JP5342076B1 - 生化学的評価方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞増殖因子の関与する生化学的反応に効果を及ぼす物質を、迅速、効率的、かつ、的確に評価できる手法を提供すること、前記手法を応用した、細胞増殖因子の関与する生化学的反応に効果を及ぼす物質のスクリーニング方法を提供すること、ならびに前記スクリーニング方法により見出された物質の有効な用途を確立することを目的とする。本発明に係る生化学的評価方法は、特定条件で毛乳頭細胞（Ａ）を培養して得られる毛乳頭細胞の細胞増殖度およびアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性値を測定し、特定の評価基準に従って、毛乳頭細胞（Ａ）に関連する生化学的作用に対する評価物質の生化学的作用を評価することを特徴とする。

Description

本発明は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路が活性化した毛乳頭細胞に対する細胞増殖因子の影響を評価する方法、該細胞増殖因子の作用に対する被験物質の影響を評価する方法、該方法を応用した細胞増殖因子の生化学的作用に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって見出された生化学的に活性な物質および該物質の用途などに関する。

細胞増殖因子とは、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。細胞増殖因子としては、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等が知られている。細胞増殖因子は、動物における発生、分化、成長、機能制御、生体補修等、幅広く生体内反応に関わっていることが知られている。

例えば、創傷治癒の過程において、肉芽組織形成期には繊維芽細胞、筋繊維芽細胞、新生血管の生成が見られ、瘢痕期には増生したコラーゲンが皮面に平行に再配列するとともに新生血管の減少と再構築が見られるが、この際、各種細胞増殖因子が、繊維芽細胞、筋繊維芽細胞、血管内皮細胞などで産生され、これらが創傷治癒に重要な作用を及ぼしていると考えられている。これら知見に基づき、上皮増殖因子（ＥＧＦ）や線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）が治療に使用され始めている。またＶＥＧＦなどは虚血等により障害された心筋を灌流する新生血管を増生するべく、またＨＧＦなどは肺障害、肝障害、腎障害などを治療するべく、医療用薬剤としての応用が試みられている。しかしながら、上記細胞増殖因子を医療用薬剤として応用するに当って、遺伝子工学的手法を用いた組換え体を開発して利用しようとすると、製造コストがかかる上に、製剤の安定性にも注意せねばならない。それ故、遺伝子工学的手法を用いた組換え体の開発が抱える問題を有さない、上記細胞増殖因子のアゴニスト（作動薬）のニーズは大きい。

以下、上記細胞増殖因子のうち、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を例に挙げてより詳細に説明する。

ＦＧＦファミリーおよびそれらのシグナル伝達受容体は、虫からヒトまでの生物の成長および形態の維持のために鍵となるプロセス（発達、新脈管形成、代謝）を管理する複数の生物学的活性（増殖、生存、アポトーシス、分化、運動性）に関連する。ＦＧＦファミリーとして、２２種のＦＧＦが同定されており、これらは全て、アミノ酸配列が保存された１２０アミノ酸コア領域を、１５〜６５％の配列同一性で共有する。ＦＧＦは、受容体チロシンキナーゼ（ＦＧＦＲと略す。ＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４の４種類がある）のいずれかに結合して、それらを活性化することにより細胞応答を仲介する。より詳細には、ＦＧＦＲは、個々に複数のアイソフォームがオルターナティブスプライシングにより形成され、多様な機能に対応していると考えられている。ＦＧＦＲは、ＦＧＦ分子と結合した後、二量体化して活性化され、ＦＧＦＲ分子の自己リン酸化部位のリン酸化が生じ、引続いて、細胞内シグナル伝達経路の活性化が生じる。さらに細胞動員が生じる場合もある。

ＦＧＦ／ＦＧＦＲ経路の生物学的役割は、マウスモデルにおける、特定の発達系や発現パターンの分析および遺伝子標的化アプローチによる分析によって調査されてきた。これらの調査に基く研究により、新脈管形成、創傷治癒、発達および代謝等を含む多くの生物学的機能におけるＦＧＦ／ＦＧＦＲ経路の関与が実証されてきた。例えば、頭蓋および指の骨格の発達に重度の障害をもたらす骨格形成異常は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３における特定の機能的変異に関連付けられている。

