JP5342834B2 - 骨髄線維症処置剤 - Google Patents
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Description
原発性骨髄線維症は、全身の骨髄の線維化および肝・脾における髄外造血を伴い、末梢血では幼若な顆粒球と赤芽球が出現する白赤芽球症を認めることを特徴とし、慢性骨髄増殖性疾患に属する。原発性骨髄線維症の本態は、造血幹細胞レベルで生じたJak2の遺伝子変異を含む遺伝子異常による、モノクローナルな造血細胞の増殖とされている。増殖した造血系細胞(主に巨核球)から産生される種々のサイトカインが骨髄間質細胞に作用して、骨髄の線維化、骨硬化、血管新生など、反応性のポリクローナルな骨髄間質細胞の増殖が生じる。その結果、無効造血、末梢血での涙滴状赤血球の出現、白赤芽球症、髄外造血による巨脾などの特徴的な臨床症状を呈する。
原発性骨髄線維症の約40%には、サイトカインのシグナル伝達に必須なチロシンキナーゼであるJak2に遺伝子変異が生じ、その結果Jak2がサイトカインの刺激がない状態においても恒常的に活性化されている。Jak2以外に、c−mpl(トロンボポイエチンのレセプター)に遺伝子変異を有する症例も少数存在する。
現時点では原発性骨髄線維症の薬物療法による治癒は困難とされており、同種造血幹細胞移植が唯一の治癒的治療法となっている。しかし、移植関連死亡率は25〜48%と高く、それに伴い、総生存率は50%前後に留まっている。最近になって、治療関連毒性がより少ない骨髄非破壊的幹細胞移植(ミニ移植)の有用性がクローズアップされているが、未だ少数例の検討しかなされておらず、長期予後も不明である。
薬物療法としては、対症療法にとどまるが、ダナゾール、プリモボランなどのタンパク同化ホルモン、サリドマイド、レナリドマイドなどの血管新生抑制剤、ヒドロキシカルバミド、アナグレリド、イマチニブ、2−クロロデオキシアデノシン、メルファラン、ブスルファン、エトポシドなどの抗腫瘍薬、エリスロポエチンなどの薬剤の、貧血や血小板減少症、脾腫への有効性が示されている(非特許文献1および2参照)。
こうした状況を受けて、骨髄線維症治療剤の開発に多大な研究努力が注がれてきた。その結果、例えば、チロシンキナーゼJAK2V617Fの阻害剤、TGF−β可溶性レセプターなどのTGF−β阻害剤、ボルテゾミブなどのNFκB阻害剤、デシタビンなどのDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、トリコスタチンAなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤、PTK787/ZK222584、ベバシズマブなどのVEGF阻害剤(非特許文献1参照)、ある種の抗ヒトリンパ球抗体(特許文献1参照)などの薬剤が、骨髄線維症動物モデルまたは臨床試験においてある程度の成果を収めたことが報告されている。しかしながら、いずれの薬剤も未だ満足できるものではなく、さらなる骨髄線維症治療剤の開発が求められていた。
ビタミンAを含む担体が、ビタミンAを貯蔵する星細胞に薬物を送達することは知られていたが(特許文献2参照)、骨髄線維症との関係についてはこれまで全く知られておらず、また、細胞外マトリックス産生阻害剤を有効成分とする組成物により骨髄線維症を処置できるとの報告もなされていなかったため、今回の知見は驚くべきものである。
(1)レチノイドを標的化剤として含む、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達用担体。
(2)レチノイド誘導体がレチノールを含む、(1)の担体。
(3)レチノイドの含有量が担体全体の0.2〜20重量%である、(1)または(2)の担体。
(4)リポソームの形態を有し、レチノイドと、リポソームに含まれる脂質とのモル比が8:1〜1:4である、(1)〜(3)の担体。
(5)骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を含む、骨髄線維症処置用組成物。
(6)(1)〜(4)の担体をさらに含む、(5)の組成物。
(7)骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物が、ゼラチナーゼA、ゼラチナーゼBおよびアンギオテンシノーゲンからなる群から選択される生理活性物質の活性または産生阻害剤、細胞活性抑制剤、増殖阻害剤、アポトーシス誘導剤、および、細胞外マトリックス構成分子または該細胞外マトリックス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子の少なくとも1つを標的とするsiRNA、リボザイム、アンチセンス核酸、DNA/RNAキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、(5)または(6)の組成物。
(8)細胞外マトリックス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子がHSP47である、(7)の組成物。
(9)薬物と担体とを、医療の現場またはその近傍で混合してなる、(5)〜(8)の組成物。
