JPH0829112B2 - araBプロモーター、および微生物学的方法によるセクロピン類を含むポリペプチド類の製造法 - Google Patents
araBプロモーター、および微生物学的方法によるセクロピン類を含むポリペプチド類の製造法Info
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- JPH0829112B2 JPH0829112B2 JP6094753A JP9475394A JPH0829112B2 JP H0829112 B2 JPH0829112 B2 JP H0829112B2 JP 6094753 A JP6094753 A JP 6094753A JP 9475394 A JP9475394 A JP 9475394A JP H0829112 B2 JPH0829112 B2 JP H0829112B2
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Description
【0001】関連出願 この出願は、1985年1月28日に出願された米国特
許第695,309号の一部継続出願である。
許第695,309号の一部継続出願である。
【0002】技術分野 本発明は、組換えDNA工学および、形質転換された宿
主における異種遺伝子の発現にaraBプロモーターを使
用することに関する。さらに、この特許は、殺菌性ペプ
チドであるセクロピンおよびその類縁物質をコードして
いる遺伝子の修飾、クローニング、および発現に関する
ものである。
主における異種遺伝子の発現にaraBプロモーターを使
用することに関する。さらに、この特許は、殺菌性ペプ
チドであるセクロピンおよびその類縁物質をコードして
いる遺伝子の修飾、クローニング、および発現に関する
ものである。
【0003】技術的背景 DNA分子にコードされている遺伝情報は、DNAのm
−RNAへの転写およびそれに続くm−RNAのポリペ
プチドまたは蛋白質への翻訳を含む一連の過程で発現さ
れる。ポリペプチドを形成するための、コード化された
情報の発現は、RNAポリメラーゼが結合し、転写を開
始させるDNA上の領域、即ちプロモーター部位で開始
される。異種遺伝子の発現のための組換えDNA法に使
用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ(ペニシ
リナーゼ)やラクトース(β−ガラクトシダーゼ)のプロ
モーター系[チャング(Chang)ら、ネイチャー(Natur
e)、275:615(1978); イタクラ(Itakura)
ら、サイエンス(Science)、198:1056(197
7); ゴーデル(Goeddel)ら、Nature。281:544
(1979)]および、トリプトファン(trp)プロモーター
系[Goeddelら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、
8:4057(1980): EPO特許出願公開第003
6776号]が含まれる。他の知られたプロモーターに
は、バクテリオファージλプロモーター、(PL)および
(PR)、hut、コリシンE1、ガラクトース、アルカリフ
ォスファターゼ、キシロースAおよび、tacなどがあ
る。
−RNAへの転写およびそれに続くm−RNAのポリペ
プチドまたは蛋白質への翻訳を含む一連の過程で発現さ
れる。ポリペプチドを形成するための、コード化された
情報の発現は、RNAポリメラーゼが結合し、転写を開
始させるDNA上の領域、即ちプロモーター部位で開始
される。異種遺伝子の発現のための組換えDNA法に使
用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ(ペニシ
リナーゼ)やラクトース(β−ガラクトシダーゼ)のプロ
モーター系[チャング(Chang)ら、ネイチャー(Natur
e)、275:615(1978); イタクラ(Itakura)
ら、サイエンス(Science)、198:1056(197
7); ゴーデル(Goeddel)ら、Nature。281:544
(1979)]および、トリプトファン(trp)プロモーター
系[Goeddelら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、
8:4057(1980): EPO特許出願公開第003
6776号]が含まれる。他の知られたプロモーターに
は、バクテリオファージλプロモーター、(PL)および
(PR)、hut、コリシンE1、ガラクトース、アルカリフ
ォスファターゼ、キシロースAおよび、tacなどがあ
る。
【0004】araB遺伝子とそのプロモーター(araB)
は、L−アラビノースオペロン中に位置している。エシ
エリヒアコリ(大腸菌)(Escherichia coli)およびサル
モネラチフィムリウム(Salmonella typhimurium)のL
−アラビノースオペロン(araBAD)は、研究されてい
る。S.チフィムリウム中のL−アラビノースオペロン
は、特に興味深い。その配列は、以下に開示されてい
る: ホルウィツ(Horwitz,A.)らの“S.チフィムリ
ウムLT2中のaraBAD−araCコントロール領域のD
NA配列"、ジーン(Gene)、14: 309−319(1
981)および、リン(Lin, H.−C.)らによる
“S.チフィムリウムLT2のaraBADオペロン、
I.araBのヌクレオチド配列および、その生成物リブ
ロキナーゼの一次構造“Gene、34: 111−122
(1985); II." araAのヌクレオチド配列およ
び、その生成物L−アラビノースイソメラーゼの一次構
造" Gene、34:123−128(1985); III.
“araDとその側面領域のヌクレオチド配列および、そ
の生成物L−リブロース−5−フォスフェイト−4−エ
ピメラーゼの一次構造" Gene、34: 129−134
(1985)などの一連の文献に開示されている。araB
ADオペロンは、L−アラビノースの初期代謝に関与し
ている3つの構造遺伝子を含んでいる[リー、ヤー−ハ
ウ(Lee, Jar−How)らの“S.チフィムリウムLT2
ara 突然変異の遺伝子的特徴付け" 、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー(J.of Bacteriology)、15
8: 344−46(1984)]。L−アラビノースは、a
raA遺伝子産物であるL−アラビノースイソメラーゼに
より、まず、L−リブロースに変換される。それから、
L−リブロースは、araB遺伝子産物であるリブロキナ
ーゼによりL−リブロース−5−フォスフェイトにリン
酸化される。araD遺伝子産物であるL−リブロース−
5−フォスフェイト−4−エピメラーゼは、L−リブロ
ース−5−フォスフェイトのD−キシロース−5−ホス
フェイトへの変換を触媒し、次いでこの後者がペントー
スリン酸化系路に入る。araBADオペロンは、インジ
ューサー(誘導酵素)であるL−アラビノースとaraC調
節遺伝子産物によって調和をもってコントロールされ
る。
は、L−アラビノースオペロン中に位置している。エシ
エリヒアコリ(大腸菌)(Escherichia coli)およびサル
モネラチフィムリウム(Salmonella typhimurium)のL
−アラビノースオペロン(araBAD)は、研究されてい
る。S.チフィムリウム中のL−アラビノースオペロン
は、特に興味深い。その配列は、以下に開示されてい
る: ホルウィツ(Horwitz,A.)らの“S.チフィムリ
ウムLT2中のaraBAD−araCコントロール領域のD
NA配列"、ジーン(Gene)、14: 309−319(1
981)および、リン(Lin, H.−C.)らによる
“S.チフィムリウムLT2のaraBADオペロン、
I.araBのヌクレオチド配列および、その生成物リブ
ロキナーゼの一次構造“Gene、34: 111−122
(1985); II." araAのヌクレオチド配列およ
び、その生成物L−アラビノースイソメラーゼの一次構
造" Gene、34:123−128(1985); III.
“araDとその側面領域のヌクレオチド配列および、そ
の生成物L−リブロース−5−フォスフェイト−4−エ
ピメラーゼの一次構造" Gene、34: 129−134
(1985)などの一連の文献に開示されている。araB
ADオペロンは、L−アラビノースの初期代謝に関与し
ている3つの構造遺伝子を含んでいる[リー、ヤー−ハ
ウ(Lee, Jar−How)らの“S.チフィムリウムLT2
ara 突然変異の遺伝子的特徴付け" 、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー(J.of Bacteriology)、15
8: 344−46(1984)]。L−アラビノースは、a
raA遺伝子産物であるL−アラビノースイソメラーゼに
より、まず、L−リブロースに変換される。それから、
L−リブロースは、araB遺伝子産物であるリブロキナ
ーゼによりL−リブロース−5−フォスフェイトにリン
酸化される。araD遺伝子産物であるL−リブロース−
5−フォスフェイト−4−エピメラーゼは、L−リブロ
ース−5−フォスフェイトのD−キシロース−5−ホス
フェイトへの変換を触媒し、次いでこの後者がペントー
スリン酸化系路に入る。araBADオペロンは、インジ
ューサー(誘導酵素)であるL−アラビノースとaraC調
節遺伝子産物によって調和をもってコントロールされ
る。
【0005】本明細書および請求の範囲に記載した1つ
の態様では、araBプロモーターを、セクロピンをコー
ドしている遺伝子と機能的に連結し、セクロピンタンパ
ク質の発現のため適当な宿主に挿入しているので、セク
ロピンについての背景技術文献を概観することは価値あ
ることである。
の態様では、araBプロモーターを、セクロピンをコー
ドしている遺伝子と機能的に連結し、セクロピンタンパ
ク質の発現のため適当な宿主に挿入しているので、セク
ロピンについての背景技術文献を概観することは価値あ
ることである。
【0006】セクロピア蛾と数種の鱗翅類の昆虫の免疫
機構は、主として、最近抗菌ペプチド類として見出され
たセクロピン類が関与している有効な体液性応答によっ
て特徴付けられる[ボーマン、H.G.(Boman, H.
G.)とステイナー、H(Steiner, H.)のカレント・
トピックス・イン・ミクロバイオロジー・アンド・イム
ノロジー(Current Topics in Microbiology and
Immunology)、94/95:75−91(1981)]。
3つの主要なセクロピン、A、BおよびDが免疫性血液
とリンパから精製されており、それらの配列が明らかに
された[ステイナー(Steiner)らのネイチャー(Natur
e)、292:246−248(1981); キュー(Qu)ら
のヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(European Journal of Biochemistry)、12
7:219−224(1982); フルトマルク、D(Hul
tmark, D)のイビッド(ibid)127:207−217(1
982); およびフルトマルクの米国特許第4,355,
104号]。これらすべてのセクロピンは、互いに高度
の配列ホモロギー(相同性)を持った小さな塩基性ペプチ
ドである。アンセレア・ペルニー(Antheraea pernyi)
[A.P.]とハイロフォラ・セクロピア(Hylophora ce
cropia)[H.C.]由来のセクロピンBおよびDのアミ
ノ酸配列は以下の通りである:
機構は、主として、最近抗菌ペプチド類として見出され
たセクロピン類が関与している有効な体液性応答によっ
て特徴付けられる[ボーマン、H.G.(Boman, H.
G.)とステイナー、H(Steiner, H.)のカレント・
トピックス・イン・ミクロバイオロジー・アンド・イム
ノロジー(Current Topics in Microbiology and
Immunology)、94/95:75−91(1981)]。
3つの主要なセクロピン、A、BおよびDが免疫性血液
とリンパから精製されており、それらの配列が明らかに
された[ステイナー(Steiner)らのネイチャー(Natur
e)、292:246−248(1981); キュー(Qu)ら
のヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(European Journal of Biochemistry)、12
7:219−224(1982); フルトマルク、D(Hul
tmark, D)のイビッド(ibid)127:207−217(1
982); およびフルトマルクの米国特許第4,355,
104号]。これらすべてのセクロピンは、互いに高度
の配列ホモロギー(相同性)を持った小さな塩基性ペプチ
ドである。アンセレア・ペルニー(Antheraea pernyi)
[A.P.]とハイロフォラ・セクロピア(Hylophora ce
cropia)[H.C.]由来のセクロピンBおよびDのアミ
ノ酸配列は以下の通りである:
【化1】
【0007】セクロピンは、その構造が蜂毒液であるメ
リチンに似ているが、メリチンよりも広い抗菌スペクト
ラムを有していて、培養肝細胞、羊の赤血球、または、
昆虫細胞を溶解しない。上に示したように、全てのヤク
ロピンのカルボキシ末端は封鎖されていて、ヤクロピン
Aの場合は、封鎖している基は、1級アミド基である
[アンドリュー(Andreu)らのプロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイ
ズ、USA(Proceedings of the NationalAcadem
y of Sciences, USA)、80:6475−6479
(1983)]。ヤクロピンAとその数種の関連ペプチド
は、近年、固相法によって合成されていて、それらは、
化学的および物理的判定基準では、天然のヤクロピンA
と全く識別できない(Andreuら、同上)。
リチンに似ているが、メリチンよりも広い抗菌スペクト
ラムを有していて、培養肝細胞、羊の赤血球、または、
昆虫細胞を溶解しない。上に示したように、全てのヤク
ロピンのカルボキシ末端は封鎖されていて、ヤクロピン
Aの場合は、封鎖している基は、1級アミド基である
[アンドリュー(Andreu)らのプロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイ
ズ、USA(Proceedings of the NationalAcadem
y of Sciences, USA)、80:6475−6479
(1983)]。ヤクロピンAとその数種の関連ペプチド
は、近年、固相法によって合成されていて、それらは、
化学的および物理的判定基準では、天然のヤクロピンA
と全く識別できない(Andreuら、同上)。
【0008】興味あることに、カルボキシ末端のテトラ
ペプチドイミドは、E.コリに対しての抗菌活性にとっ
てさほど重要性を持っていないが、試験した他の3つの
細菌では、抗菌活性はセクロピンAの抗菌活性より3%
から20%低下した。
ペプチドイミドは、E.コリに対しての抗菌活性にとっ
てさほど重要性を持っていないが、試験した他の3つの
細菌では、抗菌活性はセクロピンAの抗菌活性より3%
から20%低下した。
【0009】セクロピンは、グラム陰性菌およびグラム
陽性菌などを含む様々な細菌に対して抗菌性を有してい
る。セクロピンの作用機序に関して得られた資料によ
り、セクロピンは、細菌の細胞質膜を破壊することが判
明した[スタイナー(Steiner)らのNature、292:2
46−248(1981)]。その文献より、細菌種が異
なればセクロピンに対する感受性も異なり、各々のセク
ロピンが固有の活性スペクトラムを有することは明白で
ある。たとえば、バシルス・メガテリウム(Bacillus
megaterium)は、セクロピンAとBに対して高感受性で
あるが、セクロピンDに対しては比較的耐性である。グ
ラム陰性菌もグラム陽性菌もセクロピンに対して、μモ
ル濃度の範囲で感受性を示すことがわかった。セクロピ
ンに対する感受性の高い細菌は、E.コリ、シュードモ
ナス・アエルギノサ(Pseudomonas areruginosa)、S.
マルセスセンス(Serratia marsescens)、キセノルハ
ブダス・ネマトフィルス(Xenorhabdus nematophilu
s)、B.メガテリウム(B.megatherium)および、ミク
ロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)である。
セクロピンAおよびBは全部で12個のアミノ酸置換を
示すが、9種の異なる細菌種に対する活性は非常に似て
いる。このことは、多くのアミノ酸を、ペプチドの生物
活性を変えることなく置換し得ることを示している。同
様に、中国のオーク絹蛾(A.pernyi)から得られるセク
ロピンBと南アメリカ絹蛾(H.cecropia)から得られる
セクロピンBとは、4つの部位で異なっている。しか
し、その内の3つの置換は、H.cecropiaA形に存在す
る対応アミノ酸の置換である。4番目の置換は、H.ce
cropiaAとBが異なっている部位でのものであり、保存
的置換である。よって、保存的アミノ酸置換によって作
られたセクロピンの特異な誘導体が、その生物活性を持
つ続けることは明らかである。セクロピンDでみられる
ような非保存的置換は、ペプチドの活性を変えてしまう
可能性がある。セクロピンDは、セクロピンAおよびB
とほとんど同程度のE.コリに対する活性を持っている
が、他の8種の細菌種に対しては、明らかに活性が低く
なっている。
陽性菌などを含む様々な細菌に対して抗菌性を有してい
る。セクロピンの作用機序に関して得られた資料によ
り、セクロピンは、細菌の細胞質膜を破壊することが判
明した[スタイナー(Steiner)らのNature、292:2
46−248(1981)]。その文献より、細菌種が異
なればセクロピンに対する感受性も異なり、各々のセク
ロピンが固有の活性スペクトラムを有することは明白で
ある。たとえば、バシルス・メガテリウム(Bacillus
megaterium)は、セクロピンAとBに対して高感受性で
あるが、セクロピンDに対しては比較的耐性である。グ
ラム陰性菌もグラム陽性菌もセクロピンに対して、μモ
ル濃度の範囲で感受性を示すことがわかった。セクロピ
ンに対する感受性の高い細菌は、E.コリ、シュードモ
ナス・アエルギノサ(Pseudomonas areruginosa)、S.
