JP2003052380A - Method of amplifying nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床分野において
有用な標的核酸の検出方法及び遺伝子工学分野において
有用なＤＮＡの合成方法に関し、鋳型となる核酸の増幅
方法および該方法で増幅された標的核酸の検出方法に関
する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid useful in the clinical field and a method for synthesizing DNA useful in the field of genetic engineering, including a method for amplifying a nucleic acid serving as a template and a target nucleic acid amplified by the method. Regarding the detection method of.
【０００２】[0002]
【従来の技術】遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの
合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレ
オチドのような短鎖のＤＮＡの合成を除けば、そのほと
んどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により
実施されている。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（Ｐ
ＣＲ法）があるが、それは米国特許第４，６８３，１９
５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１
５９号に詳細に記述されている。もう一つの例として
は、トレンズ イン バイオテクノロジー（Trendsin B
iotechnology）第１０巻、１４６〜１５２頁（１９９
２）に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆
転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）が挙げられる。上記の
方法の開発により、ＤＮＡから、若しくはＲＮＡから目
的とする領域を増幅することが可能になった。In the field of genetic engineering, DNA synthesis is used for various purposes. Most of them are carried out by an enzymatic method using a DNA polymerase, except for the synthesis of short-chain DNA such as oligonucleotides. For example, polymerase chain reaction (P
CR method), which is disclosed in US Pat. No. 4,683,19.
5, No. 4,683,202 and No. 4,800,1
No. 59 is described in detail. Another example is Trends in Biotechnology (Trendsin B
iotechnology) Volume 10, 146-152 (199
A reverse transcription PCR method (RT-PCR method), which is a combination of the method described in 2) and a reverse transcriptase reaction, may be mentioned. The development of the above method has made it possible to amplify a target region from DNA or RNA.
【０００３】これらのＤＮＡ合成方法は、目的とするＤ
ＮＡ領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡ
の一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプラ
イマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成
（伸長）の３つのステップからなる反応により、もしく
は、”シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白
質 核酸 酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜
４２８頁（１９９６））と呼ばれる、前述の３ステップ
反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステ
ップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施され
る。These DNA synthesizing methods are aimed at
For amplifying the NA region, for example, double-stranded template DNA
By a reaction consisting of three steps of dissociation into single strands (denaturation), annealing of primers to single-stranded template DNA, synthesis of complementary strands from primers (extension), or "shuttle PCR"("PCRmethod")."Forefront","Protein, Nucleic Acid, and Enzyme", Supplement, Vol. 41, No. 5, 425-
428 (1996)), which is a two-step reaction in which the steps of primer annealing and extension among the above-mentioned three-step reaction are carried out at the same temperature.
【０００４】さらに、別法としては、１９８９年６月１
４日に公開された欧州特許出願第３２０，３０８号に記
述されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ligase chain
reaction）法、あるいはＰＣＲ プロトコールズ（PCR
Protocols, Academic Press. Inc.,1990）２４５〜２
５２頁に記述されている転写増幅システム（ＴＡＳ；tr
anscription-based amplification system）法が挙げら
れる。上記４法は、次の増幅サイクルのための一本鎖標
的分子を再生するために、高温から低温の反応を何回も
繰り返す必要がある。このように温度によって反応が制
約されるため、反応系は不連続な相またはサイクルで行
なう必要がある。Further, as an alternative method, June 1, 1989
Ligase chain reaction (LCR) described in European Patent Application No. 320,308 published on the 4th
reaction) method or PCR protocol (PCR
Protocols, Academic Press. Inc., 1990) 245-2
Transcription amplification system (TAS; tr described on page 52)
anscription-based amplification system) method. The above-mentioned four methods require the reaction from high temperature to low temperature to be repeated many times in order to regenerate the single-stranded target molecule for the next amplification cycle. Since the reaction is restricted by the temperature, the reaction system needs to be carried out in a discontinuous phase or cycle.
【０００５】従って、上記の方法には広い温度範囲で、
かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高
価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。
また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうた
め設定温度にするために要する時間が必要であり、その
ロス時間はサイクル数に比例して増大していく。Therefore, the above method has a wide temperature range,
In addition, it is necessary to use an expensive thermal cycler that can perform precise temperature control over time.
Further, since the reaction is performed under two to three kinds of temperature conditions, it takes time to reach the set temperature, and the loss time thereof increases in proportion to the number of cycles.
【０００６】そこで、上記問題点を解決すべく等温状態
で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、特公平
７−１１４７１８号に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；st
randdisplacement amplification）法、自立複製（３Ｓ
Ｒ；self-sustained sequence replication）法、日本
国特許番号第２６５０１５９号に記載の核酸配列増幅
（ＮＡＳＢＡ；nucleic acid sequence based amplific
ation）法、ＴＭＡ（transcription-mediated amplific
ation）法、日本国特許番号第２７１０１５９号に記載
のＱβレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第５，８２
４，５１７号、国際公開第９９／０９２１１号パンフレ
ット、国際公開第９５／２５１８０号パンフレットある
いは、国際公開第９９／４９０８１号パンフレット等に
記載の種々の改良ＳＤＡ法が挙げられる。米国特許番号
第５，９１６，７７７号には等温状態でのオリゴヌクレ
オチドの酵素的合成方法が記載されている。これらの等
温核酸増幅法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応に
おいては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物（ま
たは元の標的配列）へのプライマーのアニーリングや、
それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された
反応混合物中で同時に起こる。Therefore, in order to solve the above problems, a nucleic acid amplification method which can be carried out in an isothermal state has been developed. For example, strand displacement amplification (SDA; st described in Japanese Patent Publication No. 7-114718).
randdisplacement amplification) method, independent replication (3S
R; self-sustained sequence replication) method, nucleic acid sequence amplification based on Japanese Patent No. 2650159 (NASBA; nucleic acid sequence based amplific
ation) method, TMA (transcription-mediated amplific
ation) method, the Qβ replicase method described in Japanese Patent No. 2710159, and US Pat. No. 5,82.
4,517, International Publication No. 99/092111 pamphlet, International Publication No. 95/25180 pamphlet, International Publication No. 99/49081 pamphlet, and various improved SDA methods. US Pat. No. 5,916,777 describes a method for enzymatic synthesis of oligonucleotides under isothermal conditions. In the reactions of these isothermal nucleic acid amplification methods or oligonucleotide synthesis methods, extension of the primer, annealing of the primer to the single-stranded extension product (or the original target sequence),
Subsequent extension of the primer occurs simultaneously in the reaction mixture incubated at constant temperature.
【０００７】これらの等温核酸増幅法のうち最終的にＤ
ＮＡが増幅される系、例えば、ＳＤＡ法は、ＤＮＡポリ
メラーゼと制限エンドヌクレアーゼを介する二本鎖の置
換による、試料中の標的核酸配列（およびその相補鎖）
の増幅法であるが、該方法では、増幅に使用するプライ
マーは４種類必要であり、その内の２種類は、制限エン
ドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要が
ある。また、該方法では、ＤＮＡ合成のための基質とし
て、修飾されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸、例
えばα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子（Ｓ）に置換
された（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチド３リン酸を
大量に用いる必要があり、ルーチンワークで反応を行な
う遺伝子検査等においては、そのランニングコストが深
刻な問題となってくる。さらに該方法では、増幅された
ＤＮＡ断片中に上記の修飾ヌクレオチド、たとえば（α
−Ｓ）デオキシリボヌクレオチドが含まれるため、例え
ば、増幅後のＤＮＡ断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ；
restriction enzyme fragment length polymorphism）
解析に供しようとする場合に、該断片が制限酵素で切断
できないことがある。Of these isothermal nucleic acid amplification methods, finally D
A system in which NA is amplified, for example, the SDA method, uses a target nucleic acid sequence (and its complementary strand) in a sample by displacement of a double strand via a DNA polymerase and a restriction endonuclease.
In this method, four kinds of primers used for amplification are required, and two kinds of them need to be constructed so as to include a recognition site for a restriction endonuclease. Further, in this method, as a substrate for DNA synthesis, a modified deoxyribonucleotide triphosphate, for example, an oxygen atom of a phosphate group at the α-position is substituted with a sulfur atom (S) (α-S) deoxyribonucleotide. Since it is necessary to use a large amount of triphosphate, the running cost becomes a serious problem in genetic tests and the like that perform reactions in routine work. Further, in the method, the above-mentioned modified nucleotide such as (α
-S) deoxyribonucleotide is included, therefore, for example, a DNA fragment after amplification is subjected to restriction enzyme length polymorphism (RFLP;
restriction enzyme fragment length polymorphism)
The fragment may not be cleaved with a restriction enzyme when it is subjected to analysis.
【０００８】また、米国特許番号第５，８２４，５１７
号記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成さ
れ、少なくとも３’末端にＤＮＡが配置された構造を必
須要件とするキメラプライマーを使用するＤＮＡ増幅方
法である。また、国際公開第９９／０９２１１号パンフ
レットに記載の改良ＳＤＡ法は、３'突出末端を生じさ
せる制限酵素が必要である。また、国際公開第９５／２
５１８０号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、少な
くとも２組のプライマー対を必要とする。さらに、国際
公開第９９／４９０８１号パンフレットに記載の改良Ｓ
ＤＡ法は、少なくとも２組のプライマーと少なくとも１
種類の修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸を必要と
する。一方、米国特許番号第５，９１６，７７７号は、
オリゴヌクレオチドを合成するために、３’末端にリボ
ヌクレオチドを有するプライマーを使用してＤＮＡを合
成し、反応終了後にエンドヌクレアーゼによりプライマ
ー伸長鎖中のプライマーと伸長鎖の間にニックをいれて
分離させ、テンプレートを消化し、さらにプライマーを
回収して再利用するというものである。該方法では、プ
ライマーを再利用する際には反応系よりプライマーを単
離したうえで鋳型を再度アニーリングさせる必要があ
る。また、国際公開第００／２８０８２号パンフレット
に記載のＬＡＭＰ(Loop-mediated Isothermal Amplific
ation)法は増幅に４種類のプライマーを必要とし、ま
た、増幅産物は増幅の標的とされた領域が繰り返され
た、サイズの一定しないＤＮＡである。Also, US Pat. No. 5,824,517
The improved SDA method described in No. 1 is a DNA amplification method that uses a chimeric primer that is essentially composed of RNA and DNA and has a structure in which DNA is arranged at least at the 3'end. In addition, the improved SDA method described in WO 99/09211 requires a restriction enzyme that produces a 3 ′ overhang. Also, International Publication No. 95/2
The improved SDA method described in 5180 requires at least two primer pairs. Furthermore, the improved S described in WO 99/49081 pamphlet
The DA method requires at least two pairs of primers and at least one primer.
It requires a class of modified deoxyribonucleotide triphosphates. On the other hand, US Pat. No. 5,916,777
In order to synthesize an oligonucleotide, DNA is synthesized using a primer having a ribonucleotide at the 3'end, and after the reaction is completed, a nick is inserted between the primer and the extended chain in the primer extended chain by an endonuclease to separate them. , The template is digested, and the primer is recovered and reused. In this method, when the primer is reused, it is necessary to isolate the primer from the reaction system and then anneal the template again. In addition, LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplificate described in WO 00/28082 pamphlet).
ation) method requires four kinds of primers for amplification, and the amplification product is a non-constant size DNA in which the region targeted for amplification is repeated.
【０００９】さらに、キメラオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いた等温核酸増幅方法として、国際公開第００
／５６８７７号パンフレットに記載のＩＣＡＮ（Isothe
rmaland Chimeric primer-initiated Amplification of
Nucleic acids）法がある。しかしながら、従来の等温
核酸増幅法はまだまだ種々の問題をかかえており、低ラ
ンニングコストで、かつ結果的に得られたＤＮＡ断片を
さらに遺伝子工学的な処理に使用することが可能な核酸
の増幅方法が求められていた。[0009] Further, as an isothermal nucleic acid amplification method using a chimeric oligonucleotide primer, WO 00
/ ICAN (Isothe
rmaland Chimeric primer-initiated Amplification of
Nucleic acids) method. However, the conventional isothermal nucleic acid amplification method still has various problems, a low running cost, and the resulting DNA fragment can be used for further genetic engineering treatment. Was required.
【００１０】[0010]
【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
試料中の標的核酸の高感度、特異的に増幅する標的核酸
の増幅方法、及びこれらの方法に用いる組成物及びキッ
トを提供することにある。The main object of the present invention is to:
It is intended to provide a method for amplifying a target nucleic acid having high sensitivity and specific amplification of a target nucleic acid in a sample, and a composition and a kit used for these methods.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、国際公開第００／５６８７７号パンフレットに記
載のＩＣＡＮ法において、キメラオリゴヌクレオチドプ
ライマー及び鋳型となる核酸の該プライマーのアニーリ
ングする位置の３’側にアニーリングする上流オリゴヌ
クレオチドプライマーを組み合わせて使用することによ
り、標的核酸の増幅効率が向上し、検出感度が改善され
ることを見いだし、本発明を完成させた。Means for Solving the Problems As a result of earnest research, the present inventors have found that in the ICAN method described in WO 00/56877, the position of the chimeric oligonucleotide primer and the position of the template nucleic acid at which the primer is annealed. The inventors have found that the use of a combination of an upstream oligonucleotide primer that anneals to the 3'-side of is improved the amplification efficiency of the target nucleic acid and the detection sensitivity, and completed the present invention.
【００１２】すなわち、本発明の第１の発明は、核酸を
増幅する方法において、（ａ）鋳型となる核酸、デオキ
シリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼ、少なくとも１種類のキメラオリゴヌク
レオチドプライマー、少なくとも１種類の上流オリゴヌ
クレオチドプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して
反応混合物を調製する工程；ここで該キメラオリゴヌク
レオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実
質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオ
チド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリ
ボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プ
ライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラ
オリゴヌクレオチドプライマーであり、該上流オリゴヌ
クレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の当該キメラ
オリゴヌクレオチドプライマーと実質的に相補的な領域
の３’側の塩基配列に実質的に相補的であり；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物
をインキュベートする工程、を包含することを特徴とす
る核酸の増幅方法に関する。That is, the first invention of the present invention is, in a method for amplifying a nucleic acid, (a) a nucleic acid serving as a template, deoxyribonucleotide triphosphate, and DN having strand displacement activity.
A polymerase, at least one kind of chimeric oligonucleotide primer, at least one kind of upstream oligonucleotide primer, and RNaseH are mixed to prepare a reaction mixture, wherein the chimeric oligonucleotide primer is a nucleotide sequence of a nucleic acid serving as a template. A chimeric oligonucleotide substantially complementary to, containing at least one selected from deoxyribonucleotides and nucleotide analogs and a ribonucleotide, the ribonucleotide being located at the 3'end or 3'end of the primer. A primer, wherein the upstream oligonucleotide primer is substantially complementary to the base sequence on the 3'side of the region of the template nucleic acid that is substantially complementary to the chimeric oligonucleotide primer; and
(B) incubating the reaction mixture for a sufficient time to produce a reaction product.
【００１３】本発明の第１の発明において、さらに鋳型
となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有する第
２のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反
応混合物を使用してもよい。さらに鋳型となる核酸の第
２のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に
実質的に相同な配列を有する領域の３’側の塩基配列と
実質的に相同な配列を第２の上流オリゴヌクレオチドプ
ライマーを含有する反応混合物を使用してもよい。In the first invention of the present invention, a reaction mixture containing a second chimeric oligonucleotide primer having a sequence substantially homologous to the base sequence of the nucleic acid serving as the template may be used. In addition, a second upstream oligonucleotide primer containing a sequence substantially homologous to the base sequence on the 3'side of the region having a sequence substantially homologous to the base sequence of the second chimeric oligonucleotide primer of the nucleic acid serving as a template A reaction mixture of
【００１４】本発明の第２の発明は、本発明の第１の発
明の核酸の増幅方法のための組成物であって、それぞれ
少なくとも１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマ
ー及び上流オリゴヌクレオチドプライマーを含有する組
成物に関する。The second invention of the present invention is a composition for the method for amplifying a nucleic acid of the first invention of the present invention, which comprises at least one kind of chimeric oligonucleotide primer and upstream oligonucleotide primer, respectively. It relates to a composition.
【００１５】本発明の第３の発明は、本発明の第１の発
明の核酸の増幅方法のためのキットであって、それぞれ
少なくとも１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマ
ー及び上流オリゴヌクレオチドプライマーを含有するキ
ットに関する。A third invention of the present invention is a kit for the method for amplifying a nucleic acid of the first invention of the present invention, wherein the kit comprises at least one chimeric oligonucleotide primer and an upstream oligonucleotide primer, respectively. Regarding
【００１６】本発明の第４の発明は、下記工程を包含す
ることを特徴とする標的核酸の検出方法であって；
（ａ）本発明の第１の発明の核酸の増幅方法により、標
的核酸を増幅する工程；および、（ｂ）上記工程により
増幅された標的核酸を検出する工程；を包含する標的核
酸の検出方法に関する。A fourth invention of the present invention is a method for detecting a target nucleic acid, which comprises the following steps:
A method for detecting a target nucleic acid comprising: (a) amplifying a target nucleic acid by the method for amplifying a nucleic acid according to the first invention of the present invention; and (b) detecting the target nucleic acid amplified by the above step. Regarding
【００１７】
［発明の詳細な説明］本明細書においてデオキシリボヌ
クレオチド（本明細書中ではｄＮとも記載する）とは、
糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレ
オチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シ
トシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。
さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデ
オキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチ
ドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記の
デオキシリボヌクレオチドに包含される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In the present specification, deoxyribonucleotide (also referred to as dN in the present specification) means
The sugar moiety refers to a nucleotide composed of D-2-deoxyribose, and examples thereof include those having adenine, cytosine, guanine, and thymine in the base moiety.
Further, deoxyribonucleotide analogs such as deoxyribonucleotide and deoxyinosine nucleotide having a modified base such as 7-deazaguanosine are also included in the above deoxyribonucleotide.
【００１８】本明細書においてリボヌクレオチド（本明
細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボー
スで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分に
アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するもの
が挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾
リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の
酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド
［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載
する］やこの他の誘導体等も含まれる。In the present specification, ribonucleotide (also referred to as N in the present specification) means a nucleotide having a sugar moiety composed of D-ribose, and adenine, cytosine, guanine and uracil are added to the base moiety. The thing which has is mentioned. Further, the ribonucleotide includes a modified ribonucleotide, for example, a modified ribonucleotide in which the oxygen atom of the phosphate group at the α-position is replaced with a sulfur atom [(α-S) ribonucleotide, (α-S) N is also described. Do] and other derivatives.
【００１９】本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、該プライマーの３’末端又は３’末端
側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において
核酸鎖が伸長でき、エンドヌクレアーゼで切断でき、鎖
置換反応を行うことができるものであれば、いずれもが
本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含さ
れる。The chimeric oligonucleotide primer used in the present invention has a ribonucleotide arranged at the 3'end or 3'end of the primer, the nucleic acid chain can be extended in the method of the present invention, and can be cleaved with an endonuclease. Any chimeric oligonucleotide primer of the present invention is included as long as it can carry out a substitution reaction.
