JP5347255B2 - 組換え蛋白質の可溶性蛋白質としての製造方法 - Google Patents
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Description
一方、これらの組換え蛋白質発現系で目的蛋白質を発現させた場合、発現された蛋白質が正確に折り畳まれないためにその蛋白質本来の機能を発現できなかったり、封入体と呼ばれる不溶性の凝集体が形成されることが少なくない。このような場合、例えば封入体を変性剤や界面活性剤等により可溶化した後、再折り畳みを行っても、必ずしも正常に折り畳まれた本来の機能を有する蛋白質が得られるとは限らない。また、本来の機能を発現する蛋白質が得られたとしても、満足な回収率が得られないことも多い。
このような背景において、現在まで発現組換え目的蛋白質の封入体の形成を抑制する方法は、確立されていない。その代法として、可溶性の高い分子量4万のマルトース結合蛋白質またはグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)と不溶性目的蛋白質とを融合させることにより可溶性蛋白として発現さすることが試みられている(非特許文献1:Fox,J.D.and Waugh, D.S. (2003) Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods Mol. Biol.205:99-117、非特許文献2:Ausubel, F.M. et al. eds. (1996) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 16.0.1)。しかし、可溶性タンパクが本来の活性あるいは機能を示さないこと、マルトース結合蛋白質またはGSTを削除した場合、目的蛋白質が不溶化する等の問題があった。
しかしながら、IgG結合領域のZZドメインを目的蛋白質と融合発現した場合、融合蛋白質の可溶性を増す効果および目的蛋白質の効率的な活性型蛋白質へのリフォールディングに関与する効果についての報告はない。今日まで、プロテインA由来のZZドメインは、目的蛋白質と融合蛋白質を発現後、目的蛋白質精製おけるIgG抗体アフィニティークロマト法におけるリガンドとして用いられてきたにすぎない。さらに、IgG抗体カラムは高価であり、ZZドメインを利用して遺伝子組換え融合蛋白質を大量生産利用する場合にも、利用可能な場合は限定されている。
Fox,J.D.and Waugh, D.S. (2003) Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods Mol. Biol.205:99-117 Ausubel, F.M. et al. eds. (1996) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 16.0.1 Nilsson B. et al., Protein Eng. (1987) 1: 107-113
(1)発現誘導可能なプロモーター配列;
(2)ZZドメインをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有する発現ベクターを用いて目的蛋白質を発現させると、目的蛋白質が可溶性蛋白質として発現されることを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
(1) (1)発現誘導可能なプロモーター配列;
(2)式(Z)n
(式中、nは1〜5の整数を表し、Zは以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドを表す:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有する発現ベクター、
(2) 前記式(Z)nで表されるポリペプチドが、(Z)2で表されるポリペプチドである、上記(1)記載のベクター、
(3) 前記式(Z)2で表されるポリペプチドが、
(e)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(f)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、
(g)配列番号:3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、および
(h)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、上記(2)記載のベクター、
(4) 前記発現誘導可能なプロモーター配列が、低温で発現誘導可能なプロモーター配列である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のベクター、
(5) 前記低温で発現誘導可能なプロモーター配列が、コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、上記(4)記載のベクター、
(6) 前記コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、上記(5)記載のベクター、
(7) 前記大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子cspA、cspB、cspG、cspIまたはcsdAのプロモーター配列である、上記(6)記載のベクター、
(8) 前記第1のコード配列と、前記第2のコード配列との間に、さらに切断可能なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、上記(1)〜(7)のいずれかに記載のベクター、
(9) 前記切断可能なリンカーペプチドが、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドである、上記(8)記載のベクター、
(10) 前記第1のコード配列の5’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、上記(1)〜(9)のいずれかに記載のベクター、
(11) 前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、上記(10)記載のベクター、
(12) (1)発現誘導可能なプロモーター配列;
(2)式(Z)n
(式中、nは1〜5の整数を表し、Zは以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドを表す:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列を挿入することができる少なくとも1つの制限酵素サイト
を含有する発現ベクター、
(13) 前記式(Z)nで表されるポリペプチドが、(Z)2で表されるポリペプチドである、上記(12)記載のベクター、
(14) 前記式(Z)2で表されるポリペプチドが、
(e)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(f)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、
(g)配列番号:3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、および
(h)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、上記(13)記載のベクター、
(15) 前記発現誘導可能なプロモーター配列が、低温で発現誘導可能なプロモーター配列である、上記(12)〜(14)のいずれかに記載のベクター、
(16) 前記低温で発現誘導可能なプロモーター配列が、コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、上記(15)記載のベクター、
(17) 前記コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、上記(16)記載のベクター、
(18) 前記大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子cspA、cspB、 cspG、cspIまたはcsdAのプロモーター配列である、上記(17)記載のベクター、
(19) 前記第1のコード配列と、前記第2のコード配列との間に、さらに切断可能なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、上記(12)〜(18)のいずれかに記載のベクター、
(20) 前記切断可能なリンカーペプチドが、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドである、上記(19)記載のベクター、
(21) 前記第1のコード配列の5’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、上記(12)〜(20)のいずれかに記載のベクター、
(22) 前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、上記(21)記載のベクター、
(23) (1)式(Z)n
(式中、nは1〜5の整数を表し、Zは以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドを表す:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含有する第1のアミノ酸配列;および
(2)目的蛋白質のアミノ酸配列を含有する第2のアミノ酸配列
を含有する、可溶性蛋白質として発現させることができる融合蛋白質、
(24) 前記式(Z)nで表されるポリペプチドが、(Z)2で表されるポリペプチドである、上記(23)記載の融合蛋白質、
(25) 前記式(Z)2で表されるポリペプチドが、