(10)骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物、レチノイド、ならびに、必要に応じてレチノイド以外の担体構成物質を、単独でまたは組み合わせて含む1つまたはそれ以上の容器を含む、(6)〜(9)の組成物の調製キット。
(11)配列番号13で表される核酸配列の1130〜1145位、1485〜1500位、1501〜1516位、1654〜1678位および1951〜1978位から選択される部分を標的とするsiRNA。
(12)以下のA〜Eのセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせ:
A:5’−UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG−3’(センス鎖、配列番号:1)と、3’−UAACCUACCCUUUCUACGUCUUCUUCC−5’(アンチセンス鎖、配列番号:2)との組み合わせ、
B:5’−UGUCUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG−3’(センス鎖、配列番号:3)と、3’−UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC−5’(アンチセンス鎖、配列番号:4)との組み合わせ、
C:5’−GAUGCGAGAUGAGUUGUAGAGUCCAAG−3’(センス鎖、配列番号:5)と、3’−UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAGGU−5’(アンチセンス鎖、配列番号:6)との組み合わせ、
D:5’−CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG−3’(センス鎖、配列番号:7)と、3’−UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA−5’(アンチセンス鎖、配列番号:8)との組み合わせ、
E:5’−GAGACAAGAUGCGAGAUGAGUUGUAAG−3’(センス鎖、配列番号:9)と、3’−UACUCUGUUCUACGCUCUACUCAACAU−5’(アンチセンス鎖、配列番号:10)との組み合わせ、
のいずれかから構成される、(11)のsiRNA。
本発明の担体により、有効成分を作用部位、さらには標的細胞に効率的に送達できるため、骨髄線維症、特にこれまで治療が困難であった原発性骨髄線維症などの治癒、進行の抑制または発症の予防が可能となり、ヒト医療および獣医療への貢献は極めて大きい。
さらに、本発明の組成物は、これまで骨髄線維症への有効性が知られていなかった細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を有効成分として含むものであるため、従来とは異なる作用機序で骨髄線維症を処置することが可能となり、従来の作用機序の薬剤では効果がなかった病態の改善や、これら従来の薬剤との併用による治療効果の向上が期待できる。
また、本発明の担体は、任意の薬剤(例えば、既存の骨髄線維症治療薬)と組み合わせてその作用効率を高めることができるため、製剤的な応用範囲が広く、効果的な処置剤の製造を簡便に行うことができるという利点もある。
本発明において、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞は、骨髄に存在する細胞外マトリックス産生能を有する細胞であれば特に限定されないが、典型的には骨髄線維芽細胞を含む。骨髄線維芽細胞はα−SMA(α平滑筋アクチン)の発現を特徴としている。本発明における骨髄線維芽細胞は、検出可能に標識された抗α−SMA抗体を用いた免疫染色などによって同定されるものである。
本発明におけるレチノイドは、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への特異的な物質送達を促進するものである。レチノイドによる物質送達促進の機構は未だ完全には解明されていないが、例えば、RBP(retinol binding protein)と特異的に結合したレチノイドが、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の細胞表面上に位置するある種のレセプターを介して同細胞に取り込まれることが考えられる。
レチノイドは、4個のイソプレノイド単位がヘッド−トゥー−テイル式に連結した骨格を持つ化合物の群の1員であり(G. P. Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents,” 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251(1992)参照)、ビタミンAは、レチノールの生物学的活性を定性的に示すレチノイドの一般的な記述子である。本発明において用いることができるレチノイドとしては、特に限定されず、例えばレチノール、レチナール、レチノイン酸、レチノールと脂肪酸とのエステル、脂肪族アルコールとレチノイン酸とのエステル、エトレチナート、トレチノイン、イソトレチノイン、アダパレン、アシトレチン、タザロテン、パルミチン酸レチノールなどのレチノイド誘導体、およびフェンレチニド(4−HPR)、ベキサロテンなどのビタミンAアナログを挙げることができる。
