis documentation.
すなわち、ビタミンB12の定量を行う食品等の試料を採取し、そこに水、酢酸緩衝液及びシアン化カリウム溶液を添加した後、所定時間、煮沸抽出を行う。 That is, samples were taken of the food or the like for quantitative determination of vitamin B 12, which water, after addition of acetate buffer and potassium cyanide solution for a predetermined time, performs boiling extraction.
ここで、日本食品標準成分表の分析マニュアルによれば、酢酸緩衝液は0.57mol/l酢酸緩衝液を使用するが、0.57mol/l酢酸緩衝液にかえて0.1mol/l酢酸緩衝液を使用することが好ましい。発明者らが検討した結果、0.57mol/l酢酸緩衝液が後述するビタミンB12用培地に持ち込まれることによって、供試菌株のビタミンB12に対する確度に影響を及ぼすことが判明した。かかる場合に、0.57mol/l酢酸緩衝液にかえて0.1mol/l酢酸緩衝液を使用することで、ビタミンB12の確度を高めることができる。 Here, according to the analysis manual of the Japanese food standard ingredient table, 0.57 mol / l acetate buffer is used as the acetate buffer, but 0.1 mol / l acetate buffer is used instead of 0.57 mol / l acetate buffer. It is preferable to do. As a result of investigations by the inventors, it has been found that the accuracy of the test strain against vitamin B 12 is affected by bringing 0.57 mol / l acetate buffer into the vitamin B 12 medium described later. In such a case, the accuracy of vitamin B 12 can be increased by using a 0.1 mol / l acetate buffer instead of the 0.57 mol / l acetate buffer.
煮沸抽出後、冷却し、そこにメタリン酸溶液を添加する。定容し濾過した後、ろ液を分取し、ビタミンB12定量用試料と、アルカリ耐性因子定量用試料を調製する。 After boiling extraction, it is cooled and a metaphosphoric acid solution is added thereto. After constant volume filtration, it was separated the filtrate, and vitamin B 12 quantitative sample, preparing the alkali resistance factor quantitative sample.
（２）ビタミンB12量の定量
図３は、本実施形態のビタミンB12の定量方法に使用される検量線の作成手順と上記（１）で調製した試料のビタミンB12量を定量する方法を説明した図である。ビタミンB12量の定量は、日本食品標準成分表の分析マニュアルに基づき実施することができる。
(2) Quantification of Vitamin B 12 FIG. 3 is a procedure for preparing a calibration curve used in the method for quantifying vitamin B 12 according to the present embodiment and a method for quantifying the amount of vitamin B 12 in the sample prepared in (1) above. FIG. The amount of vitamin B 12 can be quantified based on the analysis manual of the Japanese Food Standard Composition Table.
検量線の作成は、まず濃度を変えたビタミンB12の標準液を調製し、ビタミンB12を定量するための培地に加える。次に、ビタミンB12の定量用乳酸菌を接種し、所定の条件で乳酸菌を培養する。乳酸菌としては、上記１で説明したビタミンB12定量用乳酸菌を使用する。 Creating a calibration curve, first a standard solution of vitamin B 12 with different concentrations were prepared and added to the culture medium for quantitating vitamin B 12. Next, lactic acid bacteria for quantification of vitamin B 12 are inoculated, and the lactic acid bacteria are cultured under predetermined conditions. As the lactic acid bacteria, the lactic acid bacteria for vitamin B 12 determination described in 1 above are used.
上記１で説明したビタミンB12定量用乳酸菌を使用することにより、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指示菌として使用されているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830株と比較して、検量線が安定して精度が高いビタミンB12の定量が可能となる。 Compared with Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 strain, which is conventionally used as an indicator for bioassay of vitamin B 12 by using the lactic acid bacteria for quantification of vitamin B 12 described in 1 above, Vitamin B 12 can be quantified with a stable line and high accuracy.