(e)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(f)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、
(g)配列番号:3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、および
(h)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、上記(24)記載の融合蛋白質、
(26) 前記目的蛋白質が、アポイクオリン、ガウシアルシフェラーゼおよびエビルシフェラーゼからなる群から選択されるいずれかである、上記(23)〜(25)のいずれかに記載の融合蛋白質、
(27) 前記第1のアミノ酸配列と、前記第2のアミノ酸配列との間に、さらに切断可能なリンカーペプチドのアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列を含有する、上記(23)〜(26)のいずれかに記載の融合蛋白質、
(28) 前記切断可能なリンカーペプチドが、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドである、上記(27)記載の融合蛋白質、
(29) 前記第1のアミノ酸配列のアミノ末端側に、さらに精製のためのアミノ酸配列を含有する、上記(23)〜(28)のいずれかに記載の融合蛋白質、
(30) 前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、上記(29)記載の融合蛋白質、
(31) 式(Z)n−L−X
(式中、nは1〜5の整数を表し;Lは切断可能なリンカーペプチドを表し;Zは以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドを表し:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド;Xは目的蛋白質のアミノ酸配列を表す)
で表される、可溶性蛋白質として発現させることができる融合蛋白質、
(32) 前記目的蛋白質が、アポイクオリン、ガウシアルシフェラーゼおよびエビルシフェラーゼからなる群から選択されるいずれかである、上記(31)記載の融合蛋白質、
(33) 上記(23)〜(32)のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(34) DNAである、上記(33)記載のポリヌクレオチド、
(35) (1)発現誘導可能なプロモーター配列;
(2)式(Z)n
(式中、nは1〜5の整数を表し、Zは以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドを表す:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有する発現ベクターを用いて蛋白質を発現させることを含む、前記目的蛋白質を可溶性蛋白質として製造する方法、
(36) 前記式(Z)nで表されるポリペプチドが、(Z)2で表されるポリペプチドである、上記(35)記載の方法、
(37) 前記式(Z)2で表されるポリペプチドが、
(e)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(f)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、
(g)配列番号:3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、および
(h)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、上記(36)記載の方法、
(38) 前記発現誘導可能なプロモーター配列が、低温で発現誘導可能なプロモーター配列である、上記(35)〜(37)のいずれかに記載の方法、
(39) 前記低温で発現誘導可能なプロモーター配列が、コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、上記(38)記載の方法、
(40) 前記コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、上記(39)記載の方法、
(41) 前記大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子cspA、cspB、 cspG、cspIまたはcsdAのプロモーター配列である、上記(40)記載の方法、
(42) 前記第1のコード配列と、前記第2のコード配列との間に、さらに切断可能なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、上記(35)〜(41)のいずれかに記載の方法、
(43) 前記切断可能なリンカーペプチドが、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドである、上記(42)記載の方法、
(44) 前記第1のコード配列の5’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、上記(35)〜(43)のいずれかに記載の方法、
(45) 前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、上記(44)記載の方法
などを提供する。
したがって、本発明は有用蛋白質や、機能や構造の解析対象となる蛋白質などの蛋白質の製造方法として極めて有用である。
(2)目的蛋白質のアミノ酸配列を含有する第2のアミノ酸配列
を含有する融合蛋白質、前記融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを用いた前記融合タンパク質の製造方法などを提供する。
また、本発明は、(1)発現誘導可能なプロモーター配列、
(2)式(Z)nで表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列、および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有する発現ベクター、前記発現ベクターを用いて蛋白質を発現させることを含む前記目的蛋白質の製造方法なども提供する。該製造方法によれば、目的蛋白質を可溶化された状態で製造することができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の融合蛋白質は、
(1)式(Z)nで表されるポリペプチドのアミノ酸配列を含有する第1のアミノ酸配列、および
(2)目的蛋白質のアミノ酸配列を含有する第2のアミノ酸配列
を含有する。
さらに、本発明の融合蛋白質は、
(3)切断可能なペプチドリンカー
のアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
以下、本発明の融合蛋白質についてより詳細に説明する。
式(Z)nで表されるポリペプチドは、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性または機能を有する。
Zは、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドを表す:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
式(Z)nで表されるポリペプチドにおいて、各Zは同一であっても異なっていてもよい。
式(Z)nで表されるポリペプチドとしては、特に式(Z)2で表されるポリペプチドが好ましい。
前記「実質的に同質の活性もしくは機能」とは、例えば、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性もしくは機能を意味する。このような活性もしくは機能、例えば、ZZドメインのIgG 結合能は、IgGとの結合アッセイ法により測定することができる。
(e)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(f)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性もしくは機能を有するポリペプチド、
(g)配列番号:3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性もしくは機能を有するポリペプチド、および
(h)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性もしくは機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドなどが挙げられる。
本発明の融合蛋白質における目的蛋白質には特に制限はない。例えば、組換え蛋白質発現系で発現させた場合に封入体を形成しやすい蛋白質も、好ましく用いることができる。