これらのうち、レチノール、レチナール、レチノイン酸、レチノールと脂肪酸とのエステル(例えばレチニルアセテート、レチニルパルミテート、レチニルステアレート、およびレチニルラウレートなど)および脂肪族アルコールとレチノイン酸とのエステル(例えばエチルレチノエートなど)は、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への特異的な物質の送達の効率の点で好ましい。
レチノイドのシス−トランスを含む異性体全ては、本発明の範囲内に入る。レチノイドはまた1または2以上の置換基で置換されることもある。本発明におけるレチノイドは、単離された状態のものはもちろんのこと、これを溶解または保持することができる媒体に溶解または混合した状態のレチノイドをも含む。
このような成分としては、脂質、例えば、グリセロリン脂質などのリン脂質、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質、コレステロールなどのステロール、大豆油、ケシ油などの植物油、鉱油、卵黄レシチンなどのレシチン類等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、リポソームを構成し得るもの、例えば、レシチンなどの天然リン脂質、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)などの半合成リン脂質、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジラウロイルホスファチジルコリン(DLPC)、コレステロールなどが好ましい。
本発明における「骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物」のうち、好ましいのは、コラーゲン、プロテオグリカン、テナスチン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、オステオネクチン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分の産生・分泌を阻害する薬物であり、特に好ましくはHSP47(Heat Shock Protein(熱ショックタンパク質)47)の阻害剤、とりわけHSP47に対するsiRNAである。
本発明の担体が送達する物質や物体は、標識されていてもいなくてもよい。標識化により、運搬の成否や、標的細胞の増減などをモニタリングすることが可能となり、特に試験・研究レベルにおいて有用である。標識は、当業者に公知な任意のもの、例えば、任意の放射性同位体、磁性体、標識化物質に結合する物質(例えば抗体)、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、および酵素などから選択することができる。
本発明において「骨髄における細胞外マトリックス産生細胞用」または「骨髄における細胞外マトリックス産生細胞送達用」とは、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞を標的細胞として使用するのに適することを意味し、これは例えば、同細胞に、他の細胞、例えば正常細胞よりも迅速、高効率かつ/または大量に物質を送達できることを含む。例えば、本発明の担体は、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞に、他の細胞に比べ、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、さらには3倍以上の速度および/または効率で物質を送達することができる。
本発明における骨髄線維症は、当該技術分野で知られた任意の手法により診断することができる。骨髄線維症の最も特徴的な病態は骨髄の線維化であり、これは、骨髄穿刺で骨髄液を採取できないこと(dry tap)によりある程度判断することができる。確定診断は、骨髄生検により、骨髄の線維化および/または骨梁の増加を確認することにより行う(図1参照)。原発性骨髄線維症では、このほか、貧血、肝脾腫、末梢血における白赤芽球症、涙滴赤血球などの奇形赤血球、芽球、巨大血小板、巨核球の出現、血清LDHの上昇、骨髄シンチグラフィによる肝脾への取り込みの増加、時に出血傾向、腹部膨満感、発熱、全身倦怠感、体重減少などを認め得る。また、二次性骨髄線維症については、基礎疾患の症状が前面に出てくる場合が多い。基礎疾患の具体的症状は、当業者によく知られている。
本発明の組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肺内、気道内、気管内、気管支内、経鼻、直腸内、動脈内、門脈内、心室内、骨髄内、リンパ節内、リンパ管内、脳内、髄液腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる(例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、2003年などを参照)。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肺内、気道内、気管内、気管支内、経鼻、直腸内、動脈内、門脈内、心室内、骨髄内、リンパ節内、リンパ管内、脳内、髄液腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、1日多数回(すなわち1日2、3、4回または5回以上)、1日1回、数日毎(すなわち2、3、4、5、6、7日毎など)、1週間に数回(例えば、1週間に2、3、4回など)、1週間毎、数週間毎(すなわち2、3、4週間毎など)であってもよい。