マルセスセンス(Serratia marsescens)、キセノルハ
ブダス・ネマトフィルス(Xenorhabdus nematophilu
s)、B.メガテリウム(B.megatherium)および、ミク
ロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)である。
セクロピンAおよびBは全部で12個のアミノ酸置換を
示すが、9種の異なる細菌種に対する活性は非常に似て
いる。このことは、多くのアミノ酸を、ペプチドの生物
活性を変えることなく置換し得ることを示している。同
様に、中国のオーク絹蛾(A.pernyi)から得られるセク
ロピンBと南アメリカ絹蛾(H.cecropia)から得られる
セクロピンBとは、4つの部位で異なっている。しか
し、その内の3つの置換は、H.cecropiaA形に存在す
る対応アミノ酸の置換である。4番目の置換は、H.ce
cropiaAとBが異なっている部位でのものであり、保存
的置換である。よって、保存的アミノ酸置換によって作
られたセクロピンの特異な誘導体が、その生物活性を持
つ続けることは明らかである。セクロピンDでみられる
ような非保存的置換は、ペプチドの活性を変えてしまう
可能性がある。セクロピンDは、セクロピンAおよびB
とほとんど同程度のE.コリに対する活性を持っている
が、他の8種の細菌種に対しては、明らかに活性が低く
なっている。
【0010】セクロピンやその類縁体の高い有用性およ
び、組換えDNA法によってタンパク質を生産できると
いう大きな展望から、遺伝子組換え法によるセクロピン
の生産系を提供することは価値あることであると考えら
れる。
び、組換えDNA法によってタンパク質を生産できると
いう大きな展望から、遺伝子組換え法によるセクロピン
の生産系を提供することは価値あることであると考えら
れる。
【0011】
【発明の開示】araBプロモーターを、生物活性産物を
コードしているヘテロローガス(異種)遺伝子と機能的に
結合させるなどしてaraBプロモーターを組換えDNA
分子におけるプロモーターとして使用し得ることがわか
った。ヘテロローガス遺伝子の発現をコントロールする
のにaraBプロモーターを使用することは、多くの付帯
的な有利さがある。araBプロモーターコントロール系
はしっかりと統制される。araBプロモーターはL−ア
ラビノースで誘導し得る。例えば、生産されるポリペプ
チド類は培養培地にL−アラビノースを添加するまでは
合成されない。即ち、L−アラビノースの非存在下で
は、ポリペプチドを生成するヘテロローガス遺伝子の発
現はない。L−アラビノースで誘導されることにより、
araBプロモーターで開始されるメッセンジャーRNA
の一部としてポリペプチドが転写される。一旦誘導され
れば、ポリペプチドは迅速に、かつ効率的に生産され
る。さらに、発酵期間は他の系と比較して短い。重要な
ことは発現の程度が増大すること、即ち、ヘテロローガ
スポリペプチドの生産が非常に改良されることであり、
従って、産業上利用することを望ましいものにしてい
る。最後に、発現された融合ポリペプチドは、宿主細胞
内で細胞封入体を形成し、これは、サイズが増大してい
るにもかかわらず非常に安定であり、ヘテロローガスタ
ンパク質の精製が容易である。
コードしているヘテロローガス(異種)遺伝子と機能的に
結合させるなどしてaraBプロモーターを組換えDNA
分子におけるプロモーターとして使用し得ることがわか
った。ヘテロローガス遺伝子の発現をコントロールする
のにaraBプロモーターを使用することは、多くの付帯
的な有利さがある。araBプロモーターコントロール系
はしっかりと統制される。araBプロモーターはL−ア
ラビノースで誘導し得る。例えば、生産されるポリペプ
チド類は培養培地にL−アラビノースを添加するまでは
合成されない。即ち、L−アラビノースの非存在下で
は、ポリペプチドを生成するヘテロローガス遺伝子の発
現はない。L−アラビノースで誘導されることにより、
araBプロモーターで開始されるメッセンジャーRNA
の一部としてポリペプチドが転写される。一旦誘導され
れば、ポリペプチドは迅速に、かつ効率的に生産され
る。さらに、発酵期間は他の系と比較して短い。重要な
ことは発現の程度が増大すること、即ち、ヘテロローガ
スポリペプチドの生産が非常に改良されることであり、
従って、産業上利用することを望ましいものにしてい
る。最後に、発現された融合ポリペプチドは、宿主細胞
内で細胞封入体を形成し、これは、サイズが増大してい
るにもかかわらず非常に安定であり、ヘテロローガスタ
ンパク質の精製が容易である。
【0012】従って本発明は、宿主内で発現し得るポリ
ヌクレオチド分子であって、該宿主にとってヘテロロー
ガスな遺伝子と機能的に結合しているaraBプロモータ
ーの配列を含有しているポリヌクレオチド分子を提供す
るものである。ポリヌクレオチド(類)をコードしている
ヘテロローガス遺伝子は、生物学的に活性である(生物
活性を有する)。本発明はまた、該ポリヌクレオチド分
子を含有している。複製および発現可能なビヒクル、該
ビヒクルで形質転換された宿主、および、最終的な発現
およびヘテロローガスなペプチド(類)を回収するために
該宿主を培養するための発酵法を提供するものである。
ヌクレオチド分子であって、該宿主にとってヘテロロー
ガスな遺伝子と機能的に結合しているaraBプロモータ
ーの配列を含有しているポリヌクレオチド分子を提供す
るものである。ポリヌクレオチド(類)をコードしている
ヘテロローガス遺伝子は、生物学的に活性である(生物
活性を有する)。本発明はまた、該ポリヌクレオチド分
子を含有している。複製および発現可能なビヒクル、該
ビヒクルで形質転換された宿主、および、最終的な発現
およびヘテロローガスなペプチド(類)を回収するために
該宿主を培養するための発酵法を提供するものである。
【0013】本発明はまた、組換えDNA法によりセク
ロピンペプチドおよびその類似体を生産するための方
法、およびその方法に使用する手段を提供するものであ
る。セクロピン(類)は上記araBプロモーターまたはそ
の他のプロモーターを使って発現させることができる。
ロピンペプチドおよびその類似体を生産するための方
法、およびその方法に使用する手段を提供するものであ
る。セクロピン(類)は上記araBプロモーターまたはそ
の他のプロモーターを使って発現させることができる。
【0014】特に本発明は、セクロピン様殺菌作用を有
するペプチドをコードしている遺伝子配列を提供するも
のである。単独で、あるいは他のペプチドまたはアミノ
酸残基と一緒にセクロピンペプチドを含有しているもっ
と長い配列の一部として提供されるこれらの遺伝子配列
は、それらを発現宿主としてのE.coli(大腸菌)に最も
受け入れられ易くする様にコンピュータを使った方法で
設計するのが理想的である。
するペプチドをコードしている遺伝子配列を提供するも
のである。単独で、あるいは他のペプチドまたはアミノ
酸残基と一緒にセクロピンペプチドを含有しているもっ
と長い配列の一部として提供されるこれらの遺伝子配列
は、それらを発現宿主としてのE.coli(大腸菌)に最も
受け入れられ易くする様にコンピュータを使った方法で
設計するのが理想的である。
【0015】具体的には、本発明は、異なったポリペプ
チドをコードしている第2遺伝子配列と機能的に結合し
ているセクロピンをコードしている第1遺伝子配列の融
合配列である遺伝子構築物であって、セクロピン感受性
宿主内で発現し得る遺伝子構築物を提供するものである
(ここで、異なったポリペプチドとは、セクロピン感受
性宿主に対する該発現された融合産物の殺菌作用を抑制
し得るものである)。
チドをコードしている第2遺伝子配列と機能的に結合し
ているセクロピンをコードしている第1遺伝子配列の融
合配列である遺伝子構築物であって、セクロピン感受性
宿主内で発現し得る遺伝子構築物を提供するものである
(ここで、異なったポリペプチドとは、セクロピン感受
性宿主に対する該発現された融合産物の殺菌作用を抑制
し得るものである)。
【0016】本発明のもう1つの目的は、誘導し得るプ
ロモーター配列に機能的に結合しているセクロピンをコ
ードしている遺伝子配列を含有している、セクロピン感
受性宿主内で発現し得る遺伝子構築物を提供するもので
ある。
ロモーター配列に機能的に結合しているセクロピンをコ
ードしている遺伝子配列を含有している、セクロピン感
受性宿主内で発現し得る遺伝子構築物を提供するもので
ある。
【0017】本発明はまた、上記遺伝子構築物を含有し
ている複製および発現可能なビヒクル、該ビヒクルで形
質転換された宿主、および該ビヒクル、構築物ならびに
宿主を使ってセクロピンを生産する方法を提供するもの
である。
ている複製および発現可能なビヒクル、該ビヒクルで形
質転換された宿主、および該ビヒクル、構築物ならびに
宿主を使ってセクロピンを生産する方法を提供するもの
である。
【0018】更に本発明は、セクロピンとポリペプチド
との融合タンパク質であって、細菌宿主に対する殺菌作
用が減少したタンパク質を提供するものである。
との融合タンパク質であって、細菌宿主に対する殺菌作
用が減少したタンパク質を提供するものである。
【0019】セクロピンをコードしている遺伝子配列
は、発現宿主としての大腸菌に最も受け入れられやすく
する様に、好ましくはコンピュータを使った方法で設計
する。また、自己相補性を最小にし、挿入を容易にする
ために配列の内部または外側に制限エンドヌクレアーゼ
部位を避ける様にあるいは設ける様に、そして所望の発
現ビヒクルとの相補性を最小にする様に設計する。ポリ
ヌクレオチド配列をこの様な最適な状態にすることによ
り、本発明は、大抵の場合、セクロピン源として用いら
れる各種の天然の遺伝子とは構造的に異なっている合成
配列を提供する。
は、発現宿主としての大腸菌に最も受け入れられやすく
する様に、好ましくはコンピュータを使った方法で設計
する。また、自己相補性を最小にし、挿入を容易にする
ために配列の内部または外側に制限エンドヌクレアーゼ
部位を避ける様にあるいは設ける様に、そして所望の発
現ビヒクルとの相補性を最小にする様に設計する。ポリ
ヌクレオチド配列をこの様な最適な状態にすることによ
り、本発明は、大抵の場合、セクロピン源として用いら
れる各種の天然の遺伝子とは構造的に異なっている合成
配列を提供する。
【0020】定義 以下の記載においては、組換えDNA技術で用いられる
多くの用語が多数使用されている。明細書および請求の
範囲を明瞭にかつ統一的に理解できる様に、またこの様
な用語の範囲を明確にするためにも、以下に用語の定義
を行なう。
多くの用語が多数使用されている。明細書および請求の
範囲を明瞭にかつ統一的に理解できる様に、またこの様
な用語の範囲を明確にするためにも、以下に用語の定義
を行なう。
【0021】オペロン ポリペプチド発現のための構造
遺伝子およびその発現を調節しているコントロール領域
を含んでいる遺伝子。
遺伝子およびその発現を調節しているコントロール領域
を含んでいる遺伝子。
【0022】オペレーター 特定のリプレッサーと相互
作用し得るDNA配列であり、その相互作用により隣接
遺伝子(群)の機能がコントロールされる。
作用し得るDNA配列であり、その相互作用により隣接
遺伝子(群)の機能がコントロールされる。
【0023】プロモーター RNAポリメラーゼが結合
し、隣接遺伝子(群)の転写を開始させる、コントロール
領域内のDNA配列。
し、隣接遺伝子(群)の転写を開始させる、コントロール
領域内のDNA配列。
【0024】アクチベーター RNAポリメラーゼによ
るRNA合成の開始に必要なタンパク。
るRNA合成の開始に必要なタンパク。
【0025】イニシエーター アクチベーターが相互作
用するDNA配列であり、これにより隣接遺伝子がコン
トロールされる。
用するDNA配列であり、これにより隣接遺伝子がコン
トロールされる。
【0026】ポリヌクレオチド分子 糖と燐酸残基の交
互連結で構成される骨格により互いに連結しているヌク
レオチドの線状配列であり、本明細書においては、DN
AおよびRNAポリマーの両者を含んでいる。
互連結で構成される骨格により互いに連結しているヌク
レオチドの線状配列であり、本明細書においては、DN
AおよびRNAポリマーの両者を含んでいる。
【0027】構造遺伝子 鋳型またはメッセンジャーR
NAを介して、特定のペプチドに特徴的なアミノ酸配列
をコードしているDNA配列。
NAを介して、特定のペプチドに特徴的なアミノ酸配列
をコードしているDNA配列。
【0028】ヘテロローガス(異種)遺伝子 外来性の、
即ち宿主とは異なる供給体に由来する遺伝子であるか、
または化学的に合成された遺伝子であり、宿主とは異な
る種の供給体を含んでいる。この遺伝子は、発現ビヒク
ルによる形質転換を受ける生物によって通常生産されな
いポリペプチドをコードしている。
即ち宿主とは異なる供給体に由来する遺伝子であるか、
または化学的に合成された遺伝子であり、宿主とは異な
る種の供給体を含んでいる。この遺伝子は、発現ビヒク
ルによる形質転換を受ける生物によって通常生産されな
いポリペプチドをコードしている。
【0029】生物活性(生物学的に活性) 本明細書にお
いては、生物系内で生じる目的の効果を達成する性質ま
たはそのプロセスを意味する。
いては、生物系内で生じる目的の効果を達成する性質ま
たはそのプロセスを意味する。
【0030】機能的な結合 本明細書では、プロモータ
ーがヘテロローガス遺伝子によってコードされているポ
リペプチドの発現の開始をコントロールすることを意味
している。
ーがヘテロローガス遺伝子によってコードされているポ
リペプチドの発現の開始をコントロールすることを意味
している。
【0031】発現 構造遺伝子によりポリペプチドが生
産されるプロセスを発現という。これには、遺伝子のメ
ッセンジャーRNA(mRNA)への転写とmRNAのポリ
ペプチドへの翻訳が含まれる。
産されるプロセスを発現という。これには、遺伝子のメ
ッセンジャーRNA(mRNA)への転写とmRNAのポリ
ペプチドへの翻訳が含まれる。
【0032】クローニングビヒクル 宿主細胞内で複製
し得るプラスミドまたはファージDNAまたはその他の
DNA配列であり、DNAの必須の生物学的機能を失う
ことなく、決定可能な様にそのDNA配列を切断し得る
1つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ認識部位によ
って特徴づけられ、かつ、形質転換細胞の同定に使用す
るのに適当な表現型選択マーカーを含んでいるものをい
う。マーカーは、例えばテトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン耐性である。「ベクター」という用語がクロー
ニングベクターの代わりに用いられることがある。
し得るプラスミドまたはファージDNAまたはその他の
DNA配列であり、DNAの必須の生物学的機能を失う
ことなく、決定可能な様にそのDNA配列を切断し得る
1つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ認識部位によ
って特徴づけられ、かつ、形質転換細胞の同定に使用す
るのに適当な表現型選択マーカーを含んでいるものをい
う。マーカーは、例えばテトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン耐性である。「ベクター」という用語がクロー
ニングベクターの代わりに用いられることがある。
【0033】発現コントロール配列 構造遺伝子と機能
的に結合された場合、この構造遺伝子の発現をコントロ
ールまたは調節するヌクレオチド配列。これにはファー
ジラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領
域、lac系、trp系、fd外皮タンパク質のコントロール領
域、および原核性または真核性細胞の遺伝子の発現をコ
ントロールすることが知られているその他の配列が含ま
れる。
的に結合された場合、この構造遺伝子の発現をコントロ
ールまたは調節するヌクレオチド配列。これにはファー
ジラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領
域、lac系、trp系、fd外皮タンパク質のコントロール領
域、および原核性または真核性細胞の遺伝子の発現をコ
ントロールすることが知られているその他の配列が含ま
れる。
【0034】発現ビヒクル クローニングビヒクルに似
たビヒクルであるが、通常ある種の調節配列のコントロ
ール下で、宿主内において、与えられた構造遺伝子を発
現することができるビヒクルをいう。
たビヒクルであるが、通常ある種の調節配列のコントロ
ール下で、宿主内において、与えられた構造遺伝子を発
現することができるビヒクルをいう。
【0035】宿主 複製可能な発現ビヒクルの受容体と
なる全ゆる生物を意味し、これには細菌および酵母が含
まれる。
なる全ゆる生物を意味し、これには細菌および酵母が含
まれる。
【0036】セクロピン 本明細書および請求の範囲を
通じて、当業界で認められている殺菌活性測定法で測定
した場合、インビボまたはインビトロで該活性が認めら
れる、全ゆる昆虫類由来のポリペプチドを含んでいる。
通じて、当業界で認められている殺菌活性測定法で測定
した場合、インビボまたはインビトロで該活性が認めら
れる、全ゆる昆虫類由来のポリペプチドを含んでいる。
【0037】本発明においてセクロピンという用語は、
適当な系で殺菌活性を示す、天然セクロピンの全ゆる類
似体、同族体、ミュータント、異性体または誘導体につ
いても用いられる。この用語は更に、天然のアミノ酸よ
り少ない数のフラグメント、例えば天然のセクロピンま
たはその類似体の部分的フラグメントをも意味する。更
にまた、この用語は、天然のセクロピンまたはその類似
体の配列と、1またはそれ以上のその周辺アミノ酸、好
ましくはカルボキシ末端のアミノ酸、を含んでいる、セ
クロピン様殺菌活性を有する産物をも意味する。また、
この用語は、天然のアミノ酸より少ない数のセクロピン
であるが、殺菌活性を示すものも含むものとする。
適当な系で殺菌活性を示す、天然セクロピンの全ゆる類
似体、同族体、ミュータント、異性体または誘導体につ
いても用いられる。この用語は更に、天然のアミノ酸よ
り少ない数のフラグメント、例えば天然のセクロピンま
たはその類似体の部分的フラグメントをも意味する。更
にまた、この用語は、天然のセクロピンまたはその類似
体の配列と、1またはそれ以上のその周辺アミノ酸、好
ましくはカルボキシ末端のアミノ酸、を含んでいる、セ
クロピン様殺菌活性を有する産物をも意味する。また、
この用語は、天然のアミノ酸より少ない数のセクロピン
であるが、殺菌活性を示すものも含むものとする。
【0038】ある種のセクロピンをこの定義の範囲内に
入れるホモロギー(相同性)の程度は、殺菌活性に関与し
ているセクロピンの領域に応じてかわる。この定義の範
囲内に入るためには、殺菌活性を示すのに必須である領
域は高いホモロギーを示すが、殺菌作用を示す構造を維
持したり、リセプター結合を行なうのに関与しない配列
は、比較的低いホモロギーを示すものであってもよい。
更に、機能的に類似している側鎖を置換しても、臨界領
域は殺菌活性を示し、本明細書で定義した意味でホモロ
ーガスである。「機能的に類似」という用語は、側鎖の優
勢な特性、例えば塩基性、中性または酸性、立体障害の
有無などをいう。一般に、セクロピンとして定義される
ペプチドは、本明細書の「技術的背景」の項に示したセク
ロピン類と実質的に相同(ホモローガス)である領域を含
んでいる。カルボキシ末端領域に比較してアミノ末端領
域でのホモロギーはさほど必要ではない。
入れるホモロギー(相同性)の程度は、殺菌活性に関与し
ているセクロピンの領域に応じてかわる。この定義の範
囲内に入るためには、殺菌活性を示すのに必須である領
域は高いホモロギーを示すが、殺菌作用を示す構造を維
持したり、リセプター結合を行なうのに関与しない配列
は、比較的低いホモロギーを示すものであってもよい。
更に、機能的に類似している側鎖を置換しても、臨界領
域は殺菌活性を示し、本明細書で定義した意味でホモロ
ーガスである。「機能的に類似」という用語は、側鎖の優
勢な特性、例えば塩基性、中性または酸性、立体障害の
有無などをいう。一般に、セクロピンとして定義される
ペプチドは、本明細書の「技術的背景」の項に示したセク
ロピン類と実質的に相同(ホモローガス)である領域を含
んでいる。カルボキシ末端領域に比較してアミノ末端領
域でのホモロギーはさほど必要ではない。
【0039】「殺菌作用(活性)」という用語は、先に定義
した活性を意味し、それは天然のセクロピン種の活性よ
り大きくても、あるいは小さくてもよい。具体的には、
天然種の約1%から、天然のセクロピンの活性より実質
的に高い(例えば10倍、100倍またはそれ以上)活性
の範囲の殺菌作用を持ったセクロピンペプチドが含まれ
る。
した活性を意味し、それは天然のセクロピン種の活性よ
り大きくても、あるいは小さくてもよい。具体的には、
天然種の約1%から、天然のセクロピンの活性より実質
的に高い(例えば10倍、100倍またはそれ以上)活性
の範囲の殺菌作用を持ったセクロピンペプチドが含まれ
る。
