JP5357593B2 - Starch granules or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzing enzyme and process for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、澱粉粒又はセルロース粉末に、澱粉加水分解酵素を結合させた澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素及びその製法に関するものであり、更に詳しくは、澱粉粒に、水又はエタノール水溶液を、澱粉粒重量当たり１０〜４０％加えて、澱粉加水分解酵素を混合、結合させて澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素を製造する方法及び該製法により作製した澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素に関するものである。 The present invention relates to starch granules or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzing enzymes obtained by binding starch hydrolyzing enzymes to starch granules or cellulose powders, and more specifically, to a method for producing starch starch, water or ethanol aqueous solution. 10 to 40% of the weight of starch granules, starch hydrolyzing enzyme is mixed and combined, and starch granules or cellulose powder fixed starch hydrolyzing enzyme is produced, and starch granules or cellulose powder fixed produced by the production method It relates to a modified starch hydrolase.
本発明は、より効率的に、澱粉加水分解酵素を固定化するために、澱粉粒としては、α−アミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼを作用させて、その表面に、穴を開けた澱粉粒又は粒表面を一部糊化した澱粉粒を用いること、また、澱粉粒表面又はセルロース粉末を、酸化処理した後に、澱粉加水分解酵素を結合させること、また、固定化を強化するために、卵白、ゼラチン、カゼインナトリウム、ツェインなど、タンパク質で、澱粉粒又はセルロース粉末表面を被覆してから、酵素を結合させること、更には、澱粉加水分解酵素と担体を、グルタルアルデヒドで結合させること、を特徴とするものである。なお、本発明で、結合とは、化学結合である共有結合、イオン結合、疎水結合、単なる吸着結合も含むものである。澱粉粉末は、通常は、澱粉と呼称され、澱粉粒の形態である。損傷澱粉粒、破砕澱粉も含まれることもあるが、本明細書では、澱粉粒の形態であることを意味するものとして、澱粉、澱粉粒、澱粉粉末は、同義であるものとして取扱う。 In the present invention, in order to more efficiently immobilize starch hydrolyzing enzyme, starch granules or granules having holes formed on the surface thereof by allowing α-amylase and / or glucoamylase to act as starch granules. In order to use starch granules whose surface is partially gelatinized, to bind starch hydrolyzing enzyme after oxidation treatment of the surface of starch granules or cellulose powder, and to enhance fixation, egg white, gelatin It is characterized in that the surface of starch granules or cellulose powder is coated with protein such as sodium caseinate or zein, and then the enzyme is bound, and further, the starch hydrolyzing enzyme and the carrier are bound with glutaraldehyde. Is. In the present invention, the term “bond” includes a chemical bond such as a covalent bond, an ionic bond, a hydrophobic bond, and a simple adsorption bond. Starch powder is usually referred to as starch and is in the form of starch granules. Damaged starch granules and crushed starch may be included, but in the present specification, starch, starch granules, and starch powder are treated as having the same meaning, meaning that they are in the form of starch granules.
従来から、酵素の固定化技術としては、各種の方法がある（非特許文献１）。一般に、酵素を不溶性担体に固定化する方法としては、大別して、３種の方法、すなわち、１）酵素と担体を共有結合、イオン結合、物理的吸着あるいは生化学的な特異性や親和性により結合させる担体結合法、２）２個又はそれ以上の官能基を持つ試薬、例えば、グルタルアルデヒドなどを介して、酵素分子と担体を結合させる架橋法、３）ゲルの格子中に酵素を包み込む「格子型」や、半透膜性ポリマーの皮膜、リポソームや中空繊維に酵素を封じ込む「マイクロカプセル型」形成法がある（非特許文献２）。 Conventionally, there are various methods for immobilizing enzymes (Non-Patent Document 1). In general, there are three main methods for immobilizing an enzyme on an insoluble carrier, namely, 1) the enzyme and the carrier are covalently bonded, ionic bond, physical adsorption or biochemical specificity or affinity. A carrier binding method for binding, 2) a crosslinking method for binding an enzyme molecule and a carrier via a reagent having two or more functional groups such as glutaraldehyde, and 3) enveloping the enzyme in the lattice of the gel. There are “lattice type” and “microcapsule type” forming methods in which an enzyme is encapsulated in a semi-permeable polymer film, liposome or hollow fiber (Non-patent Document 2).
具体的には、例えば、ＤＥＡＥなどのイオン交換樹脂に結合させた方法として、酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを、イオン交換樹脂に固定化し、該固定化酵素を用い、グリシンとホルムアルデヒドからＬ−セリンを製造する方法がある（特許文献１）。 Specifically, for example, as a method of binding to an ion exchange resin such as DEAE, the enzyme serine hydroxymethyltransferase is immobilized on the ion exchange resin, and L-serine is produced from glycine and formaldehyde using the immobilized enzyme. There is a method to do (Patent Document 1).
Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス（メタクリルアミド）・グリシジルメタクリレート・アリルグリシジルエーテル・メタクリルアミド共重合体に固定化されていることを特徴とする、枯草菌由来の酵素を固定化した、固定化アセチルハイドロラーゼがある（特許文献２）。 Immobilized acetyl immobilized with an enzyme derived from Bacillus subtilis, characterized in that it is immobilized on an N, N′-methylene-bis (methacrylamide) / glycidyl methacrylate / allyl glycidyl ether / methacrylamide copolymer. There is a hydrolase (Patent Document 2).
酵素タンパク質のカルボキシ末端側に、システイン残基をカルボキシ末端とする数個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を導入して、改変酵素タンパク質を調製した後、そのカルボキシ末端のシステイン残基におけるメルカプト基を介して、固定化担体に結合させることにより、固定化酵素を製造する方法がある（特許文献３）。 An amino acid sequence consisting of several amino acid residues having a cysteine residue as the carboxy terminus is introduced into the carboxy terminus of the enzyme protein to prepare a modified enzyme protein, and then the mercapto group in the cysteine residue at the carboxy terminus is introduced. There is a method for producing an immobilized enzyme by binding to an immobilized carrier (Patent Document 3).
再生粒状多孔質キトサン担体に対し、ビニルアルコールのアルキルエーテルと無水マレイン酸との共重合体溶液を、該担体１乾燥重量部に対し、０．０５〜０．６０乾燥重量部反応させた後、該溶液を除去し、次いで、酵素水溶液を加え、酵素を固定化した固定化酵素の製造方法がある（特許文献４）。 After reacting a copolymer solution of vinyl alcohol alkyl ether and maleic anhydride with a regenerated granular porous chitosan support, 0.05 to 0.60 dry parts by weight with respect to 1 part by weight of the support, There is a method for producing an immobilized enzyme by removing the solution and then adding an aqueous enzyme solution to immobilize the enzyme (Patent Document 4).
寒天を用いて調製した寒天ゲルを、固定化担体として、多点結合法により、酵素を固定化する方法であって、寒天ゲルに、グリシドール（２，３−エポキシプロパノール）を反応させて、プロパンジオール基を導入し、次いで、過ホウ素酸ナトリウムを反応させて、アセトアルデヒド基とした後、酵素を固定化することを特徴とする固定化酵素の製造方法がある（特許文献５）。 A method for immobilizing an enzyme by an agar gel prepared using agar as an immobilization carrier by a multi-point binding method, in which glycidol (2,3-epoxypropanol) is reacted with propane There is a method for producing an immobilized enzyme characterized by introducing a diol group and then reacting sodium perborate to form an acetaldehyde group and then immobilizing the enzyme (Patent Document 5).
エピクロルヒドリンで架橋した澱粉、エピクロルヒドリンで架橋したグアーガム及びセルロースの中から選ばれた少なくとも１種の物質を充填したカラムに、水又は硫酸アンモニウムの溶液中で、糖質関連酵素を吸着させ、硫酸アンモニウム溶液で洗浄して、該酵素以外の不純物を除去した後、水又は緩衝液を用いて、該吸着酵素を溶離して回収することを特徴とする高純度糖質関連酵素の製造方法、並びに該酵素を用いる固定化糖質関連酵素の製造方法がある（特許文献６）。 Glucose-related enzymes are adsorbed in water or ammonium sulfate solution to a column packed with at least one substance selected from epichlorohydrin-crosslinked starch, epichlorohydrin-crosslinked guar gum and cellulose, and washed with ammonium sulfate solution. Then, after removing impurities other than the enzyme, the adsorbed enzyme is eluted and collected using water or a buffer solution, and a method for producing a high-purity carbohydrate-related enzyme, and the enzyme are used. There is a method for producing an immobilized carbohydrate-related enzyme (Patent Document 6).
本方法では、特定の物質をカラムに充填し、流速が保持できる酵素吸着用担体を用いて、水又は硫安溶液中で、糖質関連酵素を吸着し、酵素以外の不純物を同溶液で洗浄・除去して、酵素結合ゲル、酵素結合物とし、純水又は緩衝液で、該酵素を溶離して、精製酵素を得て、更に、該酵素を各種の固定化基材と混合し、ゼラチンなどで結合させて、固定化酵素製材としている。 In this method, a specific substance is packed in a column, and an enzyme-supporting carrier that can maintain a flow rate is used to adsorb carbohydrate-related enzymes in water or ammonium sulfate solution, and impurities other than enzymes are washed with the same solution. Remove the enzyme-bound gel, enzyme-bound product, elute the enzyme with pure water or buffer to obtain purified enzyme, mix the enzyme with various immobilization substrates, gelatin, etc. To make immobilized enzyme lumber.
澱粉を、ジアルデヒド化するためには、通常、澱粉を溶解して、反応させる（非特許文献３）。澱粉を、水媒体中にて、触媒の存在下、過酸化物を使用して、酸化反応を行う際に、一旦、澱粉を含む水媒体を、当該澱粉の糊化開始温度以上に加熱して、糊化した後、糊化開始温度以下の温度に冷却し、次いで、過酸化物を供給して、反応を行なうことを特徴とする澱粉の酸化方法がある（特許文献７）。 In order to dialdehydeize starch, usually starch is dissolved and reacted (Non-patent Document 3). When the starch is oxidized in an aqueous medium using a peroxide in the presence of a catalyst, the aqueous medium containing the starch is once heated above the gelatinization start temperature of the starch. There is a starch oxidation method characterized in that after gelatinization, the mixture is cooled to a temperature equal to or lower than the gelatinization start temperature, and then a peroxide is supplied to perform the reaction (Patent Document 7).