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および/または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、骨髄線維症の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、骨髄線維症発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
配列A:5’−UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG−3’(センス、配列番号:1)と、3’−UAACCUACCCUUUCUACGUCUUCUUCC−5’(アンチセンス、配列番号:2)との組み合わせ。
配列B:5’−UGUCUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG−3’(センス、配列番号:3)と、3’−UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC−5’(アンチセンス、配列番号:4)との組み合わせ。
配列C:5’−GAUGCGAGAUGAGUUGUAGAGUCCAAG−3’(センス、配列番号:5)と、3’−UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAGGU−5’(アンチセンス、配列番号:6)との組み合わせ。
配列D:5’−CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG−3’(センス、配列番号:7)と、3’−UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA−5’(アンチセンス、配列番号:8)との組み合わせ。
配列E:5’−GAGACAAGAUGCGAGAUGAGUUGUAAG−3’(センス、配列番号:9)と、3’−UACUCUGUUCUACGCUCUACUCAACAU−5’(アンチセンス、配列番号:10)との組み合わせ。
これらのうち、配列CおよびDが、そのHSP47発現抑制効果の強さから特に好ましい。
本発明のsiRNAは、マウスにおけるHSP47の発現抑制、および、これに伴うコラーゲンの生成抑制に極めて有用であり、特にマウスを用いた研究、実験、試験などに好適に用いることができる。
骨髄線維症のモデルマウスとして、下田和哉博士と原田実根博士が開発したトロンボポイエチン(TPO)トランスジェニックマウス(以下、TPOマウスとも記す(Leukemia Research 29: 761-769, 2005参照))を用いた。本マウスは、TPO遺伝子導入細胞からTPOが過剰に産生されるため、骨髄中の巨核球が増多し、増多した巨核球からトランスフォーミング増殖因子β(transforming growth factor-beta、TGF-beta)が過剰に産生され、これが骨髄線維芽細胞を刺激し、線維芽細胞からのコラーゲン分泌を促進して骨髄線維化が起きる(図2参照)。
TPOマウス(九州大学実験施設部より供与)を通常の飼育条件で飼育し、生後4、7、9または12ヶ月でマウスを安楽死させ、骨髄を採取して組織標本を作製し、ヘマトキシリンエオジン(HE)染色、ギッター(Gitter)染色、または、アザン(Azan)染色でそれぞれ染色し、光学顕微鏡にて骨髄像を観察した。結果を図3〜5に示す。
生後9カ月(9M)および生後12カ月(12M)では、ともに骨梁の肥厚は著明であり(HE)、細網線維の増生(Gitter)とコラーゲンの沈着(Azan)を認めた。なお、12Mでは9Mに比べて骨髄線維化と骨梁肥厚が進行(増悪)していた(図4参照)
TPOマウスの骨髄HE標本においては、生後9カ月(9M)から骨梁の肥厚が始まり、生後12カ月(12M)ではさらに骨梁肥厚が増悪していた(図5参照)。
以上のとおり、TPOマウスにおいて、骨髄線維症の症状が発現することが確認された。
骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性を抑制する薬物として、マウスHSP47を標的とするsiRNA(HSP47 siRNA)を作製した。具体的には、以下の配列を有する5種類のHSP47 siRNA(HSP47 siRNA−A〜E)とRandom siRNAとを作製し、以後の実験に用いた。なお、HSP47 siRNAは、株式会社iGENE(東京)から購入した(HSP47 siRNAのターゲット配列は2006年11月登録のデータベースRefseq(GenBank Accession No. NM_009825)からデザインした)。Random siRNAも、株式会社iGENEから購入した(商品名:dsRNA scramble)。
HSP47 siRNA−A:5’−UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG−3’(センス、配列番号:1)