【0040】本発明を実施する最良の方法 1.araBプロモーター 本発明は、宿主にとってヘテロローガス(異種)遺伝子に
機能的に結合させたaraBプロモーターの配列を含んで
いる該宿主内で発現し得るポリヌクレオチド分子を提供
するものである。異種遺伝子は、生物活性をもちポリペ
プチドをコードしている。本発明はまた、araBプロモ
ーターと関連する構成を提供するものである。araBプ
ロモーターは、誘導プロモーターである。即ち、コード
されたポリペプチドを生成するための異種遺伝子の発現
は、L−アラビノースの添加により開始され、誘導され
る。L−アラビノースは、araC遺伝子の産物であるア
クチベーターと相互作用し、araBの発現を調節する。
これは、lac、trp、λPL およびtacのようなネガティブ
コントロール系とは逆にポジティブコントロール系であ
る。L−アラビノースの添加がなければ、異種ポリペプ
チドは発現または合成されない。ひとたび誘導されれ
ば、生物活性ポリペプチドである生産物は、迅速に、能
率的に製造される。これらポリペプチド生産物は、典型
的には、宿主細胞中で細胞封入体として形成される。細
胞封入体は、細胞密度の増加と共に急速に増大する。細
胞封入体は、宿主細胞中では、非常に安定に存在する。
この特徴により、再現性よく高収率で生産され、発酵の
監視が容易になる。進行中の発酵を終わらせるための正
確な決定は、細胞封入体の大きさと飽和した増殖に基づ
いて簡単に行なうことができる。
機能的に結合させたaraBプロモーターの配列を含んで
いる該宿主内で発現し得るポリヌクレオチド分子を提供
するものである。異種遺伝子は、生物活性をもちポリペ
プチドをコードしている。本発明はまた、araBプロモ
ーターと関連する構成を提供するものである。araBプ
ロモーターは、誘導プロモーターである。即ち、コード
されたポリペプチドを生成するための異種遺伝子の発現
は、L−アラビノースの添加により開始され、誘導され
る。L−アラビノースは、araC遺伝子の産物であるア
クチベーターと相互作用し、araBの発現を調節する。
これは、lac、trp、λPL およびtacのようなネガティブ
コントロール系とは逆にポジティブコントロール系であ
る。L−アラビノースの添加がなければ、異種ポリペプ
チドは発現または合成されない。ひとたび誘導されれ
ば、生物活性ポリペプチドである生産物は、迅速に、能
率的に製造される。これらポリペプチド生産物は、典型
的には、宿主細胞中で細胞封入体として形成される。細
胞封入体は、細胞密度の増加と共に急速に増大する。細
胞封入体は、宿主細胞中では、非常に安定に存在する。
この特徴により、再現性よく高収率で生産され、発酵の
監視が容易になる。進行中の発酵を終わらせるための正
確な決定は、細胞封入体の大きさと飽和した増殖に基づ
いて簡単に行なうことができる。
【0041】S.チフィムリウム中のaraBプロモータ
ーは、以下のヌクレオチド配列を有している:
ーは、以下のヌクレオチド配列を有している:
【化2】
【0042】araB遺伝子の一部分であるaraBプロ
モーターは、L−アラビノースオペロン中に位置してい
る。L−アラビノースオペロン(araBAD)は、E.コ
リとS.チフイムリウムで分離された。しかし、本発明
の実施においては、araBプロモーターの供給源を、こ
れら2つに限定するものではない。他の供給源は、L−
アラビノースオペロンをコードしている遺伝子を含んだ
どんな細菌にでも求められる。これらaraBプロモータ
ーの供給源には、シュードモナス、シトロバクター、キ
サントモナスおよび、エルウイニアの細菌群が含まれ
る。
モーターは、L−アラビノースオペロン中に位置してい
る。L−アラビノースオペロン(araBAD)は、E.コ
リとS.チフイムリウムで分離された。しかし、本発明
の実施においては、araBプロモーターの供給源を、こ
れら2つに限定するものではない。他の供給源は、L−
アラビノースオペロンをコードしている遺伝子を含んだ
どんな細菌にでも求められる。これらaraBプロモータ
ーの供給源には、シュードモナス、シトロバクター、キ
サントモナスおよび、エルウイニアの細菌群が含まれ
る。
【0043】更に、araBプロモーターは、天然起源よ
りもむしろ、例えば実験室での操作によって合成されて
もよい。換言すれば、この概念は、人工的に合成された
もの、あるいは、人工的に減成された産物をも意味して
いる。このように、天然のaraBプロモーターの完全な
配列が、ある生物種のゲノムDNA中に組込まれて存在
していても、その生物のゲノムDNAから分離されたar
aBプロモーターに相当する分離された配列は、先導ポ
リペプチドに相当する隣接配列、および開始並びに停止
信号が付いていようといまいと、天然に存在するもので
はなく、“合成"されたものと考える。その上、遺伝子
コードには同義性があるので、そのアミノ酸配列がわか
っていても、必ずしも、また、決定的には、それをコー
ドしている天然の遺伝子配列を決める訳にはいかない。
りもむしろ、例えば実験室での操作によって合成されて
もよい。換言すれば、この概念は、人工的に合成された
もの、あるいは、人工的に減成された産物をも意味して
いる。このように、天然のaraBプロモーターの完全な
配列が、ある生物種のゲノムDNA中に組込まれて存在
していても、その生物のゲノムDNAから分離されたar
aBプロモーターに相当する分離された配列は、先導ポ
リペプチドに相当する隣接配列、および開始並びに停止
信号が付いていようといまいと、天然に存在するもので
はなく、“合成"されたものと考える。その上、遺伝子
コードには同義性があるので、そのアミノ酸配列がわか
っていても、必ずしも、また、決定的には、それをコー
ドしている天然の遺伝子配列を決める訳にはいかない。
【0044】どんな合成配列を作成する場合でも、最善
の方法は4つかまたはそれ以上の過程からなり、それ
は、araBプロモーターの合成に適用できると共に、異
種ポリペプチドを含むペプチド配列の合成にも適用でき
る。まず、所望の配列に対し、その配列中の各アミノ酸
に対する可能なDNAコドンのリストをつくる。そし
て、これらコドンを、細菌または酵母で使用される頻度
に従って順番に並べる。コドンの予備的順序は、酵母に
ついては、ベネッシェン(Bennetzen)とハル(Hall)と
のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Journal of Biological Chemistry)、257:
3026−3031(1982)、細菌については、フィ
ールス(Fiers)、W.ネイチャー(Nature)、260、
500(1976)の文献に基づいて行なってよい。さら
に、これら文献の技術以上の精密な配列化を推薦する。
の方法は4つかまたはそれ以上の過程からなり、それ
は、araBプロモーターの合成に適用できると共に、異
種ポリペプチドを含むペプチド配列の合成にも適用でき
る。まず、所望の配列に対し、その配列中の各アミノ酸
に対する可能なDNAコドンのリストをつくる。そし
て、これらコドンを、細菌または酵母で使用される頻度
に従って順番に並べる。コドンの予備的順序は、酵母に
ついては、ベネッシェン(Bennetzen)とハル(Hall)と
のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Journal of Biological Chemistry)、257:
3026−3031(1982)、細菌については、フィ
ールス(Fiers)、W.ネイチャー(Nature)、260、
500(1976)の文献に基づいて行なってよい。さら
に、これら文献の技術以上の精密な配列化を推薦する。
【0045】どのコドンを選択するかに影響する第2の
要因は、クローニング過程において制限酵素の使用を容
易になる様な、遺伝子クローニング過程で使用する制限
酵素部位が存在するか存在しないかという点である。公
知であるエンドヌクレアーゼ部位の配列(ひとつの部位
が4〜6個のヌクレオチドで成り立っている)を“宿主
に好まれる"一次配列と比較することで、この要因を最
も適正化できる。制限酵素であるエンドヌクレアーゼ部
位のリストは、たとえば、ロバート(Roberts)、R.
J.のヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic
Acid Research)、11:1(1983)、r135−r1
37に開示されている。
要因は、クローニング過程において制限酵素の使用を容
易になる様な、遺伝子クローニング過程で使用する制限
酵素部位が存在するか存在しないかという点である。公
知であるエンドヌクレアーゼ部位の配列(ひとつの部位
が4〜6個のヌクレオチドで成り立っている)を“宿主
に好まれる"一次配列と比較することで、この要因を最
も適正化できる。制限酵素であるエンドヌクレアーゼ部
位のリストは、たとえば、ロバート(Roberts)、R.
J.のヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic
Acid Research)、11:1(1983)、r135−r1
37に開示されている。
【0046】特定のコドンの選択に影響を与える3番目
の要因は、合成されたDNAフラグメントの内部の二次
構造を最小限にする必要があることである。それは、折
り畳まれてしまい、近接したDNAフラグメントとのア
ニーリングが阻止されることを避けるためである。この
要因には、意図した遺伝子中の互いに隣接し合っている
セグメントを除き、セグメントが、互いに過度に相補的
となることを避ける様に配列設計を検索することであ
る。相補性を調べること(即ち、その回避)は、設計され
た遺伝子配列と提供される複製ビヒクル(プラスミドや
ファージ)の間でも実施することができる。
の要因は、合成されたDNAフラグメントの内部の二次
構造を最小限にする必要があることである。それは、折
り畳まれてしまい、近接したDNAフラグメントとのア
ニーリングが阻止されることを避けるためである。この
要因には、意図した遺伝子中の互いに隣接し合っている
セグメントを除き、セグメントが、互いに過度に相補的
となることを避ける様に配列設計を検索することであ
る。相補性を調べること(即ち、その回避)は、設計され
た遺伝子配列と提供される複製ビヒクル(プラスミドや
ファージ)の間でも実施することができる。
【0047】最適化させる4番目の要因は、転写が早く
終わるのを避けるために、特に、GC塩基対の豊富な配
列が前にある場合は、AT塩基対の豊富な配列(約5ま
たはそれ以上)を回避することである。
終わるのを避けるために、特に、GC塩基対の豊富な配
列が前にある場合は、AT塩基対の豊富な配列(約5ま
たはそれ以上)を回避することである。
【0048】コドンの選択に影響を与える5番目の要因
は、情報を安定させるためにRNase部位を避けることで
ある。
は、情報を安定させるためにRNase部位を避けることで
ある。
【0049】最後に、もし、2つの可能なコドンのいず
れを使用してもよい場合は、微生物ゲノム中で発現を最
大にするものを使用するのが適当である[たとえば、フ
ィールス(Fiers)らのNature260、500、(197
6); 米国特許第4,366,246号、6巻、を参照]。
れを使用してもよい場合は、微生物ゲノム中で発現を最
大にするものを使用するのが適当である[たとえば、フ
ィールス(Fiers)らのNature260、500、(197
6); 米国特許第4,366,246号、6巻、を参照]。
【0050】細菌や酵母での発現を最も効果的にするた
めに、必要な比較を行うようコンピュータにプログラム
することも最も好ましい。
めに、必要な比較を行うようコンピュータにプログラム
することも最も好ましい。
【0051】本発明の具体例をひとつ挙げれば、誘導ar
aBプロモーターを生物活性をもつポリペプチドをコー
ドしている遺伝子配列に機能的に連結させる。そして、
得られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入するか、ま
たは、その一部とする。次いで、発現ビヒクルを適当な
宿主を形質転換するために使用する。その宿主を、発育
を最適にするように選ばれた培養条件下で発酵する。ar
aBプロモーターは、異種遺伝子の発現を開始させる様
にプロモーターを誘導するL−アラビノースで処理され
るまでは不活性である。その働きの順序は、mRNAへ
の遺伝子の転写とそれに続くポリペプチド産物への翻訳
である。
aBプロモーターを生物活性をもつポリペプチドをコー
ドしている遺伝子配列に機能的に連結させる。そして、
得られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入するか、ま
たは、その一部とする。次いで、発現ビヒクルを適当な
宿主を形質転換するために使用する。その宿主を、発育
を最適にするように選ばれた培養条件下で発酵する。ar
aBプロモーターは、異種遺伝子の発現を開始させる様
にプロモーターを誘導するL−アラビノースで処理され
るまでは不活性である。その働きの順序は、mRNAへ
の遺伝子の転写とそれに続くポリペプチド産物への翻訳
である。
【0052】本発明におけるもう一つの具体例では、ar
aBプロモーターを生物活性をもつ異種ポリペプチドを
コードしている遺伝子配列に機能的に連結し、そして、
この遺伝子配列をもう一つのポリペプチドをコードして
いる2番目の遺伝子配列に連結させる。発現により、融
合体、即ち2番目のポリペプチドのアミノ酸配列と所望
の異種ポリペプチドのアミノ酸配列を含む前駆体タンパ
ク質であって所望のアミノ酸配列に隣接した選択的開裂
部位を含有しているタンパク質が得られる。
aBプロモーターを生物活性をもつ異種ポリペプチドを
コードしている遺伝子配列に機能的に連結し、そして、
この遺伝子配列をもう一つのポリペプチドをコードして
いる2番目の遺伝子配列に連結させる。発現により、融
合体、即ち2番目のポリペプチドのアミノ酸配列と所望
の異種ポリペプチドのアミノ酸配列を含む前駆体タンパ
ク質であって所望のアミノ酸配列に隣接した選択的開裂
部位を含有しているタンパク質が得られる。
【0053】開裂部位は、従来技術で知られている好ま
しいいずれの部位でもよいが、メチオニンが好ましい。
所望の異種遺伝子は、実際に選ばれた開裂部位に相当す
る開裂部位を、その内部に持っていないことが好まし
い。他の知られている開裂部位には、Asn−Gly、Asp
−Pro、Lys、Arg、およびLys−Argがある。
しいいずれの部位でもよいが、メチオニンが好ましい。
所望の異種遺伝子は、実際に選ばれた開裂部位に相当す
る開裂部位を、その内部に持っていないことが好まし
い。他の知られている開裂部位には、Asn−Gly、Asp
−Pro、Lys、Arg、およびLys−Argがある。
【0054】融合または前駆体タンパク質の選択的開裂
は、主として、発現ビヒクルの複製環境の外で行う。こ
の翻訳後の段階で、選択的処理により融合または前駆体
タンパク質が切断される。たとえば、メチオニンを開裂
部位とする場合、融合または前駆体タンパク質は、所望
の異種ポリペプチドを切断するために、臭化シアノジエ
ンで処理される。他の知られた開裂部位の場合、切断の
ための処置にはヒドロキシルアミン、酸、トリプシンお
よび、Lys−Arg開裂酵素などが使用される。
は、主として、発現ビヒクルの複製環境の外で行う。こ
の翻訳後の段階で、選択的処理により融合または前駆体
タンパク質が切断される。たとえば、メチオニンを開裂
部位とする場合、融合または前駆体タンパク質は、所望
の異種ポリペプチドを切断するために、臭化シアノジエ
ンで処理される。他の知られた開裂部位の場合、切断の
ための処置にはヒドロキシルアミン、酸、トリプシンお
よび、Lys−Arg開裂酵素などが使用される。
【0055】融合した、機能的に連結した遺伝子を調製
する方法、および、細菌中でそれを発現させる方法は公
知のもので、たとえば、米国特許第4,366,246号
(その引用は割愛する)に開示されている。
する方法、および、細菌中でそれを発現させる方法は公
知のもので、たとえば、米国特許第4,366,246号
(その引用は割愛する)に開示されている。
【0056】本明細書に記載された遺伝子構築物と方法
は、細菌宿主において異種ポリペプチドを発現させるの
に使用できる。
は、細菌宿主において異種ポリペプチドを発現させるの
に使用できる。
【0057】たとえば、E.coli K12 294株
(ATCC31446)およびMC1061株(ATCC
39450)は特に有用である。使用し得るその他の微
生物株としてE.coli X1776(ATCC3153
7)が挙げられるが、これに限られない。上記の株の
他、E.coli W3110(F-, ラムダ-, プロトトロ
フィック(ATCC27325))およびその他の腸内細
菌群、たとえばS.typhimuriumまたはSerrati marce
scens、および各種のシュードモナド種を用いることも
できる。
(ATCC31446)およびMC1061株(ATCC
39450)は特に有用である。使用し得るその他の微
生物株としてE.coli X1776(ATCC3153
7)が挙げられるが、これに限られない。上記の株の
他、E.coli W3110(F-, ラムダ-, プロトトロ
フィック(ATCC27325))およびその他の腸内細
菌群、たとえばS.typhimuriumまたはSerrati marce
scens、および各種のシュードモナド種を用いることも
できる。
【0058】一般に、宿主細胞と相容性(適合性)のある
種由来のレプリコンおよびコントロール配列を含んでい
るプラスミドベクターが、これらの宿主との関連で用い
られる。ベクターは通常、複製部位と共に、形質転換さ
れた細胞に表現型選択性を付与し得る特定の遺伝子を持
っている。たとえば、E.coliは通常、E.coli種由来
のプラスミド、pBR322[ボリバー(Bolivar)ら、ジ
ーン(Gene)、2:95(1977)]を使って形質転換さ
れる。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性の遺伝子を含んでおり、形質転換された細胞を
同定するための容易な手段となる。このpBR322プ
ラスミドまたはその他の微生物プラスミドは、微生物に
よって、それ自身のタンパク質を発現するのに使用し得
るプロモーターを含んでるか、あるいは含む様に改良さ
れなければならない。
種由来のレプリコンおよびコントロール配列を含んでい
るプラスミドベクターが、これらの宿主との関連で用い
られる。ベクターは通常、複製部位と共に、形質転換さ
れた細胞に表現型選択性を付与し得る特定の遺伝子を持
っている。たとえば、E.coliは通常、E.coli種由来
のプラスミド、pBR322[ボリバー(Bolivar)ら、ジ
ーン(Gene)、2:95(1977)]を使って形質転換さ
れる。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性の遺伝子を含んでおり、形質転換された細胞を
同定するための容易な手段となる。このpBR322プ
ラスミドまたはその他の微生物プラスミドは、微生物に
よって、それ自身のタンパク質を発現するのに使用し得
るプロモーターを含んでるか、あるいは含む様に改良さ
れなければならない。
【0059】araBプロモーターは、生物活性を有する
ヘテロローガス(異種)ポリペプチドまたはタンパク質を
コードしている遺伝子配列と機能的に結合することがで
きる。この様なポリペプチドまたはタンパク質の例には
酵素、ホルモン、ヘモグロビン、抗体、構造タンパク
質、α−、β−およびγ−インターフェロン、インター
ロイキン、インスリンおよび組織プラスミノーゲンアク
チベーターなどが含まれる。特定の例としてヒト腫瘍成
長因子、カルシトニンおよびセクロピンが挙げられる。
ヘテロローガス(異種)ポリペプチドまたはタンパク質を
コードしている遺伝子配列と機能的に結合することがで
きる。この様なポリペプチドまたはタンパク質の例には
酵素、ホルモン、ヘモグロビン、抗体、構造タンパク
質、α−、β−およびγ−インターフェロン、インター
ロイキン、インスリンおよび組織プラスミノーゲンアク
チベーターなどが含まれる。特定の例としてヒト腫瘍成
長因子、カルシトニンおよびセクロピンが挙げられる。
【0060】形質転換された宿主を、当技術分野で知ら
れている方法に従って発酵し、培養して最適の細胞増殖
を達成することができる。下記の本発明による好ましい
発酵法および生産方法を使ってヘテロローガスポリペプ
チドを大量に生産することができる。さらに、ヘテロロ
ーガス遺伝子と機能的に結合させたaraBプロモーター
を使うことにより、ヘテロローガス遺伝子の発現程度が
増大する。
れている方法に従って発酵し、培養して最適の細胞増殖
を達成することができる。下記の本発明による好ましい
発酵法および生産方法を使ってヘテロローガスポリペプ
チドを大量に生産することができる。さらに、ヘテロロ
ーガス遺伝子と機能的に結合させたaraBプロモーター
を使うことにより、ヘテロローガス遺伝子の発現程度が
増大する。
【0061】好ましい発酵法は以下の通りである。形質
転換された宿主、好ましくは細菌、より好ましくはE.
