JP5381099B2 - 低密度リポ蛋白中コレステロール測定方法およびその試薬 - Google Patents
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Description
第一反応でHDL、VLDL、CM中のリポ蛋白コレステロールに作用する、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ、これらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を含む緩衝液中で、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、さらに、第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定することで、LDL−Cを簡便に、特異性、精密性良く分別測定できることを見出した。また、本測定法ではポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく、自動分析機への適用性が優れていることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
(1)試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法であって、
第一反応で、以下の(a)〜(d)を含む緩衝液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、以下の(a)〜(e)を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する、
低密度リポ蛋白中のコレステロール測定方法。
(a)コレステロールエステラーゼ、
(b)コレステロールオキシダーゼ、
(c)コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
(d)カゼイン、および/または、第四級アンモニウム塩、および/または、ベタイン化合物
(e)第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
(2)コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である(1)記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
(3)コール酸誘導体が、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミドまたはN,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミドより選択される1種または複数である(2)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(4)コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、0.01〜0.2%である(2)または(3)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(5)第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される1種または複数である(1)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(6)第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン(2モル)ポリオキシエチレンデシルエーテルである(5)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(7)第一反応において2価金属イオンを含有する(1)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(8)2価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである(7)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(9)第四級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、である(1)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(10)ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体、である(1)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(11)第一反応においてさらに脂肪酸を含有する(1)〜(10)のいずれかの低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
(12)第一反応および第二反応のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない(1)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(13)ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である(12)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(14)(1)ないし(13)のいずれかに記載の、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法に、用いるための試薬であって、
第一試薬に、以下の(a)〜(c)および緩衝液を含み、かつ、
第一試薬と第二試薬とを合わせた組成物に、以下の(a)〜(e)を含むように構成されている、低密度リポ蛋白中のコレステロール測定試薬。
(a)コレステロールエステラーゼ、
(b)コレステロールオキシダーゼ、
(c)コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
(d)カゼイン、および/または、第四級アンモニウム塩、および/または、ベタイン化合物
(e)第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
(15)コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である(14)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(16)コール酸誘導体が、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミドまたはN,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミドより選択される1種または複数である(15)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(17)コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、0.01〜0.2%である(15)または(16)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(18)第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される1種または複数である(14)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(19)第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン(2モル)ポリオキシエチレンデシルエーテルである(18)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(20)第一試薬に2価金属イオンを含有する(14)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(21)2価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである(20)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(22)第4級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、である(14)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(23)ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体、である(14)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(24)第一試薬にさらに脂肪酸を含有する(14)〜(23)のいずれかの低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
(25)第一試薬および第二試薬のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない(14)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(26)ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である(25)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
本発明においては、HDL、VLDL、CM中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がLDL−Cに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のHDL、VLDL、CM中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
コレステロールオキシダーゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましい下限は、第一試薬中で通常0.5U/mL、好ましくは1U/mLである。好ましい上限は通常10U/mL、好ましくは5U/mLである。
本発明においては、HDL、VLDL、CM中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がLDL−Cに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のHDL、VLDL、CM中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
コレステロールエステラーゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましい下限は、第一試薬中で通常0.01U/mL、好ましくは0.05U/mLである。好ましい上限は通常10U/mL、好ましくは5U/mLである。
「実用上十分」とは、血清試料中に標準的に含まれるとされる濃度の、HDL、VLDL、CMそれぞれのコレステロールに作用し、これを消去するに十分であることをいう。
このような物質として例えばコール酸誘導体がある。コール酸誘導体としては、特に限定されないが、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミド、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、7−オキソリトコール酸、12−オキソリトコール酸、12−オキソケノデオキシコール酸、7−オキソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、デヒドロコール酸等およびこれらの塩が挙げられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。好ましくは、少ない添加量でLDL−Cに対する反応性を低下させ得ることから、N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミド、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミドおよびその塩が良い。また、これらのコール酸誘導体より選択される1種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。これらの使用量としては特に限定されるものではないが、コール酸誘導体の総量として第一試薬中で通常0.001〜5%の範囲で用いられ得るが、好ましくは限界ミセル濃度(c.m.c)付近かそれ以下で使用するのがよい。これは、これらコール酸誘導体の本来ある界面活性剤としての作用が反って本発明の期待するコレステロールエステラーゼおよび/またはコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応阻害効果を弱めることに起因する。