生物学的機能におけるＦＧＦ／ＦＧＦＲ経路が関与する例としては、その他にも、遺伝学的研究により明らかとなった、ヒト癌におけるＦＧＦ／ＦＧＦＲ経路の遺伝子の異常発現やそれによって引き起こされる現象が報告されている。例えば、ＦＧＦＲ１遺伝子の転座および他遺伝子との融合による骨髄増殖性障害への関与、多発性骨髄腫におけるＦＧＦＲ３の無秩序な過剰発現、乳癌におけるＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の遺伝子増幅およびタンパク質過剰発現、胃癌および子宮内膜癌におけるＦＧＦＲ２変異による癌細胞の活性化、膀胱癌におけるＦＧＦ非結合時でのＦＧＦＲ３キナーゼ活性化およびＦＧＦＲ３タンパク質の過剰発現等である。従って、ＦＧＦＲの活性を阻害できる化合物は、無秩序なＦＧＦＲシグナル伝達を伴うヒト癌の治療薬の候補となり易い。例えば、ＦＧＦＲのシグナル伝達を阻害する、低分子量阻害剤の利用はすでに知られている。

上記のような疾病治療の重要性が増すと共に、高齢化と多ストレスの社会を反映して薄毛・脱毛に対する治療、あるいはケアに対する発毛・育毛剤の需要も高まっている。特に、近年は女性向けの発毛・育毛剤の需要が高まっており、中でも、普遍的に効果を発揮する発毛・育毛剤のニーズは恒常的に高い。現在も、発毛・育毛剤を開発する目的で、新規の発毛・育毛効果を有する物質の探索が精力的になされているが、真に実効性のある新規物質を見出すことは容易ではない。その原因の１つとして、発毛・育毛剤成分の候補物質をスクリーニングする際の評価方法が、発毛・育毛剤としての効能を評価する上で、必ずしも適切でないことが指摘されている。

毛成長の制御には、複数のＦＧＦが関与している。現在まで知られている２２種類のＦＧＦ分子のうち、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１８およびＦＧＦ−２２が皮膚および毛包の上皮で発現していることが知られている。これら７種のＦＧＦが、標的となる細胞表面のＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４のいずれかに結合することで、細胞内にシグナルが伝達して毛周期が制御されるものと考えられる。そこでＦＧＦ分子そのもの(遺伝子組み換えＦＧＦを含む)を配合した成分、あるいは、ＦＧＦの産生を促進する成分を配合した育毛剤が提案されている。例えば、ＥＧＦと同様に、皮膚系の細胞がＦＧＦ−１（酸性ＦＧＦとも称する）、ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦとも称する）に良く反応して増殖することから、これら２種のＦＧＦを配合する育毛剤が開発されている（特許文献１）。その他にも、ＦＧＦ−７に関する機構は、外的刺激を受けた毛乳頭細胞がＦＧＦ−７を産生し、髪の元となる毛母細胞がそのＦＧＦ−７に応答して増殖すると説明されており、ＦＧＦ−７分子およびその作動薬が育毛剤の配合成分として期待されている。他のＦＧＦ分子種についても、その応答する細胞の増殖度による毛成長が説明されており、やはりＦＧＦ−７分子およびその作動薬が育毛剤の配合成分として期待されている。

その一方で、ＦＧＦ−５は、毛成長に対して抑制的に働き、前記ＦＧＦ分子種とはその作用が明らかに異なる。すなわち、ＦＧＦ−５は、毛包の毛周期における成長期を退行期に誘導する。換言すると、ＦＧＦ−５は、毛包の成長期後期に限定的に発現することにより毛包の成長期を終了させ、毛成長を停止へと導く。加えて、ＦＧＦ−５のｍＲＮＡは毛包内の外毛根鞘において特異的に発現することが示されている（非特許文献１）。さらに、単離した毛乳頭細胞がＦＧＦ−５分子に応答して増殖することが知られており、従ってＦＧＦ−５は外毛根鞘において産生され毛乳頭に作用すると考えられている（非特許文献２）。

上記知見を発毛・育毛効果を有する物質の探索に活かすべく、ＦＧＦ−５の作用を阻害することで、毛周期における成長期を終了させないで毛成長を維持あるいは促進する育毛機構が提案され、それに基づく発毛・育毛効果を有する物質のスクリーニング法も提案されている。具体的には、毛周期を強制同調させたマウスにＦＧＦ−５を投与した脱毛症モデルを作成し、脱毛症を回復する効果を有する物質を探索するためのイン・ビボスクリーニング法が提案されている（特許文献２）。