coliを、細菌の増殖に必要な栄養物質を含んでいる培養
培地に入れる。この様な物質には、炭素および窒素源、
鉱物、アミノ酸、プリン類、ピリミジン類およびビタミ
ン類などが含まれる。好ましい培養培地はまた、表現型
マーカー耐性に必要な量の代謝産物を含んでおり、この
様な代謝産物としては、たとえばテトラサイクリンまた
はアンピシリンが挙げられる。最大増殖率が得られる様
に選択した培養条件下で宿主を増殖させる。温度条件は
宿主によるが、通常最適範囲は約30℃〜約40℃であ
り、形質転換されたE.coliについては37℃が最も好
ましい。酵素も培地に供給する。後期指数的成長相まで
宿主を増殖させてから新しい培養培地に移す。
転換された宿主、好ましくは細菌、より好ましくはE.
coliを、細菌の増殖に必要な栄養物質を含んでいる培養
培地に入れる。この様な物質には、炭素および窒素源、
鉱物、アミノ酸、プリン類、ピリミジン類およびビタミ
ン類などが含まれる。好ましい培養培地はまた、表現型
マーカー耐性に必要な量の代謝産物を含んでおり、この
様な代謝産物としては、たとえばテトラサイクリンまた
はアンピシリンが挙げられる。最大増殖率が得られる様
に選択した培養条件下で宿主を増殖させる。温度条件は
宿主によるが、通常最適範囲は約30℃〜約40℃であ
り、形質転換されたE.coliについては37℃が最も好
ましい。酵素も培地に供給する。後期指数的成長相まで
宿主を増殖させてから新しい培養培地に移す。
【0062】次いで、宿主を生産(production)培養培地
に接種する。この工程中、細菌は、もはや***しないが
生存している飽和密度濃度に達するまで***と生長をつ
づける。飽和密度に達するのに十分な時間は培地、宿主
の遺伝子型、温度および空気導入度によってかわる。
に接種する。この工程中、細菌は、もはや***しないが
生存している飽和密度濃度に達するまで***と生長をつ
づける。飽和密度に達するのに十分な時間は培地、宿主
の遺伝子型、温度および空気導入度によってかわる。
【0063】当初、生産工程での発酵および培養条件
は、先に培養工程で述べた条件と同じである。ただし、
溶存酸素が増殖中に消費されるので、最小溶存酸素
(D.O.)を30%に維持するために、撹拌と空気導入
率を増大させる。好ましいpH域は約6〜8である。上
記の生産培地のpHは、E.coliの増殖に最適な6.5
−6.8に絶えず自己調節される。従って、E.coli宿
主の場合は、培地pHの酸および塩基調節は不要であ
る。しかし、他の宿主については、培地pHの調節は必
要となろう。最適細胞密度に達したら(E.coliについ
ては光学密度OD10 600)、ヘテロローガス遺伝子を誘導
してポリペプチドが生産される様に、L−アラビノース
を添加する。既述した様に、ポリペプチドは、宿主内に
おいて細胞封入体を形成する。このペプチドは、濾過ま
たは沈澱の様な既知の方法で回収する。得られた、発現
されたヘテロローガスペプチドが融合タンパク質である
場合は、その融合タンパク質を回収し、形質転換後工程
で処理し、所望のヘテロローガスポリペプチドを分離す
ることができる。次いで、このヘテロローガスポリペプ
チドを回収し、既知の方法で精製する。
は、先に培養工程で述べた条件と同じである。ただし、
溶存酸素が増殖中に消費されるので、最小溶存酸素
(D.O.)を30%に維持するために、撹拌と空気導入
率を増大させる。好ましいpH域は約6〜8である。上
記の生産培地のpHは、E.coliの増殖に最適な6.5
−6.8に絶えず自己調節される。従って、E.coli宿
主の場合は、培地pHの酸および塩基調節は不要であ
る。しかし、他の宿主については、培地pHの調節は必
要となろう。最適細胞密度に達したら(E.coliについ
ては光学密度OD10 600)、ヘテロローガス遺伝子を誘導
してポリペプチドが生産される様に、L−アラビノース
を添加する。既述した様に、ポリペプチドは、宿主内に
おいて細胞封入体を形成する。このペプチドは、濾過ま
たは沈澱の様な既知の方法で回収する。得られた、発現
されたヘテロローガスペプチドが融合タンパク質である
場合は、その融合タンパク質を回収し、形質転換後工程
で処理し、所望のヘテロローガスポリペプチドを分離す
ることができる。次いで、このヘテロローガスポリペプ
チドを回収し、既知の方法で精製する。
【0064】araBプロモーターは、便宜上、セクロピ
ンを含んでいる本発明の各種態様に関連して記載されて
いるが、araBプロモーターは、生物活性を有する全ゆ
るポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝
子配列に機能的に結合させてもよいと理解されなければ
ならない。
ンを含んでいる本発明の各種態様に関連して記載されて
いるが、araBプロモーターは、生物活性を有する全ゆ
るポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝
子配列に機能的に結合させてもよいと理解されなければ
ならない。
【0065】2.セクロピン感受性宿主を使用するセク
ロピンの微生物学的製造法 本発明の1つの目的は、セクロピン感受性宿主を使用し
てセクロピンを微生物学的に製造する方法を提供するこ
とにある。本発明の1つの思想は、セクロピンをコード
している遺伝子配列を発現させると共に、その生産物の
殺菌作用を回避する、または遅らせることにある。
ロピンの微生物学的製造法 本発明の1つの目的は、セクロピン感受性宿主を使用し
てセクロピンを微生物学的に製造する方法を提供するこ
とにある。本発明の1つの思想は、セクロピンをコード
している遺伝子配列を発現させると共に、その生産物の
殺菌作用を回避する、または遅らせることにある。
【0066】1つの態様においては、セクロピンをコー
ドしている遺伝子配列を誘導し得るプロモーターに連結
し、得られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入する。
次いで、この発現ビヒクルを使って適当な宿主を形質転
換し、この宿主を、プロモーターが活性化されない通常
の条件下で発酵させる。適当な時期が経過したら、たと
えば細胞が定常期になったら、たとえば塩濃度、光、代
謝産物の存在または非存在、金属などの外部環境因子を
変えることによりプロモーターを誘導する。この変化に
より、セクロピン遺伝子配列のmRNAへの転写、次い
でその翻訳が起こり殺菌性のセクロピンが得られる。得
られたセクロピンは殺菌性があり、細菌宿主を破壊する
が、この様な破壊は発酵サイクルの後期まで起こらな
い。調節されたプロモーターの例は、ラムダ−PLおよ
びPR、lac、gal、trp、ara、hutなどである。
ドしている遺伝子配列を誘導し得るプロモーターに連結
し、得られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入する。
次いで、この発現ビヒクルを使って適当な宿主を形質転
換し、この宿主を、プロモーターが活性化されない通常
の条件下で発酵させる。適当な時期が経過したら、たと
えば細胞が定常期になったら、たとえば塩濃度、光、代
謝産物の存在または非存在、金属などの外部環境因子を
変えることによりプロモーターを誘導する。この変化に
より、セクロピン遺伝子配列のmRNAへの転写、次い
でその翻訳が起こり殺菌性のセクロピンが得られる。得
られたセクロピンは殺菌性があり、細菌宿主を破壊する
が、この様な破壊は発酵サイクルの後期まで起こらな
い。調節されたプロモーターの例は、ラムダ−PLおよ
びPR、lac、gal、trp、ara、hutなどである。
【0067】第2の好ましい態様においては、セクロピ
ンをコードしている遺伝子配列を機能的に、該セクロピ
ン以外のポリペプチドに結合させ、セクロピンおよび付
加したポリペプチドの両アミノ酸配列から成り、かつ目
的のセクロピンアミノ酸配列に隣り合って選択的な切断
部位を含有する、融合あるいは前駆体タンパク質が発現
によって得られるようにするならば、得られた融合タン
パク質は殺菌性ではないということが見出された。次い
で、殺菌活性のセクロピンを翻訳後に選択切断して単離
することができる。
ンをコードしている遺伝子配列を機能的に、該セクロピ
ン以外のポリペプチドに結合させ、セクロピンおよび付
加したポリペプチドの両アミノ酸配列から成り、かつ目
的のセクロピンアミノ酸配列に隣り合って選択的な切断
部位を含有する、融合あるいは前駆体タンパク質が発現
によって得られるようにするならば、得られた融合タン
パク質は殺菌性ではないということが見出された。次い
で、殺菌活性のセクロピンを翻訳後に選択切断して単離
することができる。
【0068】最も一般的には、発現担体の複製環境外
で、たとえば微生物培養物を集めた後に切断を行う。従
って、この付加的なポリペプチドは、細胞外切断まだの
間、セクロピンからその殺菌効果を失なわしめ、十分長
期にわたって宿主を生存させて高レベルの目的生産物を
生じさせる。このセクロピンは、余分のポリペプチドを
切り落とす際に用いる選択的切断部位に対応する内部切
断部位を欠いていることが好ましいが、これは必ずしも
絶対条件ではない。セクロピンはメチオニンを含有して
いないので、セクロピン配列に隣り合ったメチオニンの
ところで臭化シアン切断するのが有効である。
で、たとえば微生物培養物を集めた後に切断を行う。従
って、この付加的なポリペプチドは、細胞外切断まだの
間、セクロピンからその殺菌効果を失なわしめ、十分長
期にわたって宿主を生存させて高レベルの目的生産物を
生じさせる。このセクロピンは、余分のポリペプチドを
切り落とす際に用いる選択的切断部位に対応する内部切
断部位を欠いていることが好ましいが、これは必ずしも
絶対条件ではない。セクロピンはメチオニンを含有して
いないので、セクロピン配列に隣り合ったメチオニンの
ところで臭化シアン切断するのが有効である。
【0069】この余分のポリペプチドをコードしている
遺伝子配列をセクロピンの構造遺伝子より先に転写させ
るのが好ましいが、セクロピンのC末端に隣り合った位
置で余分のポリペプチドを発現させることも可能である
ので、必ずしもこうである必要はない。
遺伝子配列をセクロピンの構造遺伝子より先に転写させ
るのが好ましいが、セクロピンのC末端に隣り合った位
置で余分のポリペプチドを発現させることも可能である
ので、必ずしもこうである必要はない。
【0070】この余分の隣接ポリペプチドの性質には限
定はなく、既知の構造、酵素、ホルモンまたはその他の
生理学的な関連タンパク質の一部、全部または繰り返し
単位のいずれであってもよい。また、非機能的なポリペ
プチドであってもよい。いずれの特定の理論に拘束され
ることもなく、融合タンパク質を長くすると全体のポリ
ペプチドの立体配置を変えることによってセクロピンの
殺菌性をどういうわけか“遮蔽する"ものと本発明者等
は考えている。余分な隣接ポリペプチドをコードしてい
る遺伝子配列は、好ましくはその長さが少なくとも約3
00塩基対以上であるべきであり、より好ましくは約4
00bp〜5kbであり、最も好ましくは400bp〜2kbで
ある。これは、好ましくは約100〜1700アミノ酸
残基の余分のポリペプチドに対応する。
定はなく、既知の構造、酵素、ホルモンまたはその他の
生理学的な関連タンパク質の一部、全部または繰り返し
単位のいずれであってもよい。また、非機能的なポリペ
プチドであってもよい。いずれの特定の理論に拘束され
ることもなく、融合タンパク質を長くすると全体のポリ
ペプチドの立体配置を変えることによってセクロピンの
殺菌性をどういうわけか“遮蔽する"ものと本発明者等
は考えている。余分な隣接ポリペプチドをコードしてい
る遺伝子配列は、好ましくはその長さが少なくとも約3
00塩基対以上であるべきであり、より好ましくは約4
00bp〜5kbであり、最も好ましくは400bp〜2kbで
ある。これは、好ましくは約100〜1700アミノ酸
残基の余分のポリペプチドに対応する。
【0071】多数の余分のポリペプチドを所望のセクロ
ピンペプチド配列に融合することができる。このポリペ
プチド遺伝子配列は、有機合成によって(この場合、最
適方法が推奨されるであろう)調製することができる
が、適当なmRNAの逆転写のような方法によって調製
されることもあるであろう。ポリペプチドの遺伝子配列
と構造セクロピンペプチドの遺伝子配列との酵素的結合
をcDNAの調製後に行う。酵素的結合は、制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位の2本鎖の1つからなる接着末端
を供給するか、あるいは平滑ライゲーションのどちらか
によって行うことができる。余分のポリペプチドの例は
ベーターガラクトシダーゼあるいはリブロキナーゼ(ara
B遺伝子によってコードされている)である。酵素およ
び構造タンパク質が好ましい。用いることが可能なその
他の産物は、以下に挙げる遺伝子によってコードされて
いる産物である: aceAあるいはaceB、araA、araB、
araC、araD、argG、aroB、lacA、serA、purA、t
rpA、trpB、trpC、trpD、trpE、tyrA等。この余
分のポリペプチドは普通グリコシル化されていない。ar
aBプロモーターが好ましいプロモーターであるが、ラ
ムダPLおよびPR、lac、gal、trp、hutおよびその他の
araプロモーターなどのその他のプロモーターを用いる
ことができる。
ピンペプチド配列に融合することができる。このポリペ
プチド遺伝子配列は、有機合成によって(この場合、最
適方法が推奨されるであろう)調製することができる
が、適当なmRNAの逆転写のような方法によって調製
されることもあるであろう。ポリペプチドの遺伝子配列
と構造セクロピンペプチドの遺伝子配列との酵素的結合
をcDNAの調製後に行う。酵素的結合は、制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位の2本鎖の1つからなる接着末端
を供給するか、あるいは平滑ライゲーションのどちらか
によって行うことができる。余分のポリペプチドの例は
ベーターガラクトシダーゼあるいはリブロキナーゼ(ara
B遺伝子によってコードされている)である。酵素およ
び構造タンパク質が好ましい。用いることが可能なその
他の産物は、以下に挙げる遺伝子によってコードされて
いる産物である: aceAあるいはaceB、araA、araB、
araC、araD、argG、aroB、lacA、serA、purA、t
rpA、trpB、trpC、trpD、trpE、tyrA等。この余
分のポリペプチドは普通グリコシル化されていない。ar
aBプロモーターが好ましいプロモーターであるが、ラ
ムダPLおよびPR、lac、gal、trp、hutおよびその他の
araプロモーターなどのその他のプロモーターを用いる
ことができる。
【0072】本発明のさらに別の態様においては、セク
ロピン遺伝子配列を、融合産物においてセクロピンの殺
菌活性を阻害あるいは不活性化することができる余分の
ポリペプチドの配列に機能的に結合させ、さらに誘導プ
ロモーターに結合させる。この方法では、融合タンパク
質法で得られる効果と誘導プロモーターの使用で得られ
る効果の両方を都合よく、かつ同時に利用することがで
きる。
ロピン遺伝子配列を、融合産物においてセクロピンの殺
菌活性を阻害あるいは不活性化することができる余分の
ポリペプチドの配列に機能的に結合させ、さらに誘導プ
ロモーターに結合させる。この方法では、融合タンパク
質法で得られる効果と誘導プロモーターの使用で得られ
る効果の両方を都合よく、かつ同時に利用することがで
きる。
【0073】本発明はセクロピン感受性の宿主(たとえ
ば、細菌宿主)においてセクロピンを産生させる方法に
関するものであるが、本発明で調製した遺伝子構築物お
よびその関連方法を、その他の非セクロピン感受性宿主
においてセクロピンを発現させるために用いることもで
きる。これらの非セクロピン感受性宿主には酵母および
哺乳動物細胞培養物が含まれる。有用な酵母、哺乳動物
宿主およびベクターは当業界ではよく知られており、言
及がなされている(たとえば、欧州特許公開00936
19、1983年11月9日発行)。細菌性宿主には、a
raBプロモーターを有する既述の宿主、並びにシュード
モナス(Pseudomonas)、シトロバクター(Citrobacte
r)、クサントモナス(Xanthomonas)およびエルビニア
(Erwinia)などの属の細菌宿主が含まれる。araBプロ
モーターを有する上記のような宿主と共存しうるすべて
のプラスミドベクターを用いることができる。
ば、細菌宿主)においてセクロピンを産生させる方法に
関するものであるが、本発明で調製した遺伝子構築物お
よびその関連方法を、その他の非セクロピン感受性宿主
においてセクロピンを発現させるために用いることもで
きる。これらの非セクロピン感受性宿主には酵母および
哺乳動物細胞培養物が含まれる。有用な酵母、哺乳動物
宿主およびベクターは当業界ではよく知られており、言
及がなされている(たとえば、欧州特許公開00936
19、1983年11月9日発行)。細菌性宿主には、a
raBプロモーターを有する既述の宿主、並びにシュード
モナス(Pseudomonas)、シトロバクター(Citrobacte
r)、クサントモナス(Xanthomonas)およびエルビニア
(Erwinia)などの属の細菌宿主が含まれる。araBプロ
モーターを有する上記のような宿主と共存しうるすべて
のプラスミドベクターを用いることができる。
【0074】別の好ましいセクロピン用プロモーターは
ラムダ(PL)である。セクロピン用遺伝子構築物および
余分のポリペプチドを、バクテリオファージラムダ
(PL)の左側のプロモーターの制御下に置くことができ
る。このプロモーターは制御されうる最も強力な既知プ
ロモーターの1つである。制御はラムダリプレッサーに
よって発揮され、隣接制限部位が知られている。CI遺
伝子の温度感受性対立遺伝子を、セクロピンの完全配列
を含有するベクターあるいは別のベクター上に配置する
ことができる。温度が42℃まで上昇したときに、この
リプレッサーは不活性化され、プロモーターはその最大
レベルで発現される。これらの条件下で産生したmRN
A量は、PLプロモーター由来の新しく合成したRNA
を約10%含有する細胞を生じるに十分であるはずであ
る。この方法において、機能的なセクロピン融合構築物
配列がリボソーム結合配列に隣接し、そしてラムダPL
プロモーターから種々の距離にあるクローンバンクを作
成することが可能である。次いで、これらのクローンを
スクリーニングし、最大の収量を与えるクローンを選別
することができる。
ラムダ(PL)である。セクロピン用遺伝子構築物および
余分のポリペプチドを、バクテリオファージラムダ