【００２０】本明細書において３’末端側とは、核酸、
例えば、プライマーにおいてその中央より３’末端にか
けての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸におい
てその中央より５’末端にかけての部分を指す。In the present specification, the 3'terminal side means a nucleic acid,
For example, it refers to the part from the center to the 3'end in the primer. Similarly, the 5′-terminal side refers to the portion from the center to the 5′-end in the nucleic acid.
【００２１】本明細書において上流位置とは、本発明の
方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの
５’末端よりもさらに５’側の任意の位置を言う。従っ
て、キメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリン
グする鋳型となる核酸鎖から見ると該プライマーのアニ
ーリング位置よりも３’側の任意の位置である。[0021] In the present specification, the upstream position refers to an arbitrary position further 5'to the 5'end of the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention. Therefore, when viewed from the nucleic acid chain serving as the template to which the chimeric oligonucleotide primer anneals, it is located at an arbitrary position 3'to the annealing position of the primer.
【００２２】本明細書においてエンドヌクレアーゼと
は、鋳型核酸にアニーリングした上記キメラオリゴヌク
レオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した
二本鎖ＤＮＡに作用して、該プライマーのリボヌクレオ
チド部分を特異的に切断するものであればよい。In the present specification, the endonuclease acts on the double-stranded DNA generated by extending the DNA from the above chimeric oligonucleotide primer annealed to the template nucleic acid to specifically bind the ribonucleotide portion of the primer. Anything can be cut.
【００２３】本明細書においてＤＮＡポリメラーゼと
は、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵
素のことを言い、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前
記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素とし
ては、例えば鎖置換(Strand displacement)活性を有す
るＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活
性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラ
ーゼが挙げられる。In the present specification, the DNA polymerase refers to an enzyme that synthesizes a new DNA chain using the DNA chain as a template, and includes not only a natural DNA polymerase but also a mutant enzyme having the above activity. Examples of the enzyme include a DNA polymerase having a strand displacement activity, a DNA polymerase having no 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity, and a DNA polymerase having both a reverse transcriptase activity and an endonuclease activity.
【００２４】本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳
型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ
鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングして
いる相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displac
ement）することができる活性のことをいう。また、本
明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列か
ら遊離したＤＮＡ鎖のことを「置換鎖」と称する。As used herein, the term "strand displacement activity" refers to DNA used when DNA replication is carried out according to a nucleic acid sequence serving as a template.
Progressing while displacing the strands, the complementary strands annealed to the template strand are released, that is, strand displacement (strand displac
ement) refers to the activity that can be done. Further, in the present specification, a DNA strand released from a nucleic acid sequence serving as a template by strand displacement is referred to as a “displacement strand”.
【００２５】以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプラ
イマー
本発明の方法において使用されるプライマーは、少なく
ともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナロ
グから選択されるものとリボヌクレオチドを含有するキ
メラオリゴヌクレオチドプライマーである。該プライマ
ーには未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボ
ヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプライ
マーも含まれる。The present invention will be described in detail below. (1) Chimeric oligonucleotide primer used in the present invention The primer used in the method of the present invention is a chimeric oligonucleotide primer containing at least one selected from deoxyribonucleotides and nucleotide analogs and a ribonucleotide. The primers also include oligoribonucleotide primers containing unmodified ribonucleotides and / or modified ribonucleotides.
【００２６】本発明の方法において使用されるキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の
一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、使用される条
件において、ＤＮＡ鎖の伸長に寄与することができ、さ
らに、その３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチド
が配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであ
る。当該プライマーは通常、増幅しようとする領域の上
流、すなわち鋳型核酸上の増幅しようとする領域に対応
する塩基配列の３’側部分に相補的に設計される。な
お、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用さ
れる反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング
可能な塩基配列を意味する。The chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention has a base sequence that is substantially complementary to a part of the base sequence of the template nucleic acid, and contributes to the extension of the DNA chain under the conditions used. Furthermore, the chimeric oligonucleotide primer has a ribonucleotide arranged at the 3'end or the 3'end side thereof. The primer is usually designed to be complementary to the upstream of the region to be amplified, that is, the 3'side portion of the base sequence corresponding to the region to be amplified on the template nucleic acid. The term "substantially complementary base sequence" as used herein means a base sequence that can anneal to the template DNA under the reaction conditions used.
【００２７】本発明の方法において使用されるキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーは１以上の修飾リボヌクレ
オチドを含有するものであってもよい。即ち、本明細書
においてリボヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、エ
ンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるもので
あれば、未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リ
ボヌクレオチドのいずれであってもよく、そのような未
修飾あるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含さ
れる。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプ
ライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で
未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用
することができ、さらにこれらを組合せて使用すること
ができる。このような修飾リボヌクレオチドとしては、
特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基に結
合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）リボ
ヌクレオチドや、リボースの２位の水酸基がメトキシ基
に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。このよう
な修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレ
オチドプライマーは、例えば、米国特許第５，００３，
０９７号記載の硫化反応試薬（グレンリサーチ社製）を
用いた方法で調製した（α−Ｓ）リボヌクレオチド３リ
ン酸、あるいは２−ＯＭｅ−ＲＮＡ−ＣＥ ホスホアミ
ダイド試薬（グレンリサーチ社製）を用いて作製するこ
とができる。The chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention may contain one or more modified ribonucleotides. That is, in the present specification, a ribonucleotide is an unmodified ribonucleotide and / or a modified ribonucleotide as long as it is arranged at the 3 ′ end or 3 ′ end of a chimeric oligonucleotide primer and can be recognized or cleaved by an endonuclease. And any such unmodified or modified ribonucleotides are included. That is, unmodified ribonucleotides and modified ribonucleotides can be used in the chimeric oligonucleotide primer of the present invention as long as the function of the primer is not lost, and these can be used in combination. Such modified ribonucleotides include
Although not particularly limited, for example, a (α-S) ribonucleotide in which an oxygen atom bonded to a phosphate group is substituted with a sulfur atom, or a ribonucleotide in which the hydroxyl group at the 2-position of ribose is substituted with a methoxy group is used. Can be mentioned. Chimeric oligonucleotide primers containing such modified ribonucleotides are described, for example, in US Pat. No. 5,003,003.
(Α-S) ribonucleotide triphosphate prepared by a method using the sulfurization reaction reagent described in No. 097 (manufactured by Glen Research) or 2-OMe-RNA-CE phosphoamidide reagent (manufactured by Glen Research). Can be made.
【００２８】また、エンドヌクレアーゼによる切断に耐
性を付与するような性質の修飾リボヌクレオチドを含有
し、本発明の増幅方法に使用できるキメラオリゴヌクレ
オチドプライマーを設計してもよく、この様なプライマ
ーは、増幅反応工程におけるエンドヌクレアーゼの切断
位置を制御し得る点において有用である。本発明の方法
で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、増
幅後のＤＮＡ断片を一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形
態で得たいかによって１種類もしくは２種類を使い分け
ることができる。すなわち、一本鎖ＤＮＡが望まれる場
合には１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー
を、また、二本鎖が望まれる場合には２種類のプライマ
ーが使用される。A chimeric oligonucleotide primer containing a modified ribonucleotide having a property of imparting resistance to cleavage by an endonuclease and usable in the amplification method of the present invention may be designed. It is useful in that the endonuclease cleavage position in the amplification reaction step can be controlled. As the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention, one kind or two kinds can be selectively used depending on whether it is desired to obtain the amplified DNA fragment in a single-stranded form or a double-stranded form. That is, one type of chimeric oligonucleotide primer is used when single-stranded DNA is desired, and two types of primers are used when double-stranded is desired.
【００２９】本発明の方法において使用されるキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーは、特に限定するものでは
ないが、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド
の長さのものが好ましい。さらに好ましくは、約１５ヌ
クレオチドから約４０ヌクレオチドの長さのプライマー
である。その塩基配列は使用される反応条件において鋳
型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に
相補的な配列であることが好ましい。該プライマーは、
後に示す段階で使用されるエンドヌクレアーゼにより認
識される配列を３’末端又は３’末端側に含む。The chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention is not particularly limited, but preferably has a length of about 12 nucleotides to about 100 nucleotides. More preferably, it is a primer having a length of about 15 nucleotides to about 40 nucleotides. The base sequence is preferably a sequence substantially complementary to the template nucleic acid so as to anneal to the template nucleic acid under the reaction conditions used. The primer is
The sequence recognized by the endonuclease used in the step described later is included at the 3'end or the 3'end.
【００３０】本発明を何ら限定するものではないが、例
えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチド
を本発明のＤＮＡ合成方法にプライマーとして使用する
ことができる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０また
は１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び
／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオ
チド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの
部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよく、３’末
端のヌクレオチドは当該末端からのＤＮＡポリメラーゼ
による伸長が起こらないような修飾を有していてもよ
い）
例えば、上記一般式においてａ＝１１以上の任意の整数
で、ｂ＝１、ｃ＝０のキメラオリゴヌクレオチドプライ
マー、ｂ＝２、ｃ＝０のキメラオリゴヌクレオチドプラ
イマー、ｂ＝３〜５、ｃ＝０のキメラオリゴヌクレオチ
ドプライマー、さらにｂ＝２、ｃ＝０〜５のキメラオリ
ゴヌクレオチドプライマー等がいずれも本発明に好適に
使用できる。即ち、本発明の方法に用いるキメラオリゴ
ヌクレオチドプライマーの３'末端又は３'末端側のリボ
ヌクレオチドの長さは、好ましくは１ｍｅｒ〜１５ｍｅ
ｒ、さらに好ましくは、１ｍｅｒ〜１０ｍｅｒ、特に好
ましくは１ｍｅｒ〜５ｍｅｒである。また、上記一般式
中のｃの数は、特に限定はなく、本発明の方法に使用で
きる数を選択すればよいが、通常５以下が好適であり、
４、３、２、１、の順に反応結果が良く、特にｃ＝０の
場合が最も反応効率がよい。Although the present invention is not limited thereto, for example, an oligonucleotide having a structure represented by the following general formula can be used as a primer in the DNA synthesis method of the present invention. General formula: 5'-dNa-Nb-dNc-3 '(a: an integer of 11 or more, an integer of b: 1 or more, c: 0 or an integer of 1 or more, dN: deoxyribonucleotide and / or nucleotide analog, N: Unmodified ribonucleotides and / or modified ribonucleotides, and dN at a part of the site of dNa may be replaced with N, so that the nucleotide at the 3'end does not cause extension by DNA polymerase from the end. It may have modification) For example, in the above general formula, a = 11 or more arbitrary integer, b = 1, c = 0 chimeric oligonucleotide primer, b = 2, c = 0 chimeric oligonucleotide primer , B = 3-5, c = 0 chimeric oligonucleotide primer, further b = 2, c = 0-5 chimeric oligonucleotide primer, etc. Both can be preferably used in the present invention. That is, the length of the ribonucleotide at the 3 ′ end or 3 ′ end of the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention is preferably 1 mer to 15 me.
r, more preferably 1 mer to 10 mer, particularly preferably 1 mer to 5 mer. Further, the number of c in the above general formula is not particularly limited and may be selected so that it can be used in the method of the present invention, but usually 5 or less is preferable,
The reaction results were good in the order of 4, 3, 2, 1, and particularly when c = 0, the reaction efficiency was the best.
【００３１】本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオ
チドプライマーは、該プライマーよりＤＮＡポリメラー
ゼで伸長されたＤＮＡ鎖（プライマー伸長鎖）に含まれ
るリボヌクレオチド含有部位がエンドヌクレアーゼで認
識あるいは切断されるような構造を有しており、当該リ
ボヌクレオチドはその３’末端又は３’末端側に配置さ
れている。本発明を特に限定するものではないが、例え
ば、鋳型核酸にアニーリングした、上記の一般式で表さ
れるキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの
伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡにＲＮａｓｅＨを作
用させた場合には、上記キメラオリゴヌクレオチドプラ
イマーのリボヌクレオチド部分が切断され、上記オリゴ
ヌクレオチドプライマーと伸長により合成されたＤＮＡ
鎖の間にニックの入った二本鎖ＤＮＡが生じる。さら
に、該ニックの入った部位からＤＮＡポリメラーゼによ
り鎖置換反応がおこる。従って、プライマーの３’末端
から核酸鎖を伸長させることができ、エンドヌクレアー
ゼにより切断されることができ、そしてＤＮＡポリメラ
ーゼにより鎖置換反応ができるキメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーは全て本発明の方法に使用することができ
る。さらに、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライ
マーには、その３’末端がＤＮＡポリメラーゼによる伸
長が不可能な形に修飾されており、エンドヌクレアーゼ
による切断によって生じた３’末端からＤＮＡの伸長が
行われるものが包含される。The chimeric oligonucleotide primer used in the present invention has a structure in which a ribonucleotide-containing site contained in a DNA chain (primer extended chain) extended by a DNA polymerase from the primer is recognized or cleaved by an endonuclease. And the ribonucleotide is located at the 3'end or the 3'end. Although the present invention is not particularly limited, for example, RNase H was allowed to act on double-stranded DNA produced by extending DNA from a chimeric oligonucleotide primer represented by the above general formula, which was annealed to a template nucleic acid. In this case, the ribonucleotide portion of the chimeric oligonucleotide primer is cleaved, and the DNA is synthesized by extension with the oligonucleotide primer.
Double-stranded DNA with nicks between the strands results. Furthermore, a strand displacement reaction is caused by a DNA polymerase from the site containing the nick. Therefore, any chimeric oligonucleotide primer capable of extending a nucleic acid chain from the 3'end of the primer, cleaving with an endonuclease, and undergoing a strand displacement reaction with a DNA polymerase can be used in the method of the present invention. You can Furthermore, the chimeric oligonucleotide primer of the present invention has its 3'end modified so that it cannot be extended by a DNA polymerase, and DNA is extended from the 3'end generated by cleavage with an endonuclease. Is included.
【００３２】また、上記キメラオリゴヌクレオチドプラ
イマーの５’末端側には、ＲＮＡポリメラーゼのプロモ
ーター配列を含んでいてもよい。該ＲＮＡポリメラーゼ
としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼあるいはＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼが例示される。The 5'-terminal side of the chimeric oligonucleotide primer may contain an RNA polymerase promoter sequence. Examples of the RNA polymerase include T7 RNA polymerase or SP6
An example is RNA polymerase.
【００３３】さらに本発明の方法において使用されるキ
メラオリゴヌクレオチドプライマーはヌクレオチドアナ
ログやその他の物質を含有するものであってもよい。即
ち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに
は、ＤＮＡポリメラーゼがその３’末端からポリメラー
ゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲
で１以上のヌクレオチドアナログを含有させることがで
き、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類の
ものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチド
アナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デ
オキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレ
オチドあるいは７−デアザグアニンのような修飾塩基を
有するヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有す
るヌクレオチドアナログ等を使用することができる。ま
た、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、
上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、例えば標識
化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボ
ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよ
い。Further, the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention may contain a nucleotide analog or other substance. That is, the chimeric oligonucleotide primer of the present invention may contain one or more nucleotide analogs within the range in which the DNA polymerase causes a polymerase extension reaction from its 3 ′ end and does not lose the function of the primer. Can be used by combining a plurality of types. The nucleotide analog is not particularly limited, but for example, deoxyinosine nucleotide, deoxyuracil nucleotide, nucleotide analog having a modified base such as 7-deazaguanine, nucleotide analog having a derivative of ribose, and the like can be used. Further, the chimeric oligonucleotide used in the present invention is
It may contain deoxynucleotides, ribonucleotides, and nucleotide analogs to which various modifications have been made, for example, addition of labeling compounds and the like, within the range in which the above functions are retained.
【００３４】ヌクレオチドアナログのプライマーへの導
入は、プライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型との
アニーリング形成の安定化の観点からも有効である。さ
らに、同様の目的でリボヌクレオチドをプライマーに導
入しても良い。特に限定するものではないが、非特異的
なエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）によるプライマー
の分解を防ぐ観点からは、例えば、（α―Ｓ）リボヌク
レオチドのような修飾リボヌクレオチドが好適に使用で
きる。The introduction of the nucleotide analog into the primer is also effective from the viewpoint of suppressing the formation of higher-order structure of the primer itself and stabilizing the formation of annealing with the template. Furthermore, ribonucleotides may be introduced into the primer for the same purpose. Although not particularly limited, modified ribonucleotides such as (α-S) ribonucleotides can be preferably used from the viewpoint of preventing degradation of the primer by a non-specific endonuclease (RNase).
【００３５】これらのキメラオリゴヌクレオチドプライ
マーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライ
ド バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Applied Biosyste
ms Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、
ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法とし
てリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホ
スホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたも
のであっても良い。These chimeric oligonucleotide primers have, for example, Applied Biosystems (ABI, Applied Biosyste) so as to have an arbitrary nucleic acid sequence.
ms Synthesizer DNA Synthesizer Model 394,
It can be synthesized by the phosphoamidite method. Further, as another method, there are a phosphoric acid triester method, an H-phosphonate method, a thiophosphonate method and the like, but those synthesized by any method may be used.
【００３６】（２）本発明に使用する上流オリゴヌクレ
オチドプライマー
本発明の方法において使用される上流オリゴヌクレオチ
ドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド
又はヌクレオチドアナログから選択されるものが好適に
使用できる。(2) Upstream oligonucleotide primer used in the present invention As the upstream oligonucleotide primer used in the method of the present invention, at least one selected from deoxyribonucleotides or nucleotide analogs can be preferably used.
【００３７】本発明の方法において使用される上流オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配
列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、該鋳型と
なる核酸上の上記（１）のキメラオリゴヌクレオチドプ
ライマーのアニーリング位置のさらに３’側の領域にア
ニーリングできるものが好適に使用できる。また、上流
オリゴヌクレオチドプライマーは、使用される条件にお
いて、ＤＮＡ鎖の伸長に寄与することができるものであ
れば特に限定はされない。当該プライマーは通常、増幅
しようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅し
ようとする領域に対応する塩基配列の３’側部分に相補
的に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基
配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤ
ＮＡにアニーリング可能な塩基配列を意味する。The upstream oligonucleotide primer used in the method of the present invention has a base sequence that is substantially complementary to a part of the base sequence of the nucleic acid that serves as a template, and the above-mentioned (1 Those which can anneal to the region further 3'to the annealing position of the chimeric oligonucleotide primer of 3) can be preferably used. The upstream oligonucleotide primer is not particularly limited as long as it can contribute to the extension of the DNA chain under the conditions used. The primer is usually designed to be complementary to the upstream of the region to be amplified, that is, the 3'side portion of the base sequence corresponding to the region to be amplified on the template nucleic acid. The term "substantially complementary nucleotide sequence" as used herein refers to D that serves as a template under the reaction conditions used.
It means a base sequence that can be annealed to NA.
【００３８】本発明の方法で使用する上流オリゴヌクレ
オチドプライマーは、増幅後のＤＮＡ断片を一本鎖もし
くは二本鎖のいずれの形態で得たいかによって１種類も
しくは２種類を使い分けることができる。すなわち、一
本鎖ＤＮＡが望まれる場合には１種類のキメラオリゴヌ
クレオチドプライマー及び上流オリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用することができる。また、二本鎖が望まれ
る場合にはそれぞれ２種類の上記キメラオリゴヌクレオ
チドプライマー及び上流オリゴヌクレオチドプライマー
を使用することができる。As the upstream oligonucleotide primer used in the method of the present invention, one kind or two kinds can be selectively used depending on whether it is desired to obtain the amplified DNA fragment in a single-stranded form or a double-stranded form. That is, one type of chimeric oligonucleotide primer and upstream oligonucleotide primer can be used when single-stranded DNA is desired. Further, when a double strand is desired, two types of the above chimeric oligonucleotide primer and upstream oligonucleotide primer can be used respectively.