乳酸菌の培養後、吸光度を測定し、生育濁度を測定する。そして、ビタミンB12濃度とそれに対応する吸光度の値に基づいて検量線を作成する。 After culturing lactic acid bacteria, the absorbance is measured and the growth turbidity is measured. Then, a calibration curve is created based on the vitamin B 12 concentration and the absorbance value corresponding thereto.
検量線を作成した後、上記（１）で調製したビタミンB12定量用試料をビタミンB12を定量用培地に加え、ビタミンB12定量用乳酸菌を添加して培養し、吸光度で生育濁度を測定する。同様にして、上記（１）で調製したアルカリ耐性因子定量用試料についても実施する。そして、先に作成した検量線から濁度に対応するビタミンB12量とアルカリ耐性因子量を算出する。 After creating the calibration curve, the vitamin B 12 quantitative sample prepared in the above (1) was added to the quantitative medium vitamin B 12, and cultured with the addition of vitamin B 12 quantitative lactobacilli, growth turbidity by absorbance taking measurement. Similarly, the alkali resistance factor quantification sample prepared in the above (1) is also carried out. Then, the amount of vitamin B 12 corresponding to the turbidity and the amount of alkali resistance factor are calculated from the calibration curve created earlier.
最後に、ビタミンB12量からアルカリ耐性因子量を引けば、試料中に含まれるビタミンB12含量を算出することができる。 Finally, the vitamin B 12 content contained in the sample can be calculated by subtracting the alkali resistance factor amount from the vitamin B 12 amount.
１．検量線の作成
（１）供試菌株
ビタミンB12定量用乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）、NRIC 0705株（受託番号：NITE P-727）、NRIC 0755株（受託番号：NITE P-728）、NRIC 0756株（受託番号：NITE P-729）及び従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830株を使用した。
1. As for creating (1) test strain vitamin B 12 for quantification lactobacillus calibration curve, Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii.) NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726), NRIC 0705 strain (consignment number: NITE P -727), NRIC 0755 strain (consignment number: NITE P -728), NRIC 0756 strain (consignment number: NITE P -729) and specify the bioassay conventional vitamin B 12 bacteria Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 strain, known as
（２）保存方法
供試菌株を表２に示すトマト寒天培地に接種し、37℃、24時間培養後、1〜2週間低温室で保存した。
(2) Storage method The test strains were inoculated on a tomato agar medium shown in Table 2, cultured at 37 ° C for 24 hours, and then stored in a cold room for 1-2 weeks.
（３）前培養
トマト寒天培地に保存した供試菌株を表３に示すトマト培地に接種し、37℃、24時間培養した。これを2回行った。
(3) Preculture The test strain preserved in the tomato agar medium was inoculated into the tomato medium shown in Table 3, and cultured at 37 ° C. for 24 hours. This was done twice.
（４）接種菌液の調製
トマト培地にて培養後、0.85 %の滅菌生理食塩水を用いて、菌体洗浄を2回行い、菌体量を一定にするため600 nmにおける透過率が80〜90 ％となるように希釈し、接種菌液とした。
(4) Preparation of inoculum solution After culturing in tomato medium, 0.85% sterilized physiological saline is used to wash the cells twice, and the transmittance at 600 nm is 80 to 80% in order to keep the amount of cells constant. It was diluted to 90% and used as an inoculum.
（５）本培地の調製
表４に示す組成からなるビタミンB12 定量用基礎培地（pH 6.0）1.25 mlにビタミンB12 標準液を加えて、必要に応じて蒸留水でフィルアップし、全量2.5 mlとした。その後、121℃、5分間オートクレーブで滅菌したものを本培地とした。なお、ビタミンB12 標準液は、シアノコバラミン標準品を25%（v/v）エタノール溶液に溶かし、10 μg/mlの水溶液の361 nmの吸光度0.207を用いて希釈し、調製したものを使用した。
(5) vitamin B 12 quantitative basal medium (pH 6.0) having the composition shown in preparation Table 4 of this medium was added vitamin B 12 standard into 1.25 ml, was filled up with distilled water if necessary, the total amount 2.5 ml. Then, this medium was sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 5 minutes. The vitamin B 12 standard solution was prepared by dissolving a cyanocobalamin standard solution in a 25% (v / v) ethanol solution and diluting it with an absorbance of 0.271 at 361 nm in a 10 μg / ml aqueous solution.