本発明の目的蛋白質としては、例えば、B型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルス、HIV、インフルエンザなどの病原性ウィルスゲノムにコードされる、外被タンパク質、コアタンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなどのタンパク質(ウィルス抗原);抗体のFab、(Fab)2;血小板由来増殖因子(PDGF)、幹細胞成長因子(SCF)、肝細胞成長因子(HGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、神経成長因子(NGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、インスリン様成長因子(IGF)などの増殖因子;腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイン類;エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、トロンボポエチンなどの造血因子;黄体形成ホルモン放出ホルモン(LH−RH)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)、インスリン、ソマトスタチン、成長ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、黄体形成ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、バソプレシン、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン(PTH)、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、セルレイン、モチリンなどのペプチドホルモン;エンケファリン、エンドルフィン、ディノルフィン、キョウトルフィンなどの鎮痛性ペプチド;スーパーオキシドディスミュターゼ(SOD)、ウロキナーゼ、ティシュープラスミノーゲンアクティベーター(TPA)、アスパラギナーゼ、カリクレインなどの酵素;ボムベシン、ニュウロテンシン、ブラジキニン、サブスタンスPなどのペプチド性神経伝達物質;アルブミン;コラーゲン;プロインスリン;レニン;α1アンチトリプシンなども挙げられるが、これらに限定されない。
本発明で用いられる部分ペプチドは、抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明の融合蛋白質は、前記式(Z)nで表されるポリペプチドのアミノ酸配列を含有する第1のアミノ酸配列と、目的蛋白質のアミノ酸配列を含有する第2のアミノ酸配列との間に、さらに、切断可能なリンカーペプチドのアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
切断可能なリンカーペプチドとは、酵素的または化学的切断物質により切断することができる切断部位を有するリンカーペプチドを意味する。酵素(プロテアーゼ)または化学物質により切断されるペプチドは多数知られている(例えば、Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988);Walsh, Proteins Biochemistry and Biotechnology, John Wiley & Sons, LTD., West Sussex, England (2002)など参照)。切断物質とは、ペプチドにおける切断部位を認識し、ペプチド内の結合の切断によりペプチドを2つのペプチドに分割する化学物質または酵素である。切断物質としては、例えば、化学物質、プロテアーゼなどが挙げられる。
本発明において好ましい切断可能なリンカーペプチドは、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドである。プロテアーゼ切断部位としては、例えば、トロンビン切断部位、ヒトレノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位、ファクターXaなどが挙げられる。
本発明の融合蛋白質が切断可能なリンカーペプチドを含む場合には、本発明の融合蛋白質を発現させた後、切断物質で処理することによって、本発明の融合蛋白質から前記第1のアミノ酸配列が除去された目的蛋白質を得ることができる。
式(Z)n−L−X
(式中、Lは直接結合または切断可能なリンカーペプチドを表し、Xは目的蛋白質のアミノ酸配列を表し、nおよびZは前記と同じ意味を表す)
で表される融合蛋白質も挙げられる。
本発明は、前述した本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の融合蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(以下、RT-PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
(1)式(Z)nで表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性または機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(2)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
とを含有するポリヌクレオチドなどが含まれる。
ここで、式(Z)nは前記と同じ意味を表す。
(1)式(Z)2で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列、および
(2)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有するポリヌクレオチドが好ましい。
ここで、式(Z)2は前記と同じ意味を表す。
(e)配列番号:4の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(f)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性または機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(g)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(h)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性または機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド
などが挙げられる。
(1)以下の(e)〜(h)からなる群から選択される第1のコード配列:
(e)配列番号:4の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(f)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性または機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(g)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(h)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性または機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;と、
(2)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
とを含有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターおよび形質転換体を提供する。
(1)発現ベクター
本発明の発現ベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド(DNA)を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド(DNA)を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。
本発明の発現ベクターとしては、具体的には、例えば、
(1)発現誘導可能なプロモーター配列;
(2)式(Z)n
(式中、nおよびZ前記と同じ意味を表す。)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有する発現ベクターなどが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルスなど)などがあげられる。また、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター(以上、タカラバイオ社製)なども好適に使用することができる。
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド(すなわち、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド)を含有する発現ベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド(DNA)を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などがあげられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。
本発明の発現ベクターとしては、なかでも低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが好ましい。低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを用いることによって、本発明の融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させることができる。
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターとは、具体的には、
(1)低温で発現誘導可能なプロモーター配列;
(2)式(Z)n
(式中、nおよびZは前記と同じ意味を表す。)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性または機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有する発現ベクターを意味する。
式(Z)nで表されるポリペプチドについては、前記した通りである。
(1)低温で発現誘導可能なプロモーター配列;
(2)式(Z)2