3’−UAACCUACCCUUUCUACGUCUUCUUCC−5’(アンチセンス、配列番号:2)
HSP47 siRNA−B:5’−UGUCUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG−3’(センス、配列番号:3)
3’−UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC−5’(アンチセンス、配列番号:4)
HSP47 siRNA−C:5’−GAUGCGAGAUGAGUUGUAGAGUCCAAG−3’(センス、配列番号:5)
3’−UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAGGU−5’(アンチセンス、配列番号:6)
HSP47 siRNA−D:5’−CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG−3’(センス、配列番号:7)
3’−UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA−5’(アンチセンス、配列番号:8)
HSP47 siRNA−E:5’−GAGACAAGAUGCGAGAUGAGUUGUAAG−3’(センス、配列番号:9)
3’−UACUCUGUUCUACGCUCUACUCAACAU−5’(アンチセンス、配列番号:10)
Random siRNA:5’−CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG−3’(センス、配列番号:11)
3’−UAGCUAAGCGAUCUGGCCGAAGUAACG−5’(アンチセンス、配列番号:12)
また、蛍光色素6’−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)を5’側に標識したsiRNAも作製した。
4〜6週齢のTPOマウスの骨髄細胞を15%のウシ胎仔血清(fetal calf serum、FCS)を添加したMEM(Minimum Essential Medium Eagle、Sigma社)で4週間培養して初代培養の骨髄線維芽細胞を得た。図6に倒立顕微鏡で観察した細胞形態を示すが、細胞は線維芽細胞として典型的な紡錘形をしていた。図7に間葉系細胞のマーカーであるビメンチン(Vimentin)およびαSMAの発現をそれぞれの抗体(anti-Vimentin antibody(Santa Cruz Biotechnology社)、anti-αSMA antibody(Santa Cruz Biotechnology社))を用いたフローサイトメトリーで解析した結果を示すが、両者の発現が認められた。これは、上記培養で得られた細胞が、典型的な骨髄線維芽細胞であることを示すものである。なお、解析に用いたフローサイトメーターはFACS calibur(Becton Dickinson社)であり、測定データはCellQuest software(Becton Dickinson社)を用いて解析した。
1×105個のNIH3T3細胞を10%仔ウシ血清(Calf serum、CS)を添加したDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM、Life Technologies社)に浮遊させ、6穴培養プレートに播種した。24時間後、50〜60%コンフルエントになったNIH3T3細胞にLipotrust(北海道システム・サイエンス株式会社)を用いてHSP47 siRNAをトランスフェクションした。具体的には、20nMのLipotrustと50nMのRandom siRNAまたはHSP47 siRNAをボルテックスで混合したものをトランスフェクションした。トランスフェクションしたNIH3T3細胞は、無血清のOPTI−MEM(GIBCO社)で4時間培養した。このNIH3T3細胞をDMEMで洗浄し、さらに24時間10%のCSを添加したDMEMで培養し、タンパク質を抽出した。その後、ウエスタンブロット法でHSP47の発現を解析した。すなわち、NIH3T3から抽出したタンパク質を、4/20 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を用いて分画した後、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。まず、HSP47に対する1次抗体(Stressgen社)またはβ-アクチンに対する1次抗体(Cell Signaling Technology社)でプローブし、さらにペルオキシダーゼを結合させた2次抗体(Oncogene Research Product社)でプローブし、最後にECL(Amersham Life Science社)を用いて発色させた。
その結果、NIH3T3にHSP47 siRNAを導入後24時間の時点において、HSP47 siRNA−CおよびDがA、BおよびEと比較して効果が強いことが明らかとなった(図8のA参照)。したがって、以下の実験ではHSP47 siRNAとして、HSP47 siRNA−CまたはDを用いた。