グルタルアルデヒド架橋法により、キトサンビーズに、クレアチニンデイミナーゼを固定化した例がある（非特許文献４）。作用極の上に、グルタルアルデヒド架橋牛血清アルブミン膜及びグルコースオキシダーゼ含有光架橋樹脂膜を、順次形成せしめてなる尿糖バイオセンサ、グルコースオキシダーゼ含有光架橋樹脂膜上に、更に、グルコースオキシダーゼ非含有光架橋樹脂膜を形成せしめてなる尿糖バイオセンサがある（特許文献８）。 There is an example in which creatinine deiminase is immobilized on chitosan beads by a glutaraldehyde crosslinking method (Non-patent Document 4). A glutaraldehyde-crosslinked bovine serum albumin film and a glucose oxidase-containing photocrosslinked resin film are sequentially formed on the working electrode, a glucose oxidase-containing photocrosslinked resin film, and a glucose oxidase-free light. There is a urine sugar biosensor in which a crosslinked resin film is formed (Patent Document 8).
酵素や牛血清アルブミンなどの蛋白質膜を、ガラス基板上に、均一に、しかも安定して、再現性良く塗布し得る固定化酵素膜の形成方法がある（特許文献９）。ヒスタミンオキシダーゼが、多孔性アルキルアミノ化ガラス、多孔性アミノ化ポリアクリロニトリル及び多孔性アルキルアミノ化セラミックスから成る群より選ばれた少なくとも１種のものに固定化され、グルタルアルデヒド架橋法によって、担体に固定化した場合、固定化率が９０％以上と極めて高く、カラムに詰めて使用する場合、ビーズ状担体に固定化する方法がある（特許文献１０） There is a method for forming an immobilized enzyme film that can apply a protein film such as an enzyme or bovine serum albumin uniformly, stably and with good reproducibility on a glass substrate (Patent Document 9). Histamine oxidase is immobilized on at least one member selected from the group consisting of porous alkylaminated glass, porous aminated polyacrylonitrile, and porous alkylaminated ceramics, and fixed to the carrier by the glutaraldehyde crosslinking method. In the case of use, the immobilization rate is extremely high as 90% or more, and there is a method of immobilizing on a bead-shaped carrier when used in a column (Patent Document 10).
固定化担体と固定化法について検討した例があり、不織布、バイオキューブ、セライト、キトパール、ウレタンフォームの特性を比較検討した結果、不織布が、他の担体よりタンパク質の吸着量が最も高かった、としている（非特許文献５）。 There are examples that examined immobilization carriers and immobilization methods, and as a result of comparing the characteristics of non-woven fabric, biocube, celite, chitopearl, urethane foam, non-woven fabric had the highest amount of protein adsorption than other carriers (Non-Patent Document 5).
ヘミセルラーゼを、グルタルアルデヒド処理によって、多孔性ガラスに固定化し、また、カルボジイミド処理によって、シリカゲルに固定化することを試み、多孔性ガラスに固定化することで、高い酵素活性が得られている（非特許文献６）。 Hemicellulase was immobilized on porous glass by glutaraldehyde treatment, and was attempted to be immobilized on silica gel by carbodiimide treatment, and high enzyme activity was obtained by immobilizing on porous glass ( Non-patent document 6).
キシラナーゼの固定化において、キトサンを担体として、グルタルアルデヒド処理によって、固定化した酵素は、高い操作安定性を示したという報告もある（非特許文献７）。 キシラナーゼを、カルボジイミド処理により、可溶性高分子（ポリビニルアルコール）に固定化し、６０％の活性回収率が得られることを示した例がある（非特許文献８）。 In the immobilization of xylanase, there is also a report that the enzyme immobilized by glutaraldehyde treatment using chitosan as a carrier showed high operational stability (Non-patent Document 7). There is an example in which xylanase is immobilized on a soluble polymer (polyvinyl alcohol) by carbodiimide treatment and an activity recovery rate of 60% is obtained (Non-patent Document 8).
キシラナーゼの固定化を行い、グルタルアルデヒド架橋処理によって、ダイヤイオンＨＰ２００に固定化した酵素を用いた限外濾過型バイオリアクターにより、キシロビオースの製造が可能であることを報告している例がある（非特許文献９）。キシラナーゼを、ガラスビーズに固定化することにより、酵素の熱安定性が向上することを明らかにした報告もある（非特許文献１０）。 There is an example that reports that xylobiose can be produced by an ultrafiltration bioreactor using an enzyme immobilized on Diaion HP200 by immobilization of xylanase and glutaraldehyde cross-linking treatment. Patent Document 9). There is also a report that clarifies that the thermal stability of an enzyme is improved by immobilizing xylanase on glass beads (Non-patent Document 10).
関連技術として、優れた経時変化耐性、電子レンジ耐性及び風味を付与することができる澱粉ペプチド複合体から成る食品用素材の製造法がある（特許文献１１）。本法では、「澱粉類は、水分調整を行なったものでも水分未調整のものでもいずれも使用し得るが、含水率を８〜２５％、特に１５〜２０％に調整した澱粉が好ましい。澱粉類とペプチドとの反応は、常圧又は９００ｋＰａ［Ｇ］以下の加圧下で、温度１００〜１８０℃にて１０分間〜５時間、特に２０分間〜３時間加熱処理することが好ましい。」としている。 As a related technique, there is a method for producing a food material comprising a starch peptide complex capable of imparting excellent aging resistance, microwave resistance and flavor (Patent Document 11). In this method, “starch can be used either with or without moisture adjustment, but starch with a moisture content adjusted to 8 to 25%, particularly 15 to 20% is preferred. The reaction between the peptide and the peptide is preferably heat-treated at normal temperature or under a pressure of 900 kPa [G] or less at a temperature of 100 to 180 ° C. for 10 minutes to 5 hours, particularly 20 minutes to 3 hours. .
澱粉粒に、水分を添加して、粉末状態又は分散状態で、加熱処理し、粒表面を糊化させれば、室温又は定温放置により老化又は固化し、難消化性及び／又は物性が改変されることは、本発明者らによる先願（特許文献１２）で提案されている。 If moisture is added to starch granules and heat treatment is performed in a powdered or dispersed state to gelatinize the surface of the grains, they are aged or solidified by standing at room temperature or at a constant temperature, and the indigestibility and / or physical properties are modified. This is proposed in the prior application (Patent Document 12) by the present inventors.
物理的吸着に先駆けて、澱粉加水分解酵素を、ジアゾ化合物、グルタルアルデヒドなどのモノ又は多機能試薬で修飾又は架橋し、水不溶性担体、活性炭、ガラス、珪藻土、リン酸カルシウムゲル澱粉、アミロースなどに澱粉加水分解酵素を物理的吸着により固定化する方法がある（特許文献１３）。 Prior to physical adsorption, starch hydrolase is modified or cross-linked with mono- or multifunctional reagents such as diazo compounds and glutaraldehyde, and starch hydrolyzed to water-insoluble carriers, activated carbon, glass, diatomaceous earth, calcium phosphate gel starch, amylose, etc. There is a method of immobilizing a degrading enzyme by physical adsorption (Patent Document 13).
このように、固定化酵素の生産には、各種の方法があり、各種の原料から、各種の生産物が製造されている。しかし、これらの固定化酵素の生産方法は、一般に、高コストで、煩雑な工程があり、更に、固定化酵素への生産物の吸着、不要物の混入の可能性があり、また、目的の素材が効率的に得られないなどの不利な面もあるのが実情である。一方、澱粉粒は、安定性に優れ、食品素材として、安全で、大量に生産され、これを固定化酵素の担体として利用できれば、酵素作用で生成されたものを担体に含めた全体利用が可能であり、要すれば、分離も簡単であり、安全性にも優れた製品となると考えられる。 Thus, there are various methods for producing an immobilized enzyme, and various products are produced from various raw materials. However, these immobilized enzyme production methods are generally expensive and have complicated steps. Furthermore, there is a possibility of adsorption of the product to the immobilized enzyme and the mixing of unnecessary substances. The fact is that there are disadvantages such as the inability to obtain materials efficiently. On the other hand, starch granules are excellent in stability, are safe as food materials, are produced in large quantities, and can be used as a carrier for immobilized enzymes. If necessary, it is considered that the product can be easily separated and has excellent safety.
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、簡便な方法で、食品製造に安全な固定化酵素の製造法を開発することを目標として鋭意研究を重ね、食品素材生産用に好適な材料として、澱粉とセルロースを選択し、これらに、澱粉加水分解酵素を結合させることを試みた結果、条件により、澱粉粒に、直接結合させ、目的とする酵素剤素材が調製できることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、澱粉粒又はセルロース粉末担体に、粉末状態を維持して澱粉加水分解酵素を結合させることを特徴する澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素の製造方法及びその澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素を提供することを目的とするものである。 Under such circumstances, the present inventors have conducted intensive research with the goal of developing a method for producing an immobilized enzyme that is safe for food production, in a simple manner, in view of the above-described conventional techniques. As a result of selecting starch and cellulose as suitable materials for material production, and trying to bind starch hydrolyzing enzyme to them, depending on the conditions, it is directly bonded to starch granules, and the target enzyme agent material is obtained. It was found for the first time that it could be prepared, and the present invention was completed. The present invention relates to a method for producing a starch granule or cellulose powder-immobilized starch hydrolase, wherein the starch hydrolyzing enzyme is bound to the starch granule or cellulose powder carrier while maintaining the powder state, and the starch granule or cellulose powder An object of the present invention is to provide an immobilized starch hydrolase.