(式中、Zは前記と同じ意味を表す。)
で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有する発現ベクターが好ましい。
式(Z)2で表されるポリペプチドについては、前記した通りである。
式(Z)2で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについても、前記した通りである。
(1)発現誘導可能なプロモーター配列;
(2)式(Z)n
(式中、nおよびZは前記と同じ意味を表す。)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性または機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列を挿入することができる少なくとも1つの制限酵素サイト
を含有する発現ベクターなども挙げられる。
発現誘導可能なプロモーターとしては、低温で発現誘導可能なプロモーターが好ましい。
式(Z)nで表されるポリペプチドについては、前記した通りである。
「目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列を挿入することができる少なくとも1つの制限酵素サイト」とは、目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列を挿入することができる制限酵素認識部位を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドである。前記制限酵素サイトとしては、目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列を挿入することができればよく、特に制限はないが、いわゆるマルチクローニングサイトであるのが好ましい。マルチクローニングサイトなどの制限酵素サイトは、当技術分野において周知であり、報告されている(例えば、Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. Gene 33 (1985) 103-119、Improved M13 phage cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33 (1985) 103-119など参照)。
(1)低温で発現誘導可能なプロモーター配列;
(2)式(Z)2
(式中、Zは前記と同じ意味を表す。)
で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列を挿入することができる少なくとも1つの制限酵素サイト
を含有する発現ベクターが好ましい。
式(Z)2で表されるポリペプチドについては、前記した通りである。
式(Z)2で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについても、前記した通りである。
前記第1のコード配列の5’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有していてもよい。精製のためのアミノ酸配列については、前記した通りである。
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明の融合蛋白質を生成させる工程を含む、本発明の融合蛋白質の製造方法を提供する。本発明の融合蛋白質は、前記形質転換体を本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド(DNA)が発現可能な条件下で培養し、本発明の融合蛋白質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明の融合蛋白質が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明の融合蛋白質が蓄積される。
上記培養物から、本発明の融合蛋白質を分離・精製することによって、本発明の融合蛋白質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の融合蛋白質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
カルシウム結合発光蛋白質アポイクオリン(アポイクオリンを「アポAQ」と略記することがある。)をコードするイクオリン遺伝子はpAQ440(特開昭61-135586号公報参照)のコーデング領域であるHindIII-EcoRI フラグメントを含むpAM-HEよりPCR法により調製した。発現ベクターとしてpCold II ベクター(タカラバイオ社)を使用した。
pAM-HEを鋳型として2種のPCRプライマー:AQ-EcoRI-Met(5’ ccg GAA TTC ATG AAA CTT ACA TCA GAC TTC GAC AAC 3’(配列番号:27);EcoRI制限酵素部位はアンダーライン)およびAQ-C-SalI(5’ cgc gtc gac tta ggg gac agc tcc acc gta gag ctt 3’(配列番号:28);SalI制限酵素部位はアンダーライン)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施して、所望のイクオリン遺伝子領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製した。精製されたDNA断片を常法により制限酵素EcoRI/SalIにて消化した後、pColdIIの制限酵素EcoRI/SalI部位に連結することによって、図1に示す発現ベクターpCold-AQを構築した。なお、DNA シークエンサー(ABI社製)により塩基配列を決定することにより、インサートDNAの確認を行った。
大腸菌において組換えZZ−アポAQ融合蛋白質を発現させるために、ZZ遺伝子およびイクオリン遺伝子を以下に記載する方法に従って調製した。IgG結合ドメインであるZZドメインをコードする ZZ遺伝子はpEZZ18(アマシャムバイオサイエンス社)から、PCR法により調製した。アポイクオリンをコードするイクオリン遺伝子はpAQ440(特開昭61-135586号公報参照)のコーディング領域であるHindIII-EcoRI フラグメントを含むpAM-HEよりPCR法により調製した。発現ベクターとしてpCold II ベクター(タカラバイオ社)を使用した。ZZ−アポAQ融合蛋白質発現ベクターの構築法は以下の通りである。
6ZZ-N-NdeI(5’ CCG CAT ATG GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTG3’(配列番号:29);NdeI制限酵素部位はアンダーライン)および
7ZZ-C-BamHI(5’ GGC GGA TCC CGA GCT CGA ATT TGC GTC TAC3’(配列番号:30);BamHI制限酵素部位はアンダーライン)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製した。精製されたDNA断片を常法により制限酵素NdeI/BamHIにて消化した後、参考例1で得られたpCold-AQの制限酵素NdeI/BamHI部位に連結することによって、図2に示す発現ベクターpCold-ZZ-AQを構築した。本発現ベクターは、低温で誘導可能である。発現したZZ-アポAQは、アミノ末端にヒスチジンダグを有する。
深海コペポーダであるガウシアプリンセス由来のガウシアルシフェラーゼ蛋白質を大腸菌内で発現させるために、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子(hGL遺伝子)を、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を有するpcDNA3-hGL(LUX社製)から調製した。発現ベクターとしてpCold II(タカラバイオ社製)を使用した。
ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を有するpcDNA3-hGL(LUX社製)を鋳型として2種のPCRプライマー:
GL5-N/SacI(5’ gcc GAG CTC AAG CCC ACC GAG AAC AAC GAA 3’(配列番号:31);SacI制限酵素部位はアンダーライン)およびGL2-C/EcoRI(5’gcc GAA TTC TTA GTC ACC ACC GGC CCC CTT 3’(配列番号:32);EcoRI制限酵素部位はアンダーライン)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られた断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素SacI/EcoRIにて消化した後、pColdIIの制限酵素SacI/EcoRI部位に連結することによって、図3に示す発現ベクターpCold-hGLを構築した。
大腸菌において組換えZZ-hGL融合蛋白質を発現させるために、ZZ遺伝子およびガウシアルシフェラーゼ遺伝子を以下に記載する方法に従って調製した。IgG結合ドメインであるZZドメインをコードする ZZ遺伝子は、ZZ遺伝子を有するpEZZ18(アマシャムバイオサイエンス社)から、PCR法により調製した。ガウシアルシフェラーゼ遺伝子(hGL遺伝子)は、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を有するpcDNA3-hGL(LUX社製)から、PCR法により調製した。発現ベクターとしては、pCold II(タカラバイオ社)を使用した。