（６）本培養
上記（４）で調製した接種菌液20 μlを上記（５）で調製したビタミンB12 定量用基礎培地に接種し、37℃、24時間培養した。
The inoculum 20 [mu] l prepared in (6) the culture above (4) was inoculated into vitamin B 12 for quantifying basal medium prepared in the above (5), 37 ° C., and cultured for 24 hours.
（７）生育濁度の測定
吸光度計（ＬＫＢ社製のNOVASPEC II）を使用して、600 nmの波長で上記（６）で得られた培養液中の生育濁度を測定した。対照として無接種培地の測定値を差し引き、各濃度における吸光度を求めた。
(7) Measurement of growth turbidity Using an absorptiometer (NOVASPEC II manufactured by LKB), the growth turbidity in the culture solution obtained in (6) above was measured at a wavelength of 600 nm. As a control, the measured value of the non-inoculated medium was subtracted to determine the absorbance at each concentration.
（８）検量線の作成
図４は、各乳酸菌のビタミンB12の検量線を示す図である。R2は決定係数を意味し、値が１に近づくほど理論値に近い検量線であることを示す。図４に示すとおり、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）、NRIC 0705株（受託番号：NITE P-727）、NRIC 0755株（受託番号：NITE P-728）、NRIC 0756株（受託番号：NITE P-729）の各乳酸菌は、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830株よりも決定係数（R2）の値が高く、ビタミンB12のバイオアッセイの指示菌としての適性が高いことが判明した。
(8) Creation Figure 4 of the calibration curve is a diagram showing the calibration curve of vitamin B 12 of the lactic acid bacteria. R 2 means a coefficient of determination, and the closer the value is to 1, the closer to the theoretical value is the calibration curve. As shown in FIG. 4, Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii.) NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726), NRIC 0705 strain (consignment number: NITE P -727), NRIC 0755 strain (consignment number: NITE P -728), NRIC 0756 strain (consignment number: NITE P -729) each lactic acid bacteria are Lactobacillus, known as specified bacteria bioassay conventional vitamin B 12 It was found that the coefficient of determination (R 2 ) was higher than that of Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 strain, and that vitamin B 12 was highly suitable as an indicator for bioassay.
（９）線形回帰モデルの選定
現在日本食品標準成分表の分析マニュアルにおいて選定されている線形回帰モデルは単回帰モデルである。しかし、線形回帰モデルは他にも対数容量モデルやロジスティック回帰モデルがあるため、供試菌株ごとに最も適した線形回帰モデルを選定することが望ましい。そこで、各供試菌株ごとに得られた検量線について、単回帰モデル、対数容量モデル、ロジスティック回帰モデルによる分析を行った。結果を表５に示す。
(9) Selection of linear regression model The linear regression model currently selected in the analysis manual for the Japanese food standard composition table is a single regression model. However, since there are other logarithmic capacity models and logistic regression models, it is desirable to select the most suitable linear regression model for each test strain. Therefore, the standard curve obtained for each test strain was analyzed using a single regression model, logarithmic capacity model, and logistic regression model. The results are shown in Table 5.
その結果、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）はロジスティック回帰モデル、NRIC 0705株（受託番号：NITE P-727）はロジスティック回帰モデル、NRIC 0755株（受託番号：NITE P-728）は単回帰モデル又はロジスティック回帰モデル、NRIC 0756株（受託番号：NITE P-729）ロジスティック回帰モデルがそれぞれ適していることが判明した（図５、図６参照）。なお、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830株は全線形回帰モデルにおいて「直線性」、「傾き」、「三連の誤差」のいずれの項目も安定性を示す変動係数が上記４株と比較して劣っていた。 As a result, Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii.) NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726) logistic regression models, NRIC 0705 strain (consignment number: NITE P -727) is logistic regression model, NRIC 0755 strain (consignment number: NITE P -728) is a single regression model or a logistic regression model, NRIC 0756 strain (consignment number: NITE P -729) found that logistic regression model is suitable respectively (See FIGS. 5 and 6). In addition, Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 strain, which is conventionally known as a designated bacterium for vitamin B 12 bioassay, is “linearity”, “slope”, “triple error” in the all linear regression model. In any of the items, the coefficient of variation indicating stability was inferior to that of the above four strains.