しかしながら、一般的にイン・ビボスクリーニング法では、多個体のマウスの毛周期を同調させて試験を行うことが容易とはいい難い。すなわち、体毛の成長期を一斉に開始させるために休止期にある毛を抜くあるいは剃る処理を施すが、皮膚への刺激を一定に揃えることに相当な熟練を要する点で改善の余地がある。加えて、特許文献２の方法では、ＦＧＦ−５注射時の炎症反応が測定評価の障害となることがある点で改善の余地がある。また、育毛剤候補物質のスクリーニングの段階でイン・ビボ試験を実施することに関し、動物愛護の観点から改善の余地がある。

その一方で、ＦＧＦ−５を阻害する物質を探索するためのイン・ビトロスクリーニング法は特許文献３に開示されている。すなわち、細胞表面にＦＧＦ受容体を発現する細胞の培養液を複数用意し、ＦＧＦ−５およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）を別々の培養液に添加して、上記細胞をそれぞれＦＧＦ−５特異的およびＩＬ−３特異的に活性化する。この二通りに活性化された細胞を含む培養液のそれぞれに被験物質を添加して細胞培養後、該細胞の増殖の程度を測定、比較することにより該被験物質のＦＧＦ−５に対する特異的な阻害作用、ひいては、発毛・育毛作用を評価する。該方法により発毛・育毛作用を有すると評価された植物抽出液のうち、地楡（ジユ）の名で知られるワレモコウエキス（Ｓａｎｇｕｉｓｏｒｂａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの根茎部抽出物）については、臨床的にも抜け毛を減少する、成長期の毛の比率を増加させる等の育毛効果を奏することが実証されている（非特許文献３）。しかしながら、当該法で使用される細胞は、ＦＧＦ−５およびＩＬ３により活性化された免疫系由来細胞であり、別途、毛成長に関与する細胞試験、器官試験、動物試験等をイン・ビボあるいはイン・ビトロ法により行うことで、被験物質の育毛効果を追試、再確認する必要があるという点で改善の余地がある。

例えば、毛乳頭細胞を用いて上述の追試、再確認を行うことが考えられる。さらに毛乳頭細胞を用いた、より直接的なスクリーニング方法が考えられる。毛乳頭細胞は、毛の成長器官である毛包を形成する重要器官である。また、形態学的には、毛乳頭の周囲を毛母細胞が取り囲み、盛んに***、増殖しながら毛幹（通常毛と呼ぶもの）を形成していく。従って、毛乳頭細胞の活性化は、直接、毛成長に関与するものと考えられている。実際のところ、毛乳頭細胞をイン・ビトロスクリーニング試験に用いることは既に報告されている（特許文献４）。この試験方法は、動物あるいはヒトの正常細胞および不老死化した毛乳頭細胞を使用し、育毛候補物質を該毛乳頭細胞に添加して、毛乳頭細胞の増殖度をＤＮＡ合成能あるいはミトコンドリア活性をホルマザン反応で測定し、毛乳頭細胞の増殖度を指標として、育毛候補物質の育毛効果を評価するものである。しかしながら、毛乳頭細胞の増殖能力は、本来、毛乳頭細胞自身の維持、増加に関わる指標であり、必ずしも、毛髪の形成能力を約束するものではない。

毛乳頭細胞の活性化に関連すると考えられる因子としては、他には、毛乳頭細胞内のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性が知られている。毛周期における成長期において毛乳頭細胞内でＡＬＰ活性が高まること、換言すれば、ＡＬＰ活性が高いことは毛乳頭細胞が毛周期の成長期にあることを示すマーカー分子であることは広く受け入れられている（非特許文献４）。また、細胞内の重要シグナル伝達経路であるＷｎｔ／β―カテニン経路が、上記成長期において活性化されていることも知られている（非特許文献５）。さらに、毛乳頭細胞に、Ｗｎｔ／β―カテニン経路の活性化剤の一種であるＧＳＫ―３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸを添加することによって、毛乳頭細胞の細胞当りのＡＬＰ活性が上昇することが報告されており（非特許文献６）、この報告から、Ｗｎｔ／β―カテニン経路とＡＬＰ活性は一連のシグナル経路上にあることが示唆される。しかし、該シグナル経路の活性化におけるＦＧＦ−５の影響については報告の事例がない。また、ＦＧＦ−５添加による該シグナル経路が活性化された毛乳頭細胞のＡＬＰ活性の変化についても知られていない。

特開平０５−１８６３１４号公報 特開２００１−３４３３８３号公報 再表２００５／０３４８９４号公報 特開平１０−２２９９７８号公報

Ｃｅｌｌ（１９９４）７８：１０１７−１０２５ Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．（１９９６）Ａｐｒ；２０５（４）：３７９−８６ 西日本皮膚科（２００７）６９（１）：８１−８６ Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．（２００７）４９：１８５−１９５ Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．（２００１）Ｄｅｃ；１０９（２）：１７３−８１ Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．（２００９）Ｊｕｎ；３０１（５）：３５７−６５