(PL)の左側のプロモーターの制御下に置くことができ
る。このプロモーターは制御されうる最も強力な既知プ
ロモーターの1つである。制御はラムダリプレッサーに
よって発揮され、隣接制限部位が知られている。CI遺
伝子の温度感受性対立遺伝子を、セクロピンの完全配列
を含有するベクターあるいは別のベクター上に配置する
ことができる。温度が42℃まで上昇したときに、この
リプレッサーは不活性化され、プロモーターはその最大
レベルで発現される。これらの条件下で産生したmRN
A量は、PLプロモーター由来の新しく合成したRNA
を約10%含有する細胞を生じるに十分であるはずであ
る。この方法において、機能的なセクロピン融合構築物
配列がリボソーム結合配列に隣接し、そしてラムダPL
プロモーターから種々の距離にあるクローンバンクを作
成することが可能である。次いで、これらのクローンを
スクリーニングし、最大の収量を与えるクローンを選別
することができる。
【0075】また、このセクロピン配列の発現を、形質
転換されていない状態では微生物にホモローガス“相
同"であってもよい他のレギュロンの制御下で行うこと
もできる。たとえば、E.コリの染色体DNAはラクト
ースあるいはlacオペロンを含有し、これは酵素ベータ
ーガラクトシダーゼを同化することによってラクトース
消化を仲介する。このlac制御要素を、E.コリに感染
するバクテリオファージラムダplac5から得ることがで
きる。このファージのlacオペロンを、同一の細菌種か
ら形質導入して得ることができる。本発明の方法に用い
るのに適したレギュロンを、微生物本来のプラスミドD
NAから得ることができる。このlacプロモーター−オ
ペレーター系をIPTGで誘起することができる。
転換されていない状態では微生物にホモローガス“相
同"であってもよい他のレギュロンの制御下で行うこと
もできる。たとえば、E.コリの染色体DNAはラクト
ースあるいはlacオペロンを含有し、これは酵素ベータ
ーガラクトシダーゼを同化することによってラクトース
消化を仲介する。このlac制御要素を、E.コリに感染
するバクテリオファージラムダplac5から得ることがで
きる。このファージのlacオペロンを、同一の細菌種か
ら形質導入して得ることができる。本発明の方法に用い
るのに適したレギュロンを、微生物本来のプラスミドD
NAから得ることができる。このlacプロモーター−オ
ペレーター系をIPTGで誘起することができる。
【0076】本発明において特に興味深いことは、セク
ロピンペプチドをコードしている合成ポリヌクレオチド
配列を提供することである。本発明の好ましい態様にお
いては、セクロピンペプチドの合成配列(隣接配列があ
ってもなくても)を、その発現体が種々の宿主(たとえ
ば、酵母および細菌、特に後者)と共存しうるように最
適なものにする。特に、E.コリにおいて供与配列すべ
ての発現を最適化することは極めて重要である。従っ
て、上記のような最適化操作を行った後には、隣接配列
を有するかあるいは有しないセクロピンペプチドの実際
の遺伝子配列は、通常、元の種における天然の配列とは
異なっている。
ロピンペプチドをコードしている合成ポリヌクレオチド
配列を提供することである。本発明の好ましい態様にお
いては、セクロピンペプチドの合成配列(隣接配列があ
ってもなくても)を、その発現体が種々の宿主(たとえ
ば、酵母および細菌、特に後者)と共存しうるように最
適なものにする。特に、E.コリにおいて供与配列すべ
ての発現を最適化することは極めて重要である。従っ
て、上記のような最適化操作を行った後には、隣接配列
を有するかあるいは有しないセクロピンペプチドの実際
の遺伝子配列は、通常、元の種における天然の配列とは
異なっている。
【0077】さらに、融合産物のための所望の遺伝子の
設計には、メチオニン(臭化シアンで切断可能)、トリプ
トファン(o−ヨードソ安息香酸で切断可能)、グルタミ
ン酸[スタフ(Staph.)プロテアーゼで切断可能]等の切
断部位のアミノ酸のためのコドンを導入するのが好まし
い。
設計には、メチオニン(臭化シアンで切断可能)、トリプ
トファン(o−ヨードソ安息香酸で切断可能)、グルタミ
ン酸[スタフ(Staph.)プロテアーゼで切断可能]等の切
断部位のアミノ酸のためのコドンを導入するのが好まし
い。
【0078】本発明のある態様においては、融合産物の
所望のDNA配列におけるコドンのすべてについて、特
定部位の突然変異誘発によって意図したところで突然変
異誘発を行うことができる。従って、所望のDNA配列
を合成した後に、切断しうる部位をこの配列に導入する
ことができる。特定部位の突然変異誘発は既知であり、
ワレイス等が言及している[(Wallace et al.)、サ
イエンス(Scienc)、209: 1396〜1400(19
80)、参考のために本明細書中に入れた]。
所望のDNA配列におけるコドンのすべてについて、特
定部位の突然変異誘発によって意図したところで突然変
異誘発を行うことができる。従って、所望のDNA配列
を合成した後に、切断しうる部位をこの配列に導入する
ことができる。特定部位の突然変異誘発は既知であり、
ワレイス等が言及している[(Wallace et al.)、サ
イエンス(Scienc)、209: 1396〜1400(19
80)、参考のために本明細書中に入れた]。
【0079】セクロピンペプチドにおいて潜在的なC−
末端残基に続いているアミノ酸残基あるいは残基群に
は、上記のように、先導ポリペプチド(それが存在する
場合)と同一または異なる構造および種々の長さのさら
に別のポリペプチド(“トレイリング(trailing)"ポリペ
プチド)が続いていてもよい。このような場合、C−末
端アミノ酸残基とトレイリングポリペプチド配列の間に
同一または異なる選択切断部位を与えるのが都合よい。
これらの切断部位は、先導ポリペプチドとセクロピンペ
プチドの構造遺伝子との間に存在するものと同一であっ
て、同一でなくてもよい。
末端残基に続いているアミノ酸残基あるいは残基群に
は、上記のように、先導ポリペプチド(それが存在する
場合)と同一または異なる構造および種々の長さのさら
に別のポリペプチド(“トレイリング(trailing)"ポリペ
プチド)が続いていてもよい。このような場合、C−末
端アミノ酸残基とトレイリングポリペプチド配列の間に
同一または異なる選択切断部位を与えるのが都合よい。
これらの切断部位は、先導ポリペプチドとセクロピンペ
プチドの構造遺伝子との間に存在するものと同一であっ
て、同一でなくてもよい。
【0080】換言すれば、余分のポリペプチドは先導ポ
リペプチド、トレイリングポリペプチドまたはその両者
として存在することができる。
リペプチド、トレイリングポリペプチドまたはその両者
として存在することができる。
【0081】所望のセクロピンペプチドの構造遺伝子を
そのまま発現用担体に挿入しようとする場合は、この遺
伝子の前には“開始"コドンが存在し、そしてトレイリ
ング配列が続いている場合には、1またはそれ以上の終
止あるいは停止コドンが存在する。発現産物がセクロピ
ンペプチドおよびポリペプチドの一部あるいは全体の両
者からなる融合タンパク質であるときには、この開始コ
ドンはポリペプチドのN−末端の前に置かれていてよい
(ポリペプチドが先導である場合)。
そのまま発現用担体に挿入しようとする場合は、この遺
伝子の前には“開始"コドンが存在し、そしてトレイリ
ング配列が続いている場合には、1またはそれ以上の終
止あるいは停止コドンが存在する。発現産物がセクロピ
ンペプチドおよびポリペプチドの一部あるいは全体の両
者からなる融合タンパク質であるときには、この開始コ
ドンはポリペプチドのN−末端の前に置かれていてよい
(ポリペプチドが先導である場合)。
【0082】ポリヌクレオチドの合成法は当業界でよく
知られている。参照文献としては、たとえばイタクラ等
[Itakura et al.、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサエティ(Journal of American C
hemical Society)、97:3727(1975)のトリ
エステル法がある。
知られている。参照文献としては、たとえばイタクラ等
[Itakura et al.、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサエティ(Journal of American C
hemical Society)、97:3727(1975)のトリ
エステル法がある。
【0083】本発明方法によって得たセクロピンを、特
定の応用分野に向けられた広範な抗微生物剤として用い
ることができる。このような応用分野には、たとえば加
工食品製品の防腐剤[対象微生物: (1)クロストリジウ
ム・ボツリナム(Clostridiumbotulinum)、(2)ラクト
バシリ(Lactobacilli)、(3)ミクロコッチ(Micrococc
i)]; 口腔内衛生製品の抗カリエス剤[対象微生物: スト
レプトコッカス・ミュータンス(Streptcoccus mutan
s)]; 膣酵母感染の治療に有用な薬物[対象微生物: カン
ジダ・アルビカンス(Candida albicans)]および防臭
剤中の抗微生物剤[対象微生物: (1)ミクロコッチ(Mic
rococci)、(2)ジフテロイズ(Diphtheroids)]としてセ
クロピンを使用することが含まれる。上記の応用分野に
ついてセクロピン様ペプチドの相対的な効果を、セクロ
ピンペプチドの1つに対するいずれかの微生物の感受性
を測定することによって、当業者は容易に概算すること
ができる。試験管内で用いられる同一の細菌スクリーニ
ングを用いて投与量および濃度を決めることができる。
定の応用分野に向けられた広範な抗微生物剤として用い
ることができる。このような応用分野には、たとえば加
工食品製品の防腐剤[対象微生物: (1)クロストリジウ
ム・ボツリナム(Clostridiumbotulinum)、(2)ラクト
バシリ(Lactobacilli)、(3)ミクロコッチ(Micrococc
i)]; 口腔内衛生製品の抗カリエス剤[対象微生物: スト
レプトコッカス・ミュータンス(Streptcoccus mutan
s)]; 膣酵母感染の治療に有用な薬物[対象微生物: カン
ジダ・アルビカンス(Candida albicans)]および防臭
剤中の抗微生物剤[対象微生物: (1)ミクロコッチ(Mic
rococci)、(2)ジフテロイズ(Diphtheroids)]としてセ
クロピンを使用することが含まれる。上記の応用分野に
ついてセクロピン様ペプチドの相対的な効果を、セクロ
ピンペプチドの1つに対するいずれかの微生物の感受性
を測定することによって、当業者は容易に概算すること
ができる。試験管内で用いられる同一の細菌スクリーニ
ングを用いて投与量および濃度を決めることができる。
【0084】ここまで、本発明を一般的に記載したが、
特定の実施例について言及することにより本発明はさら
によく理解されるであろう。この実施例は説明のために
だけ挙げたものであって、他に指定がない限り本発明を
限定しようとするものではない。
特定の実施例について言及することにより本発明はさら
によく理解されるであろう。この実施例は説明のために
だけ挙げたものであって、他に指定がない限り本発明を
限定しようとするものではない。
【0085】方法 アミノ酸組成 減圧下、110℃で24時間、5.5MのHCl[ピアー
ス(Pierce)]を用いてセクロピンポリペプチドの加水分
解を行った。試料を減圧下、40℃で乾燥し、ベックマ
ン・モデル6300試料緩衝液(Beckman Model、低p
Hクエン酸塩)200μl中に再懸濁した。
ス(Pierce)]を用いてセクロピンポリペプチドの加水分
解を行った。試料を減圧下、40℃で乾燥し、ベックマ
ン・モデル6300試料緩衝液(Beckman Model、低p
Hクエン酸塩)200μl中に再懸濁した。
【0086】ベックマン・モデル6300分析機を用い
てアミノ酸分析を行った。ポストカラム(Postcolumn)
ニンヒドリンを検知に用いた。ヒューレット・パッカー
ド(Hewlet Packard、HP)積分器モデル3390を
用いてデータを記録した。個々のピークを540および
440nmにおけるシグナルの合計として記録した。それ
ぞれのアミノ酸を含有するベックマン標準を用いて積分
器を補正し、マッコウクジラミオグロビン[アプライド
・バイオシステムズ(Applied Biosystems)]を用いて
検量が正確であることを確認した。
てアミノ酸分析を行った。ポストカラム(Postcolumn)
ニンヒドリンを検知に用いた。ヒューレット・パッカー
ド(Hewlet Packard、HP)積分器モデル3390を
用いてデータを記録した。個々のピークを540および
440nmにおけるシグナルの合計として記録した。それ
ぞれのアミノ酸を含有するベックマン標準を用いて積分
器を補正し、マッコウクジラミオグロビン[アプライド
・バイオシステムズ(Applied Biosystems)]を用いて
検量が正確であることを確認した。
【0087】タンパク質の配列決定 アプライド・バイオシステムズ・モデル470Aタンパ
ク質シークエネーター(アミノ酸配列分析装置)を、すべ
てのタンパク質配列決定に用いた。配列決定法の細目は
フンカピラー−フッド(Hunkapiller−Hood)のプログ
ラムに従った。この系には、メタノール性HClによる
切断を用いる非減圧プログラムを用いた。
ク質シークエネーター(アミノ酸配列分析装置)を、すべ
てのタンパク質配列決定に用いた。配列決定法の細目は
フンカピラー−フッド(Hunkapiller−Hood)のプログ
ラムに従った。この系には、メタノール性HClによる
切断を用いる非減圧プログラムを用いた。
【0088】PTHの測定 データ供与用のHPモデル3390A積分器を備えたH
Pモデル1090AHPLCを用いてPTHの測定を行
った。IBMシアノ−プロピルカラムをPTHアミノ酸
の分離に用いた。緩衝液は5%テトラヒドロフランを含
有する30mMのNaHAc(pH5.1)であった。流速は
1ml/分、温度は37℃であった。減圧下で乾燥した
後、試料を33%アセトニトリル水溶液30μlで30
分間溶解した。使用したPTH標準はピアース・ケミカ
ル社(Pierce Chemical Co.)から入手した。
Pモデル1090AHPLCを用いてPTHの測定を行
った。IBMシアノ−プロピルカラムをPTHアミノ酸
の分離に用いた。緩衝液は5%テトラヒドロフランを含
有する30mMのNaHAc(pH5.1)であった。流速は
1ml/分、温度は37℃であった。減圧下で乾燥した
後、試料を33%アセトニトリル水溶液30μlで30
分間溶解した。使用したPTH標準はピアース・ケミカ
ル社(Pierce Chemical Co.)から入手した。
【0089】実施例1 合成セクロピンA(CA)遺伝子の合成およびクローニン
グ A.CA遺伝子の合成 CAをコードする遺伝子を、高度に発現されたイー・コ
リ蛋白に通常みられるコドンを導入するようにコンピュ
ータでデザインした。該遺伝子の末端に4bp分の突出部
を入れ、それぞれSalIおよびEcoRI部位リゲート
(結合)できるようにした。各種サイズの融合蛋白を構築
できるように、SalI部位のつぎにBamHI部位を含め
た。さらに、コンピュータープログラムを用いて、前述
したような最適の方法を採択した。その遺伝子を23〜
37塩基長さの8個のオリゴヌクレオチドに分割した。
グ A.CA遺伝子の合成 CAをコードする遺伝子を、高度に発現されたイー・コ
リ蛋白に通常みられるコドンを導入するようにコンピュ
ータでデザインした。該遺伝子の末端に4bp分の突出部
を入れ、それぞれSalIおよびEcoRI部位リゲート
(結合)できるようにした。各種サイズの融合蛋白を構築
できるように、SalI部位のつぎにBamHI部位を含め
た。さらに、コンピュータープログラムを用いて、前述
したような最適の方法を採択した。その遺伝子を23〜
37塩基長さの8個のオリゴヌクレオチドに分割した。
【0090】その8個の1本線DNAフラグメントを、
イトウらの固相ホスホトリエステル法[Nucleic Acid
s Research 8巻、5491(1982)]によって合
成した。
イトウらの固相ホスホトリエステル法[Nucleic Acid
s Research 8巻、5491(1982)]によって合
成した。
【0091】下記のような種々の変更および改良を行っ
た。 (1)カップリング反応をゆるやかに振盪させながら37
℃で40分間行った。
た。 (1)カップリング反応をゆるやかに振盪させながら37
℃で40分間行った。
【0092】(2)最終カップリング反応後、DNAの脱
保護基を行うために、DNA樹脂(10mg)を0.5M2
−ピリジンアルドキシム−テトラメチルグアニジニウム
のピリジン−水(8:2v/v)溶液(2ml)と振盪させなが
ら37℃で60分間反応させた。溶液を合わせ、蒸発さ
せたのち、密封アンプル中でNH4OH(28%、3ml)
にて60℃で36時間処理した。アンモニアを蒸発させ
たのち、溶液をエーテルで3回抽出し、次いで蒸発させ
た。DNAを精製するために、その残渣を50mMトリ
エチルアンモニウム重炭酸塩pH7.5(TEAB)0.
1mlに溶かし、セファデックスG−50のカラム(1×
50cm)に通した。1mlずつのフラクションを採取し
た。主に260nmに鋭い吸収ピークを有する最初の数フ
ラクションに目的物質が含まれていた。これらのフラク
ションを蒸発させ、次いで高速液体クロマトグラフィ
(HPLC)にてさらに精製した。このHPLC精製は、
ボンダパック(Bondapak)C18(Waters社)カラムにて
10mM酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(pH7.8)
中アセトニトリル(10〜40%)のリニアグラジエント
を用いて55℃で行った。そのDMT基を80%酢酸
(0.1ml)にて室温で25分間処理して加水分解し、次
いで蒸発、さらに水0.1mlを加えて蒸発させて酢酸を
完全に除去した。
保護基を行うために、DNA樹脂(10mg)を0.5M2
−ピリジンアルドキシム−テトラメチルグアニジニウム
のピリジン−水(8:2v/v)溶液(2ml)と振盪させなが
ら37℃で60分間反応させた。溶液を合わせ、蒸発さ
せたのち、密封アンプル中でNH4OH(28%、3ml)
にて60℃で36時間処理した。アンモニアを蒸発させ
たのち、溶液をエーテルで3回抽出し、次いで蒸発させ
た。DNAを精製するために、その残渣を50mMトリ
エチルアンモニウム重炭酸塩pH7.5(TEAB)0.
