JP5393077B2 - Nucleic acid amplification method - Google Patents

Abstract

An object to be achieved by the present invention is to provide a nucleic acid amplification method by which a nucleic acid can be amplified using oligonucleotide primers and DNA polymerase. The present invention provides a nucleic acid amplification method which comprises performing incubation of a reaction solution containing at least one type of deoxynucleotide triphosphate, at least one type of DNA polymerase having strand displacement activity, at least two types of oligonucleotide primer, and the nucleic acid fragment as a template so as to perform a polymerase reaction that initiates from the 3' end of the primer and thus amplifying the nucleic acid fragment, wherein a first oligonucleotide primer and a second oligonucleotide primer are designed in such a way that a region which contains two identical sequences X of serial 4 or more nucleotides within the region of 200 or less nucleotides, or a part thereof can be amplified.

Description

本発明は、核酸の増幅方法に関する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応溶液をインキュベートすることによってポリメラーゼ反応を行うことを特徴とする核酸の増幅方法に関する。   The present invention relates to a nucleic acid amplification method. More specifically, the present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid, which comprises conducting a polymerase reaction by incubating a reaction solution using a DNA polymerase.

分子生物学の研究においては、核酸の増幅は、一般的には、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法で行われている。核酸の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が広く知られている。ＰＣＲ法では、目的とする標的核酸配列を増幅させるために、鋳型である二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程（変性工程）、一本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる工程（アニーリング工程）、及びプライマーを起点として相補鎖を伸長する工程（伸長工程）の３つの工程から構成される。通常のＰＣＲ法においては、サーマルサイクラーを使用して、変性工程、アニーリング工程、伸長工程はそれぞれ異なる温度で行われている。しかし、３種類の異なる温度で核酸増幅反応を行うことは、温度制御が煩雑であり、またサイクル数に比例して時間のロスも増大していくという問題があった。   In molecular biology research, nucleic acid amplification is generally performed by an enzymatic method using a DNA polymerase. As a nucleic acid amplification method, the polymerase chain reaction (PCR) is widely known. In the PCR method, in order to amplify a target nucleic acid sequence of interest, a step of denaturing a double-stranded DNA as a template into a single-stranded DNA (denaturing step), a step of annealing a primer into the single-stranded DNA (annealing step) ) And a step of extending a complementary strand starting from a primer (extension step). In a normal PCR method, a denaturation step, an annealing step, and an extension step are performed at different temperatures using a thermal cycler. However, performing nucleic acid amplification reactions at three different temperatures has a problem in that temperature control is complicated and time loss increases in proportion to the number of cycles.

そこで、等温状態で実施することが可能な核酸増幅方法が開発されている。例えば、RCA（Rolling Circle Amplification:Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)）、 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA；Bio Industry,第18巻、2号（2001）)、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method;Nature,350,91〜(1991))、TMA(Transcription mediated amplification method;J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）)等が挙げられる。   Therefore, nucleic acid amplification methods that can be carried out in an isothermal state have been developed. For example, RCA (Rolling Circle Amplification: Proc.Natl.Acad.Sci, vol.92,4641-4645 (1995)), ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids), LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA; Bio Industry, Vol. 18, No. 2 (2001)), NASBA (Nucleic acid Sequence-based Amplification method; Nature, 350, 91- (1991)), TMA (Transcription mediated amplification method; J. Clin Microbiol. 31, 3270- (1993)).

SDA法（特開平５−１３０８７０号）は、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法であり、ポリメラーゼ伸長反応を利用したターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレア−ゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレア−ゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。しかしながら、ポリメラーゼと共にエクソヌクレアーゼを用いる必要があり、コストがかかると共に、プライマーの設計を工夫する必要があった。   The SDA method (Japanese Patent Laid-Open No. 5-130870) is a cycling assay method using exonuclease, and is one of amplification methods of a target site of a target nucleic acid fragment using a polymerase extension reaction. This method is a method in which 5 ′ → 3 ′ exonuclease is allowed to act together with a polymerase extension reaction starting from a primer specifically hybridized to a target site of a target nucleic acid fragment, so that the primer is decomposed in the reverse direction. A new primer hybridizes in place of the degraded primer, and the extension reaction by the DNA polymerase proceeds again. The extension reaction by this polymerase and the decomposition reaction by exonuclease that removes the previously extended chain are sequentially and periodically repeated. Here, the elongation reaction by polymerase and the degradation reaction by exonuclease can be carried out under isothermal conditions. However, it is necessary to use an exonuclease together with the polymerase, which is costly and it is necessary to devise a primer design.

LAMP法は、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも6箇所の特定部位を相補的に認識する少なくとも4種のプライマーと、5’→3’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖DNAを１本鎖DNAとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のBst DNAポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。しかしながら、6箇所の特定部位を認識する少なくとも4種のプライマーを用いる必要があり、プライマー設計が非常に困難であった。   The LAMP method is a method for amplifying a target site of a target nucleic acid fragment developed in recent years. In this method, at least 4 types of primers that complementarily recognize at least 6 specific sites of the target nucleic acid fragment, no nuclease activity in the 5 ′ → 3 ′ direction, and double-stranded DNA on the template are 1 This is a method of amplifying a target site of a target nucleic acid fragment as a special structure under isothermal conditions by using a strand displacement type Bst DNA polymerase that catalyzes an extension reaction while releasing it as a double-stranded DNA. However, it is necessary to use at least four types of primers that recognize six specific sites, and primer design is very difficult.

ICAN法も、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。RNA-DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法である。キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNAポリメラーゼにより相補鎖が合成される。その後,RNaseHがキメラプライマー由来のRNA部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起きるこの反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。しかしながら、この方法もキメラプライマーという特殊なプライマーを用いる必要がありプライマー設計が非常に困難である。   The ICAN method is an amplification method of a target site of a target nucleic acid fragment developed in recent years. This is an isothermal gene amplification method using RNA-DNA chimera primer, DNA polymerase having strand displacement activity and template exchange activity, and RNaseH. After the chimeric primer binds to the template, a complementary strand is synthesized by DNA polymerase. Thereafter, RNaseH cleaves the RNA portion derived from the chimeric primer, and the gene is amplified by repeating this reaction in which an elongation reaction accompanied by a strand displacement reaction and a template exchange reaction occurs repeatedly from the cleaved portion. However, this method also requires the use of a special primer called a chimeric primer, and primer design is very difficult.

特表平１１−５０９４０６号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特表平１１−５０９４０６号公報に記載の方法では比較的長い反応時間が必要であるなどの問題がある。つまり、ＰＣＲ法のように簡単なプライマー設計で等温にて簡便に実施が可能な核酸増幅方法の開発が望まれていた。   Japanese National Publication No. 11-509406 describes a method of amplifying DNA of a target region by isothermal reaction with at least one pair of oligonucleotide primers in the presence of a DNA polymerase having strand displacement ability. However, the method described in JP-A-11-509406 has a problem that a relatively long reaction time is required. That is, there has been a demand for the development of a nucleic acid amplification method that can be easily carried out isothermally with a simple primer design such as the PCR method.

Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)Proc.Natl.Acad.Sci, vol.92,4641-4645 (1995) Bio Industry,第18巻、2号（2001）Bio Industry, Volume 18, Issue 2 (2001) Nature,350,91〜(1991)Nature, 350, 91- (1991) J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）J. Clin Microbiol. Volume 31, 3270- (1993) 特開平５−１３０８７０号公報JP-A-5-130870 特表平１１−５０９４０６号公報Japanese National Patent Publication No. 11-509406

本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼとを用いて実施可能な核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、短時間で標的核酸配列を高い効率で増幅することができ、かつ標的核酸配列を特異的に増幅することができる核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。   An object of the present invention is to provide a nucleic acid amplification method that can be performed using an oligonucleotide primer and a DNA polymerase. Another object of the present invention is to provide a nucleic acid amplification method capable of amplifying a target nucleic acid sequence with high efficiency in a short time and capable of specifically amplifying the target nucleic acid sequence.

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって、核酸断片を高い効率で特異的に増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。
（１） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have increased the nucleic acid fragment by designing the first oligonucleotide primer and the second oligonucleotide primer so as to satisfy any of the following conditions: The inventors have found that the amplification can be performed specifically with efficiency, and have completed the present invention.
(1) 5 ′ terminal base and 3 ′ sequence of the first oligonucleotide primer for the region where the sequence X of 4 or more bases is present in two or more locations within 200 bases Designed for the region sandwiched between the bases at the 3 ′ end of X, and the second oligonucleotide primer was placed at the 5 ′ end base of the sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ end of the sequence X on the 3 ′ side. A second oligonucleotide primer is designed on the 5 ′ side of the sequence complementary to the first oligonucleotide primer and designed for the complementary strand in the region sandwiched between the bases.
(2) For the region where the sequence X having 4 or more consecutive bases is present in 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of the 5 ′ sequence X and the 3 ′ terminal base of the 3 ′ sequence X.
(3) For the region where the sequence X of 4 or more consecutive bases is present at 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases of the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region within 100 bases on the 3 ′ side of the sequence X on the 3 ′ side.

即ち、本発明によれば、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域又はその一部を増幅できるように、第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする、核酸の増幅方法が提供される。   That is, according to the present invention, a reaction solution containing at least one deoxynucleotide triphosphate, at least one DNA polymerase having strand displacement ability, at least two oligonucleotide primers, and a nucleic acid fragment as a template is incubated. A method of amplifying a nucleic acid comprising performing a polymerase reaction starting from the 3 ′ end of the primer and amplifying the nucleic acid fragment, wherein the sequence X having 4 or more consecutive bases is present at 2 sites within 200 bases. There is provided a nucleic acid amplification method characterized by designing a first oligonucleotide primer and a second oligonucleotide primer so as to amplify a region or a part thereof existing above.

好ましくは、本発明は以下の何れかを特徴とする。
（１） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。 Preferably, the present invention is characterized by any of the following.
(1) 5 ′ terminal base and 3 ′ sequence of the first oligonucleotide primer for the region where the sequence X of 4 or more bases is present in two or more locations within 200 bases Designed for the region sandwiched between the bases at the 3 ′ end of X, and the second oligonucleotide primer was placed at the 5 ′ end base of the sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ end of the sequence X on the 3 ′ side. A second oligonucleotide primer is designed on the 5 ′ side of the sequence complementary to the first oligonucleotide primer and designed for the complementary strand in the region sandwiched between the bases.
(2) For the region where the sequence X having 4 or more consecutive bases is present in 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of the 5 ′ sequence X and the 3 ′ terminal base of the 3 ′ sequence X.
(3) For the region where the sequence X of 4 or more consecutive bases is present at 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases of the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region within 100 bases on the 3 ′ side of the sequence X on the 3 ′ side.