２．KCN法によるビタミンB12の抽出
（１）試料抽出液の調製
試料として市販のブロイラー鶏もも肉及び市販の干し海苔を使用し、日本食品標準成分表分析マニュアルに従い、KCN法によるビタミンB12の抽出を行った。試料2 gに水40 ml、0.57 mol/l酢酸緩衝液10 mlと0.05%（w/v）シアン化カリウム溶液0.4 mlを加え、100℃、30分間煮沸抽出した。得られた抽出液を冷却した後、10%（w/v）メタリン酸溶液0.6 mlを加え、水で100 mlに定容し、ろ紙（アドバンテック社製、No.2）でろ過することにより試料抽出液を得た。
2. KCN method using a commercial broiler chicken and commercially available dried seaweed Preparation Samples of extraction (1) a sample extract of vitamin B 12 by, in accordance with Standard Tables of Food Composition in Japan Analysis Manual, extraction of vitamin B 12 by KCN method went. To 2 g of the sample, 40 ml of water, 10 ml of 0.57 mol / l acetate buffer and 0.4 ml of 0.05% (w / v) potassium cyanide solution were added and boiled and extracted at 100 ° C. for 30 minutes. After cooling the resulting extract, add 0.6 ml of 10% (w / v) metaphosphoric acid solution, adjust the volume to 100 ml with water, and filter with filter paper (No. 2 manufactured by Advantech). An extract was obtained.
なお、前記0.57 mol/l酢酸緩衝液は、酢酸39.6 mlと酢酸ナトリウム三水和物77.12 gを水に溶かし、1 mol/l塩酸溶液でpH 4.5に調製し、水を加えて1,000 mlとしたものを使用した。また、前記0.05%（w/v）シアン化カリウム溶液は、シアン化カリウム50 mgを0.2%（w/v）水酸化ナトリウム溶液に溶かし、100 mlに定容したものを使用した。 The 0.57 mol / l acetate buffer was prepared by dissolving 39.6 ml of acetic acid and 77.12 g of sodium acetate trihydrate in water, adjusting the pH to 4.5 with a 1 mol / l hydrochloric acid solution, and adding water to make 1,000 ml. I used something. The 0.05% (w / v) potassium cyanide solution was prepared by dissolving 50 mg of potassium cyanide in 0.2% (w / v) sodium hydroxide solution and making a constant volume of 100 ml.
（２）ビタミンB12定量用試料の調製
上記（１）で得られた試料抽出液から25 mlを分取し、pH 6.0に調整した後、水で50 mlに定容し、ろ紙（アドバンテック社製、No.2）でろ過することによりろ液を得た。ろ液を必要に応じて希釈したものを試料溶液Aとし、ビタミンB12定量用の試料とした。
(2) Preparation of Vitamin B 12 Quantitative Sample 25 ml was taken from the sample extract obtained in (1) above, adjusted to pH 6.0, adjusted to 50 ml with water, and filter paper (Advantech) The filtrate was obtained by filtration through No. 2). A solution obtained by diluting the filtrate as necessary was designated as sample solution A, and a sample for vitamin B 12 determination.