pcDNA3-hGLを鋳型として2種のPCRプライマー:GL6-N/EcoRI(5’ gcc GAA TTC AAG CCC ACC GAG AAC AAC GAA 3’(配列番号:33);EcoRI制限酵素部位はアンダーライン)およびGL-C/XbaI(5’ gcc TCT AGA TTA GTC ACC ACC GGC CCC CTT 3’(配列番号:34);XbaI制限酵素部位はアンダーライン)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られた断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、pCold-ZZ-AQの制限酵素EcoRI/XbaI部位に連結することによって、図4に示す発現ベクターpCold-ZZ-hGLを構築した。
深海エビであるヒメヒオドシエビ由来のエビルシフェラーゼの触媒ユニットである19kDa蛋白質(KAZ)を大腸菌内で発現させるために、19kDa蛋白質コードする遺伝子(KAZ遺伝子)をpHis-KAZ(Inouye et al. FEBS Lett. 2000:481、19-25)から調製した。発現ベクターとしてpCold II(タカラバイオ社製)を使用した。
pHis-KAZを鋳型として2種のPCRプライマー:
KAZ-17N/NdeI(5’ gcg CAT ATG TTT ACG TTG GCA GAT TTC GTT 3’(配列番号:35);NdeI制限酵素部位はアンダーライン)およびKAZ-12C/EcoRI(5’ cgc GAA TTC TTA GGC AAG AAT GTT CTC GCA AAG CCT 3’(配列番号:36);EcoRI制限酵素部位はアンダーライン)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られた断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素NdeI/EcoRIにて消化した後、pColdIIの制限酵素NdeI/EcoRI部位に連結することによって、図5に示す発現ベクターpCold-KAZを構築した。
大腸菌において組換えZZ-KAZ融合蛋白質を発現させるために、ZZ遺伝子およびKAZ遺伝子を以下に記載する方法に従って調製した。IgG結合ドメインであるZZドメインをコードする ZZ遺伝子は、ZZ遺伝子を有するpEZZ18(アマシャムバイオサイエンス社)から、PCR法により調製した。エビ由来のルシフェラーゼ遺伝子は、エビ由来のルシフェラーゼ遺伝子を有するpHis-KAZ(Inouye et al. FEBS Lett. 2000:481、19-25)から、PCR法により調製した。発現ベクターとしては、pCold II 発現ベクター(タカラバイオ社)を用いた。
pHis-KAZ-NXを鋳型として2種のPCRプライマー:KAZ-8N/EcoRI(5’ gcg GAA TTC TTT ACG TTG GCA GAT TTC GTT GGA 3’(配列番号:37);EcoRI制限酵素部位はアンダーライン)およびKAZ-5C/XbaI(5’ cc gcT CTA GAA TTA GGC AAG AAT GTT CTC GCA AAG-CCT 3’(配列番号:38);XbaI制限酵素部位はアンダーライン)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られた断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、pCold-ZZ-AQの制限酵素EcoRI/XbaI部位に連結することによって、図6に示す発現ベクターpCold-ZZ-KAZを構築した。
実施例2で示したZZ融合hGL蛋白質よりZZ蛋白質部分を切断除去するための、融合部分にトロンビンまたはヒトレノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位持つ2種のベクター、pCold-ZZ-T-hGLまたはpCold-ZZ-P-hGL、を以下の通り構築した。
実施例2で得たpCold-ZZ-hGL を制限酵素BamHI/EcoRI で消化後、プロテアーゼ切断部位配列相当部分のオリゴヌクレオチドを合成し挿入した。トロンビン切断認識配列オリゴヌクレオチドとしては、Thronbin B/E-F 5’ GA TCT CTG GTT CCG CGT GGA TCC G 3’(配列番号:39)および Thrombin B/E-R 5’ AA TTC GGA TCC ACG CGG AAC CAG A 3’(配列番号:40)を用いた。ヒトレノウイルス3Cプロテアーゼ切断認識配列オリゴヌクレオチドとしては、 PreScission B/E-F 5’ GA TCT CTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC G 3’(配列番号:41)及び PreScission B/E-R5’ AA TTC GGG CCC CTG GAA CAG AAC TTC CAG A 3’(配列番号:42)を用いた。これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、常法により実施例2で得た発現ベクターpCold-ZZ-hGL のBamHI/EcoRIにより挿入して、図7に示す発現ベクターpCold-ZZ-T-hGLまたは図8に示す発現ベクターpCold-ZZ-P-hGLを構築した。
組換えZZ−アポAQ融合蛋白質の調製は、以下に記載するように、組換えZZ−アポAQ融合蛋白質を大腸菌で発現させた後、発現された該融合蛋白質を抽出し、抽出した該融合蛋白質を各種クロマトグラフ法を用いて精製することによって行った。
なお、精製過程における融合蛋白質の発光活性の測定は、以下のようにして行った。まず、10 mM EDTA を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)の緩衝液1ml 中で、粗ZZ−アポAQ融合蛋白質溶液、2-メルカプトエタノール(1μl)、エタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg/μl)を混合した後、氷上(4℃)で2時間放置することにより発光活性を持つZZ−AQ融合蛋白質を調製した。得られたZZ−AQ融合蛋白質溶液に50mM CaCl2 100μlを加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置PSN AB2200(アトー社製)で10秒間発光活性の測定を行った。発光活性(最大値(Imax)など)は、相対発光強度(rlu)で評価した。
実施例1で得た発現ベクターpCold-ZZ-AQをポリエチレングリコール法により大腸菌BL21株に導入し、形質転換株を得た。得られた形質転換株を37℃で18時間培養した。培養後、その形質転換株をアンピシリン(100μg/ml)を含有する10mlのLB液体培地(水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2)に植菌し、さらに37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌体液を新たなLB液体培地2リットル(400mlx5本)に添加して、37℃で4.5時間培養した。培養後、その培養菌体液を氷水上で冷却して、イソプロピル-β-D(−)-チオガラクトピラノシド(IPTG、和光純薬工業社製)を最終濃度0.1mMになるように培養液に添加し、15℃にて17時間培養を行った。培養菌体を、冷却遠心機により5分間、5,000rpm(6000×g)で集菌した。
上記1)で集菌した菌体を200 ml(40mlx5本)の50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理(ブランソン社製、ソニファイアーモデル250)を各2分間、3回行った。その菌体破砕液を10,000rpm(12,000×g)で20分間遠心分離後、得られた溶解性画分をZZ−アポAQ融合蛋白質精製の出発材料とした。
上記2)で得られた溶解性画分(200 ml)を、50mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したQ-セファロースカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ:直径2.5×6cm)に添加して吸着させた後、カラムを250 mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で洗浄した。カラムに吸着した蛋白質を全量100mlで、塩化ナトリウム濃度0〜1.0Mの直線濃度勾配により溶出した。塩化ナトリウム濃度0.45〜0.65Mにて発光活性を有するZZ−アポAQ融合蛋白質の溶出が確認された(25 ml;ZZ−アポAQ活性画分)。
Q-セファロースカラムから溶出したZZ−アポAQ活性画分を、50mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ:直径1.5×5cm)に添加してZZ−アポAQ融合蛋白質を吸着させた。吸着したZZ−アポAQ融合蛋白質を、全量100mlで、イミダゾール濃度0〜0.3M(和光純薬工業社製)の直線濃度勾配により溶出した。イミダゾール濃度0.06〜0.12Mにて、発光活性を有するZZ−アポAQ融合蛋白質の溶出が確認された(26 ml;ZZ−アポAQ活性画分)。
ニッケルキレートカラムから溶出したZZ−アポAQ活性画分の一部を、アミコンウルトラ-4 遠心フィルターデバイス(分子量10,000カット;ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮した溶液4mlを、IgG-セファロース 6FastFlowカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ:直径1.5×4cm)に添加して、ZZ−アポAQ融合蛋白質を吸着させた。吸着したZZ−アポAQ融合蛋白質を、0.5Mの酢酸アンモニウム(pH3.4)(和光純薬工業社製)にて溶出した。