本発明において、ある領域Ａに対してオリゴヌクレオチドプライマーを設計するとは、領域Ａと実質的に同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを設計することを言う。
別の表現をすれば、ある領域Ａに対してオリゴヌクレオチドプライマーを設計するとは、領域Ａの相補鎖に対してアニールするように、即ち領域Ａの相補鎖と実質的に相補的となるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを言う。 In the present invention, designing an oligonucleotide primer for a certain region A means designing an oligonucleotide having a sequence substantially the same as that of the region A.
In other words, designing an oligonucleotide primer for a region A is such that it anneals to the complementary strand of region A, ie, is substantially complementary to the complementary strand of region A. This refers to designing oligonucleotide primers.

本発明において、配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域とは、配列Ｘの1塩基分５’側に存在する塩基の位置、及び、配列Ｘの１００塩基分５’側に存在する塩基の位置、及び、両者に挟まれる領域を意味する。
同様に、本発明において、配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域とは、配列Ｘの1塩基分３’側に存在する塩基の位置、及び、配列Ｘの１００塩基分３’側に存在する塩基の位置、及び、両者に挟まれる領域を意味する。 In the present invention, the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X refers to the position of the base present on the 5 ′ side for one base of the sequence X and the base present on the 5 ′ side for the 100 bases of the sequence X. It means a position and a region sandwiched between both.
Similarly, in the present invention, the region within 100 bases on the 3 ′ side of the sequence X means the position of the base existing on the 3 ′ side of the base of the sequence X and the 3 ′ side of the base of the sequence X on the 3 ′ side. This means the position of the base to be used and the region sandwiched between the two.

好ましくは、配列Ｘ、及び配列Ｘに相補的な配列Ｘｃは連続した５塩基以上の配列である。
好ましくは、配列Ｘ、及び配列Ｘに相補的な配列Ｘｃは連続した７塩基以上の配列である。 Preferably, the sequence X and the sequence Xc complementary to the sequence X are sequences having 5 or more consecutive bases.
Preferably, the sequence X and the sequence Xc complementary to the sequence X are consecutive 7 bases or more.

好ましくは、反応溶液は、少なくとも０．０５％以上の界面活性剤をさらに含む。
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする。 Preferably, the reaction solution further includes at least 0.05% or more surfactant.
Preferably, the surfactant is a nonionic surfactant.
Preferably, the nonionic surfactant is selected from a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester type, a polyoxyethylene alkylphenol ether type, and a polyoxyethylene alkyl ether type.

好ましくは、反応溶液は２価の陽イオンをさらに含む。
好ましくは、２価の陽イオンはマグネシウムイオンである。
好ましくは、反応溶液は、融解温度調整剤をさらに含む。
好ましくは、融解温度調整剤は、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である。 Preferably, the reaction solution further contains a divalent cation.
Preferably, the divalent cation is a magnesium ion.
Preferably, the reaction solution further includes a melting temperature adjusting agent.
Preferably, the melting temperature adjusting agent is dimethyl sulfoxide, betaine, formamide or glycerol, or a mixture of two or more thereof.

好ましくは、反応溶液は各々１．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下のデオキシヌクレオチド３リン酸を含む。
好ましくは、反応溶液は、１μＭ以上１００μＭ以下のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。 Preferably, each reaction solution contains 1.0 mM to 100 mM deoxynucleotide triphosphate.
Preferably, the reaction solution contains 1 μM to 100 μM oligonucleotide primer.

好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは前記鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端領域のみが前記鋳型核酸断片と実質的に相補的である。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、前記鋳型核酸断片と連続した一箇所でのみ実質的に相補的である。 Preferably, the oligonucleotide primer is substantially complementary to a portion of the template nucleic acid fragment.
Preferably, only the 3 ′ end region of the oligonucleotide primer is substantially complementary to the template nucleic acid fragment.
Preferably, the oligonucleotide primer is substantially complementary only at one continuous position with the template nucleic acid fragment.

好ましくは、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼは、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである。
好ましくは、核酸を増幅する工程は実質的に等温で行われる。
好ましくは、核酸を増幅する工程は室温以上１００℃以下で行われる。 Preferably, the DNA polymerase having at least one strand displacement ability is 5 ′ → 3 ′ exonuclease-deficient Bst. DNA polymerase, Bacillus caldetenax-derived 5 ′ → 3 ′ exonuclease-deficient Bca DNA polymerase, Thermococcus litoralis-derived 5 ′ → 3 ′ exonuclease-deficient Vent. A polymerase selected from the group consisting of DNA polymerases.
Preferably, the step of amplifying the nucleic acid is performed substantially isothermally.
Preferably, the step of amplifying the nucleic acid is performed at room temperature or higher and 100 ° C. or lower.

本発明によれば、増幅産物が次々に伸長されるため、標的核酸配列を非常に高い増幅効率で増幅することができる。   According to the present invention, amplification products are extended one after another, so that the target nucleic acid sequence can be amplified with very high amplification efficiency.

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による核酸の増幅方法は、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域又はその一部を増幅できるように、第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。さらに具体的には、本発明による核酸の増幅方法は、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。
（１） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する（図１３を参照）。
（２） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する（図１５を参照）。
（３） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する（図１７を参照）。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The nucleic acid amplification method according to the present invention includes the step of incubating a reaction solution containing at least one deoxynucleotide triphosphate, at least one DNA polymerase, at least two oligonucleotide primers, and a nucleic acid fragment as a template. A method for amplifying a nucleic acid, comprising performing a polymerase reaction starting from the 3 ′ end of a primer and amplifying the nucleic acid fragment, wherein the sequence X having 4 or more consecutive bases is present in 2 or more locations within 200 bases Alternatively, the first oligonucleotide primer and the second oligonucleotide primer are designed so that a part thereof can be amplified. More specifically, the nucleic acid amplification method according to the present invention is characterized in that the first oligonucleotide primer and the second oligonucleotide primer are designed so as to satisfy any of the following conditions.
(1) 5 ′ terminal base and 3 ′ sequence of the first oligonucleotide primer for the region where the sequence X of 4 or more bases is present in two or more locations within 200 bases Designed for the region sandwiched between the bases at the 3 ′ end of X, and the second oligonucleotide primer was placed at the 5 ′ end base of the sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ end of the sequence X on the 3 ′ side. A second oligonucleotide primer is designed on the 5 ′ side of the sequence complementary to the first oligonucleotide primer and designed for the complementary strand in the region sandwiched between the bases (see FIG. 13).
(2) For the region where the sequence X having 4 or more consecutive bases is present in 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. And a second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of the 5 ′ sequence X and the 3 ′ terminal base of the 3 ′ sequence X ( (See FIG. 15).
(3) For the region where the sequence X of 4 or more consecutive bases is present at 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases of the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed with respect to the complementary strand in the region within 100 bases on the 3 ′ side of the sequence X on the 3 ′ side (see FIG. 17).

好ましくは、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。
（１） 連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２） 連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３） 連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。 Preferably, the first oligonucleotide primer and the second oligonucleotide primer are designed to satisfy any of the following conditions.
(1) 5 ′ terminal base and 3 ′ sequence of the first oligonucleotide primer for the region where the sequence X of 4 or more bases is present in two or more locations within 100 bases Designed for the region sandwiched between the bases at the 3 ′ end of X, and the second oligonucleotide primer was placed at the 5 ′ end base of the sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ end of the sequence X on the 3 ′ side. A second oligonucleotide primer is designed on the 5 ′ side of the sequence complementary to the first oligonucleotide primer and designed for the complementary strand in the region sandwiched between the bases.
(2) For the region where the sequence X having 4 or more consecutive bases is present at 2 or more locations within 100 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of the 5 ′ sequence X and the 3 ′ terminal base of the 3 ′ sequence X.
(3) For the region where the sequence X having 4 or more consecutive bases is present at 2 or more locations within 100 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region within 100 bases on the 3 ′ side of the sequence X on the 3 ′ side.

好ましくは、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。
（１） 連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２） 連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３） 連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。 Preferably, the first oligonucleotide primer and the second oligonucleotide primer are designed to satisfy any of the following conditions.
(1) For a region where two or more consecutive sequences X of 4 or more bases exist in 2 or more locations within 60 bases, the 5 ′ terminal base and 3 ′ sequence of the first oligonucleotide primer 5 ′ Designed for the region sandwiched between the bases at the 3 ′ end of X, and the second oligonucleotide primer was placed at the 5 ′ end base of the sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ end of the sequence X on the 3 ′ side. A second oligonucleotide primer is designed on the 5 ′ side of the sequence complementary to the first oligonucleotide primer and designed for the complementary strand in the region sandwiched between the bases.
(2) For a region in which a sequence X of 4 or more bases is continuously present in two or more locations within 60 bases, the first oligonucleotide primer is applied to a region within 100 bases of the 5 ′ side of sequence 5 on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of the 5 ′ sequence X and the 3 ′ terminal base of the 3 ′ sequence X.
(3) For a region in which a sequence X of 4 or more bases is continuously present in 2 or more locations within 60 bases, the first oligonucleotide primer is applied to a region of 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region within 100 bases on the 3 ′ side of the sequence X on the 3 ′ side.

本発明による核酸の増幅方法の上記（１）の概要を図１３及び図１４に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーとがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘを３’末端に含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ａとする）が得られる。   The outline of the method (1) of the nucleic acid amplification method according to the present invention is shown in FIGS. The first oligonucleotide primer and the second oligonucleotide primer are annealed to the nucleic acid fragment serving as a template, and a polymerase reaction starting from the 3 'end of the oligonucleotide primer proceeds. At that time, an amplified nucleic acid fragment containing the sequence X at the 3 'end (referred to as nucleic acid fragment A) is obtained as an amplification product of the polymerase reaction starting from the first oligonucleotide primer.

同様に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘと相補的な配列Ｘcを３’末端に含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ｂとする）が得られる。   Similarly, an amplified nucleic acid fragment (referred to as nucleic acid fragment B) containing a sequence Xc complementary to the sequence X at the 3 'end is obtained as an amplification product of the polymerase reaction starting from the second oligonucleotide primer.