本発明の目的は、細胞増殖因子（Ｃ）が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤による毛乳頭細胞内のＷｎｔ／β−カテニン経路活性化に与える影響を評価できる生化学的評価方法を提供することにある。

また、本発明の別の目的は、医薬あるいは化粧品等の分野で非常にニーズの大きい細胞増殖因子の関与する生化学的反応に効果を及ぼす物質、例えば、悪性新生物の治療薬、創傷治癒薬、発毛・育毛剤の有効成分として候補となる物質を、迅速、効率的、かつ、的確に評価できる手法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、必要に応じて、前記手法において、動物試験をできるだけ省略できる手法を確立することにある。

また、本発明の別の目的は、前記手法を応用した、細胞増殖因子の関与する生化学的反応に効果を及ぼす物質のスクリーニング方法を提供することにある。

さらに、本発明の別の目的は、前記スクリーニング方法により見出された物質の有効な用途を提供することにある。

そして、本発明の別の目的は、Ｗｎｔ３ａおよびリチウム塩から選択される少なくとも１種のＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤により毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路を活性化する方法を提供することにある。

上記課題を解決する本発明は、以下の構成を有する。
（１）（Ｙ１）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）および細胞増殖因子（Ｃ）の存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる細胞増殖因子評価用毛乳頭細胞と、（Ｙ２）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の存在下かつ細胞増殖因子（Ｃ）の非存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる細胞増殖因子評価対照用毛乳頭細胞とを調製して、
細胞増殖因子評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）および細胞増殖因子評価対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）のそれぞれについて、「細胞増殖度および／またはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性値」を測定し（但し、上記評価対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」は、上記細胞増殖因子評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）の「細胞増殖度および／またはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性値」に対応する）、
上記評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と、上記対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」とを比較することで、
細胞増殖因子（Ｃ）が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路活性化に与える影響を評価することを特徴とする生化学的評価方法。
（２）（Ｚ１）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）、細胞増殖因子（Ｃ）および被験物質（Ｄ）の存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる被験物質評価用毛乳頭細胞と、
（Ｚ２）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）および細胞増殖因子（Ｃ）の存在下かつ被験物質（Ｄ）の非存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる被験物質評価基準用毛乳頭細胞と、
（Ｚ３）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）および被験物質（Ｄ）の存在下かつ細胞増殖因子（Ｃ）の非存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる被験物質評価対照用毛乳頭細胞と、
（Ｚ４）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の存在下かつ細胞増殖因子（Ｃ）および被験物質（Ｄ）の非存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる被験物質評価対照基準用毛乳頭細胞とを調製し、
被験物質評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）、被験物質評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）、被験物質評価対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）および対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）のそれぞれについて、「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」を測定し（但し、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」、上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」、ならびに、上記被験物質評価対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」は、いずれも、上記評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対応する）、
上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と、
上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」とを比較することで、
被験物質（Ｄ）が、細胞増殖因子（Ｃ）の作用に対して与える影響を評価することを特徴とする生化学的評価方法。
（３）上記被験物質（Ｄ）の量を変えて、上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）および対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）をそれぞれ少なくとも２種調製し、
各上記評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）、各上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）のそれぞれについて、「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」を測定し（但し、上記各評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」はいずれも共通であり、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」、各上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」、ならびに、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」は、いずれも、上記各評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対応する）、
被験物質（Ｄ）の量の変化に依存した、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」の変化と、
被験物質（Ｄ）の量の変化に依存した、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」の変化とを
比較することを特徴とする請求項（２）に記載の生化学的評価方法。
（４）ヒト由来の正常毛乳頭細胞を使用することを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の生化学的評価方法。
（５）Ｗｎｔ／β―カテニン経路の活性化剤が、ＧＳＫ３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｗｎｔ３ａおよびリチウム塩からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の生化学的評価方法。
（６）培地中にヘパリンを添加することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の生化学的評価方法。
（７）細胞増殖因子（Ｃ）が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の生化学的評価方法。
（８）細胞増殖因子（Ｃ）が、ＦＧＦ−５であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の生化学的評価方法。
（９）（２）〜（８）のいずれかの生化学的評価方法による試験を実施し、前記細胞増殖因子（Ｃ）の作用に影響を及ぼす薬剤を見出すことを特徴とするスクリーニング方法。
（１０）（８）の生化学的評価方法による試験を実施し、毛乳頭細胞（Ａ）の成長期の延長または退行期への移行遅延の効果を有する育毛活性物質を見出すことを特徴とするスクリーニング方法。
（１１）フィチン酸、ピーカンナッツ抽出液、ヒバマタ抽出液および２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの共重合体のうち少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする細胞増殖因子阻害剤（ただし、フィチン酸のみを有効成分とする、ＦＧＦ−１阻害剤およびＦＧＦ−２阻害剤を除く）。
（１２）フィチン酸、ピーカンナッツ抽出液および２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの共重合体のうち少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする育毛活性剤。
（１３）（１２）に記載の育毛活性剤を含むことを特徴とする育毛活性組成物。
（１４）Ｗｎｔ３ａおよびリチウム塩から選択される少なくとも１種のＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を培養することを特徴とする毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路を活性化する方法。