（３）アルカリ耐性因子定量用試料の調製
上記（１）で得られた試料抽出液から25 mlを分取し、pH 11〜12に調整した後、オートクレーブに121℃、30分間かけて滅菌した。冷却後、pH 6.0に調整し、水で50 mlに定容し、ろ紙（アドバンテック社製、No.2）でろ過することによりろ液を得た。ろ液を必要に応じて希釈したものを試料溶液Bとし、アルカリ耐性因子定量用の試料とした。
(3) Preparation of alkali resistance factor quantification sample 25 ml was taken from the sample extract obtained in (1) above, adjusted to pH 11-12, and then sterilized in an autoclave at 121 ° C for 30 minutes. . After cooling, the pH was adjusted to 6.0, the volume was adjusted to 50 ml with water, and the filtrate was obtained by filtration through filter paper (No. 2 manufactured by Advantech). A solution obtained by diluting the filtrate as required was designated as sample solution B, which was used as a sample for quantifying alkali resistance factors.
３．試料中のビタミンB12 量の定量
（１）本培地への分注
上記１（５）で調製したビタミンB12 定量用基礎培地1.25 mlに、上記２（２）で調製した試料溶液Aを1 ml加え、蒸留水を加え、全量を2.5 mlとした。その後は上記１（６）（７）と同様の要領で培養し、生育濁度を測定した。また、試料溶液Aに代えて、上記２（３）で調製した試料溶液Bについても実施した。
3. Quantification of the amount of vitamin B 12 in the sample (1) Dispensing to the medium 1 of sample solution A prepared in 2 (2) above was added to 1.25 ml of the basic medium for vitamin B 12 determination prepared in 1 (5) above. ml and distilled water were added to make the total volume 2.5 ml. Thereafter, the cells were cultured in the same manner as in 1 (6) and (7) above, and the growth turbidity was measured. Moreover, it replaced with the sample solution A and implemented also about the sample solution B prepared by said 2 (3).
（２）ビタミンB12 量の算出
ビタミンB12 量は、検量線から求めたビタミンB12濃度に基づき、下記数式（１）から算出した。また、アルカリ耐性因子含量は、検量線から求めたアルカリ耐性因子濃度に基づき、下記数式（２）から算出した。そして、下記数式（３）に示すように、試料溶液AのビタミンB12 量から、試料溶液Bのアルカリ耐性因子量を差し引くことにより、最終的に試料中のビタミンB12含量を算出した。結果を表６に示す。
(2) Calculation of the amount of vitamin B 12 The amount of vitamin B 12 was calculated from the following formula (1) based on the vitamin B 12 concentration obtained from the calibration curve. The alkali resistance factor content was calculated from the following mathematical formula (2) based on the alkali resistance factor concentration obtained from the calibration curve. Then, as shown in the following mathematical formula (3), the vitamin B 12 content in the sample was finally calculated by subtracting the alkali resistance factor amount of the sample solution B from the vitamin B 12 amount of the sample solution A. The results are shown in Table 6.
４．試料抽出方法の検討
（１）試料を処理するときに使用する試薬の影響
試料を処理するときに使用する試薬（KCN、酢酸、メタリン酸）によって確度が影響を受けるか調べた。すなわち、検量線用に調製した各濃度のシアノコバラミン含有培地に、処理したシアノコバラミン標準液を一定量加え、供試菌株として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）と、NRIC 0755株（受託番号：NITE P-728）を接種し、吸光度で生育濁度を測定し、その測定結果に基づいて添加回収率を算出し、確度が高い範囲を調べた。
4). Examination of sample extraction method (1) Effect of reagents used when processing samples We examined whether the accuracy was affected by the reagents (KCN, acetic acid, metaphosphoric acid) used when processing samples. That is, a fixed amount of a treated cyanocobalamin standard solution was added to a cyanocobalamin-containing medium at each concentration prepared for a calibration curve, and Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii NRIC 0700 strain ( consignment numbers: the NITE P -726), NRIC 0755 strain (consignment ID: NITE P -728) was inoculated to measure growth turbidity by absorbance to calculate the added recovery rate based on the measurement result, The range with high accuracy was examined.
結果を表７に示す。NRIC 0700株（受託番号：NITE P-726）は、0から120 pg/tubeの広い範囲で確度が高かった。これに対し、NRIC 0755株（受託番号：NITE P-728）は確度の高い範囲は0から80 pg/tubeであった。 The results are shown in Table 7. NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726), the accuracy was high in a wide range of 0 to 120 pg / tube. In contrast, NRIC 0755 strain (consignment number: NITE P -728) high range accuracy was 0 from 80 pg / tube.