1mlに溶かし、セファデックスG−50のカラム(1×
50cm)に通した。1mlずつのフラクションを採取し
た。主に260nmに鋭い吸収ピークを有する最初の数フ
ラクションに目的物質が含まれていた。これらのフラク
ションを蒸発させ、次いで高速液体クロマトグラフィ
(HPLC)にてさらに精製した。このHPLC精製は、
ボンダパック(Bondapak)C18(Waters社)カラムにて
10mM酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(pH7.8)
中アセトニトリル(10〜40%)のリニアグラジエント
を用いて55℃で行った。そのDMT基を80%酢酸
(0.1ml)にて室温で25分間処理して加水分解し、次
いで蒸発、さらに水0.1mlを加えて蒸発させて酢酸を
完全に除去した。
【0093】B.CA遺伝子のリゲイションによる組立
て 化学的に合成したフラグメント1〜8の5'OH末端
を、別々に、下記組成の溶液(10μl)中でリン酸化し
た。 70mMトリス−HCl(pH7.6) 10mM MgCl2 5mMジチオスレイトール 66μMガンマー32P−ATP(1μCi) DNA400ngおよび T4ポリヌクレオチドキナーゼ2単位
て 化学的に合成したフラグメント1〜8の5'OH末端
を、別々に、下記組成の溶液(10μl)中でリン酸化し
た。 70mMトリス−HCl(pH7.6) 10mM MgCl2 5mMジチオスレイトール 66μMガンマー32P−ATP(1μCi) DNA400ngおよび T4ポリヌクレオチドキナーゼ2単位
【0094】この反応は25℃で15分間行い、10m
M非標識ATP1mlを加えてさらに15分間反応を続け
た。純度をチェックするために、リン酸化DNA10%
を、7M尿素の存在下にポリアクリルアミドゲル(15
%)電気泳動にて標準的な方法で分析した。
M非標識ATP1mlを加えてさらに15分間反応を続け
た。純度をチェックするために、リン酸化DNA10%
を、7M尿素の存在下にポリアクリルアミドゲル(15
%)電気泳動にて標準的な方法で分析した。
【0095】リン酸化DNAフラグメント2、3、4、
5、6および7の400ngを95℃で5分間加熱してT
4ポリヌクレオチドキナーゼを不活化した。次いでこれ
に、非リン酸化フラグメント1および8の400ngを加
え、95℃でさらに5分間加熱し、次いで25℃までゆ
っくり(10分間当り1℃)と冷却した。この8個のDN
Aフラグメントを全量100μlにて66mMトリス−H
Cl(pH7.5)、6.6mM MgCl2、10mMジチオ
スレイトール、0.4mM ATPおよびT4DNAリ
ガーゼ2単位の存在下に25℃で2時間リゲートした。
5、6および7の400ngを95℃で5分間加熱してT
4ポリヌクレオチドキナーゼを不活化した。次いでこれ
に、非リン酸化フラグメント1および8の400ngを加
え、95℃でさらに5分間加熱し、次いで25℃までゆ
っくり(10分間当り1℃)と冷却した。この8個のDN
Aフラグメントを全量100μlにて66mMトリス−H
Cl(pH7.5)、6.6mM MgCl2、10mMジチオ
スレイトール、0.4mM ATPおよびT4DNAリ
ガーゼ2単位の存在下に25℃で2時間リゲートした。
【0096】C.プラスミドpING1、pCA1A、p
CA1BおよびpCA1'の構築 その構築工程を図2に示す。pMH6はホルビッツらの
文献[Horwitz, A.H.et al, Gene, 309−31
9(1981)]に記載されており、M13mp9は市販さ
れている。
CA1BおよびpCA1'の構築 その構築工程を図2に示す。pMH6はホルビッツらの
文献[Horwitz, A.H.et al, Gene, 309−31
9(1981)]に記載されており、M13mp9は市販さ
れている。
【0097】1.上記B工程で得られたCA遺伝子のフ
ラグメントを、予め制限酵素エンドヌクレアーゼSalI
およびEcoRIで処理したプラスミドpING1にリゲ
ートし、次いで制限酵素エンドヌクレアーゼSmaIで消
化してpING1を保持する形質転換体を減じた。
ラグメントを、予め制限酵素エンドヌクレアーゼSalI
およびEcoRIで処理したプラスミドpING1にリゲ
ートし、次いで制限酵素エンドヌクレアーゼSmaIで消
化してpING1を保持する形質転換体を減じた。
【0098】2.SmaI処理プラスミドをイ−・コリM
C1061に導入(形質転換)した。
C1061に導入(形質転換)した。
【0099】3.CA遺伝子フラグメントを保有するプ
ラスミドを含むコロニーを、合成DNAフラグメント7
(図1)をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼ
ーションにより同定した。CAフラグメントを含む3個
の別々のコロニーが1000コロニー中に見付かった。
単離したプラスミドを各々SalIおよびEcoRIで消化
し切り取ったフラグメントのサイズをチェックした。C
A挿入体の塩基配列分析を、サンジャーら[Sanger et
al, PNAS, 74, 5463−5467(197
7)]のジデオキシ鎖末端法の変法[Wallace et al,
Gene, 16, 21−26(1981)]によって行った。
2個の配列を決定し、図7(2)および図7(3)に示し
た。これらの配列を含むプラスミドをpCA1Aおよびp
CA1B(図2)と命名した。これらの配列はそれぞれ図
7(2)および図7(3)中に矢印で示す位置で天然のCA
配列とは異なっていた。
ラスミドを含むコロニーを、合成DNAフラグメント7
(図1)をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼ
ーションにより同定した。CAフラグメントを含む3個
の別々のコロニーが1000コロニー中に見付かった。
単離したプラスミドを各々SalIおよびEcoRIで消化
し切り取ったフラグメントのサイズをチェックした。C
A挿入体の塩基配列分析を、サンジャーら[Sanger et
al, PNAS, 74, 5463−5467(197
7)]のジデオキシ鎖末端法の変法[Wallace et al,
Gene, 16, 21−26(1981)]によって行った。
2個の配列を決定し、図7(2)および図7(3)に示し
た。これらの配列を含むプラスミドをpCA1Aおよびp
CA1B(図2)と命名した。これらの配列はそれぞれ図
7(2)および図7(3)中に矢印で示す位置で天然のCA
配列とは異なっていた。
【0100】天然体の配列を生ぜしめるために種々の方
法、例えばpCA1AおよびpCA1Bをin vivoまたはi
n vitroで組換える方法、または追加の独立したクロー
ンをスクリーニングする方法などを用いることができ
る。所望の天然型配列を含むプラスミドをpCA1'(図
2)と命名した。
法、例えばpCA1AおよびpCA1Bをin vivoまたはi
n vitroで組換える方法、または追加の独立したクロー
ンをスクリーニングする方法などを用いることができ
る。所望の天然型配列を含むプラスミドをpCA1'(図
2)と命名した。
【0101】以下の記載において、プライム符号(')を
付したプラスミドは天然型CA配列のものを意味し、プ
ライム符号のないプラスミドはミュータントpCA1A
またはpCA1Bから誘導されたものを意味する。
付したプラスミドは天然型CA配列のものを意味し、プ
ライム符号のないプラスミドはミュータントpCA1A
またはpCA1Bから誘導されたものを意味する。
【0102】D.プラスミドpCA2'、pCA2A、pC
A3'、pCA3AおよびpCA3Bの構築 これを図3に示す。pCA1(またはpCA1AまたはpC
A1B)をBamHIで消化し、ポリメラーゼおよびdTN
Pで処理したのち、SstI消化に付して、フラグメント
1を得る。このものは一方の端が平滑末端で他の末端に
SstI突出部を担持している。このフラグメントを、p
MH6をNarI消化、平滑末端形成およびSstI処理に
付して得られるフラグメントT4リゲーションにて結合
させ、pCA3'(またはpCA3AまたはpCA3B)を得
る。このフラグメント1をまた、pMH6をHgiAI消
化、平滑末端形成およびSstI処理に付して得られるフ
ラグメントとT4リゲーションにて結合させ、pCA2'
(またはpCA2A)を得る。
A3'、pCA3AおよびpCA3Bの構築 これを図3に示す。pCA1(またはpCA1AまたはpC
A1B)をBamHIで消化し、ポリメラーゼおよびdTN
Pで処理したのち、SstI消化に付して、フラグメント
1を得る。このものは一方の端が平滑末端で他の末端に
SstI突出部を担持している。このフラグメントを、p
MH6をNarI消化、平滑末端形成およびSstI処理に
付して得られるフラグメントT4リゲーションにて結合
させ、pCA3'(またはpCA3AまたはpCA3B)を得
る。このフラグメント1をまた、pMH6をHgiAI消
化、平滑末端形成およびSstI処理に付して得られるフ
ラグメントとT4リゲーションにて結合させ、pCA2'
(またはpCA2A)を得る。
【0103】上記結合生成物を用いてイー・コリMC1
061を形質転換させて所望の生成物を得る。前記ミニ
分解法によりプラスミドを単離する。単離プラスミドを
それぞれBamHIおよびPstIで消化する。BamHIフ
ラグメントの正しいサイズおよび方向を有する各グルー
プのプラスミドをpCA2(またはpCA2A)およびpC
A3'(またはpCA3AまたはpCA3B)と命名する。
061を形質転換させて所望の生成物を得る。前記ミニ
分解法によりプラスミドを単離する。単離プラスミドを
それぞれBamHIおよびPstIで消化する。BamHIフ
ラグメントの正しいサイズおよび方向を有する各グルー
プのプラスミドをpCA2(またはpCA2A)およびpC
A3'(またはpCA3AまたはpCA3B)と命名する。
【0104】E.araB−CA融合蛋白の発現 プラスミドpCA1A、pCA2A、pCA3A、pCA3
BおよびpCA3D(注: pCA3Dは、以下、野生型C
A含有プラスミドpCA3'を示すためにも用いる)中にa
raB−CA融合遺伝子を含有するイー・コリ細胞を、
1.5%トリプトン、1.0%酵母エキスおよび0.5
%NaCl(TYE)並びにアンピシリン50μg/mlを含
む培地中37℃で生育させた。細胞密度OD600=0.
2にて培養物をL−アラビノース最終濃度0.5%にて
処理し、araB−CA融合蛋白の発現をもたらし、細胞
密度がOD600=1.5〜1.7に達したときに、ベッ
クマンJS−4.2ローター中4℃、4000rpmにて
20分間遠心分離により収集した。該細胞を原培養液量
の半分倍量の50mMリン酸緩衝液(pH6.6)に再懸濁
させて洗浄した。プラスミドpCA1A、pCA2Aおよ
びpCA3Aを含有する洗浄した細胞ペレットを1/1
0量のリン酸緩衝液および1%ドデシル硫酸ナトリウム
(SDS)で抽出し、10%ポリアクリルアミドSDS変
性ゲルにて分析した。この分析により、プラスミドpC
A3A含有イー・コリ培養液はpCA1AまたはpCA2
Aで形質転換した培養液のいずれよりも多量のaraB−
CA蛋白の生成が認められた。
BおよびpCA3D(注: pCA3Dは、以下、野生型C
A含有プラスミドpCA3'を示すためにも用いる)中にa
raB−CA融合遺伝子を含有するイー・コリ細胞を、
1.5%トリプトン、1.0%酵母エキスおよび0.5
%NaCl(TYE)並びにアンピシリン50μg/mlを含
む培地中37℃で生育させた。細胞密度OD600=0.
2にて培養物をL−アラビノース最終濃度0.5%にて
処理し、araB−CA融合蛋白の発現をもたらし、細胞
密度がOD600=1.5〜1.7に達したときに、ベッ
クマンJS−4.2ローター中4℃、4000rpmにて
20分間遠心分離により収集した。該細胞を原培養液量
の半分倍量の50mMリン酸緩衝液(pH6.6)に再懸濁
させて洗浄した。プラスミドpCA1A、pCA2Aおよ
びpCA3Aを含有する洗浄した細胞ペレットを1/1
0量のリン酸緩衝液および1%ドデシル硫酸ナトリウム
(SDS)で抽出し、10%ポリアクリルアミドSDS変
性ゲルにて分析した。この分析により、プラスミドpC
A3A含有イー・コリ培養液はpCA1AまたはpCA2
Aで形質転換した培養液のいずれよりも多量のaraB−
CA蛋白の生成が認められた。
【0105】F.プラスミドpCA3A、pCA3Bおよ
びpCA3Dを含有する誘導イー・コリ細胞の分画 工程Eで得られた洗浄ペレットを原量の1/10量のリ
ン酸緩衝液に再懸濁し、0℃に冷却し、フレンチ圧力セ
ル中で細胞を破砕した。ローター中で4℃、4000rp
mで20分間遠心分離して細胞中の成分を分離した。得
られた上清液および4000rpm分離ペレットを10%
ポリアクリルアミドSDS変性ゲルにて分析したとこ
ろ、pCA3A、3Bおよび3DのaraB−CA融合蛋白
のすべて4Kペレット中に見出された。
びpCA3Dを含有する誘導イー・コリ細胞の分画 工程Eで得られた洗浄ペレットを原量の1/10量のリ
ン酸緩衝液に再懸濁し、0℃に冷却し、フレンチ圧力セ
ル中で細胞を破砕した。ローター中で4℃、4000rp
mで20分間遠心分離して細胞中の成分を分離した。得
られた上清液および4000rpm分離ペレットを10%
ポリアクリルアミドSDS変性ゲルにて分析したとこ
ろ、pCA3A、3Bおよび3DのaraB−CA融合蛋白
のすべて4Kペレット中に見出された。
【0106】G. 合成CAの精製 (a)臭化シアンによる開裂 1.上記最終工程で得られたaraB−CA融合蛋白を含
有する該4Kペレットフラクションを90%ギ酸と混合
し、蛋白含量0.7〜1.1mg/mlの70%ギ酸溶液を
得た。10倍量(重量)の臭化シアン(アセトニトリル中
1gm/ml含有液)を加えた。その反応液を窒素でフラッ
シュし、室温で一夜培養した。
有する該4Kペレットフラクションを90%ギ酸と混合
し、蛋白含量0.7〜1.1mg/mlの70%ギ酸溶液を
得た。10倍量(重量)の臭化シアン(アセトニトリル中
1gm/ml含有液)を加えた。その反応液を窒素でフラッ
シュし、室温で一夜培養した。
【0107】2.ギ酸および臭化シアンを窒素気流下に
除去した。残渣を70%ギ酸に溶かし、さらに2回、窒
素気流下で乾燥した。
除去した。残渣を70%ギ酸に溶かし、さらに2回、窒
素気流下で乾燥した。
【0108】3.0.1%トリフルオロ酢酸水溶液を加
え、開裂したCAを、タンパク質1mg/mlの濃度で完全
に溶解した。
え、開裂したCAを、タンパク質1mg/mlの濃度で完全
に溶解した。
【0109】(b)臭化シアンフラグメントの高速液体ク
ロマトグラフィー 臭化シアン開裂融合タンパク質をHPLCでクロマトグ
ラフし、分子のCA部分由来のフラグメントを回収し
た。C−18逆相カラム[ウォーターズ(Waters)]を用
いた。水中0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)(バッフ
ァーA)およびアセトニトリル中0.1%TFA(バッフ
ァーB)により、グラデイエントを行った。開始溶出液
は20%バッファーBを含有していた; 試料注入から2
分後に、60分間に及ぶ20%Bから60%Bへのグラ
デイエントを開始した。流速は1ml/分であった。溶離
像(プロフィール)を280nmにおいて監視した。溶離し
た臭化シアン開裂融合タンパク質のクロマトグラムにお
ける種々のピークを集めて後述(実施例4)の細菌活性試
験に付した。
ロマトグラフィー 臭化シアン開裂融合タンパク質をHPLCでクロマトグ
ラフし、分子のCA部分由来のフラグメントを回収し
た。C−18逆相カラム[ウォーターズ(Waters)]を用
いた。水中0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)(バッフ
ァーA)およびアセトニトリル中0.1%TFA(バッフ
ァーB)により、グラデイエントを行った。開始溶出液
は20%バッファーBを含有していた; 試料注入から2
分後に、60分間に及ぶ20%Bから60%Bへのグラ
デイエントを開始した。流速は1ml/分であった。溶離
像(プロフィール)を280nmにおいて監視した。溶離し
た臭化シアン開裂融合タンパク質のクロマトグラムにお
ける種々のピークを集めて後述(実施例4)の細菌活性試
験に付した。
【0110】H.突然変異セクロピンポリペプチドをコ
ードするpCA3A
ードするpCA3A
【表1】 表1 イー・コリ内でpCA3Aによって産生されたセクロピン−Aのアミノ酸組成 突然変異体A アミノ酸 実験値 理論値* ASP 2.9 3 Thr 0.1 0 Glu 2.7 2 Pro 2.4 2 Gly 6.3 4 Ala 3.0 3 Val 3.6 4 Ile 2.9 4 Leu 1.2 1 Phe 1.1 1 Lys 6.2 6 Arg 2.1 2 Trp ND 1 Ser 1.3 1 Cys 0 0 Met 0 0 Tyr 0.1 0 His 0.4 0 N.D.=測定せず。 *理論値: 各突然変異体クローンのDNA配列決定によ
り得た値。 核酸配列およびアミノ酸配列は図7に示されている。
り得た値。 核酸配列およびアミノ酸配列は図7に示されている。
【0111】実施例2 他の突然変異体セクロピンポリペプチドの例示 実施例1、F−Gに記載の如く、プラスミドpCA3B
の細胞を分画し、CA配列を検出し、合成CAを精製、
分析した。表2に示したアミノ酸組成および配列データ
ーは、第2のクローンも突然変異体セクロピンをコード
しているCA遺伝子配列を含有していることを示してい
る。
の細胞を分画し、CA配列を検出し、合成CAを精製、
分析した。表2に示したアミノ酸組成および配列データ
ーは、第2のクローンも突然変異体セクロピンをコード
しているCA遺伝子配列を含有していることを示してい
る。
【表2】
【0112】 表2 イー・コリ内でpCA3Bによって産生されたセクロピン−Aのアミノ酸組成 突然変異体B アミノ酸 実験値 理論値* ASP 2.3 2 Thr 1.0 1 Glu 4.2 4 Pro 1.0 1 Gly 4.1 3 Ala 5.0 5 Val 3.6 4 Ile 3.9 5 Leu 1.1 1 Phe 0.9 1 Lys 6.6 7 Arg 1.0 1 Trp ND 1 Ser 1.1 1 Cys 0 0 Met 0 0 Tyr 0 0 His 0.1 0 N.D.=測定せず。 *理論値: 各突然変異体クローンのDNA配列決定によ
り得られた値。 核酸配列およびアミノ酸配列は図7に示されている。
り得られた値。 核酸配列およびアミノ酸配列は図7に示されている。
【0113】実施例3 野生型セクロピンAをコードしているプラスミドpCA
3Dの組立て 組立て図は図4および図5に示されている。
3Dの組立て 組立て図は図4および図5に示されている。
【0114】A.p19Cの組立て 1.プラスミドpING1をエンドヌクレアーゼFok
1、次いでBamHIで完全消化した: 生じた消化をフ
ェノール/クロロホルム(比1:1)抽出によって停止さ
せ、水性残渣をエーテルで洗浄した後、バイオ−ゲル
(Bio−GelR)p−10カラムに通してフェノール/ク
ロロホルムを除去した。Fok1消化の結果、“CTA
C"5'突出部(オーバーハング)が生じた。この76塩基
対のBamHI、Fok1フラグメントはaraBプロモータ
ーを含有している。
1、次いでBamHIで完全消化した: 生じた消化をフ
ェノール/クロロホルム(比1:1)抽出によって停止さ
せ、水性残渣をエーテルで洗浄した後、バイオ−ゲル
(Bio−GelR)p−10カラムに通してフェノール/ク
ロロホルムを除去した。Fok1消化の結果、“CTA
C"5'突出部(オーバーハング)が生じた。この76塩基
対のBamHI、Fok1フラグメントはaraBプロモータ
ーを含有している。
【0115】2.N末端に“GATG"5'突出部、C末
端にATTTの突出したEcoRI部位を生成させるため
に、2個のDNAフラグメントNo.1およびNo.5を
No.nn−1およびnn−5(配列は図6に記載)で置き換
える外は実施例1、ステップBに記載の方法と同様の方
法を用いて新規なCA遺伝子フラグメント(図6参照)を
組立てた。
端にATTTの突出したEcoRI部位を生成させるため
に、2個のDNAフラグメントNo.1およびNo.5を
No.nn−1およびnn−5(配列は図6に記載)で置き換
える外は実施例1、ステップBに記載の方法と同様の方
法を用いて新規なCA遺伝子フラグメント(図6参照)を
組立てた。
【0116】3.pBR322をエンドヌクレアーゼBa