【００３９】本発明の方法で使用する上流オリゴヌクレ
オチドプライマーのアニーリングする鋳型となる核酸上
の位置は、標的核酸の塩基配列、増幅領域の長さ及び組
み合わせるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの標的
核酸へのアニーリング位置によって最も増幅効率が良く
なるような位置であれば特に限定はないが、例えばキメ
ラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端から１塩基
以上、好ましくは２０塩基以上の範囲にその３’末端が
位置するように設定される。The position on the nucleic acid serving as a template for annealing the upstream oligonucleotide primer used in the method of the present invention is determined by the base sequence of the target nucleic acid, the length of the amplification region, and the position of annealing of the chimeric oligonucleotide primer to be combined with the target nucleic acid. There is no particular limitation as long as it is the position where the amplification efficiency is the best, but for example, the 3'end is located within the range of 1 base or more, preferably 20 bases or more from the 5'end of the chimeric oligonucleotide primer. Is set.
【００４０】また、本発明の方法において使用される上
流オリゴヌクレオチドプライマーは、特に限定するもの
ではないが、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオ
チドの長さのものが好ましい。さらに好ましくは、約１
５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さのプライ
マーである。その塩基配列は使用される反応条件におい
て鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核
酸に相補的な配列であることが好ましい。The upstream oligonucleotide primer used in the method of the present invention is not particularly limited, but preferably has a length of about 12 nucleotides to about 100 nucleotides. More preferably, about 1
It is a primer of 5 to about 40 nucleotides in length. The base sequence is preferably a sequence substantially complementary to the template nucleic acid so as to anneal to the template nucleic acid under the reaction conditions used.
【００４１】また、本発明の上流オリゴヌクレオチドプ
ライマーのＧＣ含量は、特に限定はされないが、４０％
以上の範囲が好適である。The GC content of the upstream oligonucleotide primer of the present invention is not particularly limited, but is 40%.
The above range is preferable.
【００４２】さらに本発明の方法において使用される上
流オリゴヌクレオチドプライマーはヌクレオチドアナロ
グやその他の物質を含有するものであってもよい。すな
わち、本発明の上流オリゴヌクレオチドプライマーに
は、ＤＮＡポリメラーゼがその３’末端からポリメラー
ゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲
で１以上のヌクレオチドアナログを含有させることがで
き、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類の
ものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチド
アナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デ
オキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレ
オチドあるいは７−デアザグアニンのような修飾塩基を
有するヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有す
るヌクレオチドアナログ等を使用することができる。ま
た、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、
上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、例えば標識
化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボ
ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよ
い。ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プ
ライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリ
ング形成の安定化の観点からも有効である。Further, the upstream oligonucleotide primer used in the method of the present invention may contain a nucleotide analog or other substance. That is, the upstream oligonucleotide primer of the present invention can contain one or more nucleotide analogs within the range in which the function of the primer that allows the DNA polymerase to carry out a polymerase extension reaction from its 3 ′ end is further included. Can be used by combining a plurality of types. The nucleotide analog is not particularly limited, but for example, deoxyinosine nucleotide, deoxyuracil nucleotide, nucleotide analog having a modified base such as 7-deazaguanine, nucleotide analog having a derivative of ribose, and the like can be used. Further, the chimeric oligonucleotide used in the present invention is
It may contain deoxynucleotides, ribonucleotides, and nucleotide analogs to which various modifications have been made, for example, addition of labeling compounds and the like, within the range in which the above functions are retained. The introduction of the nucleotide analog into the primer is also effective from the viewpoint of suppressing the formation of higher-order structure of the primer itself and stabilizing the formation of annealing with the template.
【００４３】これらの上流オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド
バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Applied Biosystems
Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホ
スホアミダイト法により合成できる。また、別法として
リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホス
ホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたもの
であっても良い。These upstream oligonucleotide primers have, for example, Applied Biosystems (ABI, Applied Biosystems) so as to have an arbitrary nucleic acid sequence.
Inc.) DNA synthesizer type 394, and can be synthesized by the phosphoamidite method. Further, as another method, there are a phosphoric acid triester method, an H-phosphonate method, a thiophosphonate method and the like, but those synthesized by any method may be used.
【００４４】（３）本発明に使用されるエンドヌクレア
ーゼ
本発明に使用されるエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸
にアニーリングした上記（１）に記載のキメラオリゴヌ
クレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成し
た二本鎖ＤＮＡに作用して、鎖置換反応が起こるように
伸長鎖を切断しうるものであればよい。即ち、上記の二
本鎖ＤＮＡのうちのキメラオリゴヌクレオチドプライマ
ー部分にニックを生成しうる酵素である。特に限定され
るものではないが、例えば、本発明にはリボヌクレアー
ゼが使用でき、特にＤＮＡとＲＮＡとから形成された二
本鎖核酸のＲＮＡ部分に作用するエンドリボヌクレアー
ゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）が好適に使用できる。また、該リ
ボヌクレアーゼには、上記作用を有するものであれば、
常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼのいずれもが好適
に本発明に使用できる。例えば、下記実施例に示すよう
に、約５０℃〜約７０℃での反応では大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）由来のＲＮａｓｅＨが本発明の方法に使用するこ
とができる。また、本発明の方法においては、耐熱性の
リボヌクレアーゼも好適に使用できる。該耐熱性リボヌ
クレアーゼとしては、特に限定はされないが、例えば市
販のＨｙｂｒｉｄａｓｅＴＭ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌ
ｅ ＲＮａｓｅＨ（エピセンターテクノロジーズ社製）
の他、好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、サ
ーマス（Ｔｈｅｒｍａｓ）属細菌、ピロコッカス（Ｐｙ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏ
ｔｏｇａ）属細菌、アルカエオグロバス（Ａｒｃｈａｅ
ｏｇｌｏｂｕｓ）属細菌等由来のＲＮａｓｅＨ等も好適
に使用できる。さらに、該リボヌクレアーゼは、天然体
および変異体のいずれもが好適に使用できる。なお、本
願明細書に記載されているＲＮａｓｅＨの酵素単位は、
実施例中の参考例に示した酵素単位測定方法に基づいて
表示された数値である。(3) Endonuclease used in the present invention The endonuclease used in the present invention is produced by extending DNA from the chimeric oligonucleotide primer described in (1) above and annealed to a template nucleic acid. Any substance can be used as long as it can act on double-stranded DNA and cleave the extended strand so that a strand displacement reaction occurs. That is, it is an enzyme capable of generating a nick in the chimeric oligonucleotide primer portion of the above double-stranded DNA. Although not particularly limited, for example, a ribonuclease can be used in the present invention, and endoribonuclease H (RNaseH) that acts on the RNA portion of a double-stranded nucleic acid formed from DNA and RNA is particularly preferably used. . In addition, if the ribonuclease has the above-mentioned action,
Any of room temperature to thermostable ribonuclease can be preferably used in the present invention. For example, as shown in the following Examples, E. coli (E.co.
RNase H from li) can be used in the method of the invention. Further, in the method of the present invention, thermostable ribonuclease can also be preferably used. The thermostable ribonuclease is not particularly limited, but for example, commercially available Hybridase ™ Thermostable
e RNaseH (manufactured by Epicenter Technologies)
In addition, thermophilic Bacillus bacterium, Thermas bacterium, Pyrococcus (Py)
bacterium of the genus rococcus, Thermotoga (Thermo
toca) bacterium, Archaeoglobus (Archae)
RNase H and the like derived from bacteria of the genus Oglobus) can also be preferably used. Further, as the ribonuclease, both a natural form and a mutant can be preferably used. The enzyme unit of RNase H described in the present specification is
It is the numerical value displayed based on the enzyme unit measuring method shown in the reference example in the examples.
【００４５】また、上記ＲＮａｓｅＨは、本発明の方法
に使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、種
々のウイルス、ファージ、原核、真核生物由来のいずれ
であってもよい。さらに、細胞性ＲＮａｓｅＨあるいは
ウイルス性ＲＮａｓｅＨのいずれであってもよい。例え
ば、上記細胞性ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌ＲＮａｓｅ
ＨＩが、ウイルス性ＲＮａｓｅＨとしてはＨＩＶ−１由
来ＲＮａｓｅＨが例示される。本発明の方法においてＲ
ＮａｓｅＨは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型のいずれもが使
用できる。特に限定はされないが、例えば大腸菌由来Ｒ
ＮａｓｅＨＩ、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカ
エオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨＩＩが好適であ
る。The RNase H is not particularly limited as long as it can be used in the method of the present invention, and may be, for example, any of various viruses, phages, prokaryotes and eukaryotes. Further, it may be either cellular RNase H or viral RNase H. For example, the cellular RNase H is E. coli RNase.
Examples of HI and viral RNase H include HIV-1-derived RNase H. In the method of the present invention R
As NaseH, any of type I, type II, and type III can be used. Although not particularly limited, for example, E. coli-derived R
NaseHI and RNaseHII derived from Pyrococcus genus or Alkaeoglobus genus bacterium are preferable.
【００４６】また、本発明の方法に使用するエンドヌク
レアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅＨの切断反応の効率は上
記プライマーの３’末端近傍の塩基配列に左右され、所
望のＤＮＡの増幅効率に影響することが考えられるの
で、使用するＲＮａｓｅＨに最適なプライマーをデザイ
ンすることは当然のことである。The efficiency of the cleavage reaction of the endonuclease used in the method of the present invention, for example, RNaseH, depends on the nucleotide sequence near the 3'end of the above-mentioned primer and may affect the amplification efficiency of the desired DNA. Therefore, it is a matter of course to design an optimal primer for the RNase H to be used.
【００４７】本明細書において使用されている「ニック
を入れる」もしくは「ニッキング」という語は、二本鎖
核酸の一方の鎖の内部を切断することを意味する。たと
えば、ＲＮａｓｅＨはＤＮＡとリボヌクレオチドを含む
ＤＮＡとのハイブリッド二本鎖核酸に作用し、二本鎖の
うちのリボヌクレオチドを含む鎖のリボヌクレオチド部
分を選択的に切断することにより、当該ハイブリッド二
本鎖核酸にニックを入れる。The term "nicking" or "nicking" as used herein means cleaving within one strand of a double-stranded nucleic acid. For example, RNase H acts on a hybrid double-stranded nucleic acid of a DNA and a DNA containing ribonucleotides, and selectively cleaves the ribonucleotide portion of the strand containing ribonucleotides in the double-stranded DNA to form the hybrid double-stranded DNA. Nick the strand nucleic acid.
【００４８】（４）本発明に使用されるＤＮＡポリメラ
ーゼ
本発明には、ＤＮＡの鎖置換（strand displacement）
活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができ
る。また、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
を有しないものが特に好適に使用することができる。本
発明において、「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配
列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えな
がら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊
離させる、即ち鎖置換（strand displacement）するこ
とができる活性のことをいう。また、本明細書において
は、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮ
Ａ鎖のこと「置換鎖」と称する。(4) DNA Polymerase Used in the Present Invention In the present invention, strand displacement of DNA is performed.
An active DNA polymerase can be used. Further, those which do not substantially have 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity can be particularly preferably used. In the present invention, “strand displacement activity” means that, when DNA replication is performed according to a nucleic acid sequence serving as a template, the process proceeds while displacing the DNA strand to release the complementary strand annealed to the template strand, that is, strand displacement (strand displacement). It means the activity that can be displaced. Further, in the present specification, DN released from a nucleic acid sequence serving as a template by strand displacement
The A chain is referred to as a "substituted chain".
【００４９】本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼ
は、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定は
なく、例えば、バチルス カルドテナックス（Bacillus
caldotenax、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス ス
テアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilu
s、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌由
来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を欠失した変異体や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ
と称す）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのラージ フラグ
メント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明
に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性
のいずれのものも好適に使用できる。Ｂ．ｃａは生育至
適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由
来のＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性
（逆転写活性）、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られ
ている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取
得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み
換えタンパク質の何れであっても良い。また、該酵素
は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、
欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良
く、このような酵素の例として、５’→３’エキソヌク
レアーゼ活性を欠損させたＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼ
であるＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社
製）等が挙げられる。The DNA polymerase used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above strand displacement activity, and for example, Bacillus cardotenax (Bacillus).
caldotenax, below, B.I. ca) and Bacillus stearothermophilu
s, hereinafter B. (hereinafter referred to as "st"), a mutant of a DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium, which lacks the 5 '→ 3' exonuclease activity, or Escherichia coli (hereinafter referred to as E. coli).
DNA fragment I derived from DNA polymerase I (Klenow fragment) and the like. As the DNA polymerase that can be used in the present invention, any one from room temperature to heat resistance can be preferably used. B. ca is a thermophilic bacterium having an optimum growth temperature of about 70 ° C., and Bca DNA polymerase derived from this bacterium is a DNA-dependent DNA.
Polymerase activity, RNA-dependent DNA polymerase activity (reverse transcription activity), 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity,
It is known to have 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity. The above-mentioned enzyme may be either one obtained by purifying it from its original source or a recombinant protein produced by genetic engineering. In addition, the enzyme is replaced by genetic engineering or another method,
Modifications such as deletion, addition, and insertion may be added, and examples of such an enzyme include BcaBEST DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), which is a Bca DNA polymerase lacking 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity. Manufactured) and the like.
【００５０】なお、ＤＮＡポリメラーゼの中には、特定
の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、ＲＮａｓｅ
Ｈ活性を有するものが知られている。このようなＤＮＡ
ポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。す
なわち、該ＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発
現されるような条件下、例えばＭｎ2+の存在下で使用す
る態様が挙げられる。該態様においては、上記ＲＮａｓ
ｅＨを添加することなく本発明の方法を実施することが
できる。すなわち、Ｍｎ2+を含有する緩衝液中で上記の
Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼがＲＮａｓｅＨ活性を示す
ことができる。なお、上記の態様はＢｃａ ＤＮＡポリ
メラーゼに限定されるものではなく、ＲＮａｓｅＨ活性
を併せ持つことが知られている公知のＤＮＡポリメラー
ゼ、例えばサーマス サーモフィラス(Thermus thermop
hilus)由来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼも本発明に使
用することができる。It should be noted that some DNA polymerases have endonuclease activity, such as RNase, under specific conditions.
Those having H activity are known. Such DNA
Polymerases can be used in the methods of the invention. That is, there is an embodiment in which the DNA polymerase is used under the condition that RNase H activity is expressed, for example, in the presence of Mn 2+ . In this embodiment, the RNas
The method of the present invention can be carried out without the addition of eH. That is, the above Bca DNA polymerase can exhibit RNase H activity in a buffer containing Mn 2+ . The above embodiment is not limited to Bca DNA polymerase, and known DNA polymerases known to have RNase H activity together, such as Thermus thermopilis.
T. th. DNA polymerase from hilus) can also be used in the present invention.
【００５１】（５）本発明の標的核酸の増幅方法
本発明の方法は、上記（１）に示されたキメラオリゴヌ
クレオチドプライマー及び上記（２）に示された上流オ
リゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ少なくとも１種
類使用し、さらに上記（３）に示されたエンドヌクレア
ーゼおよび上記（４）に示されたＤＮＡポリメラーゼを
組合わせて実施することができる。また、上記のように
ＲＮａｓｅＨ活性を有するＤＮＡポリメラーゼをＲＮａ
ｓｅＨ活性が発現するような条件で使用することができ
る。当該方法では、伸長反応の基質となるヌクレオチド
３リン酸としてＰＣＲ法等に使われるｄＮＴＰ、すなわ
ちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が
好適に使用できる。また、ｄＵＴＰを基質として用いて
もよい。さらに、当該ｄＮＴＰは、使用されるＤＮＡポ
リメラーゼの基質となる限りにおいては、ｄＮＴＰ（デ
オキシリボヌクレオチド３リン酸）のアナログ、たとえ
ば７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ等のヌクレオチド３
リン酸を含んでいてもよい。また、ｄＮＴＰあるいはｄ
ＮＴＰアナログの誘導体を使用してもよく、官能基を有
する誘導体、例えばアミノ基を有するｄＵＴＰを含んで
いてもよい。当該方法では、キメラオリゴヌクレオチド
プライマーを使用するが、当該プライマーは、例えば、
ＤＮＡ合成機等を用いて通常の合成方法と同様に調製す
ることができる。(5) Method for Amplifying Target Nucleic Acid of the Present Invention The method of the present invention comprises at least one kind of the chimeric oligonucleotide primer shown in (1) above and at least one kind of upstream oligonucleotide primer shown in (2) above. Further, the endonuclease shown in (3) above and the DNA polymerase shown in (4) above can be used in combination. In addition, as described above, a DNA polymerase having RNase H activity was
It can be used under the condition that seH activity is expressed. In this method, dNTPs used in the PCR method or the like, that is, a mixture of dATP, dCTP, dGTP and dTTP can be preferably used as the nucleotide triphosphate serving as a substrate for the extension reaction. Also, dUTP may be used as a substrate. Furthermore, the dNTP is an analog of dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate), such as nucleotide 3 such as 7-deaza-dGTP and dITP, as long as it serves as a substrate for the DNA polymerase used.
It may contain phosphoric acid. Also, dNTP or d
Derivatives of NTP analogs may be used and may include functionalized derivatives such as dUTPs having amino groups. In the method, a chimeric oligonucleotide primer is used, and the primer is, for example,
It can be prepared using a DNA synthesizer or the like in the same manner as a usual synthetic method.
【００５２】本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレ
オチドプライマーと上流オリゴヌクレオチドプライマー
の使用量は、標的核酸の塩基配列、目的の増幅断片長及
び使用する反応系組成により調整すれば良く、例えば増
幅産物量を目安に調整することができる。特に限定はさ
れないが、例えばキメラオリゴヌクレオチドプライマ
ー：上流オリゴヌクレオチドプライマーのモル比が、１
００：１．２５〜１００：１０の範囲が好適であり、特
に１００：２．５〜１００：５の範囲が好適に使用でき
る。The amounts of the chimeric oligonucleotide primer and the upstream oligonucleotide primer used in the method of the present invention may be adjusted depending on the base sequence of the target nucleic acid, the length of the target amplified fragment and the composition of the reaction system to be used. Can be adjusted as a guide. Although not particularly limited, for example, the molar ratio of chimeric oligonucleotide primer: upstream oligonucleotide primer is 1
The range of 00: 1.25 to 100: 10 is preferable, and the range of 100: 2.5 to 100: 5 is particularly preferable.