この結果から、試料を抽出するときに使用する試薬（KCN、酢酸、メタリン酸など）が確度に影響を与える可能性が示唆された。 This result suggests that the reagents (KCN, acetic acid, metaphosphoric acid, etc.) used when extracting the sample may affect the accuracy.
（２）試料を抽出する試薬の検討
上記（１）の結果に基づき、KCN法によるビタミンB12の抽出方法に使用する試薬の改良を行った。酢酸緩衝液の影響を低減させるため、酢酸緩衝液の濃度を0.57 mol/lから0.1 mol/lとした。すなわち、ビタミンB12の抽出に影響を与えず、かつ、検量線用の培地とビタミンB12量定量用の培地との酢酸緩衝液の濃度差が少なくなるように酢酸緩衝液の濃度を調整した。
(2) Based on the consideration above (1) Result of the reagent to extract samples were improved reagents for use in the method of extracting the vitamin B 12 by KCN method. In order to reduce the influence of the acetate buffer, the concentration of the acetate buffer was changed from 0.57 mol / l to 0.1 mol / l. That is, without affecting the extraction of vitamin B 12, and to adjust the concentration of the acetate buffer to a concentration difference of acetate buffer with medium and medium for amount of vitamin B 12 Determination of standard curve for decreases .
図７に、供試菌株として、NRIC 0700株を使用したときの試料のビタミンB12の回収率につき、理論値と実測値を比較した結果を示す。図７に示す通り、試料を抽出する際に使用する酢酸緩衝液の濃度を0.57 mol/lから0.1 mol/lにすることで、試料中のビタミンB12の回収率が0から160pg/5mlまでの範囲で、ほぼ100％となることが判明した。 7, provided as a fungus strain, per recovery of the sample of vitamin B 12 when using NRIC 0700 strain, it shows the result of comparing the measured values with the theoretical values. As shown in FIG. 7, the recovery rate of vitamin B 12 in the sample is reduced from 0 to 160 pg / 5 ml by changing the concentration of the acetate buffer used to extract the sample from 0.57 mol / l to 0.1 mol / l. It became clear that it became almost 100% in the range.
また、上記（１）の測定可能範囲についても、培地条件の変更により0から120 pg/tube であった測定可能範囲が、0から160 pg/tube まで安定して測定できるようになった。これは、日本食品標準成分表の分析マニュアルで定めている150 pg/tube よりも広い範囲である。
In addition, the measurable range of (1) above can be stably measured from 0 to 120 pg / tube from 0 to 120 pg / tube by changing the medium conditions. This is a wider range than the 150 pg / tube specified in the analysis manual of the Japanese Food Standard Composition Table.
Claims (3)
前記乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）を使用することを特徴とする、
ビタミンB12の定量方法。 In a method for quantifying vitamin B 12 in a sample using lactic acid bacteria,
Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii (Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii) is used as the lactic acid bacterium,
Vitamin B 12 quantification method.
請求項１に記載のビタミンB12の定量方法。 The lactic acid bacteria, Lactobacillus Deruburyukki subsp Deruburyukki (Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii.) NRIC 0700 strain (consignment number: NITE P -726), NRIC 0705 strain (Accession Number: NITE P-727), NRIC 0755 strain ( (Accession number: NITE P-728), NRIC 0756 strain (Accession number: NITE P-729), one kind of lactic acid bacteria selected from the group ,
The method of quantifying vitamin B 12 as defined in claim 1.
前記酢酸緩衝液として、0.1mol/l酢酸緩衝液を使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載のビタミンB12の定量方法。
The sample, water and an acetate buffer, a method of quantifying vitamin B 12 according to claim 1 or 2 comprising the step of treating with potassium cyanide solution,
Examples acetate buffer, characterized by the use of 0.1 mol / l acetate buffer, quantitative method of vitamin B 12 as defined in claim 1 or 2.
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