次に、上記で得られた増幅核酸断片Ａと増幅核酸断片Ｂとがハイブリッドを形成し、伸長が開始する。これにより、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。   Next, the amplified nucleic acid fragment A and the amplified nucleic acid fragment B obtained above form a hybrid, and extension begins. As a result, a high-molecular amplified nucleic acid fragment is synthesized.

または、上記で得られた増幅核酸断片Ａと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによって、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。   Alternatively, the amplified nucleic acid fragment A obtained as described above and the nucleic acid fragment serving as a template form a hybrid via the sequence X (sequence Xc), and elongation starts, whereby a high molecular weight amplified nucleic acid fragment can be synthesized. .

または、上記で得られた増幅核酸断片Ｂと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによって、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。   Alternatively, the amplified nucleic acid fragment B obtained above and the nucleic acid fragment serving as a template form a hybrid via the sequence X (sequence Xc), and elongation starts, whereby a high molecular weight amplified nucleic acid fragment can be synthesized. .

核酸断片Ａ、核酸断片Ｂ、及び、高分子の増幅核酸断片は、第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたは第二のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその両方がアニーリングすることができ、３’末端を起点としたポリメラーゼ反応が進行し、核酸断片の複製反応が継続的に起こる。結果として、鋳型となる核酸断片が検出可能なレベルまで増幅される。   The nucleic acid fragment A, the nucleic acid fragment B, and the amplified nucleic acid fragment can be annealed by the first oligonucleotide primer and / or the second oligonucleotide primer, and the polymerase reaction starting from the 3 ′ end Progresses, and the replication reaction of the nucleic acid fragment occurs continuously. As a result, the template nucleic acid fragment is amplified to a detectable level.

本発明による核酸の増幅方法の上記（２）の概要を図１５及び１６に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーとがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘを３’末端側に少なくとも２箇所含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ａとする）が得られる。   The outline of the above (2) of the nucleic acid amplification method according to the present invention is shown in FIGS. The first oligonucleotide primer and the second oligonucleotide primer are annealed to the nucleic acid fragment serving as a template, and a polymerase reaction starting from the 3 'end of the oligonucleotide primer proceeds. In this case, an amplified nucleic acid fragment (referred to as nucleic acid fragment A) containing at least two sequences X on the 3 'end side is obtained as an amplification product of the polymerase reaction starting from the first oligonucleotide primer.

同様に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘと相補的な配列Ｘcを３’末端に含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ｂとする）が得られる。   Similarly, an amplified nucleic acid fragment (referred to as nucleic acid fragment B) containing a sequence Xc complementary to the sequence X at the 3 'end is obtained as an amplification product of the polymerase reaction starting from the second oligonucleotide primer.

次に、上記で得られた増幅核酸断片Ａと増幅核酸断片Ｂとがハイブリッドを形成し、伸長が開始する。これにより、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。   Next, the amplified nucleic acid fragment A and the amplified nucleic acid fragment B obtained above form a hybrid, and extension begins. As a result, a high-molecular amplified nucleic acid fragment is synthesized.

または、上記で得られた増幅核酸断片Ａと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによって、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。   Alternatively, the amplified nucleic acid fragment A obtained as described above and the nucleic acid fragment serving as a template form a hybrid via the sequence X (sequence Xc), and elongation starts, whereby a high molecular weight amplified nucleic acid fragment can be synthesized. .

核酸断片Ａ、核酸断片Ｂ、及び、高分子の増幅核酸断片は、第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたは第二のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその両方がアニーリングすることができ、３’末端を起点としたポリメラーゼ反応が進行し、核酸断片の複製反応が継続的に起こる。結果として、鋳型となる核酸断片が検出可能なレベルまで増幅される。   The nucleic acid fragment A, the nucleic acid fragment B, and the amplified nucleic acid fragment can be annealed by the first oligonucleotide primer and / or the second oligonucleotide primer, and the polymerase reaction starting from the 3 ′ end Progresses, and the replication reaction of the nucleic acid fragment occurs continuously. As a result, the template nucleic acid fragment is amplified to a detectable level.

本発明による核酸の増幅方法の上記（３）の概要を図１７及び１８に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーとがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘを３’末端側に少なくとも２箇所含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ａとする）が得られる。   The outline of the above (3) of the nucleic acid amplification method according to the present invention is shown in FIGS. The first oligonucleotide primer and the second oligonucleotide primer are annealed to the nucleic acid fragment serving as a template, and a polymerase reaction starting from the 3 'end of the oligonucleotide primer proceeds. In this case, an amplified nucleic acid fragment (referred to as nucleic acid fragment A) containing at least two sequences X on the 3 'end side is obtained as an amplification product of the polymerase reaction starting from the first oligonucleotide primer.

同様に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Ｘと相補的な配列Ｘcを３’末端に少なくとも２箇所含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ｂとする）が得られる。   Similarly, as an amplification product of the polymerase reaction starting from the second oligonucleotide primer, an amplified nucleic acid fragment (referred to as nucleic acid fragment B) containing at least two sequences Xc complementary to sequence X at the 3 ′ end is provided. can get.

次に、上記で得られた増幅核酸断片Ａと増幅核酸断片Ｂとがハイブリッドを形成し、伸長が開始する。これにより、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。   Next, the amplified nucleic acid fragment A and the amplified nucleic acid fragment B obtained above form a hybrid, and extension begins. As a result, a high-molecular amplified nucleic acid fragment is synthesized.

または、上記で得られた増幅核酸断片Ａと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによっても、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。   Alternatively, the amplified nucleic acid fragment A obtained above and a nucleic acid fragment serving as a template form a hybrid via the sequence X (sequence Xc), and the extension starts, so that a polymer amplified nucleic acid fragment is synthesized. sell.

または、上記で得られた増幅核酸断片Ｂと鋳型となる核酸断片とが配列Ｘ（配列Ｘc）を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによっても、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。   Alternatively, the amplified nucleic acid fragment B obtained as described above and the nucleic acid fragment serving as a template form a hybrid via the sequence X (sequence Xc), and the extension starts, so that a polymer amplified nucleic acid fragment is synthesized. sell.

核酸断片Ａ、核酸断片Ｂ、及び、高分子の増幅核酸断片は、第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたは第二のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその両方がアニーリングすることができ、３’末端を起点としたポリメラーゼ反応が進行し、核酸断片の複製反応が継続的に起こる。結果として、鋳型となる核酸断片が検出可能なレベルまで増幅される。   The nucleic acid fragment A, the nucleic acid fragment B, and the amplified nucleic acid fragment can be annealed by the first oligonucleotide primer and / or the second oligonucleotide primer, and the polymerase reaction starting from the 3 ′ end Progresses, and the replication reaction of the nucleic acid fragment occurs continuously. As a result, the template nucleic acid fragment is amplified to a detectable level.

以下、本発明で用いる成分について説明する。
（１）デオキシヌクレオチド３リン酸
伸長反応の基質として、デオキシヌクレオチド３リン酸を用いる。具体的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物を使用することが好ましい。デオキシヌクレオチド３リン酸としては、ｄＮＴＰのアナログ（例えば、７−デアザ−ｄＧＴＰ等）が含まれていてもよい。 Hereinafter, the components used in the present invention will be described.
(1) Deoxynucleotide triphosphate Deoxynucleotide triphosphate is used as a substrate for the elongation reaction. Specifically, it is preferable to use a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP. As deoxynucleotide triphosphate, an analog of dNTP (for example, 7-deaza-dGTP or the like) may be contained.

また、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３．０ｍＭ、さらに好ましくは１．０ｍＭから２．０ｍＭ、特に好ましくは１．０ｍＭから１．５ｍＭの範囲である。   In addition, deoxynucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP mixture) is 0.1 mM to 100 mM, preferably 0.75 mM to 3.0 mM, more preferably 1.0 mM to 2.0 mM, respectively, at the final concentration. Particularly preferably, it is in the range of 1.0 mM to 1.5 mM.

（２）ＤＮＡポリメラーゼ
本発明においては、ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、好ましくは、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いることができる。本明細書において「鎖置換能」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displacement）することができる活性のことをいう。鎖置換能を有するポリメラーゼの具体例としては、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鎖置換能を有するポリメラーゼは、天然由来のものでもよいし、遺伝子工学的に製造した組み換え蛋白質でもよい。 (2) DNA polymerase In the present invention, a DNA polymerase is used. As the DNA polymerase, a polymerase having strand displacement ability can be preferably used. As used herein, “strand displacement ability” refers to the process of releasing a complementary strand that progresses while replacing a DNA strand and performs annealing on the template strand when DNA replication is performed according to a nucleic acid sequence as a template. activity that can be displaced). Specific examples of the polymerase having strand displacement ability include 5 ′ → 3 ′ exonuclease-deficient Bst. Derived from Bacillus stearothermophilus. DNA polymerase, Bacillus caldetenax-derived 5 ′ → 3 ′ exonuclease-deficient Bca DNA polymerase, Thermococcus litoralis-derived 5 ′ → 3 ′ exonuclease-deficient Vent. Examples include, but are not limited to, DNA polymerase. The polymerase having strand displacement ability may be a naturally derived one or a recombinant protein produced by genetic engineering.

（３）２価の陽イオン
本発明では、使用する酵素の金属要求性等に２価の陽イオンを用いる。２価の陽イオンとしては、マグネシウム塩やその他の金属塩を使用することができ、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどを使用できる。２価の陽イオンの濃度は最終濃度で、好ましくは１ｍＭ〜２０ｍＭであり、さらに好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。 (3) Divalent cation In the present invention, a divalent cation is used for the metal requirement of the enzyme used. As the divalent cation, a magnesium salt or other metal salt can be used. For example, magnesium chloride, magnesium acetate, magnesium sulfate, or the like can be used. The concentration of the divalent cation is the final concentration, preferably 1 mM to 20 mM, more preferably 2 mM to 10 mM.