限界ミセル濃度の測定は電気伝導度、浸透圧、氷点降下、蒸気圧、粘度、密度、可溶化能、洗浄力、光散乱、色素の変化などの物理性質の急変点を測定することで測定が可能である。例えば、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸の限界ミセル濃度は、0.50%(w/v)であり、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸は0.51%(w/v)であり、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミドは0.26%(w/v)であり、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミドは0.12%(w/v)であることが知られている。したがって、これらの好ましい使用量としては0.01〜0.6%である。また、その他のコール酸誘導体についても同じく限界ミセル濃度を知ることで使用量の最適化が可能である。
これらの使用量としては、反応終濃度として0〜1%(w/v)、好ましくは0〜0.5%(w/v)である。
(実施例1)
下記組成1〜10のLDL−C測定試薬を調製し下記測定条件で、試料としてヒト血清より精製したHDL、LDL、VLDL、CMを測定し、各測定値より各々のリポ蛋白中のコレステロール濃度を100%として相対%を求めた。また、比較例として下記組成11のLDL−C測定試薬を調製し実施例と同様の検討を行なった。尚、精製リポ蛋白画分の調製はHatch and Leesの方法の、3種の密度液を用い超遠心分離にて分離・分取した。
(試薬の調製)
下記組成1〜11のLDL−C測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸(同仁化学社製) 0.2%
カゼイン(和光純薬) 2.5g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 0.1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテル(エマレックスDAPE0207:日本エマルジョン社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸(同仁化学社製) 0.2%
ブロックエース(雪印社製) 2.5g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 0.1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテル(エマレックスDAPE0207:日本エマルジョン社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸(同仁化学社製) 0.2%
カゼイン(和光純薬) 2.5g/L
塩化コリン 3g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 0.1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテル(エマレックスDAPE0207:日本エマルジョン社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸(同仁化学社製) 0.2%
カゼイン(和光純薬) 2.5g/L
ベタイン一水和物 3g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 0.1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテル(エマレックスDAPE0207:日本エマルジョン社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸(同仁化学社製) 0.2%
カゼイン(和光純薬) 2.5g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル(エマルゲンMS−110:花王社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
タウロコール酸ナトリウム(ナカライテスク社製) 0.2%
カゼイン(和光純薬) 2.5g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル(エマルゲンMS−110:花王社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(同仁化学社製) 0.2%
カゼイン(和光純薬) 2.5g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル(エマルゲンMS−110:花王社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミド(同仁化学社製) 0.2%
カゼイン(和光純薬) 2.5g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル(エマルゲンMS−110:花王社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミド(同仁化学社製) 0.2%
カゼイン(和光純薬) 2.5g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル(エマルゲンMS−110:花王社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
タウロコール酸ナトリウム(ナカライテスク社製) 0.2%
オレイン酸ナトリウム(ナカライテスク社製) 0.01%
カゼイン(和光純薬) 2.5g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル(エマルゲンMS−110:花王社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸(同仁化学社製) 0.2%
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 0.1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテル(エマレックスDAPE0207:日本エマルジョン社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
日立7170形自動分析機を用いた。試料2.4μLに第一試薬 180μL添加し37℃にて5分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を90μL添加し5分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる2ポイントエンド法で600nm主波長、800nm副波長で吸光度を測定した。LDL−C濃度未知試料のLDL−C濃度の算出は、精製水および110mg/dL LDL−C標準血清の測定吸光度より算出して求めた。
実施例1に示す組成1〜10のLDL−C測定試薬にて実施例1に示す測定条件で、試料として血清20検体を測定した。また、比較例として組成11のLDL−C測定試薬を調製し実施例と同様の測定を行なった。各試薬における測定値は、当該検体の総コレステロール値(東洋紡社製 コレスカラー・リキッド使用)、HDL−C値(第一化学社製 分画剤試液により分画した試料を東洋紡社製 コレスカラー・リキッドで測定)及び中性脂肪値(東洋紡社製 リピドス・リキッド)を測定し、フリーデワルド(Friedewald)の計算式を用いて算出したLDL−C値を対照として相対%を求めた。
実施例1に示す組成6、10のLDL−C測定試薬にて実施例1に示す測定条件で、試料として血清9容に対し干渉チェックAプラス・乳び(シスメックス社製)を30000ホルマジン濁度に調製した試料を1容添加したもの、および乳びに変えてブランク用試料を添加したものを各々測定し、乳び3000ホルマジン濁度の測定値をブランク用試料の測定値に対する相対%として求め、乳びの影響を算出した。また、比較例として、実施例1で示す組成11および以下の組成12のLDL−C測定試薬にて実施例と同様の測定を行なった。
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
エマルゲンB66(花王社製) 0.2%
牛血清アルブミン(シグマ) 2.5g/L
コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 0.1U/mL
コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
トリトンX−100 2.0%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
Claims (8)
- 試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法であって、
第一反応で、以下の(a)〜(d)を含む緩衝液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、以下の(a)〜(e)を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する、
低密度リポ蛋白中のコレステロール測定方法。
(a)コレステロールエステラーゼ、
(b)コレステロールオキシダーゼ、
(c)タウロコール酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミドまたはN,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミドからなる群より選択される1種または複数種の物質
(d)カゼイン
(e)ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテルおよびポリオキシアルキレンアルキルエーテルからなる群より選択される1種または複数種の物質 - 請求項1に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法において、(d)に、さらに第四級アンモニウム塩、または、ベタイン化合物を含む方法
- 第一反応において2価金属イオンを含有する請求項1に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
- 第四級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリンである請求項2に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
- 第一反応においてさらに脂肪酸を含有する請求項1〜4のいずれかに記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
- 第一反応および第二反応のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない請求項1に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法に用いるための試薬であって、
第一試薬に、以下の(a)〜(c)および緩衝液を含み、かつ、
第一試薬と第二試薬とを合わせた組成物に、以下の(a)〜(e)を含むように構成されている、低密度リポ蛋白中のコレステロール測定試薬。
(a)コレステロールエステラーゼ、
(b)コレステロールオキシダーゼ、
(c)タウロコール酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミドまたはN,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミドからなる群より選択される1種または複数種の物質
(d)カゼイン
(e)ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテルおよびポリオキシアルキレンアルキルエーテルからなる群より選択される1種または複数種の物質 - 請求項7に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬において、(d)に、さらに第四級アンモニウム塩、または、ベタイン化合物を含む試薬。
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