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）澱粉粒の形態を保持した澱粉粒又はセルロース粉末に、澱粉加水分解酵素を混合し、当該澱粉粒又はセルロース粉末担体に、粉末状態を維持して澱粉加水分解酵素を結合させて澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素とする澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素の製造方法であって、
１）その際に、澱粉粒に、澱粉加水分解酵素を含む水又はエタノール水溶液を、澱粉粒重量当たり５〜４０％加えて混合して、当該澱粉粒に、粉末状態を維持して澱粉加水分解酵素を結合させて固定化する、
２）上記澱粉粒として、該澱粉粒に、α−アミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼを作用させて、その表面に、穴を開けた澱粉粒又は粒表面を一部糊化した澱粉粒を用いる、
３）澱粉粒又はセルロース粉末表面をタンパク質で被覆してから、澱粉加水分解酵素を結合させる処理を行う、
ことを特徴とする澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素の製造方法。
（２）澱粉粒表面又はセルロース粉末を、酸化処理した後に、澱粉加水分解酵素を結合させ処理を行う、前記（１）に記載の澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素の製造方法。
（３）澱粉加水分解酵素が、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、又はサイクロデキストリン合成酵素である、前記（１）又は（２）に記載の澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素の製造方法。
（４）タンパク質が、卵白、ゼラチン、カゼインナトリウム、又はツェインである、前記（１）に記載の澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素の製造方法。
（５）澱粉加水分解酵素と担体を、グルタルアルデヒドで結合させる、前記（１）に記載の澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素の製造方法。
（６）前記（１）から（５）のいずれかに記載の方法で製造して成る澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素であって、
澱粉粒の形態を保持した澱粉粒又はセルロース粉末担体に、粉末状態を維持して澱粉加水分解酵素を結合させて固定化した構造を有することを特徴とする澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素。
The present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
(1) A starch hydrolyzing enzyme is mixed with the starch granule or cellulose powder retaining the form of the starch granule, and the starch hydrolyzing enzyme is bonded to the starch granule or the cellulose powder carrier while maintaining the powder state. or a grout granular or manufacturing method of the cellulose powder immobilized starch hydrolyzing enzyme shall be the cellulose powder immobilized starch hydrolase,
1) At that time, 5 to 40% of starch granule water or ethanol aqueous solution containing starch hydrolyzing enzyme is added to and mixed with the starch granule, and the starch granule is maintained in a powder state to hydrolyze starch. Bind and immobilize the enzyme,
2) As the starch granules, α-amylase and / or glucoamylase is allowed to act on the starch granules, and on the surface, starch granules having holes or starch granules obtained by partially pasting the grain surfaces are used.
3) The surface of starch granules or cellulose powder is coated with protein, and then the starch hydrolyzing enzyme is bound.
A method for producing a starch hydrolyzing enzyme having immobilized starch granules or cellulose powder.
( 2 ) The method for producing a starch granule or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzing enzyme according to ( 1) , wherein the starch granule surface or cellulose powder is oxidized, and then the starch hydrolyzing enzyme is bound thereto for treatment.
( 3 ) The starch granule or cellulose powder fixed starch hydrolyzed according to (1) or (2) above, wherein the starch hydrolase is α-amylase, β-amylase, glucoamylase, pullulanase, or cyclodextrin synthase. A method for producing a degrading enzyme.
( 4 ) The method for producing a starch granule or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzing enzyme according to ( 1 ), wherein the protein is egg white, gelatin, sodium caseinate, or zein.
( 5 ) The manufacturing method of the starch granule or cellulose powder fixed starch hydrolase as described in said ( 1 ) which couple | bonds a starch hydrolase and a support | carrier with glutaraldehyde.
( 6 ) A starch granule or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzing enzyme produced by the method according to any one of (1) to ( 5 ),
A starch granule or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzed with a structure in which starch hydrolyzing enzyme is bound and immobilized on a starch granule or cellulose powder carrier that retains the form of starch granules. enzyme.
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、澱粉粒又はセルロース粉末に、澱粉加水分解酵素を結合させることを特徴する澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素の製造方法及びその澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素であり、固定化するための条件として、澱粉粒に、水を、澱粉粒重量当たり５〜４０％加えて、澱粉加水分解酵素を混合、結合させること、また、固定化を強くするために、α−アミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼを作用させて、その表面に、穴を開けた澱粉粒又は粒表面を一部糊化した澱粉粒を用いること、また、結合を強化するために、澱粉粒表面又はセルロース粉末を酸化処理した後に、澱粉加水分解酵素を結合させること、澱粉粒表面又はセルロースを、タンパク質で被覆し、グルタルアルデヒドで処理して、澱粉加水分解酵素を結合すること、などを特徴とするものである。
Next, the present invention will be described in more detail.
The present invention relates to a method for producing starch hydrolyzing starch starch or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzing enzyme characterized in that starch hydrolyzing enzyme is bound to starch granule or cellulose powder, and starch starch or cellulose powder-immobilizing starch hydrolyzing enzyme. Yes, as conditions for immobilization, water is added to the starch granules in an amount of 5 to 40% per starch granule weight, and the starch hydrolyzing enzyme is mixed and bound, and in order to strengthen the immobilization, α -Using amylase and / or glucoamylase to act on the surface, using a granulated starch granule or a granulated part of the granule surface, and in order to strengthen the binding, After the cellulose powder is oxidized, the starch hydrolyzing enzyme is bound, the starch granule surface or cellulose is coated with protein, treated with glutaraldehyde, and starch added. Combining the enzyme, it is characterized in including.
本発明では、澱粉粒又はセルロース粉末に、水分を少なくするようにして、澱粉加水分解酵素の水又はエタノール水溶液を混合、撹拌して、澱粉加水分解酵素を結合させ、粉末又は分散状態を維持して、原料に作用させる方法を確立した。澱粉加水分解酵素の量と種類は、任意であり、目的に応じて適宜選択する。エタノール濃度も任意である。澱粉粉末に添加する水又はエタノール溶液の量を調整することが肝要であり、適量は、澱粉粉末に対して、５〜４０％であり、３０％が好適である。 In the present invention, the starch granule or cellulose powder is mixed with water and ethanol aqueous solution of starch hydrolase to reduce the water, and the starch hydrolase is bound to maintain the powder or dispersed state. And established a method to act on the raw material. The amount and type of starch hydrolase are arbitrary and are appropriately selected according to the purpose. The ethanol concentration is also arbitrary. It is important to adjust the amount of water or ethanol solution added to the starch powder, and the appropriate amount is 5 to 40% with respect to the starch powder, preferably 30%.
水又はエタノール水溶液を、これ以上添加すると、４５％程度で、澱粉が団子状に固まり、５０％では、揺変性（チキソトロピー、Ｔｈｉｘｏｔｒｏｐｉｅ）で、これ以上の水の添加では、液状を呈し、このままでは、本発明の方法では使えない。しかし、室温通風乾燥すれば、使えるようになる。 When water or ethanol aqueous solution is further added, starch is solidified in about 45%, and at 50%, thixotropy is present, and when water is further added, it becomes liquid, It cannot be used in the method of the present invention. However, it can be used if it is air-dried at room temperature.
澱粉加水分解酵素の種類には、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、サイクロデキストリン合成酵素（以下、ＣＧＴａｓｅと略称することがある）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、マルトトリオース生成酵素、マルトテトラオース生成酵素、マルトペンタオース生成酵素、マルトヘキサオース生成酵素があり、澱粉加水分解酵素に限らず、スクラーゼ、ラクターゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼなどの糖質加水分解酵素、タンパク質、ペプチド加水分解酵素、その他の酵素でも、本発明の方法を適用可能である。 The types of starch hydrolyzing enzymes include α-amylase, β-amylase, glucoamylase, cyclodextrin synthase (hereinafter sometimes abbreviated as CGTase), pullulanase, isoamylase, maltotriose producing enzyme, maltotetraose. There are enzyme producing enzymes, maltopentaose producing enzymes, maltohexaose producing enzymes, not only starch hydrolyzing enzymes, but also sugar hydrolyzing enzymes such as sucrase, lactase, hemicellulase, cellulase, protein, peptide hydrolyzing enzymes, etc. The method of the present invention can also be applied to an enzyme.
穴あき澱粉粒の製法には、本発明者ら（深井、高木、小林）の方法があり、文献［日本農藝化學會誌，６８（４），７９３−８００（１９９４）］に掲載されているが、本発明では、該方法により作製したこの穴あき澱粉粒を、空洞澱粉と呼称する。また、澱粉粒表面を糊化させる方法は、本発明者らによる先願（特願２００７−２３３４６３）に掲載されており、すなわち、澱粉粉末に、水又は水溶液を、澱粉重量当たり３０％程度に添加して、大気中、高温で、焙焼する方法、が適宜用いられる。 There is a method of the present inventors (Fukai, Takagi, Kobayashi) as a method for producing perforated starch granules, which is published in a literature [Nippon Agricultural Chemical Journal, 68 (4), 793-800 (1994)]. However, in the present invention, the perforated starch granules produced by the method are referred to as hollow starch. Moreover, the method of gelatinizing the starch grain surface is published in the prior application by the present inventors (Japanese Patent Application No. 2007-233463), that is, water or an aqueous solution is added to starch powder at about 30% per starch weight. A method of adding and roasting at high temperature in the atmosphere is appropriately used.
澱粉粒に、直接、澱粉加水分解酵素を結合させて反応に用いると、澱粉粒が徐々に加水分解作用を受け、同時に、酵素が離脱する。そこで、直接、澱粉加水分解酵素の作用を受けないか、受け難いようにする方法が求められる。これに対応して、澱粉粒、空洞澱粉表面を酸化すれば、澱粉加水分解酵素の作用を受け難くすると同時に、該処理澱粉粒への澱粉加水分解酵素の結合を増強することができる。更には、澱粉加水分解酵素の作用を防御するために、澱粉粒表面を被覆することが考えられ、安全性の高い、食品素材での被覆と、酵素との結合の増強が可能である。本発明では、これらを、澱粉酸化処理粉末と呼称する。 When starch hydrolyzing enzyme is directly bonded to starch granules and used in the reaction, the starch granules are gradually hydrolyzed and the enzyme is released at the same time. Therefore, there is a need for a method that does not directly or easily receives the action of starch hydrolase. Correspondingly, if the starch granules and the surface of the hollow starch are oxidized, the action of the starch hydrolase can be made difficult, and at the same time, the binding of the starch hydrolase to the treated starch granules can be enhanced. Furthermore, in order to protect the action of the starch hydrolyzing enzyme, it is conceivable to coat the surface of the starch granules, and the coating with a food material and the binding with the enzyme can be enhanced with high safety. In the present invention, these are called starch oxidation-treated powders.
タンパク質の表面被覆素材としては、卵白が好適に利用できる。卵白のタンパク質は、オボグロビン、オボアルブミン、糖タンパクからなり、６２℃で、凝固し、８０℃以上で、完全に凝固する。卵白は、約８９％が水分であるが、水を加えると、白濁する。少量の食塩を加えて、生理的食塩水程度の食塩濃度にすると、透明に溶解するので、この状態で、澱粉粒又はセルロース粉末を混合して、被覆する。被覆用タンパク質溶液の濃度は限定されないが、均等被覆には、２．５〜２０％が好適である。 Egg white can be suitably used as the protein surface coating material. Egg white protein consists of ovoglobin, ovalbumin, and glycoprotein, which coagulates at 62 ° C. and completely coagulates at 80 ° C. or higher. Egg white is about 89% water, but becomes cloudy when water is added. When a small amount of salt is added to obtain a salt concentration of about physiological saline, it dissolves transparently. In this state, starch granules or cellulose powder are mixed and coated. The concentration of the protein solution for coating is not limited, but 2.5 to 20% is suitable for uniform coating.