【００５３】本発明の方法においては、使用される酵素
の活性が反応中に低下するおそれのある場合には、反応
の途中で当該酵素をさらに添加することができる。添加
する酵素は、反応開始時に反応液中に含まれる酵素と同
じものでもよいし、同じ作用を示す異なる種類の酵素で
あってもよい。すなわち、反応途中で添加することによ
り、検出感度の向上あるいは増幅産物量の増大等の効果
が得られるならば、添加する酵素の種類及び該酵素の性
質には何ら限定はない。In the method of the present invention, when the activity of the enzyme used may decrease during the reaction, the enzyme can be further added during the reaction. The enzyme to be added may be the same as the enzyme contained in the reaction solution at the start of the reaction, or may be a different type of enzyme having the same action. That is, the kind of enzyme to be added and the property of the enzyme are not particularly limited as long as the effects such as improvement in detection sensitivity or increase in amplification product can be obtained by adding during the reaction.
【００５４】本発明の方法において鋳型となる核酸、す
なわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性の
あるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでも
よい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応
に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に
限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、
尿、糞便、脳脊髄液、***、唾液、組織（例えば、癌組
織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞
培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイ
ロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物の
ような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物
が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、
生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を
含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試
料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸
含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば
細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の
核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを
富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料
中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるい
はＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。The nucleic acid serving as a template in the method of the present invention, that is, DNA or RNA, may be prepared or isolated from any sample that may contain the nucleic acid. Further, the above sample may be directly used in the nucleic acid amplification reaction of the present invention. The sample containing such a nucleic acid is not particularly limited, but for example, whole blood, serum, buffy coat,
Urine, feces, cerebrospinal fluid, semen, saliva, tissues (eg, cancer tissues, lymph nodes, etc.), biological samples such as cell cultures (eg, mammalian cell cultures and bacterial cultures), viroids, Nucleic acid-containing samples such as viruses, bacteria, molds, yeasts, plants and animals, samples that may be contaminated or infected with microorganisms such as viruses or bacteria (food,
Biological preparations), or samples that may contain organisms such as soil and wastewater. Further, it may be a nucleic acid-containing preparation obtained by treating the sample or the like by a known method. As the preparation, for example, a cell lysate, a sample obtained by fractionating the cell lysate, a nucleic acid in the sample, or a specific nucleic acid molecule group, for example, a sample enriched with mRNA can be used in the present invention. Furthermore, a nucleic acid such as DNA or RNA in which the nucleic acid contained in the sample is amplified by a known method can be preferably used.
【００５５】これら材料からの核酸含有調製物の調製に
は特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処
理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレ
ンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの
例においては、さらに操作を加えて核酸を精製すること
が有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在する
とき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール
抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動
または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施され
る。The preparation of the nucleic acid-containing preparation from these materials is not particularly limited, and may be carried out, for example, by dissolution treatment with a surfactant, ultrasonic treatment, shaking stirring using glass beads, use of French press and the like. it can. In some instances, it may be advantageous to perform further manipulations to purify the nucleic acid (eg, when an endogenous nuclease is present). In these examples, nucleic acid purification is carried out by known methods such as phenol extraction, chromatography, ion exchange, gel electrophoresis or density gradient centrifugation.
【００５６】ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅した
い場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によっ
て合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施
すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮ
Ａには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能
なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの
他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、
あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。When it is desired to amplify a nucleic acid having a sequence derived from RNA, the method of the present invention may be carried out using a cDNA synthesized by a reverse transcription reaction using the RNA as a template. RN applicable to the method of the present invention
A is not particularly limited as long as a primer used in the reverse transcription reaction can be prepared, and in addition to total RNA in a sample, a group of RNA molecules such as mRNA, tRNA, and rRNA,
Alternatively, a specific RNA molecular species may be mentioned.
【００５７】上記の逆転写反応に使用されるプライマー
は、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニール
するものであれば特に限定されるものではない。該プラ
イマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有す
るプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ
（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有す
るプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。
逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを
行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、
更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌク
レオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオ
チド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下
である。さらに、逆転写用プライマーとして、逆転写後
のｃＤＮＡを鋳型とした本発明の核酸増幅法を行う際に
鎖置換反応のためのプライマーとして使用可能な上記
（１）に記載された性質を有するキメラオリゴヌクレオ
チドプライマー、あるいは上記（２）記載の性質を有す
る上流オリゴヌクレオチドプライマーのいずれもが好適
に使用することができる。すなわち、ＲＮＡからの逆転
写反応に使用できるものであれば特に限定はない。The primer used in the above reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it anneals to the template RNA under the reaction conditions used. The primer includes a primer having a base sequence complementary to a specific template RNA (specific primer), and an oligo dT.
It may be a (deoxythymine) primer or a primer having a random sequence (random primer).
The length of the reverse transcription primer is preferably 6 nucleotides or more from the viewpoint of performing specific annealing,
It is more preferably 9 nucleotides or more, preferably 100 nucleotides or less, and more preferably 30 nucleotides or less from the viewpoint of oligonucleotide synthesis. Further, as a reverse transcription primer, a chimera having the property described in (1) above, which can be used as a primer for strand displacement reaction when performing the nucleic acid amplification method of the present invention using the cDNA after reverse transcription as a template. Either the oligonucleotide primer or the upstream oligonucleotide primer having the property described in (2) above can be preferably used. That is, there is no particular limitation as long as it can be used in the reverse transcription reaction from RNA.
【００５８】上記の逆転写反応に使用される酵素として
は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するもの
であれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイル
ス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネ
ズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａ
ｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２
ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられ
る。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラー
ゼを使用することもできる。また、本発明の目的のため
には、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例
えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス属細菌由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、
例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ
が好ましく、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢｃａ ＤＮＡポリメ
ラーゼが好ましい。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラー
ゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、ま
た、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しな
がらｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵
素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲にお
いて天然体、変異体のいずれもが使用できる。The enzyme used for the above-mentioned reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it has cDNA synthesis activity using RNA as a template, and for example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV RTase). , Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase (MMLV RTa
se), Rous-related virus 2 reverse transcriptase (RAV-2
Reverse transcriptase of various origins such as RTase). In addition, a DNA polymerase having a reverse transcription activity can also be used. For the purpose of the present invention, an enzyme having a reverse transcription activity at high temperature is suitable, and for example, a DNA polymerase (Tth
DNA polymerase, etc.), thermophilic Bacillus-derived D
NA polymerase or the like can be used. There is no particular limitation,
For example, a DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium is preferable, and B. st-derived DNA polymerase (Bst
DNA polymerase), and more preferably Bca DNA polymerase. For example, Bca DNA polymerase does not require manganese ion for the reverse transcription reaction and can synthesize cDNA while suppressing the secondary structure formation of template RNA under high temperature conditions. As the enzyme having the above-mentioned reverse transcriptase activity, both a natural form and a mutant form can be used as long as they have the activity.
【００５９】また、別の態様としては、増幅しようとす
る塩基配列を含むＤＮＡあるいはＲＮＡをあらかじめ複
製した後、本発明の方法の鋳型となる核酸として用いて
もよい。該複製の方法としては、特に限定はされない
が、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入し
たベクターで適当な宿主を形質転換させた後、得られた
形質転換体を培養して、上記増幅しようとする塩基配列
を含む核酸断片を挿入したベクターを抽出して使用する
方法が例示される。該ベクターは、宿主内で安定して複
製されるものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ
系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド
系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、
宿主は、使用されるベクターを保持することができるも
のであれば特に限定はなく、例えば、培養が容易な大腸
菌等が例示される。In another embodiment, the DNA or RNA containing the nucleotide sequence to be amplified may be duplicated in advance and then used as a nucleic acid as a template in the method of the present invention. The method of replication is not particularly limited, but a suitable host is transformed with a vector into which a nucleic acid fragment containing a nucleotide sequence to be amplified is inserted, and the obtained transformant is cultured to An example is a method of extracting and using a vector into which a nucleic acid fragment containing a nucleotide sequence to be amplified is inserted. The vector is not particularly limited as long as it can be stably replicated in the host, and for example, pUC
Any of the system, pBluescript system, pGEM system, cosmid system, and phage system can be preferably used. Also,
The host is not particularly limited as long as it can hold the vector used, and examples thereof include Escherichia coli and the like, which are easy to culture.
【００６０】さらに、上記複製の方法の別の態様として
は、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を鋳型と
してＲＮＡポリメラーゼで該塩基配列を有するＲＮＡを
転写した後、該ＲＮＡをそのまま、あるいは逆転写反応
によりｃＤＮＡとして本発明の方法の鋳型に用いてもよ
い。上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片は
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有していれば
特に限定はなく、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列を有するベクターに挿入されたものでもよいし、末端
にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するアダ
プターあるいはカセットをライゲーションさせたもので
もよいし、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有
するプライマーと適切な鋳型を用いて酵素的に合成した
ものであってもよい。すなわち、上記の増幅しようとす
る塩基配列を含む核酸断片を、上記のように配置された
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を用いて、ＲＮ
Ａの形で複製、増幅することができる。上記ベクター
は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するも
のであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファー
ジ系のいずれもが好適に使用できる。また、該ベクター
は、環状のままあるいは直鎖状に処理したもののいずれ
もが好適に使用できる。さらに、上記の複製、増幅方法
に用いられるＲＮＡポリメラーゼは特に限定はなく、例
えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリ
メラーゼあるいはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ等が好適に
使用できる。In another embodiment of the above-mentioned replication method, RNA having the base sequence is transcribed with RNA polymerase using a nucleic acid fragment containing the base sequence to be amplified as a template, and then the RNA is used as it is or in reverse. It may be used as a template for the method of the present invention as cDNA by a transcription reaction. The nucleic acid fragment containing the base sequence to be amplified is not particularly limited as long as it has a promoter sequence of RNA polymerase, and may be inserted into a vector having a promoter sequence of RNA polymerase, or RNA polymerase at the end. It may be ligated with an adapter or cassette having the promoter sequence of, or may be enzymatically synthesized using a primer having the promoter sequence of RNA polymerase and an appropriate template. That is, a nucleic acid fragment containing the above-mentioned base sequence to be amplified is subjected to RN using the RNA polymerase promoter sequence arranged as described above.
It can be duplicated and amplified in the form A. The above-mentioned vector is not particularly limited as long as it has a promoter sequence of RNA polymerase, and examples thereof include pUC system and pBI.
Any of the uescript system, pGEM system, cosmid system and phage system can be preferably used. Further, as the vector, any of the vector which has been treated in a circular form or a linear form can be preferably used. Furthermore, the RNA polymerase used in the above-mentioned replication and amplification method is not particularly limited, and for example, SP6 RNA polymerase, T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase and the like can be preferably used.
【００６１】上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰ
ＣＲフラグメントのような二本鎖ＤＮＡ、および全ＲＮ
Ａ若しくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮ
Ａのような一本鎖ＤＮＡのいずれもが本発明において鋳
型ＤＮＡとして好適に使用できる。上記二本鎖ＤＮＡの
場合は、一本鎖ＤＮＡに変性する工程（デネーチャー）
を施したもの及び変性する工程を施さないもののいずれ
もが好適に使用できる。Genomic DNA and P isolated by the above method
Double-stranded DNA such as CR fragment, and total RN
CDNA prepared by reverse transcription from A or mRNA
Any single-stranded DNA such as A can be suitably used as the template DNA in the present invention. In the case of the above double-stranded DNA, a step of denaturing it into single-stranded DNA (denature)
Both of those subjected to the treatment and those not subjected to the modification step can be preferably used.
【００６２】また、鋳型がＰＣＲ増幅産物のような直鎖
状２本鎖ＤＮＡにおいては、本発明の方法に用いるプラ
イマーがアニーリングする位置を、該ＤＮＡの末端から
約５０塩基程度内側に設定することにより、前述のデネ
ーチャーの工程を行わなくても本発明の核酸の増幅方法
を行うことができる場合がある。ＲＮＡ由来の配列を有
する核酸の増幅を目的とする場合には、ＲＮＡを鋳型と
した逆転写反応によって得られたＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本
鎖核酸を、ＲＮａｓｅＨを含有する本発明の増幅用反応
液に加えることにより、ＲＮＡ鎖を分解して一本鎖ｃＤ
ＮＡとし増幅反応を開始することができる。さらに、本
発明のＤＮＡの合成方法に逆転写酵素活性と鎖置換活性
とを有するＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、
ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応と、当該反応によって生
成したｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡ増幅反応とを１種類
のＤＮＡポリメラーゼで行なうことができる。When the template is a linear double-stranded DNA such as a PCR amplification product, the position at which the primer used in the method of the present invention anneals is set within about 50 bases from the end of the DNA. In some cases, the nucleic acid amplification method of the present invention can be performed without the above-mentioned denaturing step. When the purpose is to amplify a nucleic acid having a sequence derived from RNA, an RNA-cDNA double-stranded nucleic acid obtained by a reverse transcription reaction using RNA as a template is added to an amplification reaction solution of the present invention containing RNaseH. By adding, the RNA chain is decomposed and single-stranded cD
The amplification reaction can be started with NA. Furthermore, by using a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity and a strand displacement activity in the DNA synthesis method of the present invention,
The reverse transcription reaction using RNA as a template and the DNA amplification reaction using the cDNA generated by the reaction as a template can be performed with one type of DNA polymerase.
【００６３】上記鋳型の長さは、標的配列がその断片中
に完全に含まれるか、または標的配列の十分な部分が少
なくとも断片中に存在することにより、プライマー配列
の十分な結合を提供するようなものがよい。The length of the template is such that the target sequence is fully contained in the fragment, or that a sufficient portion of the target sequence is present in at least the fragment to provide sufficient binding of the primer sequence. Something good.
【００６４】本発明の方法では、特に限定するものでは
ないが、鋳型ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合にはそれらを
変性して一本鎖にすることにより鋳型ＤＮＡ鎖へのプラ
イマーの結合を可能にさせることができる。二本鎖ＤＮ
Ａが変性する温度、例えば約９５℃で保持することは好
ましい変性法である。他の方法はｐＨの上昇を含むが、
オリゴヌクレオチドプライマーを標的物に結合させるた
めには、増幅反応時にｐＨを低下させる必要がある。上
記のような二本鎖を一本鎖ＤＮＡに変性する工程、もし
くは、鋳型がＲＮＡの場合、逆転写反応によりｃＤＮＡ
（一本鎖ＤＮＡ）を調製する工程の後、等温条件下にお
いて、連続的に核酸が増幅される。ここで、「連続的
に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応
が進行していることを意味する。また、本明細書におい
て「等温」とは、酵素および核酸鎖が上記各工程におい
て機能する、実質的に一定の温度条件のことを意味す
る。In the method of the present invention, although not particularly limited, when the template DNA is a double-stranded DNA, it is possible to bind the primer to the template DNA strand by denaturing them into single strands. You can Double-stranded DN
Holding at the temperature at which A denatures, eg about 95 ° C., is the preferred denaturing method. Other methods include raising the pH,
In order to bind the oligonucleotide primer to the target substance, it is necessary to lower the pH during the amplification reaction. CDNA for denaturing double-stranded DNA into single-stranded DNA as described above, or by reverse transcription when the template is RNA
After the step of preparing (single-stranded DNA), the nucleic acid is continuously amplified under isothermal conditions. Here, "continuously" means that the reaction is proceeding without changing the reaction temperature and the composition of the reaction solution. Further, in the present specification, “isothermal” means a substantially constant temperature condition in which the enzyme and the nucleic acid chain function in each of the above steps.
【００６５】本発明の核酸増幅反応は、例えば、クレノ
ウ断片のような常温性ＤＮＡポリメラーゼを使用するこ
とにより常温（例えば３７℃）でも実施できるが、耐熱
性を有する酵素（エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラ
ーゼ）を使用して高温、例えば５０℃以上で、さらに例
えば６０℃以上で実施することができる。この場合、プ
ライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、ＤＮＡ
増幅の特異性が向上し、また鋳型ＤＮＡの二次構造が解
消されることによりＤＮＡポリメラーゼの伸長性も向上
する。さらに該方法においては、逆転写反応および核酸
の増幅を連続して行なう態様も可能であり、上記反応に
逆転写酵素を組み合わせて、あるいは逆転写活性を有す
るＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡ由来の配列を
有するＤＮＡを増幅することができる。The nucleic acid amplification reaction of the present invention can be carried out at room temperature (for example, 37 ° C.) by using a room temperature DNA polymerase such as Klenow fragment, but an enzyme having heat resistance (endonuclease, DNA polymerase) Can be used at elevated temperatures, eg above 50 ° C., and even above eg 60 ° C. In this case, non-specific annealing of the primer is suppressed and the DNA
The amplification specificity is improved, and the secondary structure of the template DNA is eliminated, so that the elongation of the DNA polymerase is also improved. Further, in this method, an embodiment in which the reverse transcription reaction and the amplification of the nucleic acid are carried out continuously is also possible, and RNA derived from RNA can be obtained by combining the above reaction with a reverse transcriptase or using a DNA polymerase having a reverse transcription activity. DNA having the sequence can be amplified.
【００６６】本発明を特に限定するものではないが、本
発明の各態様において、好ましくは、まず一本鎖の鋳型
ＤＮＡに該ＤＮＡに相補的なキメラオリゴヌクレオチド
プライマー及び上流オリゴヌクレオチドプライマーをア
ニーリングさせる。次に鎖置換活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼの作用により、当該キメラオリゴヌクレオチド
プライマー及び上流オリゴヌクレオチドプライマーの
３’末端より鋳型ＤＮＡの残りの配列に沿って鋳型ＤＮ
Ａに相補的なＤＮＡ（プライマー伸長鎖）を伸長させ
る。その際、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの伸
長鎖は、上流オリゴヌクレオチドプライマーからの伸長
鎖によって鎖置換される。また、エンドヌクレアーゼ
は、キメラオリゴヌクレオチドプライマーからの伸長鎖
とその相補的な鋳型の二本鎖ＤＮＡに作用してプライマ
ー伸長鎖のプライマー部分からの新たなＤＮＡの伸長を
開始させる。すなわち、本発明の方法においては、鎖置
換反応の起点が少なくとも２カ所生じることになる。こ
のため、本発明の方法の反応初期段階において非直線的
な増幅をするキメラオリゴヌクレオチドプライマーのア
ニーリングするための鋳型が増幅される。この初期増幅
反応により本発明の方法は、安定的に増幅効率が向上す
る。すなわち、標的核酸の検出感度が向上することにな
る。Although the present invention is not particularly limited, in each embodiment of the present invention, preferably, a single-stranded template DNA is first annealed with a chimeric oligonucleotide primer and an upstream oligonucleotide primer complementary to the DNA. . Then, by the action of the DNA polymerase having strand displacement activity, the template DN is transferred from the 3'end of the chimeric oligonucleotide primer and the upstream oligonucleotide primer along the remaining sequence of the template DNA.
A DNA complementary to A (primer extended chain) is extended. The extended strand of the chimeric oligonucleotide primer is then strand-displaced by the extended strand from the upstream oligonucleotide primer. In addition, the endonuclease acts on the extended strand from the chimeric oligonucleotide primer and the double-stranded DNA of the template complementary thereto to initiate extension of new DNA from the primer portion of the primer extended strand. That is, in the method of the present invention, at least two starting points of the strand displacement reaction occur. Therefore, the template for annealing the chimeric oligonucleotide primer that undergoes non-linear amplification is amplified in the initial stage of the reaction of the method of the present invention. This initial amplification reaction allows the method of the present invention to stably improve the amplification efficiency. That is, the detection sensitivity of the target nucleic acid is improved.