12%SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により、図9に示すように純度は95%以上であることを確認した。
精製の収率を、表1にまとめた。IgGセファロースカラムにより、培養液420ml相当から純度95%以上で7.8mgの精製ZZ−アポAQを得た。
ZZ−アポAQ融合蛋白質からZZ−AQ融合蛋白質への変換は、以下の条件で行った。
実施例5で得た精製ZZ−アポAQ融合蛋白質(1mg)を10mM DTTおよび、10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 5mlに溶解し、エタノールに溶解した1.2倍当量のセレンテラジン 24μgを加え、4℃で一昼夜放置し、ZZ−AQ融合蛋白質へと変換した。得られたZZ−AQ融合蛋白質は、アミコンウルトラ-4(分子量10,000カット)で濃縮後、10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 8ml(2mlで4回)で洗浄し、余剰のセレンテラジンを除いた。活性の回収率95%でZZ−AQ融合蛋白質を得た。
(1)組換え蛋白質の大腸菌での発現
ZZ融合蛋白質発現ベクター(pCold-ZZ-AQ、pCold-ZZ-hGL、pCold-ZZ-KAZ)またはZZ非融合蛋白質発現ベクター(pCold-AQ、pCold-hGL、pCold-KAZ)をポリエチレングリコール法により宿主大腸菌BL21株に導入し、形質転換体を得た。得られた形質転換株をアンピシリン(100μg/ml)を含有する10mlのLB液体培地(水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2)(本実施例中の以下すべての培養に関しても、同様にLB液体培地を用いた)に植菌し、さらに37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌体液を新たなLB液体培地10mlに添加して、37℃で4.5時間培養した。培養後、その培養液を氷水上で冷却して、イソプロピル-β-D(−)-チオガラクトピラノシド(IPTG、和光純薬工業社製)を最終濃度0.1mMになるように培養液に添加し、15℃にて17時間培養を行った。培養菌体1mlを、冷却遠心機により5分間、5,000rpm(6000×g)で集菌した。
集菌した菌体を1mlの10 mM EDTA を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理(ブランソン社製、ソニファイアーモデル250)を30秒行った。その菌体破砕液を10,000rpm(12,000×g)で3分間遠心分離し、上清を可溶性画分として使用した。次いで、沈殿を10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6)1mlに懸濁し、不溶性画分として使用した。
上記(2)で得た可溶性画分および不溶性画分50μlを0.95mlの10 mM EDTA を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)に溶解し、2-メルカプトエタノール(1μl)、エタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg/μl)を混合した後、アポイクオリン画分を添加し、氷上(4℃)で2時間放置することにより発光活性を持つイクオリンに再生させた。再生イクオリン1μlにCaCl2100μlを加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200(アトー社製)で10秒間発光活性を測定した。発光活性は、前記した発光活性の測定を3回行い、発光活性の最大値(Imax)の平均値(rlu)で評価した。
上記(2)で得た可溶性画分および不溶性画分1μlを0.1mlの10 mM EDTA を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)に溶解し、エタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg/μl)を混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性を測定した。発光活性は、前記した発光活性の測定を3回行い、発光活性の最大値(Imax)の平均値(rlu)で評価した。
上記(2)で得た可溶性画分および不溶性画分1μlを0.1mlの10 mM EDTA を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)に溶解し、エタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg/μl)を混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性を測定した。発光活性は、前記した発光活性の測定を3回行い、発光活性の最大値(Imax)の平均値(rlu)で評価した。
その結果を表2に示す。異種蛋白質を大腸菌内で発現させる場合、ZZ融合蛋白質として発現する方が、可溶性率が明らかに高い。
さらに、ガウシアルシフェラーゼ(hGL)はその分子内にシステイン残基が10カ所存在する。天然のガウシアルシフェラーゼは、還元剤処理によりその発光活性が完全に失活することが知れている。また、ガウシアルシフェラーゼは、大腸菌内でのリホールディングの効率が悪いことが知られている。しかし、ZZ融合蛋白質として発現させると、ZZ非融合蛋白質発現系に比べ約5倍のリホールディングの効率があがることが示された。また、低温で培養することによって、リホールディングの効率があがる場合もあることも示唆された。
一方、エビルシフェラーゼ(KAZ)を大腸菌内で発現させた場合は、既報(Inouye et al. FEBS Lett. 2000:481、19-25)にあるように、不溶性蛋白質として発現し、大腸菌の粗抽出物の発光活性は非常に低い。しかし、ZZ融合蛋白質として発現させたKAZは、可溶性であり且つ発光活性を有することが明らかとなった。
(1)組換え蛋白質の大腸菌での発現
ZZ融合蛋白質発現ベクター(pCold-ZZ-AQ、pCold-ZZ-hGL、pCold-ZZ-KAZ、pCold-ZZ-T-hGL、pCold-ZZ-P-hGL)またはZZ非融合蛋白質発現ベクター(pCold-AQ、pCold-hGL、pCold-KAZ)をポリエチレングリコール法により宿主大腸菌BL21株に導入し、形質転換体を得た。得られた形質転換株をアンピシリン(100μg/ml)を含有する10mlのLB液体培地(水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2)に植菌し、さらに37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌体液0.1 mlを新たなLB液体培地10mlに添加して、37℃で4.5時間培養した。培養後、その培養液を氷水上で冷却して、イソプロピル-β-D(−)-チオガラクトピラノシド(IPTG、和光純薬工業社製)を最終濃度0.1mMになるように培養液に添加し、15℃にて17時間培養を行った。培養菌体1mlを、冷却遠心機により5,000rpm(6000 x g)、5分で集菌した。
(2)培養菌体からの組換え蛋白質の抽出
集菌した菌体を0.5mlの10 mM EDTA を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理(ブランソン社製、ソニファイアーモデル250)を30秒行った。その菌体破砕液を10,000rpm(12,000×g)で3分間遠心分離し、上清を可溶性画分(S)として使用した。次いで、沈殿を10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6)0.5mlに懸濁し、不溶性画分(P)として使用した。
(3)組換え蛋白質のSDS−PAGE分析
上記(2)で得た可溶性画分および不溶性画分20μlにLaemmli のサンプルバッファー20μl 添加して、95℃、 3分間処理を行い、12%(w/v)SDS-PAGE ゲル(TEFCO社製)に供し、25mAで90min電気泳動を行った。泳動後のゲルは、固定液(メタノール:酢酸:水=50ml:10ml:40ml)で30分間処理した後、コロイドCBB染色キット(TEFCO社製)により1時間染色した。脱色は蒸留水200mlにより洗浄することにより行った。その結果を図10に示した。ZZ非融合蛋白質発現ベクター系であるpCold-AQ、 pCold-hGL、 pCold-KAZを用いた場合、その発現蛋白質は、主に不溶性画分(P)に認められた。一方、ZZ融合蛋白質発現ベクター系であるpCold-ZZ-AQ、 pCold-ZZ-hGL、 pCold-ZZ-KAZを用いた場合、その発現蛋白質は、主に可能性画分(S)に認められた。この結果は、発光活性とも相関があり、ZZ融合蛋白質として発現させた場合の方が、ZZ非融合蛋白質として発現させた場合より発光活性が高かった。
これらの結果から、ZZ蛋白質と融合することにより、活性を持つ蛋白質を効率的に可溶性蛋白質として発現させることが可能であることが示された。
同様に、プロテアーゼ切断認識部位を有するpCold-ZZ-T-hGL、pCold-ZZ-P-hGLベクターを用いた発現においても、図11に示すように、活性を持つ蛋白質を効率的に可溶性蛋白質として発現させることが可能であることが示された。
また、本発明の、少なくとも1つの制限酵素サイトを含有する発現ベクターは、目的蛋白質をコードする遺伝子を制限酵素サイトに挿入して発現させることによって、目的蛋白質を可溶性蛋白質として製造することができる。よって、前記発現ベクターは、有用蛋白質などの目的蛋白質の製造に好適に用いることができる。