（４）界面活性剤
本発明では、反応溶液中に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を使用することにより、非特異的な核酸の増幅を防止するという有利な効果を達成することができる。本発明で使用できる界面活性剤の種類は、特には限定されないが、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スルホコハク酸オクチルエステル塩、ステアリン酸石けんなどの陰イオン（アニオン）性界面活性剤、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ20、Ｔｗｅｅｎ40、Ｔｗｅｅｎ60、Ｔｗｅｅｎ80等）、脂肪酸アルカノールアミド、ＰＯＥアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ35、Ｂｒｉｊ58、等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎX-100、ＴｒｉｔｏｎX-114、Nonidet P40、等）、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸ビスフェニルエーテルなどの非イオン（ノニオン）性界面活性剤、そしてセチルピリジニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン（カチオン）性界面活性剤などを使用できる。界面活性剤の使用量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、通常は１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である。 (4) Surfactant In the present invention, a surfactant may be added to the reaction solution. By using a surfactant, the advantageous effect of preventing amplification of non-specific nucleic acids can be achieved. The type of surfactant that can be used in the present invention is not particularly limited, but anionic (anionic) surfactants such as sodium alkylbenzene sulfonate, sodium dodecyl sulfate (SDS), octyl ester of sulfosuccinate, and soap stearate. Sucrose fatty acid ester sorbitan fatty acid ester, POE sorbitan fatty acid ester (Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, etc.), fatty acid alkanolamide, POE alkyl ether (Brij 35, Brij 58, etc.), POE alkyl phenyl ether (Triton X-100, Triton X-114) Nonidet P40, nonylphenol, lauryl alcohol, polyethylene glycol, polyoxyethylene / polyoxypropylene block polymer, POE alkylamine, PO Nonionic (nonionic) surfactant such as fatty acid bisphenyl ether, and cetyl pyridinium chloride, lauryl dimethyl benzyl ammonium chloride, cationic (Cationic) surfactants such as stearyl trimethyl ammonium chloride and the like can be used. Although the usage-amount of surfactant is not specifically limited as long as the effect of this invention can be achieved, Preferably it is 0.01% or more, More preferably, it is 0.05% or more, More preferably, it is 0.1% or more. Although the upper limit of the usage-amount of surfactant is not specifically limited, Usually, it is 10% or less, Preferably it is 5% or less, More preferably, it is 1% or less.

界面活性剤の中でも、非イオン性界面活性剤を使用することが特に好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水性がより強い界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ価で示すと１２以上が好ましい。より好ましくは１４以上であり、上限は２０まで好ましく用いることができる。さらに好ましくは１７以下であり、より好ましくは１４以上１７以下である。構造的には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることが好ましい。さらに、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの中でも、脂肪酸エステルが一つだけのものが好ましい。例えば、以下の構造式で表すことができる。   Among the surfactants, it is particularly preferable to use a nonionic surfactant. Among nonionic surfactants, surfactants having stronger hydrophilicity are preferable, and 12 or more are preferable in terms of HLB value. More preferably, it is 14 or more, and the upper limit can be preferably used up to 20. More preferably, it is 17 or less, More preferably, it is 14 or more and 17 or less. Structurally, it is preferably selected from polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester type and polyoxyethylene alkyl ether type. Further, among the polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, those having only one fatty acid ester are preferred. For example, it can be represented by the following structural formula.

（式中、x + y + z + w = 20 であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。） (In the formula, x + y + z + w = 20 and R represents an alkyl group having 12 to 18 carbon atoms.)

アルキル基の位置は特に限定されず、以下のような構造でも好ましく用いることができる。
The position of the alkyl group is not particularly limited, and the following structure can also be preferably used.

このような界面活性剤として、物質名でポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート等が挙げられる。（商品名：Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等）の界面活性剤が挙げられる。また、使用量も特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。   As such surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester-based nonionic surfactants are named as polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene. Examples thereof include oxyethylene (20) sorbitan monostearate and polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate. (Trade names: Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, etc.) surfactants. The amount used is not particularly limited, but is preferably 0.01% or more, more preferably 0.05% or more, and more preferably 0.1% or more.

（５）オリゴヌクレオチドプライマー
本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有し、その３'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能なものである。オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有することにより、鋳型となるＤＮＡにアニーリングすることができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成されたものを使用することができ、さらに、修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するものでもよい。 (5) Oligonucleotide primer The oligonucleotide primer used in the present invention has a base sequence substantially complementary to the template DNA, and can extend the DNA strand from its 3 'end. The oligonucleotide primer can be annealed to the template DNA by having a base sequence substantially complementary to the template DNA. As the oligonucleotide primer used in the present invention, those composed of deoxyribonucleotides or ribonucleotides can be used, and further, modified ribonucleotides or modified deoxyribonucleotides may be used.

さらに、前記、オリゴヌクレオチドプライマーは、従来の等温増幅反応で用いられるような複雑な設計を必要としない。通常のＰＣＲ反応で用いられる少なくとも一組以上のプライマーを用いて等温増幅反応を行うことを可能にしたことが、本発明の大きな特徴である。詳細には、これらのプライマーは、ＬＡＭＰ法等で用いられるような５’末端が３’末端より伸長した部分と相補的になるループ構造を形成するような構造を持っていない。つまり、プライマーの3'末端の連続した領域が鋳型核酸と相補的である。さらに、ＳＤＡ法やＩＣＡＮ法で用いられるように、反応途上でプライマーが切断され、切断された３‘末端が新たな合成起点になるようなるような複雑な仕組みを持たない。   Furthermore, the oligonucleotide primer does not require a complicated design as used in the conventional isothermal amplification reaction. A major feature of the present invention is that it is possible to perform an isothermal amplification reaction using at least one set of primers used in a normal PCR reaction. Specifically, these primers do not have a structure that forms a loop structure in which the 5 'end is complementary to a portion extending from the 3' end as used in the LAMP method or the like. That is, the continuous region at the 3 ′ end of the primer is complementary to the template nucleic acid. Further, as used in the SDA method or the ICAN method, the primer is cleaved during the reaction, and there is no complicated mechanism in which the cleaved 3 'end becomes a new synthesis starting point.

前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の条件のいずれかを満たすように設計する。
（１） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３） 連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。 The oligonucleotide primer is designed to satisfy any of the following conditions.
(1) 5 ′ terminal base and 3 ′ sequence of the first oligonucleotide primer for the region where the sequence X of 4 or more bases is present in two or more locations within 200 bases Designed for the region sandwiched between the bases at the 3 ′ end of X, and the second oligonucleotide primer was placed at the 5 ′ end base of the sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ end of the sequence X on the 3 ′ side. A second oligonucleotide primer is designed on the 5 ′ side of the sequence complementary to the first oligonucleotide primer and designed for the complementary strand in the region sandwiched between the bases.
(2) For the region where the sequence X having 4 or more consecutive bases is present in 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of the 5 ′ sequence X and the 3 ′ terminal base of the 3 ′ sequence X.
(3) For the region where the sequence X of 4 or more consecutive bases is present at 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases of the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region within 100 bases on the 3 ′ side of the sequence X on the 3 ′ side.

好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の条件のいずれかを満たすように設計する。
（１） 連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２） 連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３） 連続した４塩基以上の配列Ｘが１００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。 Preferably, the oligonucleotide primer is designed to satisfy any of the following conditions.
(1) 5 ′ terminal base and 3 ′ sequence of the first oligonucleotide primer for the region where the sequence X of 4 or more bases is present in two or more locations within 100 bases Designed for the region sandwiched between the bases at the 3 ′ end of X, and the second oligonucleotide primer was placed at the 5 ′ end base of the sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ end of the sequence X on the 3 ′ side. A second oligonucleotide primer is designed on the 5 ′ side of the sequence complementary to the first oligonucleotide primer and designed for the complementary strand in the region sandwiched between the bases.
(2) For the region where the sequence X having 4 or more consecutive bases is present at 2 or more locations within 100 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of the 5 ′ sequence X and the 3 ′ terminal base of the 3 ′ sequence X.
(3) For the region where the sequence X having 4 or more consecutive bases is present at 2 or more locations within 100 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region within 100 bases on the 3 ′ side of the sequence X on the 3 ′ side.

好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の条件のいずれかを満たすように設計する。
（１） 連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
（２） 連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
（３） 連続した４塩基以上の配列Ｘが６０塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。 Preferably, the oligonucleotide primer is designed to satisfy any of the following conditions.
(1) For a region where two or more consecutive sequences X of 4 or more bases exist in 2 or more locations within 60 bases, the 5 ′ terminal base and 3 ′ sequence of the first oligonucleotide primer 5 ′ Designed for the region sandwiched between the bases at the 3 ′ end of X, and the second oligonucleotide primer was placed at the 5 ′ end base of the sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ end of the sequence X on the 3 ′ side. A second oligonucleotide primer is designed on the 5 ′ side of the sequence complementary to the first oligonucleotide primer and designed for the complementary strand in the region sandwiched between the bases.
(2) For a region in which a sequence X of 4 or more bases is continuously present in two or more locations within 60 bases, the first oligonucleotide primer is applied to a region within 100 bases of the 5 ′ side of sequence 5 on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of the 5 ′ sequence X and the 3 ′ terminal base of the 3 ′ sequence X.
(3) For a region in which a sequence X of 4 or more bases is continuously present in 2 or more locations within 60 bases, the first oligonucleotide primer is applied to a region of 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. The second oligonucleotide primer is designed for the complementary strand in the region within 100 bases on the 3 ′ side of the sequence X on the 3 ′ side.

好ましくは、配列Ｘ及びＸｃは連続した５塩基以上の配列である。
好ましくは、配列Ｘ及びＸｃは連続した７塩基以上の配列である。 Preferably, the sequences X and Xc are sequences having 5 or more consecutive bases.
Preferably, sequences X and Xc are sequences of 7 or more consecutive bases.

連続した４塩基以上の配列Ｘは必ずしも完全に一致していなくてもよい。例えば、５塩基中の４塩基以上、６塩基中の５塩基以上、７塩基中の５塩基以上、８塩基中の６塩基以上、９塩基中の７塩基以上、１０塩基中の７塩基以上が一致していれば、同様の機構で増幅することができる。   A sequence X having four or more consecutive bases does not necessarily need to be completely matched. For example, 4 bases or more in 5 bases, 5 bases or more in 6 bases, 5 bases or more in 7 bases, 6 bases or more in 8 bases, 7 bases or more in 9 bases, 7 bases or more in 10 bases If they match, it can be amplified by the same mechanism.

オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、特に限定されないが、一般的には、１０〜１００ヌクレオチド程度の長さであり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド程度の長さであり、さらに好ましくは１５〜４０ヌクレオチド程度の長さである。   The length of the oligonucleotide primer is not particularly limited, but is generally about 10 to 100 nucleotides, preferably about 15 to 50 nucleotides, and more preferably about 15 to 40 nucleotides. Is the length of

オリゴヌクレオチドプライマーは、市販のＤＮＡ合成機（例えば、アプライド バイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型など）を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。   Oligonucleotide primers can be synthesized by the phosphoramidite method using a commercially available DNA synthesizer (for example, a DNA synthesizer type 394 from Applied Biosystems Inc.).

オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、反応溶液中において０．１μＭ以上が好ましく、１μＭ以上がさらに好ましく、１．５μＭ以上が特に好ましい。   The amount of the oligonucleotide primer used is preferably 0.1 μM or more, more preferably 1 μM or more, and particularly preferably 1.5 μM or more in the reaction solution.

（６）鋳型となる核酸断片
本発明において鋳型となる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡのいずれでもよい。鋳型となる核酸を含む可能性のある試料から調製した核酸を使用してもよいし、鋳型となる核酸を含む可能性のある試料をそのまま直接使用してもよい。鋳型となる核酸を含む試料の種類は特に限定されず、例えば、体液（例えば、全血、血清、尿、脳脊髄液、***、唾液など）、組織（例えば、癌組織など）、細胞培養物のような生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、微生物が混入している可能性のある試料（例えば、食品など）、あるいは土壌、排水のような環境中の試料が挙げられる。上記したような試料から核酸を調製する場合、その調製方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた精製など当業者に公知の方法を用いることができる。核酸の試料からの精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離などにより行うことができる。 (6) Nucleic acid fragment used as template In the present invention, the nucleic acid (DNA or RNA) used as a template may be any of genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, mRNA, and total RNA. A nucleic acid prepared from a sample that may contain a template nucleic acid may be used, or a sample that may contain a template nucleic acid may be used directly. The type of the sample containing the nucleic acid that serves as the template is not particularly limited. For example, body fluid (eg, whole blood, serum, urine, cerebrospinal fluid, semen, saliva, etc.), tissue (eg, cancer tissue, etc.), cell culture Biological samples such as viruses, bacteria, molds, yeast, nucleic acid-containing samples such as plants and animals, samples that may be contaminated with microorganisms (for example, foods), or soil and wastewater Samples in the environment. When nucleic acid is prepared from the sample as described above, the preparation method is not particularly limited, and for example, a method known to those skilled in the art such as treatment with a surfactant, ultrasonic treatment, purification using glass beads, and the like can be used. it can. Purification of nucleic acid from a sample can be performed by phenol extraction, chromatography, gel electrophoresis, density gradient centrifugation, or the like.

ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施することができる。逆転写反応に使用されるプライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマーでもよいし、オリゴｄＴプライマーやランダムな配列を有するプライマーでもよい。逆転写用プライマーの長さは好ましくは６から１００ヌクレオチド程度であり、更に好ましくは９から５０ヌクレオチド程度である。逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）などを使用することができる。また、逆転写活性を併せ持つ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。   When it is desired to amplify a nucleic acid having a sequence derived from RNA, the method of the present invention can be carried out using as a template cDNA synthesized by reverse transcription using the RNA as a template. The primer used for the reverse transcription reaction may be a primer having a base sequence complementary to a specific template RNA, an oligo dT primer, or a primer having a random sequence. The length of the reverse transcription primer is preferably about 6 to 100 nucleotides, more preferably about 9 to 50 nucleotides. The enzyme used for the reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it has cDNA synthesis activity using RNA as a template. For example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV RTase), Moloney murine leukemia virus Origin reverse transcriptase (MMLV RTase), Rous associated virus 2 reverse transcriptase (RAV-2 RTase) and the like can be used. A strand displacement type DNA polymerase having reverse transcription activity can also be used.

本発明においては、ゲノムＤＮＡや核酸増幅断片のような二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡを、鋳型ＤＮＡとして使用できる。上記二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡに変性してから本発明の方法に使用してもよいし、このような変性を行うことなく本発明の方法に使用することもできる。   In the present invention, double-stranded DNA such as genomic DNA or nucleic acid amplification fragment, and single-stranded DNA such as cDNA prepared by reverse transcription reaction from RNA can be used as template DNA. The double-stranded DNA may be used in the method of the present invention after being denatured into single-stranded DNA, or may be used in the method of the present invention without performing such denaturation.

（７）融解温度調整剤
本発明における反応溶液には、融解温度調整剤を添加することができる。融解温度調整剤の具体例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、テトラアルキルアンモニウム塩、またはこれらの２種以上の混合物を挙げることができる。融解温度調整の使用量は特に限定されないが、ＤＭＳＯやホルムアミド、グリセロールの場合、通常は反応溶液中に１０％以下の量で含めることができる。
ベタインやテトラアルキルアンモニウム塩は、０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度添加することができる。 (7) Melting temperature adjusting agent A melting temperature adjusting agent can be added to the reaction solution in the present invention. Specific examples of the melting temperature adjusting agent include dimethyl sulfoxide (DMSO), betaine, formamide or glycerol, a tetraalkylammonium salt, or a mixture of two or more thereof. The amount used for adjusting the melting temperature is not particularly limited, but in the case of DMSO, formamide, or glycerol, it can usually be contained in the reaction solution in an amount of 10% or less.
Betaine and tetraalkylammonium salts can be added in an amount of 0.2 to 3.0M, preferably about 0.5 to 1.5M.

（８）緩衝成分
本発明における反応溶液には、緩衝成分を含めることができる。緩衝成分としては、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）などを使用することができる。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨは、増幅反応に用いられる酵素の至適ｐＨにもよるが、一般的には６．０〜９．０、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．０のものを使用できる。 (8) Buffer component The reaction solution in the present invention may contain a buffer component. The buffer component is not particularly limited, and for example, bicine, tricine, hepes, tris, phosphate (sodium phosphate, potassium phosphate, etc.) and the like can be used. The final concentration of the buffer component is in the range of 5 mM to 100 mM, particularly preferably in the range of 10 mM to 50 mM. The pH depends on the optimum pH of the enzyme used in the amplification reaction, but is generally 6.0 to Those having a pH of 9.0, particularly preferably 7.0 to 9.0 can be used.

（９）本発明による核酸の増幅方法
次に、本発明による核酸の増幅方法について説明する。本発明では、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートする。これにより、前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することができる。本発明では、好ましくは、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行うことができる。反応溶液をインキュベートする際の温度は好ましくは室温以上であり、より好ましくは５０℃以上であり、さらに好ましくは、５５℃以上であり、例えば、６０℃程度でインキュベートすることができる。好ましい温度範囲は、例えば、約５０℃から約７０℃であり、さらに好ましくは約５５℃から約６５℃である。この場合、プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、ＤＮＡ増幅の特異性が向上し、また鋳型ＤＮＡの二次構造が解消されることによりＤＮＡポリメラーゼの伸長性も向上する。本発明による核酸の増幅方法は、実質的に等温において実施すことができる。本発明において等温とは、各工程の反応温度を大きく変化することなく、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。 (9) Nucleic Acid Amplification Method According to the Present Invention Next, the nucleic acid amplification method according to the present invention will be described. In the present invention, a reaction solution containing at least one deoxynucleotide triphosphate, at least one DNA polymerase, a divalent cation, at least two oligonucleotide primers, and a nucleic acid fragment as a template is incubated. Thereby, the nucleic acid fragment can be amplified by performing a polymerase reaction starting from the 3 ′ end of the primer. In the present invention, preferably, the step of amplifying the nucleic acid can be performed substantially isothermally. The temperature at which the reaction solution is incubated is preferably room temperature or higher, more preferably 50 ° C. or higher, still more preferably 55 ° C. or higher. For example, incubation can be performed at about 60 ° C. A preferred temperature range is, for example, about 50 ° C. to about 70 ° C., more preferably about 55 ° C. to about 65 ° C. In this case, non-specific annealing of the primer is suppressed, the specificity of DNA amplification is improved, and the secondary structure of the template DNA is eliminated, so that the extendability of the DNA polymerase is also improved. The nucleic acid amplification method according to the present invention can be carried out substantially isothermally. In the present invention, isothermal means that each step is performed at a substantially constant temperature without greatly changing the reaction temperature of each step.

本発明において、反応溶液を実質的に等温でインキュベートする時間は、標的核酸断片が増幅できる限り特に限定されない。インキュベートする時間は、例えば、５分以上１２時間以内とすることができる。インキュベートする時間は、好ましくは、５分以上２時間以内であり、より好ましくは５分以上６０分以内であり、さらに好ましくは５分以上３０分以内であり、５分以上１５分以内とすることもできる。   In the present invention, the time for incubating the reaction solution substantially isothermally is not particularly limited as long as the target nucleic acid fragment can be amplified. The incubation time can be, for example, 5 minutes or more and 12 hours or less. The incubation time is preferably 5 minutes or more and 2 hours or less, more preferably 5 minutes or more and 60 minutes or less, further preferably 5 minutes or more and 30 minutes or less, and 5 minutes or more and 15 minutes or less. You can also.

核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、温度を上昇させたり低下させたりする必要がないことが利点の一つになる。従来のＰＣＲ法では温度を上下させる必要があり、例えばサーマルサイクラーのような反応装置が必要であったが、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、一定温度を保持できる装置のみで実施が可能である。   In the case where the step of amplifying the nucleic acid is performed substantially isothermally, one advantage is that it is not necessary to increase or decrease the temperature. In the conventional PCR method, it is necessary to raise or lower the temperature. For example, a reaction device such as a thermal cycler is required. However, when the nucleic acid amplification step is performed substantially isothermally, only a device that can maintain a constant temperature is used. Can be implemented.

（１０）本発明による核酸の増幅方法の利用
本発明による核酸の増幅方法は、核酸の検出、標識、塩基配列の決定、塩基の変異の検出（一塩基多型の検出などを含む）などに使用することができる。本発明の核酸の増幅方法には温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、多量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。 (10) Utilization of nucleic acid amplification method according to the present invention The nucleic acid amplification method according to the present invention is used for nucleic acid detection, labeling, nucleotide sequence determination, base mutation detection (including detection of single nucleotide polymorphisms, etc.), etc. Can be used. Since the nucleic acid amplification method of the present invention does not require the use of a reaction apparatus capable of adjusting the temperature, the amplification reaction can be carried out using a large amount of reaction solution.