本発明の生化学的評価方法によれば、細胞増殖因子がＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路活性化に与える影響や、該細胞増殖因子の作用に対する被験物質の影響を評価できる。

本発明の生化学的評価方法によれば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を活性化した毛乳頭細胞に対する細胞増殖因子の生化学的作用、該細胞増殖因子の生化学的作用に対する被験物質の生化学的作用を評価できる。さらに、本発明の生化学的評価方法を利用したスクリーニング方法によれば、細胞増殖因子の生化学的作用に影響を及ぼす薬剤、例えば、悪性新生物の治療薬、創傷治癒薬、発毛・育毛剤の有効成分として候補となる物質を、迅速、効率的、かつ、的確に見出すことが可能となる。本発明の評価法によれば細胞増殖因子の作用の抑制のみならず促進も評価することができるので、該評価方法を利用したスクリーニング方法により、増殖因子に対する阻害剤に加えて作動薬の候補となる物質をスクリーニングすることが可能であり、阻害剤に加えて作動薬の開発も可能となる。例えば、毛成長を促進する増殖因子の作動薬に加えて、毛成長を終了へと導く増殖因子の阻害剤の開発が可能となる。さらに、本発明の評価方法やスクリーニング方法では、イン・ビトロ法で上記評価やスクリーニングを行うので、初期スクリーニング手段としての動物試験を必要に応じて省略することができる。本発明のスクリーニング方法により見出された、増殖因子の作動薬あるいは阻害剤は、医薬・化粧料等の用途に幅広く利用可能である。

また、本発明によれば、新規細胞増殖因子阻害剤および新規育毛活性剤が提供される。

また、本発明によれば、Ｗｎｔ３ａおよびリチウム塩から選択される少なくとも１種のＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）により毛乳頭細胞内のＷｎｔ／β活性化経路を活性化する方法が提供される。

毛周期のサイクル、毛乳頭細胞の活性化、ＦＧＦ−５およびＦＧＦ−５阻害物質の関係図である。 第一の生化学的評価方法の概念図である。 第二の生化学的評価方法の概念図である。 第三の生化学的評価方法の概念図である。 第一の生化学的評価方法のフローチャートの一例を示す図である。 第二の生化学的評価方法のフローチャートの一例を示す図である。 第三の生化学的評価方法のフローチャートの一例を示す図である。 Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）を添加することで、毛乳頭細胞（Ａ）の細胞当りのＡＬＰ活性値が上昇することを示したグラフ図である。なお、横軸に記載されているのは、ウェル名である。 毛乳頭細胞（Ａ）の細胞当りの相対ＡＬＰ活性が、細胞増殖因子（Ｃ）であるＦＧＦ−５添加により抑制されること、および、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）であるヘパリン添加により該抑制が顕著になることを示したグラフ図である。なお、横軸に記載されているのは、ウェル名である。 発毛・育毛効果の有無が既知である被験物質（Ｄ）を添加した際の毛乳頭細胞（Ａ）の細胞当りの相対ＡＬＰ活性の変化に関し、細胞増殖因子（Ｃ）であるＦＧＦ−５を添加する条件下とＦＧＦ−５を添加しない条件下とを比較した結果を示したグラフ図である。なお、グラフ中の各点に付されているアルファベットと数字は、ウェル名である。 発毛・育毛効果が未知である被験物質（Ｄ）を添加した際の毛乳頭細胞（Ａ）の細胞当りのＡＬＰ活性の変化に関し、細胞増殖因子（Ｃ）であるＦＧＦ−５を添加する条件下とＦＧＦ−５を添加しない条件下とを比較した結果を示したグラフ図である。なお、グラフ中の各点に付されているアルファベットと数字は、ウェル名である。