なお、被覆の際の水溶液の添加量は、澱粉粒の場合は、３０〜４０％、セルロース粉末では、５０％程度が好適で、粉末状を保持することができる。粉末状で、高温処理することにより、分散状の澱粉粒又はセルロース粉末が得られる。また、タンパク質素材に、糖質が混入していると、高温処理によるメイラード反応で、着色することがあるが、着色状態でも、本発明の方法は適用できる。 In addition, the addition amount of the aqueous solution at the time of coating is preferably 30 to 40% in the case of starch granules and about 50% in the case of cellulose powder, and can maintain the powder form. Dispersed starch granules or cellulose powder can be obtained by high-temperature treatment in powder form. Further, when a carbohydrate is mixed in a protein material, it may be colored by a Maillard reaction by high-temperature treatment, but the method of the present invention can be applied even in a colored state.
プロラミン蛋白は、含水アルコールに可溶な蛋白であり、トウモロコシ由来のプロラミンは、ツェイン（ゼイン）と呼称される。ツェイン蛋白は、５０％エタノール水溶液に、５％濃度に溶解して被覆する。また、カゼインは、牛乳タンパク質の１つで、カゼイン自体は、水に溶けないので、アルカリで中和し、ナトリウム塩とした水溶性のカゼインナトリウムが製品化されているので、これを利用することができる。また、ゼラチンは、動物の皮膚や骨に含まれる結合組織を構成する繊維性蛋白質の１種であるコラーゲンを、温水で加熱抽出することにより得られる、変性させたコラーゲンであり、水溶性タンパク質である。 Prolamin protein is a protein soluble in hydrous alcohol, and corn-derived prolamin is called zein. The zein protein is dissolved and coated in a 50% ethanol aqueous solution at a concentration of 5%. Casein is one of the milk proteins. Casein itself does not dissolve in water, so water-soluble sodium caseinate that has been neutralized with alkali and made into a sodium salt has been commercialized. Can do. Gelatin is a denatured collagen obtained by heat extraction of collagen, which is one type of fibrous protein constituting the connective tissue contained in animal skin and bone, with warm water, and is a water-soluble protein. is there.
このように、ゼラチン、カゼインのような動物性タンパク質、大豆タンパク質、卵タンパク質、小麦タンパク質、トウモロコシタンパク質のような植物タンパク質、いずれでも、本発明の方法は、適用でき、また、タンパク質系に限らず、粒表面を被覆でき、担体が澱粉加水分解酵素の作用を受けないか、受け難くすることができる糖質系、例えば、増粘多糖類が利用可能である。 Thus, the method of the present invention can be applied to any animal protein such as gelatin and casein, soy protein, egg protein, wheat protein, and plant protein such as corn protein, and is not limited to protein systems. Sugar systems, such as thickening polysaccharides, that can coat the grain surface and can make the carrier unaffected or less susceptible to starch hydrolase are available.
原料からの生成物を、ＨＰＬＣにより分析して、酵素作用を評価する。分析は、脱気装置（ＥＲＣ−３３１０，エルマ（株）），ポンプ（８８０−Ｕ，日本分光（株）），示差屈折検出器（ＲＩＤ−３００，日本分光（株）），記録計（Ｓｉｃ Ｃｈｒｏｍａｔｏｏｒｄｅｒ １２，），高速液体クロマトグラフィー用充填カラム（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＮＨ２（５μｍ），φ４．０×２５０ｍｍ，関東化学（株））からなる高速液体クロマトシステムを用いて、分析操作を行う。
The product from the raw material is analyzed by HPLC to evaluate the enzyme action. The analysis was performed using a deaerator (ERC-3310, Elma Co., Ltd.), a pump (880-U, JASCO Corporation), a differential refraction detector (RID-300, JASCO Corporation), and a recorder (Sic Analysis operation is performed using a high performance liquid chromatographic system comprising Chromatoder 12, and a packed column for high performance liquid chromatography (
試料は、マイクロシリンジ（７０２ＳＮＲ，ハルミトン（株））を用いて、１％糖液、１成分の場合、１０μＬインジェクターに注入する。溶離液に、６５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液を用い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、室温２５℃で分析する。反応後、反応液を、密閉バイアルに一部採取、密閉して、沸騰水浴中で、５分間、失活処理して、試料とする。 A sample is injected into a 10 μL injector in the case of 1% sugar solution and one component using a microsyringe (702SNR, Halmiton Co., Ltd.). A 65% (v / v) acetonitrile aqueous solution is used as an eluent, and analysis is performed at a flow rate of 1.0 mL / min and a room temperature of 25 ° C. After the reaction, a part of the reaction solution is collected in a sealed vial, sealed, and inactivated in a boiling water bath for 5 minutes to prepare a sample.
α−アミラーゼ用基質としては、γ−サイクロデキストリンを用い、グルコアミラーゼの共存下で、澱粉加水分解酵素固定化澱粉粒試料を作用させ、消失したγ−サイクロデキストリンの算出と、生成したグルコースを検出する。これは、γ−サイクロデキストリンは、α−アミラーゼにより、加水分解を受けるが、グルコアミラーゼは、γ−サイクロデキストリンに全く作用しないことを利用するものである。加水分解率については、初発γ−サイクロデキストリンピークの面積と反応後のγ−サイクロデキストリンピークの面積の差／初発γ−サイクロデキストリンピークの面積、として、加水分解率を求める。 As a substrate for α-amylase, γ-cyclodextrin is used, and in the presence of glucoamylase, starch hydrolyzing enzyme-immobilized starch granule sample is allowed to act, calculation of lost γ-cyclodextrin and detection of generated glucose To do. This is because γ-cyclodextrin is hydrolyzed by α-amylase, but glucoamylase does not act on γ-cyclodextrin at all. As for the hydrolysis rate, the hydrolysis rate is determined as the difference between the area of the initial γ-cyclodextrin peak and the area of the γ-cyclodextrin peak after reaction / the area of the initial γ-cyclodextrin peak.
β−アミラーゼ用基質としては、マルトトリオシル−α−サイクロデキストリンを用いる。これは、β−アミラーゼが、マルトトリオシル−α−サイクロデキストリンの枝部分のマルトトリオシル基に作用し、グルコシル基に切断して、マルトースとグルコシル−α−サイクロデキストリンが生成することを利用するものである。加水分解率については、生成マルトース＋グルコシル−α−サイクロデキストリンピークの面積／初発マルトトリオシル−α−サイクロデキストリンピークの面積、として、加水分解率を求める。 As a substrate for β-amylase, maltotriosyl-α-cyclodextrin is used. This utilizes the fact that β-amylase acts on the maltotriosyl group of the branch of maltotriosyl-α-cyclodextrin and cleaves into a glucosyl group to produce maltose and glucosyl-α-cyclodextrin. Is. About a hydrolysis rate, a hydrolysis rate is calculated | required as a production | generation maltose + the area of a glucosyl-alpha-cyclodextrin peak / the area of an initial maltotriosyl-alpha-cyclodextrin peak.
グルコアミラーゼ用基質としては、マルトシル−α−サイクロデキストリンを用いる。これは、グルコアミラーゼが、マルトシル−α−サイクロデキストリンの枝部分のマルトシル基をグルコシル基に切断して、グルコースとグルコシル−α−サイクロデキストリンが生成することを利用するものである。加水分解率については、生成グルコース＋グルコシル−α−サイクロデキストリンピークの面積／初発マルトシル−α−サイクロデキストリンピークの面積、として、加水分解率を求める。 As a substrate for glucoamylase, maltosyl-α-cyclodextrin is used. This utilizes the fact that glucoamylase cleaves the maltosyl group of the branch of maltosyl-α-cyclodextrin into glucosyl groups to produce glucose and glucosyl-α-cyclodextrin. About a hydrolysis rate, a hydrolysis rate is calculated | required as the area of produced | generated glucose + glucosyl-alpha-cyclodextrin peak / the area of the initial maltosyl-alpha-cyclodextrin peak.
プルラナーゼ用基質としては、マルトシル−α−サイクロデキストリンを用いる。これは、マルトシル基を切断して、マルトースとα−サイクロデキストリンが生成することを利用するものである。加水分解率については、生成マルトース＋α−サイクロデキストリンピークの面積／初発マルトシル−α−サイクロデキストリンピークの面積、として、加水分解率を求める。 As a substrate for pullulanase, maltosyl-α-cyclodextrin is used. This utilizes the fact that maltose group and α-cyclodextrin are formed by cleaving the maltosyl group. About a hydrolysis rate, a hydrolysis rate is calculated | required as the area | region of the production | generation maltose + alpha-cyclodextrin peak / area of the initial maltosyl-alpha-cyclodextrin peak.
ＣＧＴａｓｅ用の基質としては、マルトヘプタオースを用いる。これは、α−サイクロデキストリンが生成することを利用するものである。加水分解率については、生成α−サイクロデキストリンピークの面積／初発マルトヘプタオースピークの面積、として、加水分解率を求める。なお、ＣＧＴａｓｅの反応初期には、α−サイクロデキストリンの生成が主体である。測定例のＨＰＬＣプロファイルについては、後記する。 As a substrate for CGTase, maltoheptaose is used. This utilizes the production of α-cyclodextrin. About a hydrolysis rate, a hydrolysis rate is calculated | required as the area of the production | generation (alpha) -cyclodextrin peak / the area of the initial maltoheptaose peak. In the initial stage of CGTase reaction, α-cyclodextrin is mainly produced. The HPLC profile of the measurement example will be described later.
次に、固定化酵素の調製について説明する。４００ｍｇのセルロース粉末に、４００μＬの酵素水又はエタノール水溶液を加えて、スパーテルで撹拌する。適度な湿潤粉末状態となる。粉末状態を保持できる酵素水又はエタノール水溶液の量は、セルロース当たり５０％から１５０％である。５０％では、パサパサ状態となり、１００％では、湿潤粉末状態となり、１５０％では、まとまってケーキ状態となる。これ以上の量を添加した場合は、懸濁液状となるが、室温風乾して分散させれば、酵素反応に用いることができる。 Next, preparation of the immobilized enzyme will be described. 400 μL of enzyme water or ethanol aqueous solution is added to 400 mg of cellulose powder and stirred with a spatula. A moderate wet powder state is obtained. The amount of the enzyme water or ethanol aqueous solution that can maintain the powder state is 50% to 150% per cellulose. If it is 50%, it will be in a dry state, 100% will be in a wet powder state, and 150% will be in a cake state. When an amount larger than this is added, it becomes a suspension, but can be used for enzyme reaction if it is air-dried at room temperature and dispersed.