本発明の核酸の増幅方法により得られる増幅物は、当業者に公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって特定サイズの反応産物を検出することができる。増幅産物を検出するための検出系は、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。   The amplified product obtained by the nucleic acid amplification method of the present invention can be detected by methods known to those skilled in the art. For example, according to gel electrophoresis, a reaction product of a specific size can be detected by staining the gel with ethidium bromide. Detection systems for detecting amplification products include fluorescence polarization, immunoassay, fluorescence energy transfer, enzyme labels (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), fluorescence labels (eg, fluorescein, rhodamine, etc.), chemiluminescence, bioluminescence, etc. Can be used. The amplified product can also be detected by using a labeled nucleotide labeled with biotin or the like. In this case, biotin in the amplification product can be detected using fluorescently labeled avidin or enzyme-labeled avidin.

本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。   The present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

＜実施例１＞核酸の増幅反応
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β−アクチン遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。 Example 1 Nucleic Acid Amplification Reaction (1) Preparation of Nucleic Acid Sample Solution Containing Target Nucleic Acid Fragment 3.0 ng of Human Genomic cDNA (manufactured by Clontech) at 98 ° C. for 3 min. After heating to make a single strand, the sequence in the β-actin gene was amplified under the following conditions.

＜プライマー＞
プライマーは、βアクチン遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。 <Primer>
Primers were designed targeting the β-actin gene. The sequence of each primer is shown below.

プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ)：
５'−GGGCATGGGTCAGAAGGATT−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ):
５'−CCTCGTCGCCCACATAG−３'（配列番号２） Primer (1) (Forward Primer):
5′-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
Primer (2) (Reverse Primer):
5′-CCTCGTCGCCCACATAG-3 ′ (SEQ ID NO: 2)

上記プライマーのβアクチン遺伝子に対する位置関係の詳細を図１に示した。
ここで、配列Ｘは「5'-CCCAG-3'」であり、54塩基離れた位置に存在する。プライマー（１）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計されており、プライマー（２）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計されている。 Details of the positional relationship of the primer with respect to the β-actin gene are shown in FIG.
Here, the sequence X is “5′-CCCAG-3 ′” and exists at a position 54 bases away. Primer (1) is designed for the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ terminal base of sequence X on the 3 ′ side, and primer (2) is on the 5 ′ side. It is designed for the complementary strand of the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of sequence X and the 3 ′ terminal base of sequence X on the 3 ′ side.

(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍） ０．２μＬ
50μM primer(1) ０．６４μＬ
50μM primer(2) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ) ０．４μＬ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ (2) Nucleic acid amplification reaction The amplification reaction was carried out by reacting at 60 ° C. for 60 minutes with the composition of the reaction solution shown below. The enzyme used was NEB Bst. DNA polymerase.
<Composition of reaction solution>
10 x Bst Buffer (DF) 1.0μL
100 mM MgSO4 0.6 μL
10% (v / v) Tween20 0.1μL
100% DMSO 0.5 μL
25mM dNTP each 0.56μL
SYBR Green I (2000 times) 0.2μL
50μM primer (1) 0.64μL
50μM primer (2) 0.64μL
Bst. Polymerase 0.4μL
Nucleic acid fragment sample solution (3.0 ng) obtained in 1) 0.4 μL
Purified water 4.96 μL
10.0 μL

（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図２に示す。 (3) Detection of amplification product The amplification reaction in the above (2) was subjected to fluorescence detection using a real-time fluorescence detection apparatus (Mx3000p, manufactured by Stratagene). The results are shown in FIG.

Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出した。Ct値は37.6±1.1分であった。   Using the analysis software of Mx3000p, the time (Ct value) when the fluorescence amount reached 250 in the above graph was calculated. The Ct value was 37.6 ± 1.1 minutes.

＜実施例２＞増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図３に示す。電気泳動パターンはN=6でほぼ均一であり、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。 Example 2 Electrophoresis of Amplified Product Using 3 wt% agarose gel and 0.5 × TBE buffer (50 mM Tris, 45 mM Boric acid, 0.5 mM EDTA, pH 8.4), electrophoresis was performed at 100 V for 60 minutes. The results are shown in FIG. The electrophoresis pattern was almost uniform at N = 6, and it was found that amplification products were obtained by the same reaction mechanism.

＜実施例3＞増幅産物のクローニング
電気泳動を実施後、200bp以下の領域のゲルを切り出し、QIAEXII（Qiagen製）を用いてゲル中のDNAを回収した。
回収したDNAをTOPO TA Cloning Kit（Invitrogen製）を用いてベクターに組み込み、該ベクターにより大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを加えたLB培地中で培養した。
QIAprep Miniprep（Qiagen製）を使用して培養した大腸菌からプラスミドDNAを回収した。
回収したプラスミドDNAに対してシークエンスを行い、塩基配列を調べた。プライマーにはM13 Reverse Primerを使用した。 <Example 3> Cloning of amplification product After electrophoresis, a gel having a region of 200 bp or less was excised, and DNA in the gel was recovered using QIAEXII (manufactured by Qiagen).
The recovered DNA was incorporated into a vector using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen), and Escherichia coli was transformed with the vector. The transformed E. coli was cultured in LB medium supplemented with ampicillin.
Plasmid DNA was recovered from E. coli cultured using QIAprep Miniprep (Qiagen).
The recovered plasmid DNA was sequenced and the nucleotide sequence was examined. M13 Reverse Primer was used as a primer.

M13 Reverse Primer
５'−CAGGAAACAGCTATGAC−３'（配列番号３） M13 Reverse Primer
5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 3)

シークエンスの結果、次の３種類の増幅産物が存在することがわかった。
（１）
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGG-3'
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCC-5'
38塩基対（配列番号４） As a result of sequencing, it was found that the following three types of amplification products existed.
(1)
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGG-3 '
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCC-5 '
38 base pairs (SEQ ID NO: 4)

（２）
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGGCC CAGGGCGTGA-3'
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCCGG GTCCCGCACT-5'

5'-TGGTGGGCAT GGGTCAGAAG GATTCCTATG TGGGCGACGA GG-3'
3'-ACCACCCGTA CCCAGTCTTC GTAAGGATAC ACCCGCTGCT CC-5'
92塩基対（配列番号５） (2)
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGGCC CAGGGCGTGA-3 '
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCCGG GTCCCGCACT-5 '

5'-TGGTGGGCAT GGGTCAGAAG GATTCCTATG TGGGCGACGA GG-3 '
3'-ACCACCCGTA CCCAGTCTTC GTAAGGATAC ACCCGCTGCT CC-5 '
92 base pairs (SEQ ID NO: 5)

（３）
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGGCC CAGGGCGTGA-3'
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCCGG GTCCCGCACT-5'

5'-TGGTGGGCAT GGGTCAGAAG GATTCCTATG TGGGCGACGA GGACCAGGGC-3'
3'-ACCACCCGTA CCCAGTCTTC CTAAGGATAC ACCCGCTGCT CCTGGTCCCG-5'

5'-GTGATGGTGG GCATGGGTCA GAAGGATTCC TATGTGGGCG ACGAGG-3'
3'-CACTACCACC CGTACCCAGT CTTCCTAAGG ATACACCCGC TGCTCC-5'

146塩基対（配列番号６） (3)
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGGCC CAGGGCGTGA-3 '
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCCGG GTCCCGCACT-5 '

5'-TGGTGGGCAT GGGTCAGAAG GATTCCTATG TGGGCGACGA GGACCAGGGC-3 '
3'-ACCACCCGTA CCCAGTCTTC CTAAGGATAC ACCCGCTGCT CCTGGTCCCG-5 '

5'-GTGATGGTGG GCATGGGTCA GAAGGATTCC TATGTGGGCG ACGAGG-3 '
3'-CACTACCACC CGTACCCAGT CTTCCTAAGG ATACACCCGC TGCTCC-5 '

146 base pairs (SEQ ID NO: 6)

シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図２の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、それぞれのプライマーによって増幅された産物が、配列Ｘ（CCCAG）及び配列Ｘｃ（CTGGG）を介して結合し、さらに増幅した産物である。
（３）の増幅産物は、（２）の増幅産物と２つのプライマーのどちらかによって増幅された産物が、配列Ｘ（CCCAG）及び配列Ｘｃ（CTGGG）を介して結合し、さらに増幅した産物である。 The chain length of the amplification product obtained in the sequence was consistent with the electrophoresis result shown in FIG.
The amplification product (1) is a region sandwiched between two primers.
The amplification product of (2) is a product obtained by further amplifying the product amplified by each primer by binding through the sequence X (CCCAG) and the sequence Xc (CTGGG).
The amplified product of (3) is a product obtained by binding the product amplified by either the amplified product of (2) or two primers via sequence X (CCCAG) and sequence Xc (CTGGG), and further amplifying the product. is there.

＜実施例４＞核酸の増幅反応
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β3AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。 Example 4 Nucleic Acid Amplification Reaction (1) Preparation of Nucleic Acid Sample Solution Containing Target Nucleic Acid Fragment 3.0 ng of Human Genomic cDNA (manufactured by Clontech) at 98 ° C. for 3 min. After heating to make a single strand, the sequence in the β3AR gene was amplified under the following conditions.

＜プライマー＞
プライマーは、β3ＡＲ遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。 <Primer>
Primers were designed targeting the β3AR gene. The sequence of each primer is shown below.

プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−ATCGTGGCCATCGCCT−３'（配列番号７）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCAGCGAAGTCACGAAC−３'（配列番号８） Primer (1) (Forward):
5′-ATCGTGGCCATCGCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
Primer (2) (Reverse):
5′-CCAGCGAAGTCACGAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 8)

上記プライマーのβ3ＡＲ遺伝子に対する位置関係の詳細を図4に示した。
ここで、配列Ｘは「5'-GCTGGCC-3'」であり、90塩基離れた位置に存在する。プライマー（１）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計されており、プライマー（２）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計されている。 Details of the positional relationship of the primer with respect to the β3AR gene are shown in FIG.
Here, the sequence X is “5′-GCTGGCC-3 ′” and exists at a position 90 bases away. Primer (1) is designed for the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ terminal base of sequence X on the 3 ′ side, and primer (2) is on the 5 ′ side. It is designed for the complementary strand of the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of sequence X and the 3 ′ terminal base of sequence X on the 3 ′ side.