5×105個のTPOマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞を15%のFCSを添加したMEMに浮遊させ、6穴培養プレートに播種した。24時間後に50〜60%コンフルエントになった骨髄線維芽細胞にLipotrustを用いてHSP47 siRNAをトランスフェクションした。すなわち、20nMのLipotrustと50nMのRandom siRNAまたは5〜50nMのHSP47 siRNA−CもしくはDをボルテックスで混合したもの、またはこれらをさらに5分後に40nMのビタミンA(レチノール、Sigma社)とボルテックスで混合したものをトランスフェクションした。ビタミンA結合またはビタミンA非結合リポソームHSP47 siRNAをトランスフェクションした骨髄線維芽細胞を、無血清のOPTI−MEMで4時間培養した。その後、この骨髄線維芽細胞をMEMで洗浄し、15%のFCSを添加したMEMでさらに48時間培養し、タンパク質を抽出した。また、別な実験では、50nMのビタミンA結合リポソームHSP47 siRNA−D(VA−Lip−HSP47 siRNA−D、以下では、「ビタミンA結合」を「VA」、「リポソーム」を「Lip」とそれぞれ略す)をトランスフェクションした骨髄線維芽細胞を、無血清のOPTI−MEMで4時間培養した後MEMで洗浄し、15%のFCSを添加したMEMでさらに24〜96時間培養し、タンパク質を抽出した。その後、抽出したタンパク質をウエスタンブロット法でHSP47の発現について解析した。すなわち、骨髄線維芽細胞から抽出したタンパク質を、4/20 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を用いて分画した後、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。その後、実施例4と同様に、HSP47またはβ−アクチンに対する1次抗体でプローブし、さらにペルオキシダーゼを結合させた2次抗体でプローブし、最後にECLを用いて可視化した。結果を図8のBおよびCに示す。
また、VA−Lip−HSP47 siRNA−D(50nM)の効果持続時間が72時間であることが明らかとなった(図8のC参照)。
TPOマウス由来の初代培養骨髄線維芽細胞を10%のCSを添加したOPTI−MEMの培養液中で、10mg/mlの抗レチノール結合タンパク質抗体(anti-RBP-Ab、BD Pharmingen社)の存在下または非存在下で50nMのカルボキシフルオレセイン(FAM)を結合させたLip−HSP47 siRNAまたはVA−Lip−HSP47 siRNA(Lip−HSP47 siRNA−FAMまたはVA−Lip−HSP47 siRNA−FAM)を導入し、30分後にフローサイトメトリー法で解析した。導入した細胞の平均蛍光強度(mean fluorescence intensity、MFI)はFACS caliburで測定し、CellQuest software(Becton Dickinson社)で解析した。5×105個のTPOマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞を6穴培養プレートに播種した。24時間後に、50nMのVA−Lip−HSP47 siRNA−FAMまたはLip−HSP47 siRNA−FAMを添加した。これらの細胞を10%のFCSが添加されたOPTI−MEMで30分間培養した。その後、これらの細胞をPBSで洗浄し、4%のパラホルムアルデヒドで固定した(25℃、15分間)。固定後、これらの細胞を1分間DAPIで核染色した。細胞内のFAMの局在は、蛍光顕微鏡で評価した。代表的なフローサイトメトリーのパターンを図9のAに、FAMラベルされたsiRNAの細胞内局在の代表的な結果を図9のBにそれぞれ示す。なお、MFIは図9のAに示した通りである。Lip−HSP47 siRNAに比べてVA−Lip−HSP47 siRNAの方が、TPOマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞への導入効率に優れることが明らかとなった(AおよびB)。また、VA−Lip−HSP47 siRNAの導入がanti-RBP-Abにより部分的に抑制されたこと(A)から、VA−Lip−HSP47 siRNAの一部は骨髄線維芽細胞のRBP(レチノール結合タンパク質、Retinol Binding Protein)受容体を介して取り込まれた可能性が示唆された。
5×105個の初代培養骨髄線維芽細胞を15%のFCSを添加したMEMに浮遊させて、6穴培養プレートに播種した。24時間後に50nMのLip−siRNA Random(siRNA ran)、Lip−HSP47 siRNA−D(siRNA D)、VA−Lip−siRNA Random(VA−siRNA ran)またはVA−Lip−HSP47 siRNA−D(VA−siRNA D)を導入した。4時間後に培養液を15%のFCSを添加したMEMに交換して、さらに48時間培養した。その後、培養液を除去し、無血清のOPTI−MEMを用いてさらに4時間培養した。その後まず、培養上清中のコラーゲン量をSircol(TM) Collagen Assay kit(Biocolor社)を用いて測定した。すなわち、培養上清をdye solutionと30分間混和した。その後、この溶液を10,000×gで10分間遠心した。結合していないdye solutionを除去した後、結合したdyeに1mlのアルカリ試薬を添加して、ボルテックスで10分間混和し、吸光度計(540nm)により測定した吸光度に基づいて定量した。次に培養プレートに接着している線維芽細胞に沈着しているコラーゲン量を、Sirius red dyeを添加後、吸光度計(540nm)により測定した吸光度に基づいて定量した。