[配列番号:2]配列番号:1で表されるアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:3]式(Z)2で表されるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:4]配列番号:3で表されるアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:5]参考例1で作製したアポイクオリン発現ベクターpCold-AQに挿入されたDNAにコードされている、組換えアポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:6]参考例1で作製したアポイクオリン発現ベクターpCold-AQに挿入された、組換えアポイクオリンをコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:7]実施例1で作製したZZ−アポイクオリン融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-AQに挿入されたDNAにコードされている、組換えZZ−アポイクオリン融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号:8]実施例1で作製したZZ−アポイクオリン融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-AQに挿入された、組換えZZ−アポイクオリン融合蛋白質をコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:9]参考例2で作製したガウシアルシフェラーゼ発現ベクターpCold-hGLに挿入されたDNAにコードされている、組換えガウシアルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:10]参考例2で作製したガウシアルシフェラーゼ発現ベクターpCold-hGLに挿入された、組換えガウシアルシフェラーゼをコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:11]実施例2で作製したZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-hGLに挿入されたDNAにコードされている、組換えZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号:12]実施例2で作製したZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-hGLに挿入された、組換えZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質をコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:13]参考例3で作製したエビルシフェラーゼの触媒ユニットである19KDa蛋白質(KAZ)発現ベクターpCold-KAZに挿入されたDNAにコードされている、組換えKAZのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:14]参考例3で作製したエビルシフェラーゼの触媒ユニットである19KDa蛋白質(KAZ)発現ベクターpCold-KAZに挿入された、組換えKAZをコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:15]実施例3で作製したZZ−KAZ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-KAZに挿入されたDNAにコードされている、組換えZZ−KAZ融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号:16]実施例3で作製したZZ−KAZ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-KAZに挿入された、組換えZZ−KAZ融合蛋白質をコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:17]実施例4で作製した、トロンビン切断部位を有するZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-T-hGLに挿入されたDNAにコードされている、組換えZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号:18]実施例4で作製した、トロンビン切断部位を有するZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-T-hGLに挿入された、組換えZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質をコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:19]実施例4で作製した、ヒトレノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位を有するZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-P-hGLに挿入されたDNAにコードされている、組換えZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号:20]実施例4で作製した、ヒトレノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位を有するZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-P-hGLに挿入された、組換えZZ−ガウシアルシフェラーゼ融合蛋白質をコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:21]アポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:22]アポイクオリンをコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:23]ガウシアルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:24]ガウシアルシフェラーゼをコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:25]エビルシフェラーゼの触媒ユニットである19KDa蛋白質(KAZ)のアミノ酸配列を示す。
[配列番号:26]エビルシフェラーゼの触媒ユニットである19KDa蛋白質(KAZ)をコードするDNAの塩基配列を示す。
[配列番号:27]参考例1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:28]参考例1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:29]実施例1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:30]実施例1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:31]参考例2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:32]参考例2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:33]実施例2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:34]実施例2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:35]参考例3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:36]参考例3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:37]実施例3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:38]実施例3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号:39]実施例4で用いられたトロンビン切断認識配列オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
[配列番号:40]実施例4で用いられたトロンビン切断認識配列オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
[配列番号:41]実施例4で用いられたヒトレノウイルス3Cプロテアーゼ切断認識配列オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
[配列番号:42]実施例4で用いられたヒトレノウイルス3Cプロテアーゼ切断認識配列オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
Claims (39)
- (1)コールドショック遺伝子のプロモーター配列;
(2)式(Z)n
(式中、nは1〜5の整数を表し、Zは以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるポリペプチドを表す:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有し、
融合蛋白質がエシェリヒア属菌内に可溶性蛋白質として蓄積する発現ベクター。 - 前記式(Z)nで表されるポリペプチドが、(Z)2で表されるポリペプチドである、請求項1記載のベクター。