(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍） ０．２μＬ
50μM primer(1) ０．６４μＬ
50μM primer(2) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ) ０．４μＬ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ (2) Nucleic acid amplification reaction The amplification reaction was carried out by reacting at 60 ° C. for 60 minutes with the composition of the reaction solution shown below. The enzyme used was NEB Bst. DNA polymerase.
<Composition of reaction solution>
10 x Bst Buffer (DF) 1.0μL
100 mM MgSO4 0.6 μL
10% (v / v) Tween20 0.1μL
100% DMSO 0.5 μL
25mM dNTP each 0.56μL
SYBR Green I (2000 times) 0.2μL
50μM primer (1) 0.64μL
50μM primer (2) 0.64μL
Bst. Polymerase 0.4μL
Nucleic acid fragment sample solution (3.0 ng) obtained in 1) 0.4 μL
Purified water 4.96 μL
10.0 μL

（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図５に示す。
Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出した。Ct値は41.2±0.5分であった。 (3) Detection of amplification product The amplification reaction in the above (2) was subjected to fluorescence detection using a real-time fluorescence detection apparatus (Mx3000p, manufactured by Stratagene). The results are shown in FIG.
Using the analysis software of Mx3000p, the time (Ct value) when the fluorescence amount reached 250 in the above graph was calculated. The Ct value was 41.2 ± 0.5 minutes.

＜実施例５＞増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図６に示す。電気泳動パターンはN=4でほぼ均一であり、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。 <Example 5> Electrophoresis of amplification products Electrophoresis of 3 wt% agarose gel and 0.5 x TBE buffer (50 mM Tris, 45 mM Boric acid, 0.5 mM EDTA, pH 8.4) was performed at 100 V for 60 minutes. The results are shown in FIG. The electrophoresis pattern was almost uniform at N = 4, and it was found that the amplified product was obtained by the same reaction mechanism.

＜実施例6＞増幅産物のクローニング
電気泳動を実施後、200bp以下の領域のゲルを切り出し、QIAEXII（Qiagen製）を用いてゲル中のDNAを回収した。
回収したDNAをTOPO TA Cloning Kit（Invitrogen製）を用いてベクターに組み込み、該ベクターにより大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを加えたLB培地中で培養した。
QIAprep Miniprep（Qiagen製）を使用して培養した大腸菌からプラスミドDNAを回収した。
回収したプラスミドDNAに対してシークエンスを行い、塩基配列を調べた。プライマーにはM13 Reverse Primerを使用した。 <Example 6> Cloning of amplification products After electrophoresis, a gel having a region of 200 bp or less was cut out, and DNA in the gel was recovered using QIAEXII (manufactured by Qiagen).
The recovered DNA was incorporated into a vector using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen), and Escherichia coli was transformed with the vector. The transformed E. coli was cultured in LB medium supplemented with ampicillin.
Plasmid DNA was recovered from E. coli cultured using QIAprep Miniprep (Qiagen).
The recovered plasmid DNA was sequenced and the nucleotide sequence was examined. M13 Reverse Primer was used as a primer.

M13 Reverse Primer
５'−CAGGAAACAGCTATGAC−３'（配列番号３） M13 Reverse Primer
5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 3)

シークエンスの結果、次の３種類の増幅産物が存在することがわかった。
（１）
5'-ATCGTGGCCA TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT-3'
3'-TAGCACCGGT AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA-5'
5'-CGTGACTTCGCTGG-3'
3'-GCACTGAAGCGACC-5'
64塩基対 （配列番号９） As a result of sequencing, it was found that the following three types of amplification products existed.
(1)
5'-ATCGTGGCCA TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT-3 '
3'-TAGCACCGGT AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA-5 '
5'-CGTGACTTCGCTGG-3 '
3'-GCACTGAAGCGACC-5 '
64 base pairs (SEQ ID NO: 9)

（２）
5'-ATCGTGGCCA TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT-3'
3'-TAGCACCGGT AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA-5'
5'-CGTGACTTCG CTGGGCACCG TGGGAGGCAA CCTGCTGGTC ATCGTGGCCA-3'
3'-TCACTGAAGC GACCCGTGGC ACCCTCCGTT GGACGACCAG TAGCACCGGT-5'
5'-TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT CGTGACTTCG-3'
3'-AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA GCACTGAAGC-5'
5'-CTG-3'
3'-GAC-5'
153塩基対（配列番号１０） (2)
5'-ATCGTGGCCA TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT-3 '
3'-TAGCACCGGT AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA-5 '
5'-CGTGACTTCG CTGGGCACCG TGGGAGGCAA CCTGCTGGTC ATCGTGGCCA-3 '
3'-TCACTGAAGC GACCCGTGGC ACCCTCCGTT GGACGACCAG TAGCACCGGT-5 '
5'-TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT CGTGACTTCG-3 '
3'-AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA GCACTGAAGC-5 '
5'-CTG-3 '
3'-GAC-5 '
153 base pairs (SEQ ID NO: 10)

シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図６の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、それぞれのプライマーによって増幅された産物が、配列Ｘ（GCTGGCC）及び配列Ｘｃ（GGCCAGC）を介して結合し、さらに増幅した産物である。 The chain length of the amplification product obtained in the sequence was consistent with the electrophoresis result shown in FIG.
The amplification product (1) is a region sandwiched between two primers.
The amplified product of (2) is a product obtained by further amplifying the product amplified by each primer by binding via the sequence X (GCTGGCC) and the sequence Xc (GGCCAGC).

＜実施例７＞
核酸の増幅反応
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、７番染色体中の配列の増幅を以下の条件で行った。 <Example 7>
Nucleic acid amplification reaction (1) Preparation of nucleic acid sample solution containing target nucleic acid fragment Human Genomic cDNA (manufactured by Clontech) 3.0 ng at 98 ° C. for 3 min. After heating to form a single strand, the sequence in chromosome 7 was amplified under the following conditions.

＜プライマー＞
プライマーは、７番染色体中の配列を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。 <Primer>
Primers were designed targeting the sequence in chromosome 7. The sequence of each primer is shown below.

プライマー(5)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−CATTGCTCAGGGGTCTTC−３'（配列番号１１）
プライマー(6)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−ATTTCGGCTCCCTTGG−３'（配列番号１２） Primer (5) (Forward):
5′-CATTGCTCAGGGGTCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
Primer (6) (Reverse):
5′-ATTTCGGCTCCCTTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 12)

上記プライマーの７番染色体中の配列に対する位置関係の詳細を図７に示した。
ここで、配列Ｘは「5'-GCCGGG-3'」であり、32塩基離れた位置に存在する。プライマー（5）は５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計されており、プライマー（6）は５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計されている。 Details of the positional relationship of the primer with respect to the sequence in chromosome 7 are shown in FIG.
Here, the sequence X is “5′-GCCGGG-3 ′” and is present at a position 32 bases away. Primer (5) is designed for a region within 100 bases on the 5 ′ side of sequence X on the 5 ′ side, and primer (6) has a base on the 5 ′ end and 5 ′ side of sequence X on the 5 ′ side. It is designed for the complementary strand of the region sandwiched by the base at the 3 ′ end of sequence X.

(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍） ０．２μＬ
50μM primer(5) ０．６４μＬ
50μM primer(6) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ) ０．４μＬ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ (2) Nucleic acid amplification reaction The amplification reaction was carried out by reacting at 60 ° C. for 60 minutes with the composition of the reaction solution shown below. The enzyme used was NEB Bst. DNA polymerase.
<Composition of reaction solution>
10 x Bst Buffer (DF) 1.0μL
100 mM MgSO4 0.6 μL
10% (v / v) Tween20 0.1μL
100% DMSO 0.5 μL
25mM dNTP each 0.56μL
SYBR Green I (2000 times) 0.2μL
50μM primer (5) 0.64μL
50μM primer (6) 0.64μL
Bst. Polymerase 0.4μL
Nucleic acid fragment sample solution (3.0 ng) obtained in 1) 0.4 μL
Purified water 4.96 μL
10.0 μL

（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図８に示す。
Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出した。Ct値は50.1±0.4分であった。 (3) Detection of amplification product The amplification reaction in the above (2) was subjected to fluorescence detection using a real-time fluorescence detection apparatus (Mx3000p, manufactured by Stratagene). The results are shown in FIG.
Using the analysis software of Mx3000p, the time (Ct value) when the fluorescence amount reached 250 in the above graph was calculated. The Ct value was 50.1 ± 0.4 minutes.

＜実施例８＞増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図９に示す。電気泳動パターンはN=2でほぼ均一であり、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。 <Example 8> Electrophoresis of amplification product Electrophoresis of 3 wt% agarose gel and 0.5 x TBE buffer (50 mM Tris, 45 mM Boric acid, 0.5 mM EDTA, pH 8.4) was performed at 100 V for 60 minutes. The results are shown in FIG. The electrophoretic pattern was almost uniform at N = 2, indicating that the amplified product was obtained by the same reaction mechanism.

＜実施例９＞
核酸の増幅反応
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、７番染色体中の配列の増幅を以下の条件で行った。 <Example 9>
Nucleic acid amplification reaction (1) Preparation of nucleic acid sample solution containing target nucleic acid fragment Human Genomic cDNA (manufactured by Clontech) 3.0 ng at 98 ° C. for 3 min. After heating to form a single strand, the sequence in chromosome 7 was amplified under the following conditions.

＜プライマー＞
プライマーは、７番染色体中の配列を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。 <Primer>
Primers were designed targeting the sequence in chromosome 7. The sequence of each primer is shown below.

プライマー(5)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−CATTGCTCAGGGGTCTTC−３'（配列番号１１）
プライマー(7)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−GGGCTCATAAGGTGCGTG−３'（配列番号１３） Primer (5) (Forward):
5′-CATTGCTCAGGGGTCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
Primer (7) (Reverse):
5′-GGGCTCATAAGGTGCGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 13)

上記プライマーの７番染色体中の配列に対する位置関係の詳細を図１０に示した。
ここで、配列Ｘは「5'-GCCGGG-3'」であり、32塩基離れた位置に存在する。プライマー（5）は５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計されており、プライマー（7）は３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計されている。 Details of the positional relationship of the primer with respect to the sequence in chromosome 7 are shown in FIG.
Here, the sequence X is “5′-GCCGGG-3 ′” and is present at a position 32 bases away. Primer (5) is designed for a region within 100 bases on the 5 ′ side of sequence X on the 5 ′ side, and primer (7) is a complement of a region within 100 bases on the 3 ′ side of sequence X on the 3 ′ side. Designed for chains.