以下、本発明の最良の形態について、詳細に説明する。

なお、本明細書においては、特に断りがない限り、圧力条件は、通常、０．１〜０．１２ＭＰａ程度の範囲、好ましくは常圧（約０．１０２４MPa）とする。

１．生化学的評価方法
本発明の生化学的評価方法は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路が活性化した毛乳頭細胞を試験材料にして、細胞増殖度およびアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を指標として、毛乳頭細胞の生化学的変化、例えば、毛乳頭細胞の活性化による生化学的変化、さらには細胞増殖因子の添加による生化学的変化を評価すべく検討する中で見出された。

本発明の生化学的評価方法によれば、毛乳頭細胞細胞（Ａ）が関わる生化学的反応に、ある物質（評価物質）がどのように作用するかを生化学的に評価することができる。

図１に示す毛周期を例に挙げれば、次の通りである。

成長期では、毛乳頭細胞内でＷｎｔ／β−カテニン経路が活性化して、毛乳頭細胞が増殖したり、毛乳頭細胞のＡＬＰ活性が発現したりする。その結果、毛が成長したり維持されたりしている。しかし、細胞増殖因子であるＦＧＦ−５が発現すると上記毛乳頭細胞のＡＬＰ活性が抑制されて成長期から退行期へと移行し、毛が細くなったり抜け落ちたりするようになる。

本発明の生化学的評価方法は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路が活性化した毛乳頭細胞を用い、該活性に対する細胞増殖因子の作用を「細胞増殖度および／またはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性値」を指標として評価するものであるので（後述の第二の生化学的評価方法）、毛周期の成長期から退行期への移行に関する生化学的現象のモデルとすることができる。さらには、上記モデルを利用して、例えば、上記ＦＧＦ−５の作用を抑制して成長期から退行期への移行を阻害するような物質を発見することで（後述の第三の生化学的評価方法）、育毛活性剤を見出したりすることができる。

ここで、『「細胞増殖度および／またはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性値」を指標として評価する』とは、「細胞増殖度を指標として評価する」、「ＡＬＰ活性値を指標として評価する」、「細胞増殖度およびＡＬＰ活性値を指標として評価する」ことを示すが、細胞増殖度およびＡＬＰ活性値とで評価する場合は、細胞増殖度およびＡＬＰ活性値をそのまま用いるよりも、ＡＬＰ活性値を細胞増殖度で除した「細胞当りのＡＬＰ活性値」を求めてこれを評価しようとして用いることが、細胞培養後の増殖細胞数を考慮できる点から好ましい。

本発明によれば、毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路に対するＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の生化学的作用を評価することができる(以下、「第一の生化学的評価方法」もいう)。

本発明によれば、上記Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の生化学的作用に対する細胞増殖因子（Ｃ）の影響を評価することができる（以下、「第二の生化学的評価方法」ともいう）。

本発明によれば、上記細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用に対する被験物質（Ｄ）の影響を評価することができる（以下、「第三の生化学的評価方法」ともいう）。

以下、本発明の第一〜第三の生化学的評価方法（以下、包括的に、「本発明の生化学的評価方法」ともいう）を、より具体的に説明する。

１−１．毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化
Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の存在下、毛乳頭細胞（Ａ）を培養することで、毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路が活性化される。

本発明の生化学的評価方法では、毛乳頭細胞（Ａ）、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の他に必要な成分を共存させて毛乳頭細胞（Ａ）を培養し、活性化毛乳頭細胞（Ａ）の活性化に関する作用への影響を評価する方法である。

毛乳頭細胞を活性化させるための細胞培養は、後述の生化学的評価方法の項目に記載した培養条件に準じて行えばよい。

なお、上記方法によれば、従来毛乳頭細胞（Ａ）のＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤としては知られていないＷｎｔ３ａやリチウム塩を用いても、毛乳頭細胞（Ａ）を活性化できる。

１−２．生化学的評価方法
１−２−１．第一の生化学的評価方法の概要
本発明の第一の生化学的評価方法では、毛乳頭細胞（Ａ）が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）によって活性化されたか否かを評価できる（図２参照）。

本発明の第一の生化学的評価方法では、まず、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を培養して得られるＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）と、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の不存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を培養して得られるＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤評価対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）とを調製する。

毛乳頭細胞（Ａ）の量は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）を得るための細胞培養および上記対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）を得るための細胞培養において同じであることが評価の正確性を維持する観点から好ましい。

毛乳頭細胞（Ａ）およびＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）以外の成分が存在するときは、それら成分の配合種および配合量は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）および対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の調製において同じであることが評価の正確性を維持する観点から好ましい。