- 前記式(Z)2で表されるポリペプチドが、
(e)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(f)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、および
(g)配列番号:3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項2記載のベクター。 - 前記コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子cspA、cspB、cspG、cspIまたはcsdAのプロモーター配列である、請求項4記載のベクター。
- 前記第1のコード配列と、前記第2のコード配列との間に、さらに切断可能なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記切断可能なリンカーペプチドが、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドである、請求項6記載のベクター。
- 前記第1のコード配列の5’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、請求項8記載のベクター。
- (1)コールドショック遺伝子のプロモーター配列;
(2)式(Z)n
(式中、nは1〜5の整数を表し、Zは以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるポリペプチドを表す:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列を挿入することができる少なくとも1つの制限酵素サイト
を含有し、
融合蛋白質がエシェリヒア属菌内に可溶性蛋白質として蓄積する発現ベクター。 - 前記式(Z)nで表されるポリペプチドが、(Z)2で表されるポリペプチドである、請求項10記載のベクター。
- 前記式(Z)2で表されるポリペプチドが、
(e)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(f)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、および
(g)配列番号:3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項11記載のベクター。 - 前記コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、請求項10〜12のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子cspA、cspB、 cspG、cspIまたはcsdAのプロモーター配列である、請求項13記載のベクター。
- 前記第1のコード配列と、前記第2のコード配列との間に、さらに切断可能なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、請求項10〜14のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記切断可能なリンカーペプチドが、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドである、請求項15記載のベクター。
- 前記第1のコード配列の5’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、請求項10〜16のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、請求項17記載のベクター。
- (1)式(Z)n
(式中、nは1〜5の整数を表し、Zは以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるポリペプチドを表す:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含有する第1のアミノ酸配列;および
(2)目的蛋白質のアミノ酸配列を含有する第2のアミノ酸配列
を含有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載のベクターによりエシェリヒア属菌内に可溶性蛋白質として発現させ蓄積させることができる融合蛋白質。 - 前記式(Z)nで表されるポリペプチドが、(Z)2で表されるポリペプチドである、請求項19記載の融合蛋白質。
- 前記式(Z)2で表されるポリペプチドが、
(e)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(f)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、および
(g)配列番号:3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項20記載の融合蛋白質。 - 前記目的蛋白質が、アポイクオリン、ガウシアルシフェラーゼおよびエビルシフェラーゼからなる群から選択されるいずれかである、請求項19〜21のいずれか1項に記載の融合蛋白質。
- 前記第1のアミノ酸配列と、前記第2のアミノ酸配列との間に、さらに切断可能なリンカーペプチドのアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列を含有する、請求項19〜22のいずれか1項に記載の融合蛋白質。
- 前記切断可能なリンカーペプチドが、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドである、請求項23記載の融合蛋白質。
- 前記第1のアミノ酸配列のアミノ末端側に、さらに精製のためのアミノ酸配列を含有する、請求項19〜24のいずれか1項に記載の融合蛋白質。
- 前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、請求項25記載の融合蛋白質。
- 式(Z)n−L−X
(式中、nは1〜5の整数を表し;Lは切断可能なリンカーペプチドを表し;Zは以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるポリペプチドを表し:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド;Xは目的蛋白質のアミノ酸配列を表す)
で表される、請求項6〜9のいずれか1項に記載のベクターによりエシェリヒア属菌内に可溶性蛋白質として発現させ蓄積させることができる融合蛋白質。 - 前記目的蛋白質が、アポイクオリン、ガウシアルシフェラーゼおよびエビルシフェラーゼからなる群から選択されるいずれかである、請求項27記載の融合蛋白質。
- 請求項19〜28のいずれか1項に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
- DNAである、請求項29記載のポリヌクレオチド。
- (1)コールドショック遺伝子のプロモーター配列;
(2)式(Z)n
(式中、nは1〜5の整数を表し、Zは以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるポリペプチドを表す:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド)
で表され、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第1のコード配列;および
(3)目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する第2のコード配列
を含有する発現ベクターを用いて融合蛋白質をエシェリヒア属菌内に可溶性蛋白質として発現させ蓄積させることを含む、前記目的蛋白質を可溶性蛋白質として製造する方法。 - 前記式(Z)nで表されるポリペプチドが、(Z)2で表されるポリペプチドである、請求項31記載の方法。
- 前記式(Z)2で表されるポリペプチドが、
(e)配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(f)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、および
(g)配列番号:3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項32記載の方法。 - 前記コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、請求項31〜33記載の方法。
- 前記大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子cspA、cspB、 cspG、cspIまたはcsdAのプロモーター配列である、請求項34記載の方法。
- 前記第1のコード配列と、前記第2のコード配列との間に、さらに切断可能なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、請求項31〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記切断可能なリンカーペプチドが、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドである、請求項36記載の方法。
- 前記第1のコード配列の5’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、請求項31〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、請求項38記載の方法。
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