【００６７】本発明の一つの態様においては、エンドヌ
クレアーゼは上記の二本鎖ＤＮＡにニックを入れるニッ
キング酵素として作用するか、あるいはキメラオリゴヌ
クレオチドプライマーと鋳型ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ構造
を変化させるが、本願発明は理論によって限定はされな
い。さらに、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼが
ニックの入った二本鎖ＤＮＡのニックの３’末端からＤ
ＮＡ鎖を再伸長して新たなプライマー伸長鎖を生成し、
同時にニックの３’末端から下流のＤＮＡを遊離させ
る。こうして先に合成されたプライマー伸長鎖が新たな
プライマー伸長鎖に置換される。In one embodiment of the present invention, the endonuclease acts as a nicking enzyme that nicks the above double-stranded DNA, or changes the double-stranded DNA structure of the chimeric oligonucleotide primer and the template DNA. The present invention is not limited by theory. Furthermore, a DNA polymerase having strand displacement activity is added to the nick at the 3'end of the nick of the double-stranded DNA.
Re-extend the NA strand to generate a new primer extended strand,
At the same time, the DNA downstream from the 3'end of the nick is released. In this way, the primer extension chain synthesized previously is replaced with a new primer extension chain.
【００６８】本発明の核酸増幅方法は、鋳型核酸に相補
的なキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流オリ
ゴヌクレオチドプライマーと、置換鎖に相補的なもう１
種のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び上流オリ
ゴヌクレオチドプライマーの２組のプライマーを使用し
て実施することができる。この場合、２本鎖ＤＮＡにま
ずキメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリング
してそれぞれの相補鎖を合成し、さらにそれぞれの相補
鎖に上流オリゴヌクレオチドプライマーがアニーリング
してＤＮＡ伸長反応を起し、キメラオリゴヌクレオチド
プライマーの伸長鎖を鎖置換していくと考えられる。ま
た、この伸長反応においては、鋳型交換反応も並行して
進むと考えられる。この態様を使用すると、各反応産物
が他のプライマーのための鋳型として機能できることは
明らかである。このように鋳型量が増加することによ
り、非直線的に増幅産物が増加していく。The nucleic acid amplification method of the present invention comprises a chimeric oligonucleotide primer and an upstream oligonucleotide primer which are complementary to a template nucleic acid, and another chimeric oligonucleotide primer which is complementary to a substituted strand.
It can be carried out using two sets of primers, a chimeric oligonucleotide primer and an upstream oligonucleotide primer. In this case, the chimeric oligonucleotide primer is first annealed to the double-stranded DNA to synthesize each complementary strand, and the upstream oligonucleotide primer is further annealed to each complementary strand to cause a DNA extension reaction. It is considered that the strands of the extended chain of are replaced. Further, in this extension reaction, it is considered that the template exchange reaction also proceeds in parallel. Using this embodiment, it is clear that each reaction product can serve as a template for other primers. By increasing the amount of template in this way, the amplification products increase non-linearly.
【００６９】二本鎖ＤＮＡを鋳型に用いて本発明の核酸
増幅方法を実施する場合には、二本鎖のそれぞれにアニ
ーリングするキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び
上流オリゴヌクレオチドプライマーを使用することによ
り、両方の鎖を増幅反応の鋳型とすることができる。二
本鎖ＤＮＡを鋳型に反応を開始する場合には、キメラオ
リゴヌクレオチドプライマー、４種のデオキシリボヌク
レオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼお
よびエンドヌクレアーゼを反応液に添加する。熱処理に
より二本鎖ＤＮＡを変性し、かつ耐熱性の酵素を使用し
ない場合には、変性後に酵素を添加することが好まし
い。When the nucleic acid amplification method of the present invention is carried out using double-stranded DNA as a template, by using a chimeric oligonucleotide primer and an upstream oligonucleotide primer that anneal to each double-stranded DNA, both The strand can serve as a template for the amplification reaction. When the reaction is initiated using double-stranded DNA as a template, a chimeric oligonucleotide primer, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP), DNA polymerase and endonuclease are added to the reaction solution. When the double-stranded DNA is denatured by heat treatment and a thermostable enzyme is not used, it is preferable to add the enzyme after the denaturation.
【００７０】二本鎖の鋳型ＤＮＡと２種のキメラオリゴ
ヌクレオチドプライマー及び上流オリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用する本発明の核酸増幅方法の態様におい
ては、反応の条件等にもよるが、各プライマーから伸長
反応中のそれぞれの鋳型−伸長鎖中間体の間で鋳型の交
換が起こり、合成されたプライマー伸長鎖同士がアニー
リングした二本鎖核酸を生成することがある。この二本
鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを
有しており、次いでその両端から再び鎖置換による相補
鎖伸長反応を開始することができる。この反応の結果、
一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成され
る。さらに、この反応中に鋳型の交換が起こった場合に
は前記と同様な二本鎖核酸が再度生成される。In the embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention using a double-stranded template DNA, two kinds of chimeric oligonucleotide primers and an upstream oligonucleotide primer, the extension reaction from each primer depends on the reaction conditions and the like. Template exchange may occur between the respective template-extended chain intermediates therein, and a double-stranded nucleic acid in which the synthesized primer extended chains are annealed may be produced. This double-stranded nucleic acid has chimeric oligonucleotide primers at both ends, and then complementary strand extension reaction by strand displacement can be started from both ends again. As a result of this reaction,
An amplification product having the primer sequence at one end is produced. Furthermore, when template exchange occurs during this reaction, the same double-stranded nucleic acid as above is regenerated.
【００７１】本発明により、鎖置換活性を有するＤＮＡ
ポリメラーゼを使用し、鋳型交換反応を行う工程を包含
する核酸の増幅方法が提供される。当該鋳型交換反応に
おいては、鋳型となる二本鎖核酸と、それぞれの鎖の塩
基配列に実質的に相補的な２種のキメラオリゴヌクレオ
チドプライマー及び上流オリゴヌクレオチドプライマー
と、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下
に、該鋳型に相補的な２種のプライマー伸長鎖が合成さ
れる。該プライマー伸長鎖の合成の途中において、プラ
イマー伸長鎖のそれぞれの鋳型から他方のプライマー伸
長鎖への鋳型の交換が起こる。DNA having strand displacement activity according to the present invention
Provided is a method for amplifying a nucleic acid, which comprises performing a template exchange reaction using a polymerase. In the template exchange reaction, a double-stranded nucleic acid serving as a template, two types of chimeric oligonucleotide primers and upstream oligonucleotide primers that are substantially complementary to the base sequences of the respective strands, and a DNA polymerase having strand displacement activity In the presence of, two kinds of primer extended strands complementary to the template are synthesized. During the synthesis of the primer extended chain, the exchange of the template from each template of the primer extended chain to the other primer extended chain occurs.
【００７２】ここで、鋳型交換反応とは、２本鎖核酸の
両側からの鎖置換反応による相補鎖の合成が行われる際
に、ＤＮＡポリメラーゼがその鋳型を交換し、他方のＤ
ＮＡポリメラーゼが新規に合成してきた相補鎖をそれぞ
れ鋳型として、以降の相補鎖合成を行うことを言う。言
い換えれば、鋳型となる２本鎖核酸をそれぞれのプライ
マー及び鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼで処理
し、該鋳型に相補的な伸長鎖を生成せしめる反応におい
て、該伸長鎖を合成中に、ＤＮＡポリメラーゼによって
プライマー伸長鎖が当初の鋳型から、他方のプライマー
伸長鎖へと能動的にスイッチングせしめる反応を言う。Here, the template exchange reaction means that when the complementary strands are synthesized by the strand displacement reaction from both sides of the double-stranded nucleic acid, the DNA polymerase exchanges the template and the other D
This means performing the subsequent complementary strand synthesis using the complementary strands newly synthesized by NA polymerase as templates, respectively. In other words, a double-stranded nucleic acid serving as a template is treated with each primer and a DNA polymerase having a strand displacement activity to generate an extended strand complementary to the template, and the extended polymerase is synthesized during the synthesis. Refers to a reaction in which the primer extension chain actively switches from the original template to the other primer extension chain.
【００７３】本発明には、鎖置換反応中に上記の鋳型交
換反応を行う能力を有するＤＮＡポリメラーゼが好適に
使用でき、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
を欠失したＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼの変異体酵素が
特に好適に使用される。当該酵素はＢｃａＢＥＳＴ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）として市販されてお
り、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Escheric
hia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３７２０）より日本特許第２９７８００１号に記載
の方法によって調製することもできる。In the present invention, a DNA polymerase having the ability to carry out the above-mentioned template exchange reaction during the strand displacement reaction can be preferably used. Somatic enzymes are particularly preferably used. The enzyme is BcaBEST D
Escherichia coli, which is commercially available as NA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and contains a gene for the enzyme, Escheric
hia coli HB101 / pUI205 (FERM B
It can also be prepared by the method described in Japanese Patent No. 2979801 from P-3720).
【００７４】また、本発明の増幅方法において、キメラ
オリゴヌクレオチドプライマー伸長鎖のリボヌクレオチ
ド含有部位が切断される際に、当該切断によって生じる
５’側の断片（プライマー部分）がリボヌクレオチドを
含有しないように切断される場合がある。こうして生じ
たプライマー部分から伸長されたプライマー伸長鎖はも
はやエンドヌクレアーゼにより切断されず、この結果、
末端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成され
る。上記のように、本発明の核酸増幅方法においてはプ
ライマーの配列を含まない増幅産物の他、一端、もしく
は両端にプライマーの配列を有する産物が生成しうる。
これらの産物も本発明にいう増幅産物に包含される。Further, in the amplification method of the present invention, when the ribonucleotide-containing site of the extended chain of the chimeric oligonucleotide primer is cleaved, the 5'side fragment (primer part) generated by the cleavage does not contain ribonucleotides. May be disconnected. The primer extension chain thus extended from the primer portion is no longer cleaved by the endonuclease, resulting in
An amplification product having the primer sequence at the end is generated. As described above, in the nucleic acid amplification method of the present invention, in addition to the amplification product not containing the primer sequence, a product having the primer sequence at one end or both ends can be produced.
These products are also included in the amplification products referred to in the present invention.
【００７５】キメラオリゴヌクレオチドを使用する本発
明の核酸増幅方法においては、増幅領域が連なった重合
体を生成する場合がある。このような重合体は増幅領域
が複数個、いずれも同じ向きに連なったものであり、電
気泳動による増幅産物の解析ではラダー状のバンドとし
て確認される。当該重合体の生成は、増幅される領域、
該領域のサイズ、その隣接領域、使用されるキメラオリ
ゴヌクレオチドプライマーの塩基配列あるいは反応の条
件等により影響を受けることが考えられている。In the nucleic acid amplification method of the present invention using a chimeric oligonucleotide, a polymer having continuous amplification regions may be produced. Such a polymer has a plurality of amplification regions, all of which are arranged in the same direction, and is confirmed as a ladder band in the analysis of the amplification product by electrophoresis. The production of the polymer is the region to be amplified,
It is considered to be influenced by the size of the region, its adjacent region, the base sequence of the chimeric oligonucleotide primer used, the reaction conditions, and the like.
【００７６】上記の重合体は、増幅領域を複数個含むも
のである。当該重合体は、例えば適切なプローブとのハ
イブリダイゼーションによって多数のプローブとハイブ
リダイズし、当該重合体が強いシグナルを発生すること
から、増幅領域を含む核酸の検出を目的とする場合に有
用である。また、制限酵素消化等を組み合わせて、重合
体より増幅領域、またはその一部をモノマーとして得る
こともできる。The above polymer contains a plurality of amplification regions. The polymer hybridizes with a large number of probes by, for example, hybridization with an appropriate probe, and the polymer generates a strong signal, which is useful when detecting a nucleic acid containing an amplification region. . Further, the amplification region or a part thereof can be obtained as a monomer from the polymer by combining restriction enzyme digestion and the like.
【００７７】本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼ
は、プライマー部分の３’末端から下流への伸長鎖合成
に伴い、先に伸長されたＤＮＡ鎖の置換を行う必要があ
る。そして重要なことは置換鎖を分解する可能性のある
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことであ
る。このようなＤＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌由来
のＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損変異
体であるクレノウ断片、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ由来
の同様の断片（ニューイングランドバイオラブス社
製）、Ｂ．ｃａ由来のＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）が有用である。シークエネース１．
０およびシークエネース２．０（米国バイオケミカル
社）、ジーン（Gene）第９７巻、１３〜１９頁（１９９
１）記載のＴ５ＤＮＡポリメラーゼおよびφ２９ ＤＮ
Ａポリメラーゼも使用することができる。通常は５’→
３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼであ
っても、その活性が適当な阻害剤の添加により阻害する
ことが可能な場合は、本発明のＤＮＡ合成方法に使用で
きる。In the DNA polymerase used in the present invention, it is necessary to replace the previously extended DNA strand with the synthesis of the extended strand from the 3'end of the primer portion to the downstream. And, importantly, it does not show 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity which may degrade the substituted strand. Klenow fragment, which is an exonuclease-deficient mutant of DNA polymerase I derived from E. coli, a similar fragment derived from Bst DNA polymerase (New England Biolabs), B. BcaBEST DNA polymerase derived from ca (manufactured by Takara Shuzo) is useful. Sequenace 1.
0 and SEQUENES 2.0 (US Biochemical Co., Ltd.), Gene Vol. 97, pp. 13-19 (199).
1) T5 DNA polymerase and φ29 DN described
A polymerase can also be used. Usually 5 '→
Even a polymerase having a 3'exonuclease activity can be used in the DNA synthesis method of the present invention if the activity can be inhibited by the addition of a suitable inhibitor.
【００７８】本発明の核酸の増幅方法は、変温で行って
もよく、又は等温で行ってもよい。ここで変温とは、各
工程の反応を妨げない範囲で各工程の反応温度を変化さ
せることを意味する。次に等温とは、各工程の反応温度
を変化させず、各工程が実質的に一定の温度で行われる
ことを意味する。いずれの場合においても、最適の反応
条件となるように温度を設定するのは当然である。The nucleic acid amplification method of the present invention may be carried out at variable temperature or isothermally. Here, the variable temperature means changing the reaction temperature of each step within a range that does not hinder the reaction of each step. Next, isothermal means that each step is carried out at a substantially constant temperature without changing the reaction temperature of each step. In any case, it is natural to set the temperature so as to obtain the optimum reaction condition.
【００７９】本発明の核酸の増幅方法の１つの特徴とし
ては、核酸の合成方法において温度を上げ下げする必要
がないことにある。即ち、本発明は等温での核酸の合成
方法を提供する。従来の多くの核酸増幅法は、温度を上
下することにより合成鎖から標的物を解離する必要があ
り、例えばサーマルサイクラーのような特別な反応装置
を必要とするが、本発明の方法においては一定温度を保
持できる装置のみでも実施することができる。このよう
に、本発明の方法は、単一の温度で実施することができ
る。好ましくは、プライマーの非特異的なアニーリング
が低減され、かつ鋳型となる核酸にプライマーが特異的
にアニーリングするように反応温度、ストリンジェンシ
ーのレベルを設定して実施される。特に限定するもので
はないが、上記のように耐熱性の酵素を用いて本発明の
方法を高温条件下で行う事ができる。さらに、反応の効
率を高く保つ観点から、本発明の方法は使用する酵素の
活性が十分に保持される適当な温度で行うことが好まし
い。従って、使用する酵素にもよるが、好ましい反応温
度は、約２０℃〜約８０℃であり、さらに好ましくは約
３０℃〜約７５℃であり、特に好ましくは、約５０℃〜
約７０℃である。特に高温条件下で反応を行う場合に
は、常温で反応を行う場合よりも鎖長の長いプライマー
を使用することが好ましい。例えば、本発明の方法にお
いて反応温度を５５℃から６０℃あるいは６５℃に設定
した場合、該方法に使用するプライマーの長さとして
は、特に限定するものではないが、例えば１２ヌクレオ
チド〜１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは１４ヌク
レオチド〜５０ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは
１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さのプライマ
ーが使用できる。このように反応温度を上げることの効
果としては、鋳型ＤＮＡの二次構造を解消できることが
挙げられ、ＧＣ含量の高い鋳型核酸を使用した場合にも
所望の核酸が増幅される。また、長鎖長の領域を増幅す
る場合においても同様の効果がある。該効果は、約６０
ｂｐ〜約２０ｋｂｐの範囲で、さらに約６０ｂｐ〜約
４．３ｋｂｐの範囲で、特に約６０ｂｐ〜約１５００ｂ
ｐの範囲で認められる。One feature of the nucleic acid amplification method of the present invention is that it is not necessary to raise or lower the temperature in the nucleic acid synthesis method. That is, the present invention provides a method for isothermally synthesizing nucleic acid. Many conventional nucleic acid amplification methods require the target to be dissociated from the synthetic strand by raising and lowering the temperature, and require a special reaction device such as a thermal cycler, but the method of the present invention is not constant. It can also be carried out with only a device capable of holding the temperature. Thus, the method of the present invention can be carried out at a single temperature. Preferably, the reaction temperature and the level of stringency are set so that non-specific annealing of the primer is reduced and the primer specifically anneals to the nucleic acid serving as the template. Although not particularly limited, the method of the present invention can be performed under high temperature conditions using a thermostable enzyme as described above. Further, from the viewpoint of keeping the reaction efficiency high, the method of the present invention is preferably carried out at an appropriate temperature at which the activity of the enzyme used is sufficiently retained. Therefore, depending on the enzyme used, the preferred reaction temperature is about 20 ° C. to about 80 ° C., more preferably about 30 ° C. to about 75 ° C., particularly preferably about 50 ° C.
It is about 70 ° C. Particularly when the reaction is performed under high temperature conditions, it is preferable to use a primer having a longer chain length than when the reaction is performed at room temperature. For example, when the reaction temperature is set to 55 ° C. to 60 ° C. or 65 ° C. in the method of the present invention, the length of the primer used in the method is not particularly limited, but is, for example, 12 nucleotides to 100 nucleotides. Primers with a length of preferably 14 nucleotides to 50 nucleotides, more preferably 15 nucleotides to 40 nucleotides can be used. The effect of increasing the reaction temperature is that the secondary structure of the template DNA can be eliminated, and the desired nucleic acid is amplified even when the template nucleic acid having a high GC content is used. Also, the same effect is obtained when amplifying a long chain region. The effect is about 60
bp to about 20 kbp, more preferably about 60 bp to about 4.3 kbp, especially about 60 bp to about 1500 b.
It is recognized in the range of p.
【００８０】さらに、鋳型となる核酸のＧＣ含量に応じ
て反応温度を調節し、増幅効率を向上させることができ
る。例えば、鋳型となる核酸としてＧＣ含量の低いもの
を使用する場合には、増幅する鎖長やプライマーのＴｍ
値にもよるが、５０〜５５℃で本発明の増幅反応を行う
ことができる。Furthermore, amplification efficiency can be improved by adjusting the reaction temperature according to the GC content of the template nucleic acid. For example, when a nucleic acid having a low GC content is used as a template nucleic acid, the strand length to be amplified and the Tm of the primer are
Although depending on the value, the amplification reaction of the present invention can be carried out at 50 to 55 ° C.