好適な条件としては、４００ｍｇのセルロース粉末に、４００μＬの酵素溶液を加えて、撹拌し、室温で風乾して用いる。酵素溶液の濃度は、適宜変化させて用いることができる。一例として、市販試薬プルラナーゼでは、１０ｍｇ／ｍＬの水又はエタノール水溶液を調製して用いる。本条件で調製した酵素標品は、２回の反応で、生成率は、半減する。そこで、結合を増強することが求められる。 As a suitable condition, 400 μL of enzyme solution is added to 400 mg of cellulose powder, stirred, and air-dried at room temperature. The concentration of the enzyme solution can be changed as appropriate. As an example, in the commercially available reagent pullulanase, 10 mg / mL water or ethanol aqueous solution is prepared and used. The enzyme preparation prepared under these conditions halves the production rate in two reactions. Therefore, it is required to enhance the binding.
セルロースを、文献記載の方法［日本応用糖質科学会誌、Ｖｏｌ．４６、ｐｐ．４０７−４１２（１９９９）］に準拠して、酸化処理する。すなわち、セルロース分散液（１０ｇ／５００ｍＬ）に、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム５００ｍＬを、４℃、一夜、暗所で撹拌して反応させる。反応後、５００ｍＬの蒸留水で、３回洗浄して、洗浄後、室温で風乾して、粉末状とし、その後、１０５℃で、乾燥して、サラサラの粉末とすることができる。本発明では、これを、セルロース酸化処理粉末と呼称する。 Cellulose was prepared by the method described in the literature [Journal of Applied Glycoscience, Vol. 46, pp. 407-412 (1999)]. That is, 500 mL of 100 mM sodium periodate is stirred and reacted in a dark place at 4 ° C. overnight in a cellulose dispersion (10 g / 500 mL). After the reaction, it is washed three times with 500 mL of distilled water, and after washing, it is air-dried at room temperature to form a powder, and then dried at 105 ° C. to obtain a smooth powder. In the present invention, this is referred to as cellulose oxidized powder.
澱粉の酸化処理は、文献記載の方法［日本応用糖質科学会誌、Ｖｏｌ．４６、ｐｐ．４０７−４１２（１９９９）］に準拠して行う。すなわち、澱粉、懸濁液（１０ｇ／５００ｍＬ）に、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム５００ｍＬを、４℃で、一夜、暗所で撹拌して反応させる。反応後、５００ｍＬの蒸留水で、３回洗浄して、洗浄後、室温で風乾して、粉末状とし、その後、１０５℃で、乾燥して、サラサラの粉末とする。本発明では、これを、酸化処理澱粉粉末と呼称する。 The oxidation treatment of starch is carried out by the method described in the literature [Journal of Applied Glycoscience, Vol. 46, pp. 407-412 (1999)]. That is, starch and suspension (10 g / 500 mL) are reacted with 500 mL of 100 mM sodium periodate at 4 ° C. with stirring overnight in the dark. After the reaction, it is washed three times with 500 mL of distilled water, and after washing, air-dried at room temperature to form a powder, and then dried at 105 ° C. to obtain a smooth powder. In the present invention, this is referred to as oxidized starch powder.
セルロース又はセルロース酸化処理粉末に、タンパク質被覆をする。卵白を、０．９％食塩水に溶解し、セルロースに対して、同量を加えて、混合、撹拌し、１５０℃、１時間で、焙焼すれば、白色の粉末となる。焙焼温度に制限はないが、１８０℃で、１時間以上の焙焼では、着色が進む。なお、着色しても、固定化には影響しない。本発明では、これらを、タンパク質被覆処理セルロース粉末と呼称する。 Protein is coated on cellulose or cellulose oxidized powder. If egg white is dissolved in 0.9% saline, the same amount is added to cellulose, mixed, stirred, and roasted at 150 ° C. for 1 hour to give a white powder. Although there is no restriction | limiting in the baking temperature, Coloring advances in baking at 180 degreeC for 1 hour or more. In addition, even if it colors, fixation is not affected. In the present invention, these are referred to as protein-coated cellulose powder.
澱粉粒、空洞澱粉粒、酸化処理澱粉粉末に、タンパク質被覆をする。卵白を、０．９％食塩水に溶解し、澱粉粒に対して、３０％量を加えて、混合、撹拌し、１５０℃、１時間で、焙焼すれば、白色の粉末となる。澱粉の場合も、焙焼温度に制限はないが、１７０℃で、１時間以上の焙焼では、着色が進む。なお、着色しても、固定化には影響しない。本発明では、これらを、タンパク質被覆処理澱粉粉末と呼称する。 Protein coating is applied to starch granules, hollow starch granules, and oxidized starch powder. If egg white is dissolved in 0.9% saline, 30% amount is added to the starch granules, mixed, stirred, and baked at 150 ° C. for 1 hour to give a white powder. In the case of starch as well, the baking temperature is not limited, but coloring proceeds at 170 ° C. for baking for 1 hour or longer. In addition, even if it colors, fixation is not affected. In the present invention, these are called protein-coated starch powders.
タンパク質被覆処理セルロース粉末、タンパク質被覆処理澱粉粉末に、グルタルアルデヒドを用いて、澱粉加水分解酵素と架橋させ、更に、結合を強力にするには、被覆処理粉末２ｇを、０．２Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０）で調製した５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液２０ｍＬに加え、室温で、２時間、振盪した後（アルデヒド基導入）、ｐＨ６．５〜７．５に調整した蒸留水５０ｍＬで、２回洗浄し、本蒸留水を、酵素を溶解した溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）２０ｍＬに移し、室温で、２時間、振盪後、５℃で、一晩放置して、カップリングを行う。反応後、同蒸留水で澱粉を洗浄して、未反応の酵素を除去し、室温で乾燥し、澱粉加水分解酵素架橋固定化タンパク質被覆乾燥粉末を得る。 In order to crosslink the protein-coated cellulose powder and protein-coated starch powder with starch hydrolyzing enzyme using glutaraldehyde and further strengthen the binding, 2 g of the coated powder is added to 0.2 M carbonate buffer. In addition to 20 mL of 5% (v / v) glutaraldehyde solution prepared at (pH 10), after shaking for 2 hours at room temperature (introduction of aldehyde group), 50 mL of distilled water adjusted to pH 6.5 to 7.5, After washing twice, the distilled water is transferred to 20 mL of the enzyme-dissolved solution (50 mg / mL), shaken at room temperature for 2 hours, and then allowed to stand at 5 ° C. overnight for coupling. After the reaction, the starch is washed with the same distilled water to remove unreacted enzyme and dried at room temperature to obtain a starch hydrolyzing enzyme cross-linked immobilized protein-coated dry powder.
澱粉としては、コーンスターチ（ワキシ、ハイアミロース）、馬鈴薯、甘藷、タピオカ、サゴなど、粒構造を維持しているもの、反応媒体中、構造物で、澱粉加水分解酵素を保持できるものであれば、何れでも、本発明を適用することができる。 As starch, corn starch (waxy, high amylose), potato, sweet potato, tapioca, sago, etc. that maintain the grain structure, in the reaction medium, in the structure, can hold starch hydrolase, In any case, the present invention can be applied.
澱粉粒を、カラムに詰めたり、液状で作用させるとき、水分含有量により、固着する傾向がある。これを防止するために、空隙を均一に存在させることが有効であり、食品素材の生産に適当な素材として、セルロースが好適である。この他、活性炭、グラスビーズなどでも利用できるが、作用終了後の処理に、手数がかかる可能性がある。 When starch granules are packed in a column or acted in a liquid state, they tend to stick due to the water content. In order to prevent this, it is effective to make the voids uniformly present, and cellulose is suitable as a material suitable for the production of food materials. In addition, although activated carbon, glass beads, etc. can be used, there is a possibility that the processing after the end of the operation may be troublesome.
結合をより強くするための手段としては、糖質の特性を利用したものが適当であり、グルコースのポリマーである場合、２、３位の水酸基を、酸化により、アルデヒド基として、酵素のアミノ基と結合することが考えられる。 As a means for strengthening the bond, those utilizing the characteristics of carbohydrates are suitable. In the case of a glucose polymer, the hydroxyl groups at positions 2 and 3 are oxidized to form aldehyde groups to form amino groups of the enzyme. It is possible to combine with.
澱粉加水分解酵素の種類は、極めて多く、作用様式も異なるので、目的により、適宜選択すればよいが、本発明の方法では、澱粉加水分解酵素の種類に制限はない。また、澱粉加水分解酵素産生菌体を直接用いることも可能であるが、効率は高くないものと推測される。澱粉加水分解酵素の量は、任意であり、特に、合成を目的とした場合は、澱粉加水分解酵素の作用を増強させて用いることが望ましい。 The types of starch hydrolases are extremely many and their modes of action are different, and may be appropriately selected depending on the purpose. However, in the method of the present invention, the types of starch hydrolases are not limited. In addition, it is possible to use starch hydrolase-producing cells directly, but it is estimated that the efficiency is not high. The amount of starch hydrolyzing enzyme is arbitrary, and it is desirable to enhance the action of starch hydrolyzing enzyme, particularly for the purpose of synthesis.
澱粉の場合、粉末分散状で、高温処理しないと、表面のみの局部処理ができなくなり、本発明の方法が適用できなくなる。すなわち、澱粉は、粒を分散した状態にしてから、高温処理する。この状態以外では、溶解・糊化して、本発明の方法を適用することが困難となる。このような場合、粒構造をとらせ、表面が、液に浸漬したときに、溶解しないようにする。 In the case of starch, it is in a powder dispersion state, and unless it is treated at a high temperature, local treatment of only the surface cannot be performed, and the method of the present invention cannot be applied. That is, starch is processed at a high temperature after the grains are dispersed. Except for this state, it becomes difficult to apply the method of the present invention due to dissolution and gelatinization. In such a case, the grain structure is taken so that the surface does not dissolve when immersed in the liquid.