上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）を得るための細胞培養および上記対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）を得るための細胞培養において、β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）以外に毛乳頭細胞（Ａ）の活性化に影響を与える物質（ＡＬＰ活性を低下させるＦＧＦや、その他、例えば、ＢＭＰ（bone morphogenetic protein）、ＳＯＸ（SRY-type HMG box）、ＴＧＦ（transforming growth factor）、ＨＧＦ（hepatocyte growth factor）等）を用いないことが評価の正確性を維持する観点から好ましい。

次いで、上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）および対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」を測定し、例えば後述の評価基準に従って、該「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」より、毛乳頭細胞（Ａ）がＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）によって活性化されたか否かを評価する。

但し、上記対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対応するものとする。例えば、上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）において細胞増殖度を評価指標として用いる場合は、上記対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）においても同じく細胞増殖度を評価指標として用いる。

本発明の第一の生化学的評価方法では、毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路がＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）により活性化されるとともに、毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性が上昇する（以下、この状態の毛乳頭細胞（Ａ）を「活性化毛乳頭細胞（Ａ）」ともいう）ことを利用する。活性化毛乳頭細胞（Ａ）は、ＡＬＰ活性が上昇している毛周期の成長期の毛乳頭細胞を反映していると考えられる。第一の生化学的評価では、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）がこのような状態の毛乳頭細胞を調製できるか否かを評価できる。Ｗｎｔ／β−カテニン経路と細胞増殖に関する経路は直接関連していないので、活性化剤によっては増殖を促進するものもあれば、抑制するもの、あるいは、ほとんど効果のないものもある。しかし、正確に評価する為の「細胞あたりのＡＬＰ活性」を算出するためにも、細胞増殖度の測定は重要である。

１−２−２．第二の生化学的評価方法の概要
第二の生化学的評価方法では、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路の活性化に対する細胞増殖因子（Ｃ）の作用を評価することができる（図３参照）。

第二の生化学的評価方法では、まず、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）および細胞増殖因子（Ｃ）の存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を培養して得られる細胞増殖因子評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）と、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の存在下かつ上記細胞増殖因子（Ｃ）の不存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を培養して得られる細胞増殖因子評価対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）とを調製する。

毛乳頭細胞（Ａ）およびＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の量は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）を得るための細胞培養および上記対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）を得るための細胞培養において同じであることが評価の正確性を維持する観点から好ましい。

毛乳頭細胞（Ａ）、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）および細胞増殖因子（Ｃ）以外の成分が存在するときは、それら成分の配合種および配合量は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）を得るための細胞培養および上記対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）を得るための細胞培養において同じであることが評価の正確性を維持する観点から好ましい。

さらに、上記評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）を得るための細胞培養および上記対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）を得るための細胞培養において、β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）以外に毛乳頭細胞（Ａ）の活性化に対する細胞増殖因子（Ｃ）の作用に影響を与える物質（ＡＬＰ活性を低下させるＦＧＦや、その他、例えば、ＢＭＰ、ＳＯＸ、ＴＧＦ、ＨＧＦ等）を用いないことが評価の正確性を維持する観点から好ましい。

次いで、上記評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）および対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」を測定し、例えば後述の評価基準に従って、該「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」より、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）により毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路が活性化されるという生化学的作用に対する細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用を評価する。

但し、上記対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対応するものとする。例えば、上記評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）において細胞増殖度を用いる場合は、上記対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）においても細胞増殖度を用いる。

本発明の第二の生化学的評価方法では、毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路がＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）により活性化されるとともに、毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性が上昇することを利用する。活性化毛乳頭細胞（Ａ）は、ＡＬＰ活性が上昇している毛周期の成長期の毛乳頭細胞を反映していると考えられる。そして、この活性化毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性に対して細胞増殖因子（Ｃ）がどのように働くかを評価することで、例えば、細胞増殖因子（Ｃ）の毛周期への影響を評価できる。すなわち、細胞増殖因子（Ｃ）により活性化毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性が低下するのであれば、細胞増殖因子（Ｃ）は、例えば、毛乳頭細胞（Ａ）の毛周期の成長期を退行期に導くよう作用すると評価できる。逆に、細胞増殖因子（Ｃ）により活性化毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性が上昇するのであれば、細胞増殖因子（Ｃ）は、例えば、毛乳頭細胞（Ａ）の毛周期の成長期を延長するように作用すると評価できる。特に、細胞増殖因子（Ｃ）を添加すると、多くの場合、細胞増殖度が大幅に向上する。その結果、見かけの(無処理の)ＡＬＰ活性値が増加したり、変わらないように観察される場合が出てくるので、細胞あたりのＡＬＰ活性値を算出して評価することが重要になる。