(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR Green I（2000倍） ０．２μＬ
50μM primer(5) ０．６４μＬ
50μM primer(7) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ) ０．４μＬ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ (2) Nucleic acid amplification reaction The amplification reaction was carried out by reacting at 60 ° C. for 60 minutes with the composition of the reaction solution shown below. The enzyme used was NEB Bst. DNA polymerase.
<Composition of reaction solution>
10 x Bst Buffer (DF) 1.0μL
100 mM MgSO4 0.6 μL
10% (v / v) Tween20 0.1μL
100% DMSO 0.5 μL
25mM dNTP each 0.56μL
SYBR Green I (2000 times) 0.2μL
50μM primer (5) 0.64μL
50μM primer (7) 0.64μL
Bst. Polymerase 0.4μL
Nucleic acid fragment sample solution (3.0 ng) obtained in 1) 0.4 μL
Purified water 4.96 μL
10.0 μL

（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図１１に示す。
Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出した。Ct値は49.0±5.0分であった。 (3) Detection of amplification product The amplification reaction in the above (2) was subjected to fluorescence detection using a real-time fluorescence detection apparatus (Mx3000p, manufactured by Stratagene). The results are shown in FIG.
Using the analysis software of Mx3000p, the time (Ct value) when the fluorescence amount reached 250 in the above graph was calculated. The Ct value was 49.0 ± 5.0 minutes.

＜実施例１０＞増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図１２に示す。電気泳動パターンより、N=2でほぼ同一の増幅産物が得られていることがわかった。これより、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。 <Example 10> Electrophoresis of amplification products Electrophoresis of 3 wt% agarose gel and 0.5 x TBE buffer (50 mM Tris, 45 mM Boric acid, 0.5 mM EDTA, pH 8.4) was performed at 100 V for 60 minutes. The results are shown in FIG. From the electrophoresis pattern, it was found that almost identical amplification products were obtained at N = 2. From this, it was found that the amplified product was obtained by the same reaction mechanism.

図１は、実施例で用いたプライマーのβアクチン遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。FIG. 1 shows the details of the positional relationship of the primers used in the Examples with respect to the β-actin gene. 図２は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。FIG. 2 shows the result of fluorescence detection for the amplification product obtained by the amplification reaction according to the present invention. 図３は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。FIG. 3 shows the result of electrophoresis of the amplification product obtained by the amplification reaction according to the present invention. 図４は、実施例で用いたプライマーのβ３ＡＲ遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。FIG. 4 shows the details of the positional relationship of the primers used in the Examples with respect to the β3AR gene. 図５は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。FIG. 5 shows the result of fluorescence detection for the amplification product obtained by the amplification reaction according to the present invention. 図６は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。FIG. 6 shows the result of electrophoresis of the amplification product obtained by the amplification reaction according to the present invention. 図７は、実施例で用いたプライマーの７番染色体に対する位置関係の詳細を示す。FIG. 7 shows the details of the positional relationship of the primers used in Examples with respect to chromosome 7. 図８は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。FIG. 8 shows the result of fluorescence detection for the amplification product obtained by the amplification reaction according to the present invention. 図９は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。FIG. 9 shows the result of electrophoresis of the amplification product obtained by the amplification reaction according to the present invention. 図１０は、実施例で用いたプライマーの７番染色体に対する位置関係の詳細を示す。FIG. 10 shows the details of the positional relationship of the primers used in Examples with respect to chromosome 7. 図１１は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。FIG. 11 shows the result of fluorescence detection for the amplification product obtained by the amplification reaction according to the present invention. 図１２は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。FIG. 12 shows the result of electrophoresis of the amplification product obtained by the amplification reaction according to the present invention. 図１３は、本発明の核酸の増幅方法の第一の態様の概要（前半）を示す。FIG. 13 shows the outline (first half) of the first embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention. 図１４は、本発明の核酸の増幅方法の第一の態様の概要（後半）を示す。FIG. 14 shows an outline (second half) of the first embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention. 図１５は、本発明の核酸の増幅方法の第二の態様の概要（前半）を示す。FIG. 15 shows an outline (first half) of the second embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention. 図１６は、本発明の核酸の増幅方法の第二の態様の概要（後半）を示す。FIG. 16 shows an outline (second half) of the second embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention. 図１７は、本発明の核酸の増幅方法の第三の態様の概要（前半）を示す。FIG. 17 shows the outline (first half) of the third embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention. 図１８は、本発明の核酸の増幅方法の第三の態様の概要（後半）を示す。FIG. 18 shows the outline (second half) of the third embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention.

Claims (17)

少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼを用いる等温核酸増幅反応に適した第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーの設計方法であって、前記プライマーは第一及び第二の配列Ｘを含む鋳型核酸又はその一部を増幅するのに適しており、前記第一及び第二の配列Ｘは、連続する４塩基以上の２つの同一配列を有し、かつ鋳型核酸又はその断片の２００塩基以内に存在し、第一の配列Ｘは、第二の配列Ｘの５’に存在し、プライマーは以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの要件を満たす、上記の設計方法。A method for designing first and second oligonucleotide primers suitable for isothermal nucleic acid amplification reaction using a DNA polymerase having at least one strand displacement ability, wherein the primer comprises a first and a second sequence X It is suitable for amplifying a nucleic acid or a part thereof, and the first and second sequences X have two identical sequences of 4 bases or more in succession, and within 200 bases of a template nucleic acid or a fragment thereof. The design method as described above, wherein the first sequence X is present 5 ′ of the second sequence X, and the primer satisfies any of the following requirements (a) to (c):
（ａ）連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の５’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する；(A) 5 ′ terminal base and 3 ′ sequence of the first oligonucleotide primer in the 5 ′ sequence X for a region where there are two or more consecutive sequences X of 4 or more nucleotides within 200 bases Designed for the region sandwiched between the bases at the 3 ′ end of X, and the second oligonucleotide primer was placed at the 5 ′ end base of the sequence X on the 5 ′ side and the 3 ′ end of the sequence X on the 3 ′ side. Design for the complementary strand of the region sandwiched between bases and design a second oligonucleotide primer 5 ′ to the sequence complementary to the first oligonucleotide primer;
（ｂ）連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’末端の塩基と３’側の配列Ｘの３’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する；(B) For the region where the sequence X having 4 or more consecutive bases is present at 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. Designing and designing a second oligonucleotide primer for the complementary strand of the region sandwiched between the 5 ′ terminal base of the 5 ′ sequence X and the 3 ′ terminal base of the 3 ′ sequence X;
（ｃ）連続した４塩基以上の配列Ｘが２００塩基以内に２箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを５’側の配列Ｘの５’側１００塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを３’側の配列Ｘの３’側１００塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する：(C) With respect to the region where the sequence X having 4 or more bases is continuously present in 2 or more locations within 200 bases, the first oligonucleotide primer is applied to the region within 100 bases on the 5 ′ side of the sequence X on the 5 ′ side. Design and design a second oligonucleotide primer for the complementary strand of the region within 100 bases of 3 ′ side of sequence X of 3 ′ side: 配列Ｘ、及び配列Ｘに相補的な配列Ｘｃが連続した５塩基以上の配列である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the sequence X and the sequence Xc complementary to the sequence X are sequences having 5 or more consecutive nucleotides. 配列Ｘ、及び配列Ｘに相補的な配列Ｘｃが連続した７塩基以上の配列である、請求項１又は２に記載の方法。 The method according to claim 1 or 2, wherein the sequence X and the sequence Xc complementary to the sequence X are continuous 7 or more base sequences. オリゴヌクレオチドプライマーが前記鋳型核酸断片の一部と相補的である、請求項１から３の何れかに記載の方法。 The method according to claim 1, wherein an oligonucleotide primer is complementary to a part of the template nucleic acid fragment. 前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端領域のみが前記鋳型核酸断片と相補的である、請求項１から４の何れかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 4, wherein only the 3 'terminal region of the oligonucleotide primer is complementary to the template nucleic acid fragment. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記鋳型核酸断片と連続した一箇所でのみ相補的である、請求項１から５の何れかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the oligonucleotide primer is complementary only at one continuous position with the template nucleic acid fragment. 少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである、請求項１から６の何れかに記載の方法。 A DNA polymerase having at least one strand displacement ability is a 5 '→ 3' exonuclease-deficient Bst. DNA polymerase, 5 '→ 3' exonuclease-deficient Bca DNA polymerase derived from Bacillus caldetenax, 5 '→ 3' exonuclease-deficient Vent. The method according to any one of claims 1 to 6, which is a polymerase selected from the group consisting of DNA polymerases. 等温核酸増幅反応が、室温以上１００℃以下の等温で行われる、請求項１から７の何れかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the isothermal nucleic acid amplification reaction is performed at an isothermal temperature between room temperature and 100 ° C. 請求項１から８の何れかに記載の設計方法を行うことにより第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計すること、及び
少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅すること：
含む核酸の増幅方法。 Designing the first and second oligonucleotide primers by performing the design method according to any of claims 1 to 8, and at least one deoxynucleotide triphosphate, at least one A polymerase reaction starting from the 3 ′ end of the primer is performed by incubating a reaction solution containing a DNA polymerase having strand displacement ability, first and second oligonucleotide primers, and a nucleic acid fragment as a template. Amplifying the fragment:
A method for amplifying a nucleic acid. 反応溶液が少なくとも０．０５％以上の界面活性剤を含む、請求項９に記載の方法。 The method of claim 9, wherein the reaction solution comprises at least 0.05% or more surfactant. 界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項１０に記載の方法。 The method of claim 10, wherein the surfactant is a nonionic surfactant. 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする請求項１１に記載の方法。 The method according to claim 11, wherein the nonionic surfactant is selected from a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester series, a polyoxyethylene alkylphenol ether series, and a polyoxyethylene alkyl ether series. 反応溶液が、少なくとも２価の陽イオンを含む、請求項９から１２の何れかに記載の方法。 The method according to claim 9, wherein the reaction solution contains at least a divalent cation. 反応溶液が、融解温度調整剤をさらに含む、請求項９から１３の何れかに記載の方法。 The method according to claim 9, wherein the reaction solution further contains a melting temperature adjusting agent. 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項１４に記載の方法。 The method according to claim 14, wherein the melting temperature adjusting agent is dimethyl sulfoxide, betaine, formamide or glycerol, or a mixture of two or more thereof. 反応溶液が、各々１．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下のデオキシヌクレオチド３リン酸を含む、請求項９から１５の何れかに記載の方法。 The method according to any one of claims 9 to 15, wherein the reaction solution contains 1.0 mM or more and 100 mM or less of deoxynucleotide triphosphate. 反応溶液が、各々１μＭ以上１００μＭ以下のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項９から１６の何れかに記載の方法。 The method according to any one of claims 9 to 16, wherein each reaction solution contains 1 to 100 µM oligonucleotide primers.