疎水性の環境にすると、遊離酵素では、不安定となるが、固定化すると、安定性が向上し、エタノール溶液中で反応させるができ、逆合成反応が起こりやすい。カラムに詰めて反応する場合、流速を早くするためには、澱粉加水分解酵素固定化澱粉に、セルロース又は澱粉加水分解酵素固定化セルロースを混合するか、澱粉加水分解酵素固定化セルロースを用いる。 In a hydrophobic environment, the free enzyme becomes unstable, but when immobilized, the stability is improved, the reaction can be carried out in an ethanol solution, and a reverse synthesis reaction is likely to occur. In order to increase the flow rate when packed in a column and react, cellulose or starch hydrolyzing enzyme-immobilized starch is mixed with starch hydrolyzing enzyme-immobilized starch, or starch hydrolyzing enzyme-immobilized cellulose is used.
オリゴ糖生成酵素としては、各種知られているが、これら酵素は、本発明の方法が適用でき、澱粉を可溶化した後、反応させて、各オリゴ糖を製造することができる。水酸基を持つ成分を、各種糖質と組合せ、澱粉加水分解酵素を作用させ、特に、ＣＧＴａｓｅを利用すれば、各種の配糖体が得られるので、本発明の方法を適用することができる。 Various oligosaccharide-producing enzymes are known. For these enzymes, the method of the present invention can be applied, and starch can be solubilized and then reacted to produce each oligosaccharide. Since a component having a hydroxyl group is combined with various carbohydrates and a starch hydrolyzing enzyme is allowed to act, and particularly, CGTase is used, various glycosides can be obtained, and therefore the method of the present invention can be applied.
澱粉粒に、タンパク質を被覆する方法としては、澱粉粒に、タンパク質溶液を混合撹拌して、粉末状にした状態で、高温加熱する方法、また、澱粉粒を、懸濁状態にして、タンパク質溶液に浸漬し、傾瀉して、タンパク質溶液を除去した後、室温で風乾して、粉末状態にした後に、高温加熱をする方法がある。澱粉粒を表面被覆することにより、澱粉の特性は、各様に変化させることができ、利用面は、拡大するが、本発明では、その一部を利用するものである。 As a method of coating protein on the starch granules, the protein solution is mixed and stirred in the starch granules and heated in a powdered state, and the starch granules are suspended in a protein solution. There is a method of heating at a high temperature after immersing in, decanting, removing the protein solution, air-drying at room temperature to form a powder. By covering the surface of the starch granules, the characteristics of the starch can be changed in various ways, and the use surface is expanded, but in the present invention, a part thereof is used.
本発明の方法は、被覆素材の選択、結合試薬の選択で、酸化還元酵素、異性化酵素、転移酵素など、種類を限定せず、各種の酵素の固定化に適用できる。セルロースも、同様にして、被覆し、利用することができる。 The method of the present invention can be applied to immobilization of various enzymes without limitation on types such as oxidoreductase, isomerase, transferase, etc., by selecting a coating material and a binding reagent. Cellulose can be coated and used in the same manner.
また、本発明の方法は、基本的には、タンパク質素材・成分（タンパク質、ペプチド、アミノ酸）、糖質素材・成分、脂質素材・成分などを、澱粉粒（天然澱粉から加工デンプン、ナノレベルの微粒子澱粉までを含む）、セルロースに粒子状態を保持しながら被覆する技術であり、本手法で、澱粉、セルロースの特性を変化させて、幅広い用途を開発することが可能であり、澱粉以外の粒状食品、小麦粉、米粉、微粒子食品にも適用し、物性変換、安定性向上などに利用可能である。特に、普通種澱粉粒に、モチトウモロコシ澱粉成分の被覆、タンパク質の重層被覆、香味成分などの被覆、重層被覆など、物性を変化させ、食味を改良した、新しいタイプの食品素材の製造に有用である。 In addition, the method of the present invention basically comprises a protein material / component (protein, peptide, amino acid), a carbohydrate material / component, a lipid material / component, etc., from starch granules (natural starch to modified starch, nano-level (Including fine-grained starch), a technology for coating cellulose while maintaining the particle state. With this method, it is possible to change the characteristics of starch and cellulose and develop a wide range of applications. It can also be applied to foods, wheat flour, rice flour, and fine particle foods, and can be used to change physical properties and improve stability. In particular, it is useful for the production of new types of food ingredients that have improved physical properties and improved taste, such as ordinary corn starch granules, coat of mochi corn starch, protein overlay, flavor ingredient, and overlay. is there.
以上のように、本発明は、固定化素材として、澱粉粒、セルロース粉末を選択し、これらの素材を担体として使用し、これらの担体に、澱粉加水分解酵素を固定化できる、安全、かつ簡便な方法で処理し、低コストで、固定化澱粉加水分解酵素を製造し、提供するものとして有用である。 As described above, the present invention selects starch granules and cellulose powder as an immobilization material, uses these materials as carriers, and can immobilize starch hydrolase on these carriers, which is safe and simple. Therefore, it is useful as a method for producing and providing an immobilized starch hydrolase at low cost.
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）澱粉粒に、澱粉粒重量当たり５〜４０％澱粉加水分解酵素を含む水又はエタノール水溶液を、粉末状態を維持して混合、撹拌して、澱粉加水分解酵素を結合させることで、固定化澱粉加水分解酵素を製造することができる。
（２）α−アミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼを作用させて、その表面に穴を開けた澱粉粒又は粒表面を一部糊化した澱粉粒を用いて、澱粉粒重量当たり５〜４０％澱粉加水分解酵素を含む水又はエタノール水溶液を、粉末状態を維持して混合、撹拌して、澱粉加水分解酵素を結合させ、固定化澱粉加水分解酵素を製造することができる。
（３）澱粉粒を酸化し、この酸化澱粉粒に、澱粉粒重量当たり５〜４０％、澱粉加水分解酵素を含む水又はエタノール水溶液を、粉末状態を維持して混合、撹拌して、室温で乾燥させて、澱粉加水分解酵素を結合させ、固定化澱粉加水分解酵素を製造することができる。
（４）セルロース粉末を酸化し、この酸化セルロース粉末に、セルロース重量当たり１０〜８０％、澱粉加水分解酵素を含む水又はエタノール水溶液を、粉末状態を維持して混合、撹拌して、澱粉加水分解酵素を結合させ、固定化澱粉加水分解酵素を製造することができる。
（５）澱粉粒又はセルロース粉末を、タンパク質で被覆し、乾燥タンパク質被膜粒に、粒重量当たり５〜８０％、澱粉加水分解酵素を含む水又はエタノール水溶液を、粉末状で混合、撹拌して、澱粉加水分解酵素を結合させ、固定化澱粉加水分解酵素を製造することができる。
（６）タンパク質被覆澱粉又はタンパク質被覆セルロースを、グルタルアルデヒド処理し、その後、澱粉加水分解酵素を結合させ、澱粉加水分解酵素を結合させ、固定化澱粉加水分解酵素を製造することができる。
The present invention has the following effects.
(1) Water or ethanol aqueous solution containing 5 to 40% starch hydrolyzing enzyme per starch granule weight is mixed with the starch granule while maintaining the powder state, and stirred to bind the starch hydrolyzing enzyme. A modified starch hydrolase can be produced.
(2) 5-40% starch hydrolysis with respect to the weight of starch granules using starch granules in which α-amylase and / or glucoamylase is allowed to act to form a hole in the surface or starch granules obtained by partially gelatinizing the grain surface An immobilized starch hydrolase can be produced by mixing and stirring water or an ethanol aqueous solution containing a degrading enzyme while maintaining a powder state to bind the starch hydrolase.
(3) Oxidize starch granules, and mix or stir water or ethanol aqueous solution containing 5-40% starch starch hydrolyzing enzyme and starch hydrolyzing enzyme to the oxidized starch granules while maintaining the powder state at room temperature. It can be dried to bind the starch hydrolase and produce an immobilized starch hydrolase.
(4) Cellulose powder is oxidized, and water or ethanol aqueous solution containing starch hydrolyzing enzyme is added to this oxidized cellulose powder in an amount of 10 to 80% per cellulose weight while maintaining the powder state and stirred to hydrolyze starch. Enzyme can be combined to produce immobilized starch hydrolase.
(5) Starch granules or cellulose powder is coated with protein, 5 to 80% per grain weight, water or ethanol aqueous solution containing starch hydrolyzing enzyme is mixed in powder form and stirred, An immobilized starch hydrolase can be produced by binding starch hydrolase.
(6) Protein-coated starch or protein-coated cellulose can be treated with glutaraldehyde, and then starch-hydrolyzing enzyme is bound, and starch-hydrolyzing enzyme is bound to produce an immobilized starch-hydrolyzing enzyme.
次に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。尚、以下の実施例のうち、本発明の構成要件の一部からなる実施例は、参考実施例、すなわち参考例として示したものである。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited at all by these Examples. Note that, among the following examples, an example comprising a part of the constituent elements of the present invention is shown as a reference example, that is, a reference example.
コーンスターチ粉末２ｇに、１）α−アミラーゼ（Ｗａｋｏ化学用）１０ｍｇ／１ｍＬ蒸留水溶液、２）グルコアミラーゼ（Ｗａｋｏ生化学用）１０ｍｇ／１ｍＬ蒸留水溶液、３）プルラナーゼ（市販試薬粗製プルラナーゼ、林原生物化学研究所製）１０ｍｇ／１ｍＬ蒸留水溶液、４）ＣＧＴａｓｅ（液体コンチザイム、天野エンザイム（株）製）を蒸留水で１０倍希釈した溶液、５）β−アミラーゼ（Ｗａｋｏ β−アミラーゼ，オオムギ由来）１０ｍｇ／１ｍＬ蒸留水溶液の各６００μＬを加えて、混合、撹拌した。 To 2 g of corn starch powder, 1) α-amylase (for Wako chemistry) 10 mg / 1 mL distilled aqueous solution, 2) glucoamylase (for Wako biochemistry) 10 mg / 1 mL distilled aqueous solution, 3) pullulanase (commercially available crude crude pullulanase, Hayashibara Biochemical Research) 5) β-Amylase (derived from Wako β-Amylase, barley) 10 mg / 1 mL A 10 mg / 1 mL distilled aqueous solution 4) CGTase (Liquid Contozyme, Amano Enzyme Co., Ltd.) diluted 10-fold with distilled water Each 600 μL of distilled aqueous solution was added, mixed and stirred.