mHIおよびEcoRIで完全に消化した。生じた消化を
前記の如くにして停止させた。
mHIおよびEcoRIで完全に消化した。生じた消化を
前記の如くにして停止させた。
【0117】4.上記ステップ1で得たBamHI−Fok
1フラグメントと、上記ステップ2で得た新規なCA遺
伝子を、pBR322の大きい方のBamHI−EcoRI
フラグメントにリゲートさせた。
1フラグメントと、上記ステップ2で得た新規なCA遺
伝子を、pBR322の大きい方のBamHI−EcoRI
フラグメントにリゲートさせた。
【0118】5.リゲート産物をエンドヌクレアーゼH
indIIIで消化し、pBR322を担っている形質転換
体の数を減じた。
indIIIで消化し、pBR322を担っている形質転換
体の数を減じた。
【0119】6.このHindIII処理プラスミドでイ
ー・コリMC1061を形質転換した。
ー・コリMC1061を形質転換した。
【0120】7.CA遺伝子フラグメントを担っている
プラスミドを含有するコロニーを、合成DNAフラグメ
ント7(図6)をプローブとして用いるコロニーハイブリ
ダイゼーションにより同定した。1000個のコロニー
中に、CAフラグメントを含有している3個の独立した
コロニーが見出された。単離した各プラスミドをBamH
IおよびEcoRI消化に付し、正しいフラグメントを放
出し得るプラスミドをp19Cと命名した。サンガーら
(Sanger et al.)のジデオキシ鎖末端決定法[PNA
S、74: 5463−6467(1977)]を幾分改良
した方法[ワラスら(Wallace et al.)、ジーン(Gen
e)16: 21−26(1981)]により、CA挿入体の
ヌクレオチド配列を分析したp19CはCA遺伝子の正
確な配列を含有していた。CA遺伝子は、araBプロモ
ーターの下流側に直結しており、両者の間にはaraB暗
号配列が存在していなかった。
プラスミドを含有するコロニーを、合成DNAフラグメ
ント7(図6)をプローブとして用いるコロニーハイブリ
ダイゼーションにより同定した。1000個のコロニー
中に、CAフラグメントを含有している3個の独立した
コロニーが見出された。単離した各プラスミドをBamH
IおよびEcoRI消化に付し、正しいフラグメントを放
出し得るプラスミドをp19Cと命名した。サンガーら
(Sanger et al.)のジデオキシ鎖末端決定法[PNA
S、74: 5463−6467(1977)]を幾分改良
した方法[ワラスら(Wallace et al.)、ジーン(Gen
e)16: 21−26(1981)]により、CA挿入体の
ヌクレオチド配列を分析したp19CはCA遺伝子の正
確な配列を含有していた。CA遺伝子は、araBプロモ
ーターの下流側に直結しており、両者の間にはaraB暗
号配列が存在していなかった。
【0121】B.pCAOの組立て 1.過剰量の制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびB
amHIにより消化することによってp19CのBamHI
−EcoRIフラグメントを切り取った。また、このプラ
スミドをPvuI消化に付し、次のリゲーション工程にお
いて、切り取ったフラグメントがプラスミドとリリゲー
ト(再結合)する機会を減少させた。
amHIにより消化することによってp19CのBamHI
−EcoRIフラグメントを切り取った。また、このプラ
スミドをPvuI消化に付し、次のリゲーション工程にお
いて、切り取ったフラグメントがプラスミドとリリゲー
ト(再結合)する機会を減少させた。
【0122】2.ステップA.7で得たBamHI−Eco
RIフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼBamHI
およびEcoRIで予め処理しておいたプラスミドpIN
Gにリゲートさせた後、pING1を担っている形質転
換体の数を減少させるために制限エンドヌクレアーゼS
maIで消化した。
RIフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼBamHI
およびEcoRIで予め処理しておいたプラスミドpIN
Gにリゲートさせた後、pING1を担っている形質転
換体の数を減少させるために制限エンドヌクレアーゼS
maIで消化した。
【0123】3.SmaI−処理プラスミドをイー・コリ
MC1061に導入(トランスホーム)した。
MC1061に導入(トランスホーム)した。
【0124】4.CA遺伝子フラグメントを担っている
プラスミドを含有するコロニーをプラスミドの特性化に
よって同定した。単離した各プラスミドをBamHIおよ
びEcoRIで消化し、切り取ったフラグメントのサイズ
を調べた。正しいサイズを有するプラスミドをpCAO
と命名した。ジデオキシ鎖末端決定法によりCA挿入体
のヌクレオチド配列決定を行った。pCAOはCA遺伝
子の正しい配列を含有していた。このpCAOは完全なa
raB制御遺伝子を含有しており、CA遺伝子は、セクロ
ピンAをaraB−CA融合タンパク質を生成させずに直
接発現する様、araBプロモーターの後方に直結して存
在していた。
プラスミドを含有するコロニーをプラスミドの特性化に
よって同定した。単離した各プラスミドをBamHIおよ
びEcoRIで消化し、切り取ったフラグメントのサイズ
を調べた。正しいサイズを有するプラスミドをpCAO
と命名した。ジデオキシ鎖末端決定法によりCA挿入体
のヌクレオチド配列決定を行った。pCAOはCA遺伝
子の正しい配列を含有していた。このpCAOは完全なa
raB制御遺伝子を含有しており、CA遺伝子は、セクロ
ピンAをaraB−CA融合タンパク質を生成させずに直
接発現する様、araBプロモーターの後方に直結して存
在していた。
【0125】C.プラスミドpCA3A−−1の組立て この組立ての目的は、1個のXmn1部位を除くために、
pCA3AからAvaI−PvuII領域を欠失させること
にある。この欠失により、イー・コリ細胞内でのプラス
ミドのコピー数を増加させることもできる。
pCA3AからAvaI−PvuII領域を欠失させること
にある。この欠失により、イー・コリ細胞内でのプラス
ミドのコピー数を増加させることもできる。
【0126】1.pCA3AをエンドヌクレアーゼAva
IおよびPvuIIで消化した後、dNTPの存在下、D
NAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで充填し、
平滑末端を形成させた。
IおよびPvuIIで消化した後、dNTPの存在下、D
NAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで充填し、
平滑末端を形成させた。
【0127】2.ステップ1で得たプラスミドを再リゲ
ートし、元のpCA3Aを含む形質転換体の数を減少さ
せるためにAvaIとPvuIIで消化した。
ートし、元のpCA3Aを含む形質転換体の数を減少さ
せるためにAvaIとPvuIIで消化した。
【0128】3.このAvaI、PvuII処理プラスミド
をイー・コリMC1061に導入した。
をイー・コリMC1061に導入した。
【0129】4.AvaI−PvuII領域を欠失したプラ
スミドを含有しているコロニーを、合成DNAフラグメ
ント5'−TCATCAGCGTGGTCG−3'をプロ
ーブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションによ
って同定した。50コロニー中に、AvaI−PvuII欠
失を伴った46個の独立のコロニーが見出された。単離
した各プラスミドXmaIで消化し、切除フラグメントの
サイズを調べた。正しいサイズを有するプラスミドの1
つをpCA3A−−1と命名した。
スミドを含有しているコロニーを、合成DNAフラグメ
ント5'−TCATCAGCGTGGTCG−3'をプロ
ーブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションによ
って同定した。50コロニー中に、AvaI−PvuII欠
失を伴った46個の独立のコロニーが見出された。単離
した各プラスミドXmaIで消化し、切除フラグメントの
サイズを調べた。正しいサイズを有するプラスミドの1
つをpCA3A−−1と命名した。
【0130】D.プラスミドpCA3Dの最終的な組立
て p19Cは野生型セクロピンA配列を含有しているが、a
raBとの融合タンパク質を生成するために、そのN末端
における通常の制限部位を欠除されている。
て p19Cは野生型セクロピンA配列を含有しているが、a
raBとの融合タンパク質を生成するために、そのN末端
における通常の制限部位を欠除されている。
【0131】pCA3Aは突然変異体araB−CA融合タ
ンパク質を生成させるためにCA遺伝子のC末端付近に
存在している2個の塩基対が欠失されている。
ンパク質を生成させるためにCA遺伝子のC末端付近に
存在している2個の塩基対が欠失されている。
【0132】これらの2個のプラスミドを結合させ、ar
aBと融合した野生型CA遺伝子を有するプラスミドを
組立て、araB−CA融合タンパク質を生産する。
aBと融合した野生型CA遺伝子を有するプラスミドを
組立て、araB−CA融合タンパク質を生産する。
【0133】この組立て模式図を図5に示す。 1.プラスミドp19C(1μg)をエンドヌクレアーゼXm
n1で完全に消化し、65℃で10分間加熱することに
より消化を停止させた。
n1で完全に消化し、65℃で10分間加熱することに
より消化を停止させた。
【0134】2.プラスミドpCA3A−−1(0.1μ
g)をエンドヌクレアーゼXmn1で完全に消化し、65℃
で10分間加熱することにより消化を停止させた。
g)をエンドヌクレアーゼXmn1で完全に消化し、65℃
で10分間加熱することにより消化を停止させた。
【0135】3.ステップD.1およびD.2で得たD
NAを混合し、リゲートさせた。
NAを混合し、リゲートさせた。
【0136】4.リゲート産物をPvuIIで消化し、p
19Cを担った形質転換体の数を減少させた。
19Cを担った形質転換体の数を減少させた。
【0137】5.PvuII−処理プラスミドをイー・コ
リMC1061に導入した。
リMC1061に導入した。
【0138】6.野生型araB−CA遺伝子を担ったプ
ラスミドを含有しており、araB−CA融合タンパク質
を生産し得るコロニーを、前記の如きDNA配列決定法
により同定した。分析した7個のコロニーの内、野生型
の配列を有する1個のコロニーを得、pCA3Dと命名
した。
ラスミドを含有しており、araB−CA融合タンパク質
を生産し得るコロニーを、前記の如きDNA配列決定法
により同定した。分析した7個のコロニーの内、野生型
の配列を有する1個のコロニーを得、pCA3Dと命名
した。
【表3】
【0139】 表3 イー・コリ内においてpCA3Dにより生産された野生型セクロピン−Aのアミ ノ酸組成 アミノ酸 実験値 予測値 Asp 2.2 2 Thr 1.0 1 Glu 4.1 4 Pro 1.1 1 Gly 4.4 4 Ala 5.2 5 Val 3.4 4 Ile 4.3 5 Leu 0.7 1 Phe 1.1 1 Lys 7.3 7 Arg 1.0 1 Trp ND 1 Ser 0.3 0 Cys 0 0 Met 0 0 Tyr 0 0 His 0 0 N.D.=測定せず。 核酸配列およびアミノ酸配列を図7に示す。
【0140】実施例4 殺菌活性の検定 被検生物の生存し得る細胞約107を含有するTYE培
地6mlを用いて寒天平板(直径8cm)を調製した。この平
板に、直径2mmのウエルをパンチ形成した。被検物質を
50mMリン酸バッファー(pH6.6)に溶かし、各ウエ
ルに3μlづつ適用した。25℃で一夜インキュベーシ
ョンした後、ウエル周囲の阻止帯またはかさ(halo)の直
径を測定した。かさ形成の標準を求めるために、CA1
−33タンパク質を用いた。ウエルにCA1−33を1
μgおよび3μg入れると、イー・コリ株JF568を注
入した培地上でそれぞれ、直径8mmおよび11mmのかさ
が生じた。臭化シアン消化pCA3AaraB−CA融合タ
ンパク質10μgおよび30μgはそれぞれ、直径7mmお
よび18mmのかさを形成した。
地6mlを用いて寒天平板(直径8cm)を調製した。この平
板に、直径2mmのウエルをパンチ形成した。被検物質を
50mMリン酸バッファー(pH6.6)に溶かし、各ウエ
ルに3μlづつ適用した。25℃で一夜インキュベーシ
ョンした後、ウエル周囲の阻止帯またはかさ(halo)の直
径を測定した。かさ形成の標準を求めるために、CA1
−33タンパク質を用いた。ウエルにCA1−33を1
μgおよび3μg入れると、イー・コリ株JF568を注
入した培地上でそれぞれ、直径8mmおよび11mmのかさ
が生じた。臭化シアン消化pCA3AaraB−CA融合タ
ンパク質10μgおよび30μgはそれぞれ、直径7mmお
よび18mmのかさを形成した。
【0141】HPLCで分画した臭化シアン消化融合タ
ンパク質をもこの検定法に適用した。様々なピークを試
験したところ、1つの特異的なピークが生物活性を示し
た。他の細菌株および酵母株もこの検定法により試験し
た。臭化シアンで消化した、あるいは消化していない融
合タンパク質試料をイー・コリ株JF568の試験にお
いて記載した量で適用し、形成されたかさの直径を測定
した。得られたセクロピン全てに関して得られた結果を
表4に示す。
ンパク質をもこの検定法に適用した。様々なピークを試
験したところ、1つの特異的なピークが生物活性を示し
た。他の細菌株および酵母株もこの検定法により試験し
た。臭化シアンで消化した、あるいは消化していない融
合タンパク質試料をイー・コリ株JF568の試験にお
いて記載した量で適用し、形成されたかさの直径を測定
した。得られたセクロピン全てに関して得られた結果を
表4に示す。
【表4】
【0142】 表4 かさ形成作用として測定した、種々の細菌株に対するCNBr消化pCA3A、 pCA3B、pCA3D融合タンパク質単離体(5μg)およびアンピシリン(750 ng)の生物活性 かさ形成(mm) 細菌株 pCA3A\ pCA3B\ pCA3D* アンピシリン スタフィロコッカス・アウレウス NE NE NE 11.5 (Staphylococcus aureus) ストレプトコッカス・フエカリス NE NE NE 7.0 (Streptococcus faecalis) サルモネラ・デルビイ 5.0 5.0 5.0 6.0 (Salmonella derby) シュードモナスPS−9 2.0 2.25 2.0 NE (Pseudomonas PS-9) クレブシーラ・ニューモニエ 4.5 4.0 4.5 NE (Klebsiella pneumoniae) エルウイニア・カロトボーラEC 5.0 4.5 4.75 6.5 (Erwinia carotovora EC) ストレプトコッカス・ピオゲネス NE NE NE 12.5 (Streptococcus pyogenes) キセノハブダス・ネマトフイラス 3.5 3.0 2.75 12.5 (Xenohabdus nematophillus) セラチア・マーセッセンス 1.0 1.0 1.0 NE (Serratia marcesens) イー・コリ 5506 5.0 4.5 5.0 4.5 (E.coli 5506) イー・コリ 5506DR 7.0 7.0 6.5 4.5(E.coli 5506DR)
【0143】実施例5 セクロピンおよび腫瘍増殖因子の発酵による生産 この実施例では、大腸菌内における、araBプロモータ
ーのコントロール下でのα−TGF(腫瘍増殖因子)およ
びセクロピンの発酵による製造について記載する。イー
・コリ株MC1061はaraB−α−TGFを制御する
プラスミドに支持されたaraBプロモーター(pTGF5
8)、あるいは、araB−セクロピン融合遺伝子を制御す
るプラスミドに支持されたaraBプロモーター(pCA3
D)を含有している。培養を、アンピシリン(0.1g/
l)含有TYE培養培地100ml中、37℃、250rpm
において増殖させた。培養を指数的生長相(約200Kl
ett単位、赤色フィルター)まで増殖させた。次いで培養
を調製したてのTYE培地900mlの入った4lの遮断
(バッフル)振盪フラスコに移した。さらに3時間インキ
ュベーションを続けた後、生産培地9lに接種した。生
産培地は表5に記載した成分を含有している。
ーのコントロール下でのα−TGF(腫瘍増殖因子)およ
びセクロピンの発酵による製造について記載する。イー
・コリ株MC1061はaraB−α−TGFを制御する
プラスミドに支持されたaraBプロモーター(pTGF5
8)、あるいは、araB−セクロピン融合遺伝子を制御す
るプラスミドに支持されたaraBプロモーター(pCA3
D)を含有している。培養を、アンピシリン(0.1g/
l)含有TYE培養培地100ml中、37℃、250rpm
において増殖させた。培養を指数的生長相(約200Kl
ett単位、赤色フィルター)まで増殖させた。次いで培養
を調製したてのTYE培地900mlの入った4lの遮断
(バッフル)振盪フラスコに移した。さらに3時間インキ
ュベーションを続けた後、生産培地9lに接種した。生
産培地は表5に記載した成分を含有している。
【表5】
【0144】 表5 基礎培地 添加物 成分 レベル(g/l) 成分 レベル(g/l) カゼイン加水分解物 30 グリセリン 16 酵母エキス 1 CaCl2:2H2O 0.022 KH2PO4 3 MgSO4:7H2O 0.25 Na2HPO4 6 チアミン−HCl 0.01 NaCl 0.5 アンピシリン 0.1NH4Cl 4
【0145】最初、生産用発酵条件を37℃、800rp
m、および1vvm(1分間当りの容器容量)にセットした。
増殖時期には溶存酸素が消費されるので、それに応じ
て、最少溶存酸素(D.O.)を30%に維持するために撹
拌速度と通気率を増加した。この培地のpHは終始、イ
ー・コリの増殖に適したpH6.5−6.8に自律調節
されていたので、培地のpHを酸または塩基で調節する
必要はなかった。生産培地への接種から約4時間後、細
胞密度はO.D.600=10となり、この時点でL−アラ
ビノース(50g)を加えてセクロピン融合タンパク質の
合成を誘導した。発現ベクターの安定性をさらに確かな
ものとするために、O.D.600=20の時点でブロス中
にアンピシリン1gを補給した。
m、および1vvm(1分間当りの容器容量)にセットした。
増殖時期には溶存酸素が消費されるので、それに応じ
て、最少溶存酸素(D.O.)を30%に維持するために撹
拌速度と通気率を増加した。この培地のpHは終始、イ
ー・コリの増殖に適したpH6.5−6.8に自律調節
されていたので、培地のpHを酸または塩基で調節する
必要はなかった。生産培地への接種から約4時間後、細
胞密度はO.D.600=10となり、この時点でL−アラ
ビノース(50g)を加えてセクロピン融合タンパク質の
合成を誘導した。発現ベクターの安定性をさらに確かな
ものとするために、O.D.600=20の時点でブロス中
にアンピシリン1gを補給した。
【0146】α−TGFおよびセクロピン−araB融合
タンパク質は、いずれもイー・コリ細胞の不溶性画分中
にのみ位置していた。顕微鏡的検査により、この不溶性
の封入体は、誘導後1時間後に細胞内に形成され、発酵
の間中安定的に維持されることが分かった。95%以上
の細胞が、細胞密度が増加し続けるのに伴い、迅速に大
きくなる封入体を少なくとも1個含有していた。細胞塊
の収率は1l当り13.1g(乾重量)であった。細胞塊の
約30%が融合タンパク質であった。
タンパク質は、いずれもイー・コリ細胞の不溶性画分中
にのみ位置していた。顕微鏡的検査により、この不溶性
の封入体は、誘導後1時間後に細胞内に形成され、発酵
の間中安定的に維持されることが分かった。95%以上
の細胞が、細胞密度が増加し続けるのに伴い、迅速に大
きくなる封入体を少なくとも1個含有していた。細胞塊
の収率は1l当り13.1g(乾重量)であった。細胞塊の
約30%が融合タンパク質であった。
【0147】実施例6 araB −hTGF融合タンパク質の発現がS.チフイムリ
ウムaraBプロモーターの制御下に起こるイー・コリベ
クターの組立てaraB プロモーターはaraC遺伝子産物により、正の制御
を受ける。L−アラビノースとaraCタンパク質との相
互反応によりaraBプロモーターの発現に必要な活性化
因子(アクティベーター)が生成される。S.チフイムリ