【００８１】また、本発明の方法において、逆転写酵素
活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳ
Ｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＲＮＡからｃ
ＤＮＡを調製する工程（逆転写反応）を含むＲＮＡ由来
の核酸の増幅を１種類の酵素のみで簡便に実施すること
ができる。また、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を
独立させて行い、その生成物（ｃＤＮＡ）を本発明の方
法に鋳型ＤＮＡとして使用することもできる。In the method of the present invention, a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity, for example, BcaBES is used.
When T DNA polymerase is used, RNA to c
Amplification of RNA-derived nucleic acid including the step of preparing DNA (reverse transcription reaction) can be easily carried out with only one kind of enzyme. It is also possible to independently perform the step of preparing cDNA from RNA and use the product (cDNA) as a template DNA in the method of the present invention.
【００８２】いずれの場合においても、本発明の方法に
おいては、適当な方法、例えば酵素を失活させたり反応
温度を低下させて反応を停止させるか、または基質のう
ちのいずれか一つが使い尽くされるかのいずれかまで繰
り返される。In any case, in the method of the present invention, a suitable method is used, for example, inactivating the enzyme or lowering the reaction temperature to stop the reaction, or any one of the substrates is used up. Will be repeated until either
【００８３】本発明の核酸の増幅方法は、核酸の増幅を
利用した種々の実験操作、例えば核酸の検出、標識、塩
基配列の決定に使用することができる。また、本発明の
核酸の増幅方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ核酸増幅方法、ＤＮ
Ａチップのような固相担体上での核酸増幅方法あるいは
多種類の領域を同時に増幅するマルチプレックス核酸増
幅方法として使用することができる。The nucleic acid amplification method of the present invention can be used in various experimental operations utilizing nucleic acid amplification, such as detection of nucleic acids, labeling, and determination of nucleotide sequences. The nucleic acid amplification method of the present invention includes an in situ nucleic acid amplification method, DN
It can be used as a nucleic acid amplification method on a solid phase carrier such as an A chip or a multiplex nucleic acid amplification method for simultaneously amplifying various kinds of regions.
【００８４】本発明の核酸の増幅方法の特徴の一つとし
て、一本鎖のＤＮＡを調製することが可能なことが挙げ
られる。この目的のためには、１種のキメラオリゴヌク
レオチドプライマーを使用する方法のみならず、２種の
キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法を
使用することもできる。例えば、２つのオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いる場合は、一方のオリゴヌクレオ
チドプライマー量を他方の量に対して過剰にして増幅反
応を行なう、いわゆるアシンメトリック（非対称）−Ｐ
ＣＲ法において採用される方法と同様のプライマー比率
によって行なうことができる。当該プライマー比率は、
特に限定されるものではないが１：１０〜１：５００の
範囲で好適に使用でき、特に好適には１：１０〜１：１
００の範囲である。この結果、一方の鎖を置換した産物
の量が、他方の鎖を置換した産物の量に比べて過剰にな
る。One of the features of the nucleic acid amplification method of the present invention is that single-stranded DNA can be prepared. For this purpose, not only a method using one kind of chimeric oligonucleotide primer but also a method using two kinds of chimeric oligonucleotide primers can be used. For example, when two oligonucleotide primers are used, the amplification reaction is carried out by making the amount of one oligonucleotide primer excessive with respect to the amount of the other so-called asymmetric (asymmetric) -P.
The primer ratio can be the same as that used in the CR method. The primer ratio is
Although not particularly limited, it can be preferably used in the range of 1:10 to 1: 500, and particularly preferably 1:10 to 1: 1.
The range is 00. As a result, the amount of the product obtained by displacing one strand is excessive compared with the amount of the product obtained by displacing the other strand.
【００８５】本発明の核酸の増幅方法によれば実質的に
その相補鎖を含有しない一本鎖のＤＮＡを調製すること
ができ、例えば、ＤＮＡチップのような核酸固定化物を
作製するための一本鎖ＤＮＡ、標的核酸検出のための一
本鎖ＤＮＡプローブ、または長鎖ＰＣＲ法のためのメガ
プライマーを容易にしかも短時間に作製することができ
る。また、本発明の方法を使用することにより、センス
配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみを選択して増
幅させることが可能である。従って、本発明はセンス配
列あるいはアンチセンス配列を有する核酸の製造方法と
しても有用である。According to the method for amplifying nucleic acid of the present invention, single-stranded DNA containing substantially no complementary strand thereof can be prepared. A single-stranded DNA, a single-stranded DNA probe for detecting a target nucleic acid, or a megaprimer for a long-chain PCR method can be easily prepared in a short time. Moreover, by using the method of the present invention, it is possible to select and amplify only the sense sequence or only the antisense sequence. Therefore, the present invention is also useful as a method for producing a nucleic acid having a sense sequence or an antisense sequence.
【００８６】また、本発明の方法は、ビシン、トリシ
ン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝液中で行うこ
とにより微量の鋳型となる核酸からでも所望の核酸配列
領域を増幅することができる。In addition, the method of the present invention can amplify a desired nucleic acid sequence region even from a small amount of a nucleic acid serving as a template by performing the method in bicine, tricine, hepes, phosphate or Tris buffer.
【００８７】さらに、本発明の核酸の増幅方法には経時
的な温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないた
め、大容量の反応液を使用して増幅反応を実施すること
ができる。したがって、例えば医薬用途等に使用される
核酸の工業的大量製造が可能である。Further, since it is not necessary to use a reaction apparatus capable of controlling temperature with time in the nucleic acid amplification method of the present invention, the amplification reaction can be carried out using a large volume of reaction solution. Therefore, it is possible to industrially mass-produce the nucleic acid used for pharmaceutical use and the like.
【００８８】また、本発明の核酸増幅方法は、鋳型とな
る核酸の塩基配列に忠実に増幅産物を生成することがで
きる。本発明の方法におけるＤＮＡ合成の誤りの頻度を
得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって確
認したところ、高い忠実度で核酸を増幅できることが知
られているＬＡ−ＰＣＲ法と本発明の方法のそれぞれで
得られた増幅産物中に見出された誤りの頻度は同程度で
あった。すなわち、本発明の方法はＬＡ−ＰＣＲ法に匹
敵する忠実度を有している。Further, the nucleic acid amplification method of the present invention can produce an amplification product faithfully to the base sequence of the nucleic acid serving as the template. The DNA synthesis error frequency in the method of the present invention was confirmed by analyzing the nucleotide sequence of the amplified product, and it was confirmed that the nucleic acid can be amplified with high fidelity and the LA-PCR method and the method of the present invention. The frequency of errors found in the amplification products obtained with each of the methods was comparable. That is, the method of the present invention has fidelity comparable to the LA-PCR method.
【００８９】（６）本発明のキット
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法に使用される
キットを提供する。１つの実施態様において、該キット
は、パッケージされた形態において、鎖置換反応におけ
るＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、キメラオ
リゴヌクレオチドプライマー及び上流オリゴヌクレオチ
ドプライマーの使用のための指示書を含むことを特徴と
する。さらに、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラー
ゼ、エンドヌクレアーゼならびに鎖置換反応用緩衝液を
含むキットは本発明の方法に好適に使用される。あるい
は、市販の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよ
び／またはエンドヌクレアーゼを指示書に従って選択
し、使用してもよい。さらに、ＲＮＡを鋳型とする場合
の逆転写反応用試薬を含んでもよい。ＤＮＡポリメラー
ゼは、上記（４）記載の本発明に使用されるＤＮＡポリ
メラーゼから選択することができる。また、エンドヌク
レアーゼは、上記（３）記載のエンドヌクレアーゼから
選択することができる。(6) Kit of the Present Invention The present invention provides a kit used in the method for amplifying the nucleic acid of the present invention described above. In one embodiment, the kit is characterized in that it comprises in packaged form instructions for the use of a DNA polymerase, an endonuclease, a chimeric oligonucleotide primer and an upstream oligonucleotide primer in a strand displacement reaction. Further, a kit containing a DNA polymerase having strand displacement activity, an endonuclease, and a buffer for strand displacement reaction is preferably used in the method of the present invention. Alternatively, a commercially available DNA polymerase and / or endonuclease having strand displacement activity may be selected and used according to the instructions. Furthermore, a reagent for reverse transcription reaction using RNA as a template may be included. The DNA polymerase can be selected from the DNA polymerases used in the present invention described in (4) above. In addition, the endonuclease can be selected from the endonucleases described in (3) above.
【００９０】上記「指示書」とは、当該キットの使用方
法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方法、推奨される
反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまた
はリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに
添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に
記載されたものを含む。さらに、インターネットのよう
な電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。The above-mentioned "instruction sheet" is a printed matter that describes the method of using the kit, for example, the method for preparing the reagent solution for strand displacement reaction, the recommended reaction conditions, etc. In addition, it also includes the label attached to the kit and the one written on the package in which the kit is stored. Further, the information disclosed and provided through an electronic medium such as the Internet is also included.
【００９１】さらに、本発明のキットにおいては、ビシ
ン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成
分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が
含まれていてもよい。また、鎖置換能を有するＤＮＡポ
リメラーゼやＲＮａｓｅＨが含まれていてもよい。さら
に、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオ
キシヌクレオチド３リン酸のアナログを含有していても
よい。Further, the kit of the present invention may contain a reaction buffer containing bicine, tricine, hepes, a phosphate or tris buffer component, and an annealing solution. Further, a DNA polymerase having a strand displacement ability or RNase H may be contained. Further, it may contain a modified deoxyribonucleotide or an analog of deoxynucleotide triphosphate.
【００９２】さらに、標的核酸の検出方法に使用される
キットは、上記の指示書、増幅反応のための試薬類の
他、標的核酸の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチド
プライマー及び上流オリゴヌクレオチドプライマー、増
幅された標的核酸を検出するための試薬、例えばプロー
ブ等を含むものであってもよい。Further, the kit used in the method for detecting a target nucleic acid comprises, in addition to the above-mentioned instructions and reagents for the amplification reaction, a chimeric oligonucleotide primer and an upstream oligonucleotide primer suitable for the amplification of the target nucleic acid, and an amplification reagent. It may contain a reagent for detecting the target nucleic acid thus prepared, such as a probe.
【００９３】また、本発明のキットは、上記の本発明に
使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、上流
オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は本発明のプロ
ーブを含有するキットも包含する。The kit of the present invention also includes a kit containing the above-mentioned chimeric oligonucleotide primer, upstream oligonucleotide primer and / or probe of the present invention used in the present invention.
【００９４】（７）本発明の組成物
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法、または本発
明の核酸の検出方法に使用される組成物を提供する。該
組成物としては、例えば、上記（２）に記載の上流オリ
ゴヌクレオチドプライマー、上記（３）に記載のエンド
ヌクレアーゼ、上記（４）に記載のＤＮＡポリメラーゼ
を含有するものが挙げられる。さらに、増幅反応を行う
ための成分として、緩衝成分やマグネシウム塩、ｄＮＴ
Ｐ等を含んでいてもよい。さらに、修飾されたデオキシ
リボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド３リン
酸のアナログを含有していてもよい。さらに、緩衝成分
やその他の添加物を使用することができる。(7) Composition of the present invention The present invention provides a composition used in the method for amplifying the nucleic acid of the present invention or the method for detecting the nucleic acid of the present invention. Examples of the composition include those containing the upstream oligonucleotide primer described in (2) above, the endonuclease described in (3) above, and the DNA polymerase described in (4) above. Furthermore, as components for carrying out the amplification reaction, buffer components, magnesium salts, dNT
P and the like may be included. Further, it may contain a modified deoxyribonucleotide or an analog of deoxynucleotide triphosphate. In addition, buffering ingredients and other additives can be used.
【００９５】特に好適な態様としては、本発明の核酸増
幅方法に適した組成で上記の各種成分が含有された組成
物を挙げることができ、該組成物は適切な鋳型とキメラ
オリゴヌクレオチドプライマー及び上流オリゴヌクレオ
チドプライマーを添加するのみで増幅反応を実施するこ
とができる。さらに、増幅対象があらかじめ明らかであ
る場合には、当該増幅対象の増幅に適したキメラオリゴ
ヌクレオチドプライマーを含有する組成物が好適であ
る。A particularly preferred embodiment is a composition containing the above-mentioned various components in a composition suitable for the nucleic acid amplification method of the present invention, which comprises a suitable template, a chimeric oligonucleotide primer, and The amplification reaction can be performed simply by adding the upstream oligonucleotide primer. Furthermore, when the amplification target is known in advance, a composition containing a chimeric oligonucleotide primer suitable for amplification of the amplification target is suitable.
【００９６】（８）本発明の標的核酸の検出方法
本発明の核酸の増幅方法を使用することにより、試料中
の標的核酸の検出を行うことができる。当該検出方法
は、（ａ）上記の本発明の核酸の増幅方法により、標的
核酸を増幅する工程；および、（ｂ）上記工程により増
幅された標的核酸を検出する工程；を包含する。(8) Target Nucleic Acid Detection Method of the Present Invention The target nucleic acid in a sample can be detected by using the nucleic acid amplification method of the present invention. The detection method includes (a) a step of amplifying a target nucleic acid by the above-described nucleic acid amplification method of the present invention; and (b) a step of detecting the target nucleic acid amplified in the above step.
【００９７】上記（ａ）行程において、ＲＮＡを鋳型と
する場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を１段階で行っ
てもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換
型ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせとして例えば、ＡＭ
Ｖ ＲＴａｓｅ、ＭＭＬＶＲＴａｓｅあるいはＲＡＶ−
２ ＲＴａｓｅとＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼの組み合
わせが好適に使用できる。In the step (a), when RNA is used as a template, the reverse transcription reaction and the nucleic acid amplification reaction may be carried out in one step. As a combination of a reverse transcriptase and a strand displacement type DNA polymerase, which is not particularly limited, for example, AM
V RTase, MMLV RTase or RAV-
A combination of 2 RTase and Bca DNA polymerase can be preferably used.
【００９８】上記方法は試料中に存在する特定の遺伝子
の検出、定量に利用することができる。すなわちＤＮＡ
またはＲＮＡ等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試料
から特定の遺伝子を検出、定量することができる。前述
の試料としては、特に限定はないが、例えば、全血、血
清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、***、唾
液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物
（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のよ
うな生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カ
ビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイル
ス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している
可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは
土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料か
ら特定の遺伝子を検出、定量することができる。さらに
例えば、ウイロイド、ウイルス、カビ、細菌あるいはそ
の他の微生物等由来の特定の遺伝子をターゲットとする
ことにより、該遺伝子の存在の有無によって上記の微生
物の存在を検出、定量等に利用することができる。特
に、病原性の微生物の検出方法は衛生、環境分野で有用
である。さらに、生物の遺伝子型の判別や遺伝子の発現
状態を調べるために本発明の方法を使用することもでき
る。特に疾病関連遺伝子、例えば細胞の癌化に関連する
遺伝子等の検出、発現状態の確認は医療分野において有
用である。上記検出法のための鋳型として使用される核
酸は、ＲＮＡあるいはＤＮＡのいずれもが好適に使用で
きる。The above method can be used for detecting and quantifying a specific gene present in a sample. Ie DNA
Alternatively, a specific gene can be detected and quantified from any sample that may contain nucleic acid such as RNA. The above-mentioned sample is not particularly limited, but for example, whole blood, serum, buffy coat, urine, feces, cerebrospinal fluid, semen, saliva, tissue (for example, cancer tissue, lymph node, etc.), cell culture ( For example, biological samples such as mammalian cell cultures and bacterial cultures), nucleic acid-containing samples such as viroids, viruses, bacteria, molds, yeasts, plants and animals, microorganisms such as viruses or bacteria contaminated or Specific genes can be detected and quantified from samples that may be infected (food, biological products, etc.) or samples that may contain organisms such as soil and wastewater. Furthermore, for example, by targeting a specific gene derived from viroid, virus, mold, bacterium, or other microorganism, etc., the presence or absence of the gene can be detected and used for quantification, etc. . In particular, the method for detecting pathogenic microorganisms is useful in the fields of hygiene and environment. Furthermore, the method of the present invention can be used to determine the genotype of an organism and to examine the expression status of genes. In particular, detection of a disease-related gene, for example, a gene associated with cell canceration, and confirmation of the expression state are useful in the medical field. As the nucleic acid used as a template for the above detection method, either RNA or DNA can be preferably used.
【００９９】さらに、本発明の標的核酸の検出方法によ
り、標的核酸上の塩基配列の違いを判別することができ
る。この態様においては、使用されるキメラオリゴヌク
レオチドプライマーの３’末端部分が、標的とされる塩
基配列の判別しようとする特定の塩基付近に位置するよ
うに、たとえば、該塩基とプライマーの３’末端の塩基
とが水素結合を形成するようにプライマーが設計され
る。このようなキメラオリゴヌクレオチドプライマーを
使用して増幅反応を実施した場合、プライマーの３’末
端部分の塩基配列と鋳型の塩基配列との間にミスマッチ
が存在する場合には標的核酸からの増幅が起こらず、増
幅産物の生成が見られない。当該方法により、点突然変
異、一塩基置換（Single nucleotide polymorphysm、Ｓ
ＮＰ）のような遺伝子上の特定の塩基についての情報を
得ることが可能である。Furthermore, by the method for detecting a target nucleic acid of the present invention, the difference in the base sequence on the target nucleic acid can be discriminated. In this aspect, the 3'end portion of the chimeric oligonucleotide primer used is located near the specific base to be discriminated from the target base sequence, for example, the 3'end of the base and the primer. The primer is designed to form a hydrogen bond with the base. When an amplification reaction is carried out using such a chimeric oligonucleotide primer, if there is a mismatch between the base sequence of the 3'end portion of the primer and the base sequence of the template, amplification from the target nucleic acid will occur. No amplification product is observed. By this method, point mutation, single nucleotide substitution (S
It is possible to obtain information about specific bases on a gene such as NP).
【０１００】本発明の標的核酸の検出方法は、核酸を含
有する試料より直接、標的核酸を増幅することにより実
施することができる。この場合、増幅される標的核酸の
鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出
する観点からは、例えば２００ｂｐ以下、さらに好まし
くは１５０ｂｐ以下の領域が有効である。該増幅鎖長と
なるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマ
ーを設定することにより、高感度に試料中の標的核酸を
検出することができる。The target nucleic acid detection method of the present invention can be carried out by amplifying the target nucleic acid directly from a sample containing the nucleic acid. In this case, the chain length of the target nucleic acid to be amplified is not particularly limited, but from the viewpoint of detecting the target nucleic acid with high sensitivity, a region of, for example, 200 bp or less, more preferably 150 bp or less is effective. By setting the chimeric oligonucleotide primer of the present invention to have the amplification chain length, the target nucleic acid in the sample can be detected with high sensitivity.
【０１０１】さらに、本発明の検出方法では、ビシン、
トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を
含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレ
ンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、
微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出す
ることができる。この場合、使用するエンドヌクレアー
ゼとＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされないが、例え
ばアルカエオグロバス属細菌由来のＲＮａｓｅＨ及びＢ
ｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好ま
しい。特に、上記エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメ
ラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニ
ット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感
度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バ
ッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。Furthermore, in the detection method of the present invention, bicine,
By using a reaction buffer containing tricine, hepes, phosphate or tris buffer components, and an annealing solution containing spermidine or propylenediamine,
The target nucleic acid can be detected with even higher sensitivity from a small amount of nucleic acid sample. In this case, the endonuclease and the DNA polymerase to be used are not particularly limited, but for example, RNase H and B derived from a bacterium of the genus Alkaeoglobus.