この結果、VA−Lip−HSP47 siRNA−Dを導入した初代培養線維芽細胞が培養上清中に分泌したコラーゲン量が、その他の細胞に比べて有意に少量であったこと、VA−Lip−HSP47 siRNA−Dを導入した細胞において、培養プレートに沈着しているコラーゲン量は、その他の細胞と比較して少量であったが、有意差を認めなかったこと、また、VA−Lip−HSP47 siRNA−Dを導入した線維芽細胞が培養上清中に分泌したコラーゲン量と培養上清除去後に線維芽細胞に沈着しているコラーゲン量との総和は、その他の細胞に比べて有意に少量であったことが明らかとなった。
生後7カ月のTPOマウスを用い、in vivoにおけるVA−Lip−HSP47 siRNA−Dの骨髄線維化改善効果を検討した。HSP47 siRNA−D 12.5mg/マウスを隔日に合計4回、ツベルクリンシリンジを用いて眼窩静脈叢から静注した。すなわち、siRNA 12.5mg/マウス(8μL)およびLipotrust 12.5nM(12.5μL)に、ビタミンA 25nM(2.5μL)を添加し、または添加せずに、さらにRNAase free PBSを添加して合計100μLにし、これを1回量としてマウスに投与した。マウスをHSP47 siRNA−D投与開始後8日目に安楽死させ、骨髄を採取して組織標本を作製し、ヘマトキシリンエオジン(HE)染色、ギッター(Gitter)染色、または、アザン(Azan)染色でそれぞれ染色し、光学顕微鏡にて骨髄像を観察した。結果を図11〜14に示す。
さらに図14に示す処置後のHE染色標本からは、VA−Lip−siRNA HSP47を投与した2匹のマウス(VA−Lip−siRNA HSP47(1)および(2))では、無処置マウス(No treatment)、Lip−siRNA HSP47を投与したマウス(Lip−siRNA HSP47)、およびVA−Lip−siRNA Randomを投与したマウス(VA−Lip−siRNA ran)に比べて、有意に骨梁の肥厚が改善していることが明らかとなった。
以上の結果から、HSP47を標的とするsiRNAを用いた骨髄線維症に対する処置は有用な可能性が示唆された。また、siRNAが基本的に細胞質内で作用することを考慮すれば、上記結果は、レチノイドが骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への標的化剤として機能し、同細胞に効率的に薬物を送達することにより、骨髄線維症の病態を顕著に改善したことを示すものである。
Claims (9)
- レチノイドを標的化剤として含む、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達用担体。
- レチノイド誘導体がレチノールを含む、請求項1に記載の担体。
- レチノイドの含有量が担体全体の0.2〜20重量%である、請求項1または2に記載の担体。
- リポソームの形態を有し、レチノイドと、リポソームに含まれる脂質とのモル比が8:1〜1:4である、請求項1〜3のいずれかに記載の担体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の担体と、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、骨髄線維症処置用組成物。
- 骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物が、ゼラチナーゼA、ゼラチナーゼBおよびアンギオテンシノーゲンからなる群から選択される生理活性物質の活性または産生阻害剤、細胞活性抑制剤、増殖阻害剤、アポトーシス誘導剤、および、細胞外マトリックス構成分子または該細胞外マトリックス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子の少なくとも1つを標的とするsiRNA、リボザイム、アンチセンス核酸、DNA/RNAキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、請求項5に記載の組成物。
- 細胞外マトリックス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子がHSP47である、請求項6に記載の組成物。
- 薬物と担体とを、医療の現場またはその近傍で混合してなる、請求項5〜7のいずれかに記載の組成物。
- 骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物、レチノイド、ならびに、必要に応じてレチノイド以外の担体構成物質を、単独でまたは組み合わせて含む1つまたはそれ以上の容器を含む、請求項5〜8のいずれかに記載の組成物の調製キット。
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