ウム(S.typhimurium)araBおよびaraCの遺伝子を含
有するプラスミドを用いてaraB−hTGF(ヒト腫瘍増
殖因子α)発現ベクターを組立てた。プラスミドの組立
て方法を図8に示す。最終的なプラスミドphTGF5は
548アミノ酸のタンパク質をコードしているaraB−h
TGF融合物を含有している。phTGF5を含有してい
るイー・コリ株MC1061をカゼイン加水分解物
(0.5%)とチアミン(1μg/ml)を補充した最小グリ
セリン(1%)培地中で増殖させた。培地の密度がA60
0=0.2に達したとき、L−アラビノースを1%にな
る様に加え、5時間インキュベーションを続けた後、培
養物を収集(収穫)した。全細胞性タンパク質の約10%
を表わす55KDalタンパク質がSDS−PAGEによ
って検出された。
ウムaraBプロモーターの制御下に起こるイー・コリベ
クターの組立てaraB プロモーターはaraC遺伝子産物により、正の制御
を受ける。L−アラビノースとaraCタンパク質との相
互反応によりaraBプロモーターの発現に必要な活性化
因子(アクティベーター)が生成される。S.チフイムリ
ウム(S.typhimurium)araBおよびaraCの遺伝子を含
有するプラスミドを用いてaraB−hTGF(ヒト腫瘍増
殖因子α)発現ベクターを組立てた。プラスミドの組立
て方法を図8に示す。最終的なプラスミドphTGF5は
548アミノ酸のタンパク質をコードしているaraB−h
TGF融合物を含有している。phTGF5を含有してい
るイー・コリ株MC1061をカゼイン加水分解物
(0.5%)とチアミン(1μg/ml)を補充した最小グリ
セリン(1%)培地中で増殖させた。培地の密度がA60
0=0.2に達したとき、L−アラビノースを1%にな
る様に加え、5時間インキュベーションを続けた後、培
養物を収集(収穫)した。全細胞性タンパク質の約10%
を表わす55KDalタンパク質がSDS−PAGEによ
って検出された。
【0148】実施例7 araB −hTGF遺伝子に付加した転写ターミネーター
3' 転写ターミネーターは、RNAポリメラーゼに転写を終
了させるDNA配列である。araB−hTGF遺伝子の
3'末端に転写ターミネーターを置くことにより、その
転写ターミネーターから下流の所望しない遺伝子産物の
発現が阻止される。図9に示したプラスミド構築法参
照。最終的なプラスミドphTGF58は、araB−hTG
F遺伝子の3'−末端に挿入されたイー・コリrrnB遺伝
子転写ターミネーターを含んでいる。phTGF58また
はphTGF5(親プラスミド)のいずれかを含んでいるイ
ー・コリMC1061株から分離された、部分的に純化
したaraB−hTGFタンパク質を、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動した後比較すると、主要な夾雑
タンパク質、ベーターラクタマーゼ、はphTGF58−
含有細胞において、有意に減少していた。
3' 転写ターミネーターは、RNAポリメラーゼに転写を終
了させるDNA配列である。araB−hTGF遺伝子の
3'末端に転写ターミネーターを置くことにより、その
転写ターミネーターから下流の所望しない遺伝子産物の
発現が阻止される。図9に示したプラスミド構築法参
照。最終的なプラスミドphTGF58は、araB−hTG
F遺伝子の3'−末端に挿入されたイー・コリrrnB遺伝
子転写ターミネーターを含んでいる。phTGF58また
はphTGF5(親プラスミド)のいずれかを含んでいるイ
ー・コリMC1061株から分離された、部分的に純化
したaraB−hTGFタンパク質を、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動した後比較すると、主要な夾雑
タンパク質、ベーターラクタマーゼ、はphTGF58−
含有細胞において、有意に減少していた。
【0149】実施例8 araB プロモーターおよびカルシトニン A.ヒトカルシトニン遺伝子(hCT) カルシトニンまたはチロカルシトニン(CT)は、甲状腺
から分泌される低カルシウムホルモンにつけられた名称
である。CTは、骨吸収活性を減少させる。CTはま
た、腎臓に作用して尿中カルシウムを増大させ、燐酸を
減少させる。血中カルシウムが高まるとCTが急速に放
出されるのは、CTの主目的は、高等動物を急性高カル
シウム症状から保護することにあることを示している。
CTにおける研究は、ペゲット病(Paget's disease)
のコントロール、促進された骨改造の問題、における使
用を調べることである。カルシトニンのヒト遺伝子の配
列は、次の通りである[クレイグ(Craig)ら、ネーチャ
ー(Nature)、295 345−347(1982)]。 Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly TGC GGT AAT CTG AGT ACT TGC ATC CTG GGC Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His ACA TAC ACG CAG GAC TTC AAC AAG TTT CAC Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly ACG TTC CCC CAA ACT GCA ATT GGG GTT GGA Ala Pro Gly GCA CCT GGA
から分泌される低カルシウムホルモンにつけられた名称
である。CTは、骨吸収活性を減少させる。CTはま
た、腎臓に作用して尿中カルシウムを増大させ、燐酸を
減少させる。血中カルシウムが高まるとCTが急速に放
出されるのは、CTの主目的は、高等動物を急性高カル
シウム症状から保護することにあることを示している。
CTにおける研究は、ペゲット病(Paget's disease)
のコントロール、促進された骨改造の問題、における使
用を調べることである。カルシトニンのヒト遺伝子の配
列は、次の通りである[クレイグ(Craig)ら、ネーチャ
ー(Nature)、295 345−347(1982)]。 Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly TGC GGT AAT CTG AGT ACT TGC ATC CTG GGC Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His ACA TAC ACG CAG GAC TTC AAC AAG TTT CAC Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly ACG TTC CCC CAA ACT GCA ATT GGG GTT GGA Ala Pro Gly GCA CCT GGA
【0150】B.誘導領域、araB構造遺伝子およびhC
T遺伝子を保持しているプラスミドの構築 図10にその構築を示したプラスミドp115は、正し
いカルシトニン遺伝子配列を含んでいる。このプラスミ
ドを、図11に示す様に、エンドヌクレアーゼMstIお
よびPstIで消化し、カルシトニン遺伝子を切り取っ
た。切り取ったフラグメントをaraB構造遺伝子を保持
しているプラスミド(プラスミドpING1、図12参
照)に結合させた。
T遺伝子を保持しているプラスミドの構築 図10にその構築を示したプラスミドp115は、正し
いカルシトニン遺伝子配列を含んでいる。このプラスミ
ドを、図11に示す様に、エンドヌクレアーゼMstIお
よびPstIで消化し、カルシトニン遺伝子を切り取っ
た。切り取ったフラグメントをaraB構造遺伝子を保持
しているプラスミド(プラスミドpING1、図12参
照)に結合させた。
【0151】pING1構築の出発物質として、無傷のa
raCおよびaraBを含んでいるプラスミドpMH6[ホル
ビッツ(Horwitz)ら、ジーン(Gene)、14、309−
319(1981)]を使用した。構築法を図12に示し
た。このプラスミドpMH6を制限エンドヌクレアーゼ
EcoRIおよびSalIで消化し(これは、それぞれaraB
およびaraA遺伝子を切断する)、1.9kbのSalI−E
coRIフラグメントをM13mp9[ビエイラ(Vieira)お
よびメッシング(Messing)、ジーン(Gene)、19 2
59−268(1982)]からの16塩基対のSalI−
EcoRIフラグメントで置換し、pING1を生成させ
た。araB遺伝子のリーディングフレームは、pING1
のEcoRI部位へlacZ遺伝子を融合することにより決
定された。SmaIおよびMstI制限エンドヌクレアーゼ
は共に平滑末端フラグメントを生成するので、pING
1の760塩基対フラグメントをプラスミド#115か
らのMstI−PstIフラグメントで置き換えてphCT1
を生成させた。プラスミド#115は、MstI−PstI
フラグメント内に位置する化学合成されたhCTを持っ
ている。MstIおよびSmaI末端の結合でhcT遺伝子を
araB遺伝に融合し、araB−hCTタンパク質融合物を
作成した。
raCおよびaraBを含んでいるプラスミドpMH6[ホル
ビッツ(Horwitz)ら、ジーン(Gene)、14、309−
319(1981)]を使用した。構築法を図12に示し
た。このプラスミドpMH6を制限エンドヌクレアーゼ
EcoRIおよびSalIで消化し(これは、それぞれaraB
およびaraA遺伝子を切断する)、1.9kbのSalI−E
coRIフラグメントをM13mp9[ビエイラ(Vieira)お
よびメッシング(Messing)、ジーン(Gene)、19 2
59−268(1982)]からの16塩基対のSalI−
EcoRIフラグメントで置換し、pING1を生成させ
た。araB遺伝子のリーディングフレームは、pING1
のEcoRI部位へlacZ遺伝子を融合することにより決
定された。SmaIおよびMstI制限エンドヌクレアーゼ
は共に平滑末端フラグメントを生成するので、pING
1の760塩基対フラグメントをプラスミド#115か
らのMstI−PstIフラグメントで置き換えてphCT1
を生成させた。プラスミド#115は、MstI−PstI
フラグメント内に位置する化学合成されたhCTを持っ
ている。MstIおよびSmaI末端の結合でhcT遺伝子を
araB遺伝に融合し、araB−hCTタンパク質融合物を
作成した。
【0152】C.phCT1を含有するイー・コリ細胞の
増殖 phCT1を含んでいる、形質転換イー・コリ細胞を、振
盪しながら、108−109/ml密度になるまで、37℃
で増殖させ、さらに1〜6時間増殖させる間、L−アラ
ビノース(1%wt/vol)を添加することにより、araB−
カルシトニン融合タンパク質の合成を誘導した。収集し
た細胞を超音波処理(5秒、3回)し、araB−カルシト
ニンの濃度を、抗−hCT抗体を使ってELISA法に
より分析した。
増殖 phCT1を含んでいる、形質転換イー・コリ細胞を、振
盪しながら、108−109/ml密度になるまで、37℃
で増殖させ、さらに1〜6時間増殖させる間、L−アラ
ビノース(1%wt/vol)を添加することにより、araB−
カルシトニン融合タンパク質の合成を誘導した。収集し
た細胞を超音波処理(5秒、3回)し、araB−カルシト
ニンの濃度を、抗−hCT抗体を使ってELISA法に
より分析した。
【0153】上記の発明は、理解を助ける目的で例示に
よって詳しく述べたが、請求の範囲によって限定されこ
そすれ、その発明の範囲内においてそれを変換および改
良し得ることは言うまでもない。
よって詳しく述べたが、請求の範囲によって限定されこ
そすれ、その発明の範囲内においてそれを変換および改
良し得ることは言うまでもない。
【図1】 図1は大腸菌内での発現に使用する合成遺伝
子およびセクロピンAのヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を示す図である。
子およびセクロピンAのヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を示す図である。
【図2】 図2はプラスミドpMH6およびM13mp9
からのプラスミドpING1の組立てを示し、pING1
はaraBおよびaraC遺伝子の両者を持っている。この図
はまた、プラスミドpING1からのプラスミドpCA1
A、pCA1BおよびpCA1'の組立てをも示している
図である。
からのプラスミドpING1の組立てを示し、pING1
はaraBおよびaraC遺伝子の両者を持っている。この図
はまた、プラスミドpING1からのプラスミドpCA1
A、pCA1BおよびpCA1'の組立てをも示している
図である。
【図3】 図3はpMH6およびpCA1A、pCA1B
並びにpCA1'からのプラスミドpCA3'、pCA3
A、pCA3BおよびpCA2'並びにpCA2Aの組立て
を示している図である。pCA1(またはpCA1Aおよ
び1B)、pCA2'(またはpCA2A)およびpCA3'
(またはpCA3AおよびpCA3B)間の違いは、セクロ
ピンA遺伝子と、ara遺伝子間のBamHI部位との間の
種々の長さにあり、pCA1'(またはpCA1Aおよび1
B)では500bp、pCA2'(またはpCA2A)では12
53bp、およびpCA3'(またはpCA3Aおよび3B)
では1550bpである。
並びにpCA1'からのプラスミドpCA3'、pCA3
A、pCA3BおよびpCA2'並びにpCA2Aの組立て
を示している図である。pCA1(またはpCA1Aおよ
び1B)、pCA2'(またはpCA2A)およびpCA3'
(またはpCA3AおよびpCA3B)間の違いは、セクロ
ピンA遺伝子と、ara遺伝子間のBamHI部位との間の
種々の長さにあり、pCA1'(またはpCA1Aおよび1
B)では500bp、pCA2'(またはpCA2A)では12
53bp、およびpCA3'(またはpCA3Aおよび3B)
では1550bpである。
【図4】 図4はプラスミドp19Cの組立てを示して
いる図である。
いる図である。
【図5】 図5はpCA3AからのプラスミドpCA3A
−−1の組立てを示している図である。この図はまた、
pCA3A−−1およびp19C(図4)からのプラスミド
pCA3Dの組立てをも示している。
−−1の組立てを示している図である。この図はまた、
pCA3A−−1およびp19C(図4)からのプラスミド
pCA3Dの組立てをも示している。
【図6】 図6はセクロピンA、大腸菌内で発現させる
ための第2の化学的に合成された遺伝子のヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列を示している。
ための第2の化学的に合成された遺伝子のヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列を示している。
【図7】 図7は野生型およびミュータント(突然変異)
セクロピンAのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を
示している: ここで、(1)はCA野生型(pCA3D)、
(2)はCAミュータントA(pCA3A)であり、(3)は
CAミュータントB(pCA3B)であり、ミューテーショ
ンの位置を示している図である。
セクロピンAのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を
示している: ここで、(1)はCA野生型(pCA3D)、
(2)はCAミュータントA(pCA3A)であり、(3)は
CAミュータントB(pCA3B)であり、ミューテーショ
ンの位置を示している図である。
【図8】 図8はaraB−hTGF融合体を含有している
プラスミドphTGF5の組立てを示す図である。
プラスミドphTGF5の組立てを示す図である。
【図9】 図9はプラスミドpTGF58の組立てを示
す図である。
す図である。
【図10】 図10はヒトの合成カルシトニン遺伝子を
持っている2つのプラスミドp115およびp318の組
立てを示している図である。
持っている2つのプラスミドp115およびp318の組
立てを示している図である。
【図11】 図11は融合ポリペプチド、リブロキナー
ゼ−ヒトカルシトニン(hCT)の遺伝子を含んでいるプ
ラスミドpHCT1の組立てを示す図である。
ゼ−ヒトカルシトニン(hCT)の遺伝子を含んでいるプ
ラスミドpHCT1の組立てを示す図である。
【図12】 図12はカルシトニン−ペプチド遺伝子の
クローニングおよび発現のためのビヒクルとして用いら
れるプラスミドpING1の組立てを示している。pIN
G1はaraBおよびaraC遺伝子を含んでいる図である。
クローニングおよび発現のためのビヒクルとして用いら
れるプラスミドpING1の組立てを示している。pIN
G1はaraBおよびaraC遺伝子を含んでいる図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャー−ホウ・リー アメリカ合衆国カリフォルニア90064、ロ スアンジェルス、グレンドン・アベニュー 2840番 (72)発明者 ユン−ロン・リン アメリカ合衆国カリフォルニア90064、ロ スアンジェルス、クラークソン・ロード 11446番 (72)発明者 ダン・レイ アメリカ合衆国カリフォルニア91316、エ ンシノ、リンドリー・アベニュー4610番 (72)発明者 ゲイリー・ウィルコックス アメリカ合衆国カリフォルニア90265、マ リブ、シーホーン・ドライブ3637番 (56)参考文献 特表 昭61−501186(JP,A)
Claims (6)
- 【請求項1】 生物活性を有するヘテロローガスペプチ
ドを発現する様に形質転換された細菌内で該ペプチドを
生産する方法であって、 a)以下の塩基配列を有するaraBプロモーターの配列で
あって、該プロモーターは、 (1)酵素、ホルモン、抗体、ヘモグロビン、構造タン
パク質、α、β又はγインターフェロン、インターロイ
キン、インスリン又は組織プラスミノーゲンアクチベー
ターからなる群から選ばれるポリペプチドであるが、タ
ウマチンではない、生物活性を有するポリペプチド、又
は (2)該生物活性を有するポリペプチドと付加的なポリ
ペプチドからなる融合タンパク質であって、両ペプチド
が隣接する位置に選択的開裂部位を有する融合前駆体タ
ンパク質 をコードしている遺伝子であって該プロモーターに対し
てヘテロローガスな遺伝子と機能的に結合しているara
Bプロモーターを含有しているポリヌクレオチド分子を
複製可能な発現ビヒクルに挿入し、 b)該ポリヌクレオチド分子を含有している発現ビヒクル
で、該ペプチドを発現し得る細菌を形質転換し、 c)形質転換された細菌を培養条件下で培養し、 d)該培養から該ペプチドを回収することからなる方法。 【化3】 - 【請求項2】 該細菌培養工程が、 a)該細菌にとってヘテロローガスな遺伝子に機能的に結
合しているaraBプロモーターを含有しており、生物活
性を有するペプチドをコードしているポリヌクレオチド
分子で形質転換した細菌を培養培地中、選択的増殖条件
下、指数的成長期に達するまでインキュベートし、 b)工程a)の培養を新たな培養培地に移し、十分な時間該
培養をインキュベートして更に増殖させ、 c)工程b)の培養を生産培地に接種し、最大細菌増殖を達
成するための発酵条件下、選択された細胞密度を達成す
るに十分な時間該培養をインキュベートし、 d)有意な量の該ヘテロローガスペプチドを該培地中で生
産させるのに有効な量のL−アラビノースを添加し、そ
して e)該ヘテロローガスペプチドを回収することからなる請
求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 該発現ビヒクルが、プラスミド又はバク
テリオファージである第1項又は第2項に記載の方法。 - 【請求項4】 該生物活性を有するポリペプチドが、ヒ
トのカルシトニン、ヒト腫瘍成長因子又はセクロピンで
ある第1項ないし第3項の内のいずれか1つに記載の方
法。 - 【請求項5】 該開裂部位が、メチオニン、アスパラギ
ン−グリシン、アスパラギン酸−プロリン、リジン、ア
ルギニン又はリジン−アルギニンである第1項ないし第
4項の内のいずれか1つに記載の方法。 - 【請求項6】 該形質転換された細菌が大腸菌、ネズミ
チフス菌(サルモネラ・チフイムリウム)又は霊菌(セ
ラチア・チフイムリウム)である第1項ないし第5項の
内のいずれか1つに記載の方法。
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