A combination of caBEST DNA polymerase is preferred. In particular, it is expected that the number of units that can be suitably used for each of the above endonucleases and DNA polymerases may differ depending on their types. In that case, the improvement of the detection sensitivity or the increase of the amount of amplification product should be used as an index, and The composition and the amount of enzyme added may be adjusted.
【０１０２】本発明の検出方法においては、標的核酸の
増幅の際に、ｄＵＴＰを基質として取り込ませることが
できる。したがって、ｄＵＴＰを基質に用いた場合に
は、ウラシル Ｎ−グリコシダーゼ（ｕｒａｃｉｌ Ｎ
−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ：ＵＮＧ）を利用して増幅産
物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネー
ションによる偽陽性を防止することができる。In the detection method of the present invention, dUTP can be incorporated as a substrate when the target nucleic acid is amplified. Therefore, when dUTP is used as a substrate, uracil N-glycosidase (uracil N
-Glycosidase: UNG) can be used to decompose the amplification product to prevent false positives due to carryover contamination of the amplification product.
【０１０３】上記（ｂ）工程には公知の核酸検出方法、
例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出す
る方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる
検出等を使用することができる。さらに、磁気ビーズ等
を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。上記電気
泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の
蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼ
ーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射
性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のよう
な非放射性の標識を施したものが使用できる。この他、
上記（ａ）工程において標識ヌクレオチドを使用するこ
とにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて
検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナ
ルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光エ
ネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能であ
る。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的
核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定
量を行うことが可能である。また、ハイブリッドクロマ
ト法による肉眼検出法も好適に使用できる。In the step (b), a known nucleic acid detection method,
For example, a method of detecting a reaction product having a specific size by electrophoresis, detection by hybridization with a probe, or the like can be used. Furthermore, a detection method combining magnetic beads and the like can also be suitably used. A fluorescent substance such as ethidium bromide is usually used for detection by the above-mentioned electrophoresis, but hybridization with a probe may be combined. In addition, the probe may be labeled with a radioactive isotope or a non-radioactive label such as biotin or a fluorescent substance. Besides this,
By using the labeled nucleotide in the above step (a), it is possible to incorporate the labeled nucleotide into the amplification product to facilitate the detection and to enhance the detection signal using the label, and further the fluorescence polarization method. It is also possible to perform detection using fluorescence energy transfer or the like. Furthermore, by constructing an appropriate detection system, it is possible to automatically detect the target nucleic acid or to quantify the target nucleic acid. Further, a macroscopic detection method using a hybrid chromatography method can also be preferably used.
【０１０４】消光状態になるような距離で配置された２
種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド（Ｒ
ＮＡ）プローブあるいはリボヌクレオチド及びデオキシ
リボヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチ
ドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用するこ
とができる。当該プローブは蛍光を発することはない
が、これに相補的な標的核酸由来の増幅ＤＮＡにアニー
リングした場合、ＲＮａｓｅＨは該プローブを分解す
る。この結果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大し
て蛍光が発せられるようになり、標的核酸の存在を知る
ことができる。ＲＮａｓｅＨを使用して本発明の核酸の
増幅方法が実施された場合には、その反応液中に上記の
プローブを添加するだけで標的核酸を検出することがで
きる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質として
は、例えば、６−ＦＡＭ(6-carboxyfluorescein)とＴＡ
ＭＲＡ(N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine)と
の組み合わせが好適に使用できる。2 placed at a distance such that the light is extinguished
Ribonucleotides labeled with more than one fluorescent substance (R
NA) probes or chimeric oligonucleotide probes composed of ribonucleotides and deoxyribonucleotides can be used in the detection method of the present invention. Although the probe does not emit fluorescence, RNase H decomposes the probe when annealed to amplified DNA derived from a target nucleic acid complementary thereto. As a result, the distance between the fluorescent substances on the probe is increased and fluorescence is emitted, and the presence of the target nucleic acid can be known. When the nucleic acid amplification method of the present invention is carried out using RNaseH, the target nucleic acid can be detected simply by adding the above probe to the reaction solution. Examples of the fluorescent substance used for labeling the probe include 6-FAM (6-carboxyfluorescein) and TA.
A combination with MRA (N, N, N ', N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine) can be preferably used.
【０１０５】さらに、本発明は前記の標的核酸の検出方
法に使用されるプローブを提供する。本発明のプローブ
は、上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核
酸に通常のハイブリダイゼーションの条件において標的
核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定はな
いが、増幅産物を特異的に検出する観点からは、例えば
厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリ
ダイズするものが好ましい。前記、厳密なハイブリダイ
ゼーション条件は、例えば１９８９年、コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティ
ス（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー
クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第２版
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）に
記載されている。具体的な厳密な条件としては、例えば
以下の条件を挙げることができる。すなわち、０．５％
ＳＤＳ、５×デンハルツ［Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニ
ルピロリドン、０．１％フィコール４００］及び１００
μｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳ
Ｃは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．０）中で、使用するプローブのＴｍ
値より約２５℃低い温度で４時間〜一晩保温を行う条件
を言う。前記プローブは、標的核酸の検出を容易にする
ために上記のような標識を付されたものを使用すること
ができる。Furthermore, the present invention provides a probe used in the method for detecting a target nucleic acid described above. The probe of the present invention is not particularly limited as long as it can hybridize to the target nucleic acid under the conditions of ordinary hybridization with the nucleic acid amplified by the above-described nucleic acid amplification method of the present invention, but the amplification product is specific. From the viewpoint of detection, it is preferable to hybridize under conditions known to those skilled in the art as strict conditions. The strict hybridization conditions are described in, for example, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, T.S. Edited by T. Maniatis et al., Molecular
Cloning: Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning: A La)
laboratory Manual 2nd ed. )It is described in. Examples of specific strict conditions include the following conditions. That is, 0.5%
SDS, 5 × Denhardt's, 0.
1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400] and 100
6xSSC (1xSS) containing μg / ml salmon sperm DNA
C is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), and the Tm of the probe used is
It is a condition that the temperature is kept at about 25 ° C lower than the value for 4 hours to overnight. The probe may be labeled with the above-mentioned label to facilitate detection of the target nucleic acid.
【０１０６】本発明の核酸の増幅方法の等温下における
増幅方法においては、サーマルサイクラーのような装置
を必要としない。また本発明の増幅方法では、使用する
プライマーを１種類もしくは２種類と従来法よりも少な
くすることができる。ｄＮＴＰのような試薬もＰＣＲ等
で用いられるものを流用できるため、ランニングコスト
を従来法よりも低くすることができる。そのため、ルー
チンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に
使用できる。さらに、本発明の方法はＰＣＲ法よりも短
時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、
迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することがで
きる。The isothermal amplification method of the nucleic acid amplification method of the present invention does not require a device such as a thermal cycler. Further, in the amplification method of the present invention, the number of primers used can be reduced to one type or two types compared to the conventional method. Since reagents used in PCR and the like can be used as reagents such as dNTP, the running cost can be reduced as compared with the conventional method. Therefore, it can be preferably used in the field of genetic testing and the like where routine work is performed. Furthermore, since the method of the present invention can obtain more amplification products in a shorter time than the PCR method,
It can be used as a rapid and highly sensitive gene detection method.
【０１０７】ゲノムレベルの遺伝子解析においては、大
量の塩基配列を解析するために反応系を微量化し、さら
に集積度を高める試みがなされている。その手段の一つ
として、最先端の超微細加工技術を駆使して、ゲノム解
析の基本プロセス、例えば、ＤＮＡの細胞からの抽出、
ＤＮＡ増幅反応、電気泳動、ハイブリダイゼーション、
目的ＤＮＡの検出等のプロセスを数ｃｍ角〜指先大のマ
イクロチップ上に集積化したものが開発されている。該
システムはマイクロチップ、あるいはナノチップと呼ば
れている。このようなシステムにおける遺伝子増幅反応
として現在はＰＣＲ法が考えられているが、該方法は経
時的に温度の上昇、下降を繰り返す温度制御のための手
段を必要とするため、システムが複雑なものとなる。こ
れに対し、等温条件下で核酸を増幅できる本発明の方法
はシステムの単純化が可能であり、上記のような集積化
されたシステムでの利用に非常に好適である。さらに、
本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの
構築が可能となる。In the gene analysis at the genome level, attempts have been made to reduce the reaction system in order to analyze a large amount of nucleotide sequences and further increase the degree of integration. As one of the means, we make full use of the latest ultra-fine processing technology to perform the basic process of genome analysis, for example, extraction of DNA from cells,
DNA amplification reaction, electrophoresis, hybridization,
A process has been developed in which processes such as detection of target DNA are integrated on a microchip of several cm square to fingertip size. The system is called a microchip or nanochip. The PCR method is currently considered as a gene amplification reaction in such a system, but since the method requires a means for temperature control in which temperature rises and falls repeatedly over time, the system is complicated. Becomes On the other hand, the method of the present invention capable of amplifying a nucleic acid under isothermal conditions enables simplification of the system and is very suitable for use in the integrated system as described above. further,
The technology of the present invention can be used to construct a system with a higher degree of integration.
【０１０８】[0108]
【実施例】以下に実施例によって本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるもので
はない。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to the scope of the examples.
【０１０９】参考例１ アルカエオグロバス フルギダ
スのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）アルカエオグロバス フルギダス ゲノムＤＮＡ
の調製
アルカエオグロバス フルギダス（Archaeoglobus ful
gidus、ドイッチェザムルンク フォン ミクロオルガ
ニスメン ウント ツェルクルツレンＧｍｂＨより購
入：ＤＳＭ４１３９）８ｍｌ相当分の菌体を集め、１０
０μｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）に懸濁し、２０μｌの０．５ＭＥＤＴＡ、１０
μｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク
社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反
応終了後、この反応液に８００μｌの１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼ
Ｋ（宝酒造社製）及び５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナ
トリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応
終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
殿、風乾した後に５０μｌのＴＥに溶解してゲノムＤＮ
Ａ溶液を得た。Reference Example 1 Cloning of RNase HII gene of alkaeoglobus fulgidas (1) Alkaeoglobus fulgidas genomic DNA
Preparation of Archaeoglobus fulgidas (Archaeoglobus ful)
gidus, Deutsche Zamlung von Microorganismen und Zerkulturen purchased from GmbH: DSM4139) Collect 8 ml of bacterial cells and collect 10
0 μl of 25% sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH
8.0), 20 μl of 0.5 M EDTA, 10
μl of 10 mg / ml lysozyme chloride (manufactured by Nacalai Tesque) aqueous solution was added, and the mixture was reacted at 20 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, add 800 μl of 150 mM Na to the reaction solution.
Cl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl (p
H8.0), 10 μl of 20 mg / ml proteinase K (manufactured by Takara Shuzo) and 50 μl of 10% sodium lauryl sulfate aqueous solution were added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, phenol-chloroform extraction, ethanol precipitation, air-drying, and dissolution in 50 μl TE were performed to generate genomic DN.
A solution was obtained.
【０１１０】（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニ
ング
アルカエオグロバス フルギダス（Archaeoglobus fulg
idus）は全ゲノム配列が公開されており〔ネイチャー
（Nature）、第３９０巻、第３６４−３７０頁（１９９
７）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝
子（ＡＦ０６２１）が１つ存在することが明らかになっ
ている（配列番号１、http://www.tigr.org/tdb/CMR/bt
m/htmls/SplashPage.html）。そこで、このＡＦ０６２
１遺伝子（配列番号１）の配列をもとにプライマーＡｆ
ｕＮｄｅ（配列番号２）及びＡｆｕＢａｍ（配列番号
３）を合成した。上記（１）で得たアルカエオグロバス
フルギダス ゲノムＤＮＡ３０ｎｇを鋳型にして、２
０ｐｍｏｌのＡｆｕＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＡｆｕＢ
ａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを
行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベス
トＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコ
ールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で
３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル
行った。増幅した約０．６ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ
及びＢａｍＨＩ(ともに宝酒造社製)で消化し、得られた
ＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐ
ＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換
したもの）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラ
スミドｐＡＦＵ２０４を作製した。(2) Cloning of RNase HII Gene Archaeoglobus fulg
The entire genome sequence of idus) has been published [Nature, Vol. 390, pp. 364-370 (199).
7)], it has been revealed that there is one gene (AF0621) encoding a homolog of RNase HII (SEQ ID NO: 1, http://www.tigr.org/tdb/CMR/bt).
m / htmls / SplashPage.html). Therefore, this AF062
Primer Af based on the sequence of one gene (SEQ ID NO: 1)
uNde (SEQ ID NO: 2) and AfuBam (SEQ ID NO: 3) were synthesized. Using 30 ng of the alkaeoglobus fulgidas genomic DNA obtained in (1) above as a template, 2
0 pmol AfuNde and 20 pmol AfuB
PCR was performed in a volume of 100 μl using am as the primer. Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used as the DNA polymerase in the PCR according to the attached protocol, and the PCR was carried out for 40 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute. . The amplified DNA fragment of about 0.6 kb was NdeI
And BamHI (both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and the resulting DNA fragment was used as a plasmid vector pTV119Nd (p
The plasmid pAFU204 was constructed by inserting between NdeI and BamHI of TV119N (NcoI site converted to NdeI site).
【０１１１】（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の塩基配列の決定
上記（２）で得られたｐＡＦＵ２０４の挿入ＤＮＡ断片
の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。得られた
塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩを
コードすると考えられるオープンリーディングフレーム
が見出された。このオープンリーディングフレームの塩
基配列を配列表の配列番号４に示す。また、該塩基配列
から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列
表の配列番号５に示す。(3) DN containing the RNase HII gene
Determination of nucleotide sequence of A fragment The nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of pAFU204 obtained in (2) above was determined by the dideoxy method. When the results of the obtained nucleotide sequence were analyzed, an open reading frame thought to code for RNase HII was found. The base sequence of this open reading frame is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. The amino acid sequence of RNase HII deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
【０１１２】なお、プラスミドｐＡＦＵ２０４で形質転
換された大腸菌ＪＭ１０９は、Escherichia coli JM109
／pAFU204と命名、表示され、平成１３年２月２２日よ
り独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ
ーに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２２１として寄託さ
れ、また前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物
寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９１［国
際寄託への移管請求日：平成１３年８月２日］として寄
託されている。E. coli JM109 transformed with the plasmid pAFU204 was Escherichia coli JM109.
Named / pAFU204, it was deposited on February 22, 2001, at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary under the deposit number FERM P-18221. It has been deposited at the Biological Depository Center under the deposit number FERM BP-7691 [Date of request for transfer to international deposit: August 2, 2001].
【０１１３】（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
上記（２）で得られたｐＡＦＵ２０４で大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換し、得られたｐＡＦＵ２０４を含む大腸菌
ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２
リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培
養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３
７．１ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ
フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、
超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍ
で１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、
１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒ
ｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、４０．３
ｍｌの熱処理上清液を得た。(4) Preparation of purified RNase HII preparation pAFU204 obtained in (2) above was used for Escherichia coli JM10.
The resulting E. coli JM109 containing pAFU204 was transformed with 9 μg / ml of ampicillin.
It was inoculated into liter of LB medium and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. After the culture was completed, the bacterial cells collected by centrifugation were
7.1 ml of sonication buffer [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM
Phenylmethanesulfonyl fluoride],
It was sonicated. This crushed liquid is 12000 rpm
Centrifugation for 10 minutes at 70 ° C.
It was subjected to a heat treatment for 15 minutes. After that, 12000r again
Centrifuge at pm for 10 minutes and collect the supernatant.
ml of heat-treated supernatant was obtained.
【０１１４】この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕
で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム
ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシ
ステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）
を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、Ｒ
ＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通り
した。バッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓ
カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）
に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア
バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行な
った。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ
Ｓカラムを素通りした。素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ
画分４０．０ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファ
ーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ〕２リットルを外液として、２時間の透析を
３回行なった。透析後の酵素液４０．２ｍｌを５０ｍＭ
ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａ
ｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム ファルマシア
バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて
５０〜５５０ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し
た。その結果、約２４０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出
されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。このＲＮａｓｅＨ
ＩＩ画分７．８ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社
製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約６００μｌの濃
縮液を４回に分けて１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム
（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供
し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨ
ＩＩは、３０．０キロダルトンの分子量に相当する位置
に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量
体として存在する場合に相当する。こうして溶出された
ＲＮａｓｅＨＩＩをＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品とし
た。The heat-treated supernatant was added to buffer A [50 m
M Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA]
The FPLC system (Amersham Pharmacia Biotech) was applied to the RESOURSE Q column (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with
Chromatography was performed using. As a result, R
NaseHII was passed through the RESOURSE Q column. RESOURCES S equilibrated with buffer A
Column (Amersham Pharmacia Biotech)
And subjected to chromatography using an FPLC system (Amersham Pharmacia Biotech). As a result, RNaseHII is RESOURCE
It passed through the S column. RNase HII passed by
40.0 ml of the fraction was added to buffer B containing 50 mM NaCl [50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM
Using 2 liters of EDTA] as an external solution, dialysis for 2 hours was performed 3 times. 50 mM of 40.2 ml of enzyme solution after dialysis
HiTra equilibrated with buffer B containing NaCl
It was applied to a p-heparin column (Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with a linear concentration gradient of 50 to 550 mM NaCl using the FPLC system. As a result, an RNase HII fraction eluted at about 240 mM NaCl was obtained. This RNaseH
The II fraction 7.8 ml was concentrated by ultrafiltration using Centricon-10 (manufactured by Amicon), and about 600 μl of the concentrated solution was divided into 4 portions to obtain 100 mM NaCl and 0.1 mM.
50 mM Tris-HCl (pH 7.
0) equilibrated with Superose 6 gel filtration column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with the same buffer. As a result, RNaseH
II was eluted at a position corresponding to a molecular weight of 30.0 kilodaltons. This molecular weight corresponds to the case where RNase HII exists as a monomer. The RNase HII thus eluted was used as an Afu RNase HII standard product.
【０１１５】上記で得られたＡｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ
標品を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。
Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品１μｌに４０℃であらか
じめインキュベーションした反応液〔２０ｍＭ ヘペス
−水酸化カリウム（ｐＨ７．８）、０．０１％牛血清ア
ルブミン（宝酒造社製）、１％ジメチルスルホキシド、
４ｍＭ 酢酸マグネシウム、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄ
Ｔ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、
３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク社製）〕１００μｌを添加し、４０℃で
１０分間反応さた後、１０μｌ０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）で反応を停止し、２６０ｎｍの吸収を測定し
た。その結果、Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａ
ｓｅＨ活性が認められた。Afu RNase HII obtained above
The enzyme activity was measured by the following method using the preparation.
Reaction solution pre-incubated with 1 μl of Afu RNase HII preparation at 40 ° C. [20 mM Hepes-potassium hydroxide (pH 7.8), 0.01% bovine serum albumin (Takara Shuzo), 1% dimethyl sulfoxide,
4 mM magnesium acetate, 20 μg / ml poly (d
T) (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech),
100 μl of 30 μg / ml poly (rA) (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was added and reacted at 40 ° C. for 10 minutes, and then 10 μl of 0.5 M EDTA (p.