この混合物は、粉末状態を保持している。２時間、室温で放置し、乾燥して、澱粉加水分解酵素固定化澱粉乾燥粉末を得た。第１回目の反応として、本粉末の１００ｍｇを、５ｍＬの１％濃度のγ−サイクロデキストリン、マルトシル−α−サイクロデキストリン、マルトヘプタオース、マルトトリオシル−α−サイクロデキストリン蒸留水溶液に加えて、４０℃、１時間、撹拌して反応させた。この上清２０μＬを、ＨＰＬＣで測定した結果、加水分解率は、１）で３８％、２）で６３％、３）で５６％、４）で８１％、５）で５９％であった。 This mixture retains the powder state. It was allowed to stand at room temperature for 2 hours and dried to obtain a starch hydrolyzing enzyme-immobilized starch dry powder. As the first reaction, 100 mg of this powder was added to 5 mL of 1% concentration of γ-cyclodextrin, maltosyl-α-cyclodextrin, maltoheptaose, maltotriosyl-α-cyclodextrin in distilled water solution, The reaction was allowed to stir at 1 ° C. for 1 hour. As a result of measuring 20 μL of this supernatant by HPLC, the hydrolysis rate was 38% for 1), 63% for 2), 56% for 3), 81% for 4), and 59% for 5).
対照試験として、同じ酵素溶液を、同様にして反応させた場合も、ほぼ同様の加水分解率であった。試験区の澱粉部分を、遠心分離して集め、第２回目の反応として、基質溶液を加えて、同様に反応させた結果、加水分解率は、全て第１回目の半分以下となった。すなわち、半減回数は、２回以下ということになる。なお、プルラナーゼとＣＧＴａｓｅの反応生成物を示すＨＰＬＣプロファイルを、図４と図７に示した。 As a control test, when the same enzyme solution was reacted in the same manner, the hydrolysis rate was almost the same. The starch portion in the test group was collected by centrifugation, and as a second reaction, the substrate solution was added and reacted in the same manner. As a result, the hydrolysis rates were all less than half of the first reaction. That is, the number of times of half is less than 2 times. In addition, the HPLC profile which shows the reaction product of a pullulanase and CGTase was shown in FIG. 4 and FIG.
深井・高木・小林の方法［日本農藝化學會誌，６８（４），７９３−８００（１９９４）］で、コーンスターチから調製した空洞澱粉乾燥粉末２ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、澱粉加水分解酵素固定化空洞澱粉乾燥粉末を得た。実施例１と同様に反応して、ほぼ同等の加水分解率を得たが、半減回数は、２に向上した。 In the same manner as in Example 1 except that 2 g of hollow starch dry powder prepared from corn starch was used in the method of Fukai, Takagi, Kobayashi [Nippon Agricultural Chemical Journal, 68 (4), 793-800 (1994)]. Thus, a starch hydrolyzing enzyme-immobilized hollow starch dried powder was obtained. The reaction was carried out in the same manner as in Example 1 to obtain almost the same hydrolysis rate, but the half-time was improved to 2.
コーンスターチを、文献記載の方法［日本応用糖質科学会誌、Ｖｏｌ．４６、ｐｐ．４０７−４１２（１９９９）］に準拠して、酸化処理した。すなわち、コーンスターチ懸濁液（１０ｇ／５００ｍＬ）に、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム５００ｍＬを、４℃、一夜、暗所で撹拌して反応させた。反応後、５００ｍＬの蒸留水で３回洗浄して、洗浄後、室温風乾して粉末状とし、その後、１０５℃で乾燥して、サラサラの粉末とした。この２ｇを用い、実施例１と同様にして、澱粉加水分解酵素を固定化して、澱粉加水分解酵素固定化酸化澱粉乾燥粉末を得た。実施例１と同様に反応させて、ほぼ同等の加水分解率を得たが、半減回数は、２に向上した。 Corn starch was prepared according to the method described in the literature [Journal of Applied Glycoscience, Vol. 46, pp. 407-412 (1999)]. That is, 500 mL of 100 mM sodium periodate was reacted with corn starch suspension (10 g / 500 mL) by stirring in the dark at 4 ° C. overnight. After the reaction, it was washed three times with 500 mL of distilled water, and after washing, it was air-dried at room temperature to form a powder, and then dried at 105 ° C. to obtain a smooth powder. Using 2 g, starch hydrolase was immobilized in the same manner as in Example 1 to obtain a starch hydrolase-immobilized oxidized starch dry powder. The reaction was carried out in the same manner as in Example 1 to obtain almost the same hydrolysis rate, but the half-time was improved to 2.
市販卵を割って、白身部分を、先の太いピペットで吸引してとり、０．９％食塩水で２倍希釈したものを、空洞澱粉２ｇに、８００μＬ加えて、ミニビーカー中で混合、撹拌し、１５０℃で、１時間、焙焼した結果、殆ど着色はなく、１７０℃で、１時間の焙焼で、僅かに黄灰色になる程度であった。 Break the commercially available egg, suck the white portion with a thick pipette, add 2-fold diluted 0.9% saline to 800 g of hollow starch, mix and stir in a mini beaker As a result of baking at 150 ° C. for 1 hour, there was almost no coloration, and it was slightly yellowish gray after baking at 170 ° C. for 1 hour.
この卵白被覆空洞澱粉（卵白被覆空洞澱粉）乾燥粉末２ｇを用い、実施例１と同様にして、澱粉加水分解酵素固定化卵白被覆空洞澱粉乾燥粉末を得た。本酵素剤を用いて、実施例と同様に反応させた結果、第１回目は、ほぼ同様な結果を得たが、半減回数は、３に向上した。なお、ゼラチン、カゼインナトリウムを用いた場合も、同様の結果を得た。 Using 2 g of this egg white-coated hollow starch (egg white-coated hollow starch) dry powder, starch hydrolyzing enzyme-immobilized egg white-coated hollow starch dry powder was obtained in the same manner as in Example 1. As a result of carrying out the reaction in the same manner as in Example using this enzyme agent, almost the same result was obtained in the first round, but the half-time was improved to 3. Similar results were obtained when gelatin and sodium caseinate were used.
卵白被覆空洞澱粉５ｇを用い、０．２Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０）で調製した５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液２０ｍＬに加え、室温で、２時間、振盪した後（アルデヒド基導入）、ｐＨ６．５〜７．５に調整した蒸留水５０ｍＬで、２回洗浄し、本蒸留水に、プルラナーゼ（市販試薬粗製プルラナーゼ、林原生物化学研究所製）を溶解した溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）２０ｍＬに移し、室温で、２時間、振盪後、５℃で、一晩放置して、カップリングを行った。反応後、同蒸留水で澱粉を洗浄して、未反応の酵素を除去し、室温で乾燥し、澱粉加水分解酵素架橋固定化卵白被覆空洞澱粉乾燥粉末を得た。活性発現率は、５０〜８０％程度に低下するが、半減回数は、５となった。 After adding 5 g of egg white-coated hollow starch to 20 mL of 5% (v / v) glutaraldehyde solution prepared with 0.2 M carbonate buffer (pH 10), and shaking at room temperature for 2 hours (aldehyde group introduction), It was washed twice with 50 mL of distilled water adjusted to pH 6.5 to 7.5, and 20 mL of a solution (50 mg / mL) in which pullulanase (commercially available crude crude pullulanase, manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories) was dissolved in this distilled water. The mixture was shaken at room temperature for 2 hours, and then left overnight at 5 ° C. for coupling. After the reaction, the starch was washed with the same distilled water to remove the unreacted enzyme and dried at room temperature to obtain a starch hydrolyzing enzyme cross-linked immobilized egg white-coated hollow starch dry powder. The activity expression rate decreased to about 50 to 80%, but the half-time number became 5.
本標品を、同量のセルロース粉末を均一に混合した後、直径２センチ×２０センチのガラスカラムに詰め、５０％エタノール溶液を通してから、４０℃の定温室内、シリコン管を用いて、ペリスタポンプで、各０．１Ｍのマルトースとα−サイクロデキストリンを含む溶液を、２４時間連続サイクル送液して、マルトシル−α−サイクロデキストリンの生成を検出できた。なお、澱粉加水分解酵素架橋固定化卵白被覆空洞澱粉乾燥粉末のみを詰めたカラムでは、流速の維持が困難である。 After mixing the same amount of cellulose powder with the same amount of cellulose powder, it is packed in a glass column with a diameter of 2 cm x 20 cm, passed through a 50% ethanol solution, and then in a constant temperature room at 40 ° C, using a silicon tube, with a peristaltic pump. Each solution containing 0.1M maltose and α-cyclodextrin was continuously cycled for 24 hours, and the formation of maltosyl-α-cyclodextrin could be detected. In addition, it is difficult to maintain the flow rate in a column packed with only starch hydrolyzing enzyme cross-linked immobilized egg white-coated hollow starch dry powder.
セルロース粉末２ｇに、１）α−アミラーゼ（Ｗａｋｏ化学用）１０ｍｇ／１ｍＬ蒸留水溶液、２）グルコアミラーゼ（Ｗａｋｏ生化学用）１０ｍｇ／１ｍＬ蒸留水溶液、３）プルラナーゼ（市販試薬粗製プルラナーゼ、林原生物化学研究所製）１０ｍｇ／１ｍＬ蒸留水溶液、４）ＣＧＴａｓｅ（液体コンチザイム、天野エンザイム（株）製）を蒸留水で１０倍希釈した溶液、５）β−アミラーゼ（Ｗａｋｏ β−アミラーゼ，オオムギ由来）１０ｍｇ／１ｍＬ蒸留水溶液の各１ｍＬを加えて混合撹拌した。この混合物は、粉末状態を保持していた。２時間、室温で放置し、乾燥して、澱粉加水分解酵素固定化セルロース乾燥粉末を得た。 To 2 g of cellulose powder, 1) α-amylase (for Wako chemistry) 10 mg / 1 mL distilled aqueous solution, 2) glucoamylase (for Wako biochemistry) 10 mg / 1 mL distilled aqueous solution, 3) pullulanase (commercially available reagent crude pullulanase, Hayashibara Biochemical Research) 5) β-Amylase (derived from Wako β-Amylase, barley) 10 mg / 1 mL A 10 mg / 1 mL distilled aqueous solution 4) CGTase (Liquid Contozyme, Amano Enzyme Co., Ltd.) diluted 10-fold with distilled water 1 mL of each distilled aqueous solution was added and mixed and stirred. This mixture kept the powder state. The mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours and dried to obtain a starch hydrolyzing enzyme-immobilized cellulose dry powder.
第１回目の反応として、本粉末の１００ｍｇを、５ｍＬの１％濃度のγ−サイクロデキストリン、マルトシル−α−サイクロデキストリン、マルトヘプタオース、マルトトリオシル−α−サイクロデキストリン蒸留水溶液に加えて、４０℃で、１時間、撹拌して反応させた。この上清２０μＬを、ＨＰＬＣで測定した結果、加水分解率は、実施例１よりやや高めであった。セルロース部分を遠心分離して集め、第２回目の反応として、基質溶液を加えて、同様に反応した結果、加水分解率は、極めて低く、第１回目の２０％以下の加水分解率であった。 As the first reaction, 100 mg of this powder was added to 5 mL of 1% concentration of γ-cyclodextrin, maltosyl-α-cyclodextrin, maltoheptaose, maltotriosyl-α-cyclodextrin in distilled water solution, The reaction was allowed to stir at 1 ° C. for 1 hour. As a result of measuring 20 μL of this supernatant by HPLC, the hydrolysis rate was slightly higher than Example 1. The cellulose portion was collected by centrifugation, and as a second reaction, a substrate solution was added and reacted in the same manner. As a result, the hydrolysis rate was very low, and the hydrolysis rate was 20% or less in the first time. .
セルロースを、文献記載の方法［日本応用糖質科学会誌、Ｖｏｌ．４６、ｐｐ．４０７−４１２（１９９９）］に準拠して、酸化処理した。すなわち、セルロース懸濁液（１０ｇ／５００ｍＬ）に、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム５００ｍＬを、４℃、一夜、暗所で撹拌して反応させた。反応後、５００ｍＬの蒸留水で３回洗浄して、洗浄後、室温で風乾して粉末状とし、その後、１０５℃で乾燥して、サラサラの粉末とした。この２ｇを用い、実施例６と同様にして、澱粉加水分解酵素固定化酸化セルロース乾燥粉末を得た。実施例６と同様に反応させて、第１回目では、同等であり、第２回目では、３０％以上であった。 Cellulose was prepared by the method described in the literature [Journal of Applied Glycoscience, Vol. 46, pp. 407-412 (1999)]. Specifically, 500 mL of 100 mM sodium periodate was reacted with the cellulose suspension (10 g / 500 mL) by stirring in the dark at 4 ° C. overnight. After the reaction, it was washed with 500 mL of distilled water three times, and after washing, it was air-dried at room temperature to form a powder, and then dried at 105 ° C. to obtain a smooth powder. Using 2 g, starch hydrolyzing enzyme-immobilized oxidized cellulose dry powder was obtained in the same manner as in Example 6. The reaction was carried out in the same manner as in Example 6 and was the same in the first round and 30% or more in the second round.
市販卵白を、５％濃度で、０．９％食塩水で溶解し、セルロース粉末２ｇに１ｍＬ加えて、ミニビーカー中で、混合、撹拌し、１５０℃で、１時間、焙焼し、卵白被膜セルロース粉末を得た。この２ｇに、実施例６と同様にして、澱粉加水分解酵素固定化卵白被覆セルロース乾燥粉末を得た。この２ｇを用い、実施例６と同様にして、澱粉加水分解酵素固定化酸化セルロース乾燥粉末を得た。実施例６と同様に反応させて、第１回目では、同等であり、第２回目では、第１回目の５０％以上であった。すなわち、半減回数は、２以上である。 Commercially available egg white is dissolved in 0.9% saline at 5% concentration, 1 mL is added to 2 g of cellulose powder, mixed and stirred in a mini beaker, roasted at 150 ° C. for 1 hour, egg white coating Cellulose powder was obtained. To 2 g, starch hydrolyzing enzyme-immobilized egg white-coated cellulose dry powder was obtained in the same manner as in Example 6. Using 2 g, starch hydrolyzing enzyme-immobilized oxidized cellulose dry powder was obtained in the same manner as in Example 6. The reaction was carried out in the same manner as in Example 6. The first time was equivalent, and the second time was 50% or more of the first time. That is, the number of half times is 2 or more.
卵白被覆セルロース５ｇを用い、０．２Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０）で調製した５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液２０ｍＬに加え、室温で、２時間、振盪した後（アルデヒド基導入）、ｐＨ６．５〜７．５に調整した蒸留水５０ｍＬで、２回洗浄し、本蒸留水に、プルラナーゼ（市販試薬粗製プルラナーゼ、林原生物化学研究所製）を溶解した溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）２０ｍＬに移し、室温で、２時間、振盪後、５℃で、一晩、放置して、カップリングを行った。反応後、同蒸留水で、セルロースを洗浄して、未反応の酵素を除去し、室温で乾燥し、澱粉加水分解酵素架橋固定化卵白被覆セルロース乾燥粉末を得た。活性発現率は、７０％程度に低下するが、半減回数は、５となった。 After adding 5 g of egg white-coated cellulose to 20 mL of 5% (v / v) glutaraldehyde solution prepared with 0.2 M carbonate buffer (pH 10) and shaking at room temperature for 2 hours (aldehyde group introduction), pH 6 Washed twice with 50 mL of distilled water adjusted to 5 to 7.5 and transferred to 20 mL of a solution (50 mg / mL) in which pullulanase (commercially available crude pullulanase, manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories) was dissolved in this distilled water. Coupling was performed by shaking at room temperature for 2 hours and then standing at 5 ° C. overnight. After the reaction, the cellulose was washed with the same distilled water to remove unreacted enzyme and dried at room temperature to obtain a starch hydrolyzing enzyme cross-linked immobilized egg white-coated cellulose dry powder. Although the activity expression rate decreased to about 70%, the half-frequency was 5.
ＣＧＴａｓｅ（液体コンチザイム、天野エンザイム（株）製）を、ｐＨ６．５〜７．５に調整した蒸留水で、１０倍希釈した溶液を用いた以外は、実施例９と同様にして、同様の結果を得た。本標品を、直径２センチ×２０センチのガラスカラムに詰め、５０％エタノール溶液を通してから、４０℃の定温室内で、シリコン管を用いて、ペリスタポンプで、各０．１Ｍのマルトースとカテキンを溶解した５０％エタノール溶液を、２４時間、連続サイクル送液して、配糖体と予想されるピークを検出できた。 Similar results to Example 9 except that CGTase (Liquid Contozyme, Amano Enzyme Co., Ltd.) was diluted 10-fold with distilled water adjusted to pH 6.5 to 7.5. Got. This sample is packed in a glass column with a diameter of 2cm x 20cm, passed through a 50% ethanol solution, dissolved in 0.1M maltose and catechin with a peristaltic pump using a silicon tube in a constant temperature room at 40 ° C. The 50% ethanol solution was fed continuously for 24 hours, and a peak expected to be a glycoside could be detected.
以上詳述したように、本発明は、澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素及びその製法に係るものであり、本発明により、食品加工上安全性の高い素材である、澱粉粒、セルロース粉末を用いて、澱粉水解酵素の固定化方法及び澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素を提供することができる。本発明では、粒をタンパク質でコーテイングすることにより、固定化が増強され、更に、穏和な条件で、化学的処理、架橋処理をすることにより、固定化を強力にすることを可能にしたものである。本方法では、澱粉粒、セルロース粉末の特性を、被覆という手段で変化させることができ、これら粒構造を持つ素材への適用が可能でもある。また、本発明では、この固定化澱粉水解酵素を用いて、各種の安全性の高い食品素材を製造することもでき、酵素を選択し、逆合成作用を用い、各種の糖質の製造、水酸基を持つ化合物との反応による配糖体の製造も可能であり、極めて広汎な利用面を持つ方法として有用である。 As described above in detail, the present invention relates to starch granules or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzing enzyme and a method for producing the same, and according to the present invention, starch granules and cellulose that are highly safe in food processing. The method for immobilizing starch hydrolyzing enzyme and starch granules or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzing enzyme can be provided using the powder. In the present invention, the immobilization is enhanced by coating the grains with protein, and further, the immobilization can be strengthened by chemical treatment and cross-linking treatment under mild conditions. is there. In this method, the characteristics of starch granules and cellulose powder can be changed by means of coating, and it is possible to apply to materials having these grain structures. Further, in the present invention, it is also possible to produce various highly safe food materials using this immobilized starch hydrolyzing enzyme, select an enzyme, use reverse synthesis action, produce various carbohydrates, hydroxyl groups It is also possible to produce glycosides by reaction with a compound having a very wide range, which is useful as a method having an extremely wide range of applications.
Claims (6)
１）その際に、澱粉粒に、澱粉加水分解酵素を含む水又はエタノール水溶液を、澱粉粒重量当たり５〜４０％加えて混合して、当該澱粉粒に、粉末状態を維持して澱粉加水分解酵素を結合させて固定化する、
２）上記澱粉粒として、該澱粉粒に、α−アミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼを作用させて、その表面に、穴を開けた澱粉粒又は粒表面を一部糊化した澱粉粒を用いる、
３）澱粉粒又はセルロース粉末表面をタンパク質で被覆してから、澱粉加水分解酵素を結合させる処理を行う、
ことを特徴とする澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素の製造方法。 A starch hydrolyzing enzyme is mixed with the starch granule or the cellulose powder retaining the form of the starch granule, and the starch hydrolyzing enzyme is combined with the starch granule or the cellulose powder carrier while maintaining the powder state, thereby the starch granule or the cellulose powder. a grout granular or cellulose powder immobilized starch manufacturing method of a hydrolase shall be the immobilized starch hydrolyzing enzymes,
1) At that time, 5 to 40% of starch granule water or ethanol aqueous solution containing starch hydrolyzing enzyme is added to and mixed with the starch granule, and the starch granule is maintained in a powder state to hydrolyze starch. Bind and immobilize the enzyme,
2) As the starch granules, α-amylase and / or glucoamylase is allowed to act on the starch granules, and on the surface, starch granules having holes or starch granules obtained by partially pasting the grain surfaces are used.
3) The surface of starch granules or cellulose powder is coated with protein, and then the starch hydrolyzing enzyme is bound.
A method for producing a starch hydrolyzing enzyme having immobilized starch granules or cellulose powder.
澱粉粒の形態を保持した澱粉粒又はセルロース粉末担体に、粉末状態を維持して澱粉加水分解酵素を結合させて固定化した構造を有することを特徴とする澱粉粒又はセルロース粉末固定化澱粉加水分解酵素。 A starch granule or a cellulose powder-immobilized starch hydrolyzing enzyme produced by the method according to any one of claims 1 to 5 ,
A starch granule or cellulose powder-immobilized starch hydrolyzed with a structure in which starch hydrolyzing enzyme is bound and immobilized on a starch granule or cellulose powder carrier that retains the form of starch granules. enzyme.
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