The reaction was stopped at (H8.0) and the absorption at 260 nm was measured. As a result, Rna was added to the Afu RNase HII sample.
seH activity was observed.
【０１１６】耐熱性ＲＮａｓｅＨのユニット数は、次の
方法により算出した。ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）
（ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製）１
ｍｇをそれぞれ１ｍＭ ＥＤＴＡを含む４０ｍＭ トリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒ
Ａ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。次に、４ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００３％ＢＳ
Ａ、４％グリセロールを含む４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるポリ
（ｒＡ）溶液、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｄ
Ｔ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却
し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。この
ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに任意に希
釈した酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応さ
せ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えて反応を停止
させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定した。対照とし
て、上記反応液に０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加え
た後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定した。
その後、ＥＤＴＡ非存在下で反応させ求めた吸光度から
対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわ
ち、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイ
ブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差か
ら求めた。ＲＮａｓｅＨの１単位は、１ｎｍｏｌのリボ
ヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ260を１０分間
に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位（unit）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．
０１５２×（１１０／１００）×希釈率The number of heat-resistant RNase H units was calculated by the following method. Poly (rA) and Poly (dT)
(Both made by Amersham Pharmacia Biotech) 1
Each mg was dissolved in 1 ml of 40 mM Tris-HCl (pH 7.7) containing 1 mM EDTA, and poly (r
A) and poly (dT) solutions were prepared. Next, 4m
M MgCl 2 , 1 mM DTT, 0.003% BS
A, 40 mM Tris-HCl containing 4% glycerol
Poly (rA) solution having a final concentration of 20 μg / ml, and poly (d) having a final concentration of 30 μg / ml in (pH 7.7)
The T) solution was added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 10 minutes and then cooled to 4 ° C to prepare a poly (rA) -poly (dT) solution. To 100 μl of this poly (rA) -poly (dT) solution, 1 μl of an arbitrarily diluted enzyme solution was added, reacted at 40 ° C. for 10 minutes, and 10 μl of 0.5M EDTA was added to stop the reaction. It was measured. As a control, 10 μl of 0.5 M EDTA was added to the above reaction solution, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 10 minutes, and the absorbance was measured.
Then, a value (absorbance difference) obtained by subtracting the absorbance of the control from the absorbance obtained by the reaction in the absence of EDTA was obtained. That is, the concentration of nucleotides released from the poly (rA) -poly (dT) hybrid by the enzymatic reaction was determined from the difference in absorbance. One unit of RNase H was calculated according to the following formula, with the amount of enzyme increasing A 260 corresponding to the liberation of 1 nmol of ribonucleotide for 10 minutes. Unit = [absorbance difference x reaction solution volume (ml)] / 0.
0152 x (110/100) x dilution rate
【０１１７】実施例１
（１）上流オリゴヌクレオチドプライマーの設計
キメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型となる核酸
の該プライマーのアニーリングする位置の３’側の任意
の位置にアニーリング可能な上流オリゴヌクレオチドプ
ライマーの組み合わせについて検討した。まず、配列表
の配列番号６及び７に記載の塩基配列を有する結核菌Ｉ
Ｓ６１１０遺伝子検出用キメラオリゴヌクレオチドプラ
イマー、ＭＴＩＳ−２Ｆ及びＭＴＩＳ−２Ｒプライマー
をＤＮＡ合成機により合成した。さらに、結核菌ＩＳ６
１１０遺伝子の塩基配列を有し、鋳型となる核酸のキメ
ラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングする位
置の３’側の任意の位置にアニーリングできる配列表の
配列番号８及び９記載の上流オリゴヌクレオチドプライ
マー、ＭＴＩＳ−Ｆ７２１およびＭＴＩＳ−Ｒ９２０を
それぞれ合成した。なお、オリゴヌクレオチドＭＴＩＳ
−Ｆ７２１はセンス方向のプライマーであり、ＭＴＩＳ
−Ｒ９２０はアンチセンス方向のプライマーである。Example 1 (1) Design of Upstream Oligonucleotide Primer Combination of Chimeric Oligonucleotide Primer and Upstream Oligonucleotide Primer Annealable to Arbitrary Position 3 ′ to the Annealing Position of the Primer Nucleic Acid investigated. First, Mycobacterium tuberculosis I having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 of the sequence listing.
A chimeric oligonucleotide primer for detecting S6110 gene, MTI S-2F and MTI S-2R primer were synthesized by a DNA synthesizer. Furthermore, Mycobacterium tuberculosis IS6
An upstream oligonucleotide primer having the nucleotide sequence of 110 genes and capable of annealing at any position 3 ′ to the annealing position of the chimeric oligonucleotide primer of the nucleic acid serving as a template, the upstream oligonucleotide primer described in SEQ ID NOs: 8 and 9, MTIS- F721 and MSIS-R920 were respectively synthesized. The oligonucleotide MTIS
-F721 is a primer in the sense direction,
-R920 is a primer in the antisense direction.
【０１１８】（２）鋳型の調製
カルメットゲラン菌東京株（乾燥ＢＣＧワクチン、日本
ビーシージー製造株式会社製）１２ｍｇより常法に従
い、結核菌ゲノムＤＮＡを調製した。(2) Preparation of template A tubercle bacillus genomic DNA was prepared from 12 mg of Calmette-Guerin Tokyo strain (dried BCG vaccine, manufactured by Nippon BCG Manufacturing Co., Ltd.) according to a conventional method.
【０１１９】（３）ＩＣＡＮ反応
１０ｆｇ／μｌ〜１００ｐｇ／μｌの濃度の上記ゲノム
ＤＮＡ １μｌあるいは陰性対照の水１μｌと、これに
各５０ｐｍｏｌのＭＴＩＳ−２Ｆ及びＭＴＩＳ−２Ｒプ
ライマーおよび各２．５ｐｍｏｌのＭＴＩＳ−Ｆ７２１
およびＭＴＩＳ−Ｒ９２０プライマー、０．５ｍＭ ｄ
ＮＴＰ混合液、３２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝溶液
（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４．０ｍ
Ｍ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミ
ン、１．０％ジメチルスルホキシド、４．３７５ＵのＡ
ｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ、２．６４ＵのＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全液量２５μ
ｌの反応液をサーマルサイクラーで６０℃、１時間保温
した。なお、対照として上流オリゴヌクレオチドプライ
マーを添加しない区分を設定した。反応終了後、この反
応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分
析した。その結果を図１に示す。図１Ａは、上流オリゴ
ヌクレオチドプライマー無添加の反応系であり、レーン
１は１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性
対照（水）、レーン３：１０ｆｇの鋳型、レーン４は１
００ｆｇの鋳型、レーン５は１ｐｇの鋳型、レーン６は
１０ｐｇの鋳型、レーン７は１００ｐｇの鋳型の場合を
示す。さらに、図１Ｂは、上流オリゴヌクレオチドプラ
イマーを添加した反応系であり、レーン１は１００ｂｐ
ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照（水）、レ
ーン３：１０ｆｇの鋳型、レーン４は１００ｆｇの鋳
型、レーン５は１ｐｇの鋳型、レーン６は１０ｐｇの鋳
型、レーン７は１００ｐｇの鋳型の場合を示す。(3) ICAN reaction 1 μl of the above-mentioned genomic DNA at a concentration of 10 fg / μl to 100 pg / μl or 1 μl of water as a negative control, to which 50 pmol of MTIS-2F and MTIS-2R primer and 2.5 pmol of MTIS each were added. -F721
And MTIS-R920 primer, 0.5 mM d
NTP mixed solution, 32 mM Hepes-KOH buffer solution (pH 7.8), 100 mM potassium acetate, 4.0 m
M magnesium acetate, 0.01% bovine serum albumin, 1.0% dimethyl sulfoxide, 4.375 U of A
fu-derived RNaseH, 2.64U of BcaBEST
Total volume of liquid containing DNA polymerase (Takara Shuzo) 25μ
The reaction solution of 1 was kept at 60 ° C. for 1 hour in a thermal cycler. As a control, a section to which the upstream oligonucleotide primer was not added was set. After the reaction was completed, 5 μl of this reaction solution was analyzed by 3.0% agarose gel electrophoresis. The result is shown in FIG. FIG. 1A shows a reaction system in which an upstream oligonucleotide primer is not added. Lane 1 is a 100 bp DNA ladder marker, lane 2 is a negative control (water), lane 3:10 fg template, and lane 4 is 1.
00 fg template, lane 5 shows 1 pg template, lane 6 shows 10 pg template, lane 7 shows 100 pg template. Further, FIG. 1B shows a reaction system in which an upstream oligonucleotide primer was added, and lane 1 is 100 bp.
DNA ladder marker, lane 2 for negative control (water), lane 3: 10 fg template, lane 4 for 100 fg template, lane 5 for 1 pg template, lane 6 for 10 pg template, lane 7 for 100 pg template. Show.
【０１２０】図１に示すように上流オリゴヌクレオチド
プライマー無添加の区分においては１ｐｇの鋳型量まで
増幅が認められた。一方、上流オリゴヌクレオチドプラ
イマーを添加した区分において１０ｆｇの鋳型量まで増
幅が認められ、添加しない区分と比較して２桁の感度上
昇が認められた。なお、１０ｆｇの鋳型量は上記ゲノム
ＤＮＡの２コピーに相当する。以上のことから、キメラ
オリゴヌクレオチドプライマーと鋳型となる核酸の該プ
ライマーのアニーリングする位置の３’側の任意の位置
にアニーリング可能な上流オリゴヌクレオチドプライマ
ーを組み合わせることにより検出感度が向上することが
確認できた。As shown in FIG. 1, amplification was recognized up to a template amount of 1 pg in the section in which the upstream oligonucleotide primer was not added. On the other hand, amplification was recognized up to a template amount of 10 fg in the section to which the upstream oligonucleotide primer was added, and a 2-digit increase in sensitivity was recognized as compared with the section without addition. The template amount of 10 fg corresponds to 2 copies of the genomic DNA. From the above, it can be confirmed that the detection sensitivity is improved by combining the chimeric oligonucleotide primer and the upstream oligonucleotide primer that can be annealed at any position 3'of the primer nucleic acid that anneals the primer. It was
【０１２１】[0121]
【発明の効果】本発明により、キメラオリゴヌクレオチ
ドプライマー及び上流オリゴヌクレオチドプライマーを
組み合わせたＤＮＡ合成反応により標的核酸の塩基配列
中の特異的増幅に適した領域を増幅することを特徴とす
る標的核酸の増幅方法が提供される。また、該標的核酸
の増幅方法で得られた標的核酸の増幅断片を検出する工
程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法が提
供される。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a region suitable for specific amplification in a base sequence of a target nucleic acid is amplified by a DNA synthesis reaction combining a chimeric oligonucleotide primer and an upstream oligonucleotide primer. An amplification method is provided. Further, there is provided a method for detecting a target nucleic acid, which comprises the step of detecting an amplified fragment of the target nucleic acid obtained by the method for amplifying the target nucleic acid.
【０１２２】[0122]
【図１】 本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断
片のアガロース電気泳動写真の結果を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the result of an agarose electrophoresis photograph of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
【０１２３】配列表フリーテキスト
SEQ ID NO:1: Nucleotide sequence of AF0621 from Ar
chaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:2: PCR primer AfuNde for cloning a gene
encoding a polypeptide having a RNaseHII activity
from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO:3: PCR primer AfuBam for cloning a gene
encoding a polypeptide having a RNaseHII activity
from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO:4: Nucleotide sequence of ORF in RNaseHI
I gene from Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:5: Amino acid sequence of RNaseHII from
Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:6: Designed chimeric oligonucleotide pri
mer designated as MTIS2F to amplify a portion of M
ycobacterium tuberculosis DNA."nucleotides16 to 18
are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyri
bonucleotides.".
SEQ ID NO:7: Designed chimeric oligonucleotide pri
mer designated as MTIS2R to amplify a portion of M
ycobacterium tuberculosis DNA."nucleotides19 to 21
are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyri
bonucleotides.".
SEQ ID NO:8: Designed oligonucleotide primer desig
nated as MTIS-F721 to amplify a portion of Mycobac
terium tuberculosis DNA.
SEQ ID NO:9: Designed oligonucleotide primer desig
nated as MTIS-R920 to amplify a portion of Mycobac
terium tuberculosis DNA.Sequence Listing Free Text SEQ ID NO: 1: Nucleotide sequence of AF0621 from Ar
chaeoglobus fulgidus.SEQ ID NO: 2: PCR primer AfuNde for cloning a gene
encoding a polypeptide having a RNaseHII activity
from Archaeoglobus fulgidus SEQ ID NO: 3: PCR primer AfuBam for cloning a gene
encoding a polypeptide having a RNaseHII activity
from Archaeoglobus fulgidus SEQ ID NO: 4: Nucleotide sequence of ORF in RNaseHI
I gene from Archaeoglobus fulgidus.SEQ ID NO: 5: Amino acid sequence of RNaseHII from
Archaeoglobus fulgidus. SEQ ID NO: 6: Designed chimeric oligonucleotide pri
mer designated as MTIS2F to amplify a portion of M
ycobacterium tuberculosis DNA. "nucleotides16 to 18
are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyri
bonucleotides. ". SEQ ID NO: 7: Designed chimeric oligonucleotide pri
mer designated as MTIS2R to amplify a portion of M
ycobacterium tuberculosis DNA. "nucleotides 19 to 21
are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyri
bonucleotides. ". SEQ ID NO: 8: Designed oligonucleotide primer desig
nated as MTIS-F721 to amplify a portion of Mycobac
terium tuberculosis DNA.SEQ ID NO: 9: Designed oligonucleotide primer desig
nated as MTIS-R920 to amplify a portion of Mycobac
terium tuberculosis DNA.
【０１２４】[0124]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> A method for amplification of nucleic acids <130> T-1674 <160> 9 <210> 1 <211> 626 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 1 atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60 ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120 ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180 gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240 attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300 gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360 agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420 atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480 ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540 ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600 acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 2 aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 3 tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30 <210> 4 <211> 638 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 4 catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60 gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120 aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180 gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240 gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300 gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360 ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420 atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480 ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540 tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600 aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638 <210> 5 <211> 205 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 5 Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu 20 25 30 Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg 35 40 45 Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu 50 55 60 Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala 65 70 75 Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile 80 85 90 Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val 95 100 105 Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu 110 115 120 Arg Val Val Ala Glu HisLys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val 125 130 135 Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile 140 145 150 Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala 155 160 165 Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser 170 175 180 Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser 185 190 195 Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe 200 205 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS-2F to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA."nucleotides 16 to 1 8 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 6 tctcgtccag cgccgcuu 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2R to a mplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA."nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides." <400> 7 gacaaaggcc acgtaggcga a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MTIS-F721 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. <400> 8 agcccgcagg accacgatcg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MTIS-R920 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. <400> 9 tcgtggaagc gacccgccag 20 [Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> A method for amplification of nucleic acids <130> T-1674 <160> 9 <210> 1 <211> 626 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 1 atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60 ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120 ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180 gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240 attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300 gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360 agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420 atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480 ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540 ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600 acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 2 aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 3 tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30 <210> 4 <211> 638 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 4 catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60 gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120 aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180 gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240 gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300 gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360 ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420 atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480 ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540 tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600 aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638 <210> 5 <211> 205 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 5 Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu 20 25 30 Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg 35 40 45 Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu 50 55 60 Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala 65 70 75 Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile 80 85 90 Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val 95 100 105 Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu 110 115 120 Arg Val Val Ala Glu HisLys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val 125 130 135 Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile 140 145 150 Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala 155 160 165 Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser 170 175 180 Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser 185 190 195 Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe 200 205 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS-2F to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. "nucleotides 16 to 1 8 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides. " <400> 6 tctcgtccag cgccgcuu 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2R to a mplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides. " <400> 7 gacaaaggcc acgtaggcga a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MTIS-F721 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. <400> 8 agcccgcagg accacgatcg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MTIS-R920 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. <400> 9 tcgtggaagc gacccgccag 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page F-term (reference) 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02
Claims (6)
型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖
置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種
類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも
１種類の上流オリゴヌクレオチドプライマー、およびＲ
ＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここ
で該キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型とな
る核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくとも
デオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログか
ら選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リ
ボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端
側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーで
あり、該上流オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型と
なる核酸の当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーと
実質的に相補的な領域の３’側の塩基配列に実質的に相
補的であり；および、（ｂ）反応産物を生成するのに充
分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、を包
含することを特徴とする核酸の増幅方法。1. In a method for amplifying a nucleic acid, (a) a nucleic acid serving as a template, deoxyribonucleotide triphosphate, a DNA polymerase having strand displacement activity, at least one kind of chimeric oligonucleotide primer, and at least one kind of upstream oligonucleotide. Primer, and R
NaseH is mixed to prepare a reaction mixture, wherein the chimeric oligonucleotide primer is substantially complementary to the nucleotide sequence of the template nucleic acid, and is at least one selected from deoxyribonucleotides and nucleotide analogs. And the ribonucleotide is a chimeric oligonucleotide primer arranged at the 3 ′ end or 3 ′ end side of the primer, and the upstream oligonucleotide primer is the chimeric oligonucleotide primer of the nucleic acid serving as a template. Substantially complementary to the base sequence 3'of the substantially complementary region; and (b) incubating the reaction mixture for a time sufficient to produce a reaction product. A method for amplifying a nucleic acid, which comprises:
的に相同な配列を有する第２のキメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーを含有する反応混合物を使用することを特
徴とする請求項１記載の核酸の増幅方法。2. The nucleic acid amplification according to claim 1, which further comprises a reaction mixture containing a second chimeric oligonucleotide primer having a sequence substantially homologous to the base sequence of the nucleic acid serving as a template. Method.
リゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に実質的に相同
な配列を有する領域の３’側の塩基配列と実質的に相同
な配列を第２の上流オリゴヌクレオチドプライマーを含
有する反応混合物を使用することを特徴とする請求項２
記載の核酸の増幅方法。3. A second upstream of a sequence substantially homologous to the base sequence on the 3'side of the region having a sequence substantially homologous to the base sequence of the second chimeric oligonucleotide primer of the template nucleic acid. 3. Use of a reaction mixture containing an oligonucleotide primer.
A method for amplifying a nucleic acid as described.
核酸の増幅方法のための組成物であって、それぞれ少な
くとも１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及
び上流オリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成
物。4. A composition for the method for amplifying a nucleic acid according to claim 1, which comprises at least one kind of chimeric oligonucleotide primer and upstream oligonucleotide primer, respectively. .
核酸の増幅方法のためのキットであって、それぞれ少な
くとも１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及
び上流オリゴヌクレオチドプライマーを含有するキッ
ト。5. A kit for the method for amplifying a nucleic acid according to any one of claims 1 to 3, which comprises at least one chimeric oligonucleotide primer and an upstream oligonucleotide primer, respectively.
的核酸の検出方法；（ａ）請求項１〜３のいずれか１項
に記載の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工
程；および、（ｂ）上記工程により増幅された標的核酸
を検出する工程；を包含する。6. A method for detecting a target nucleic acid, which comprises the following steps: (a) a step for amplifying a target nucleic acid by the method for amplifying a nucleic acid according to any one of claims 1 to 3. And (b) detecting the target nucleic acid amplified in the above step.
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