１−２−３．第三の生化学的評価方法の概要
第三の生化学的評価方法では、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路の活性化に対する細胞増殖因子（Ｃ）の作用に対する被験物質（Ｄ）の作用を評価することができる（図４参照）。

第三の生化学的評価方法では、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）、細胞増殖因子（Ｃ）および被験物質（Ｄ）の存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を培養して得られる被験物質評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）および被験物質（Ｄ）の存在下、かつ、細胞増殖因子（Ｃ）の不存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を培養して得られる被験物質評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）および細胞増殖因子（Ｃ）の存在下、かつ、被験物質（Ｄ）の不存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を培養して得られる被験物質評価対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）、ならびに、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の存在下、かつ、細胞増殖因子（Ｃ）および被験物質（Ｄ）の不存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を培養して得られる被験物質評価対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）を調製する。

毛乳頭細胞（Ａ）およびＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の量は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）を得るための細胞培養、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）を得るための細胞培養、上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）を得るための細胞培養および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）を得るための細胞培養において同じであることが評価の正確性を維持する観点から好ましい。

被験物質（Ｄ）の量は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）を得るための細胞培養および上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）を得るための細胞培養において共通であることが、評価の正確性を維持する観点から好ましい。

毛乳頭細胞（Ａ）、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）および細胞増殖因子（Ｃ）以外の成分が存在するときは、それら成分の配合種および配合量は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）を得るための細胞培養、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）を得るための細胞培養、上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）を得るための細胞培養および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）を得るための細胞培養において同じとするであることが、評価の正確性を維持する観点から好ましい。

評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）を得るための細胞培養、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）を得るための細胞培養、上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）を得るための細胞培養および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）を得るための細胞培養において、上記活性化に対する細胞増殖因子（Ｃ）の作用に対する被験物質（Ｄ）の作用に影響を与える物質（ＡＬＰ活性を低下させるＦＧＦや、その他、例えば、ＢＭＰ、ＳＯＸ、ＴＧＦ、ＨＧＦ等）を用いないことが評価の正確性を維持する観点から好ましい。

次いで、上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）、上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の細胞増殖度および／またはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性値を測定し、例えば後述の評価基準に従って、該細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値より、上記細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用に対する被験物質（Ｄ）の生化学的作用を評価する。

但し、上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」、上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」は、上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対応するものとする。例えば、上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）において細胞増殖度を評価指標として用いる場合は、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）、上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）においても同じく細胞増殖度を評価指標として用いる。

第三の生化学的評価方法では、毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路がＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）により活性化されるとともに、毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性が上昇し、活性化毛乳頭細胞（Ａ）は、ＡＬＰ活性が上昇している毛周期の成長期の毛乳頭細胞を反映していると考えられる。上記第二の生化学的評価方法により、この活性化毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性に対して細胞増殖因子（Ｃ）がどのように働くかを評価しておけば、上記細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値を測定することで、図４に示す関係から被験物質（Ｄ）が細胞増殖因子（Ｃ）の活性化毛乳頭細胞（Ａ）に対する生化学的作用に対してどのように影響しているかを評価できる。例えば、細胞増殖因子（Ｃ）が活性化毛乳頭細胞（Ａ）の細胞増殖度やＡＬＰ活性を低下させる作用を有する場合、被験物質（Ｄ）により活性化毛乳頭細胞（Ａ）の細胞増殖度やＡＬＰ活性をさらに低下するように作用するのであれば、被験物質（Ｄ）は細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用を促進すると評価できる。逆に、被験物質（Ｄ）により活性化毛乳頭細胞（Ａ）の細胞増殖度やＡＬＰ活性が上昇するのであれば、被験物質（Ｄ）は細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用を抑制あるいは阻害すると評価できる。

以下、本発明の生化学的評価方法において用いられる細胞培養、細胞増殖度およびＡＬＰ活性値の測定、該測定結果を用いた生化学的評価について、順を追って説明する。

１−３．評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞、参照基準用毛乳頭細胞の調製
第一〜第三の生化学的評価方法においては、いずれの場合も、上記毛乳頭細胞（Ａ）、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）、細胞増殖因子（Ｃ）、被験物質（Ｄ）のうちの必要な成分と、その他に、培地、および必要に応じて、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）、細胞増殖因子（Ｃ）として用いた増殖因子以外の増殖因子（Ｆ）、細胞培養用に通常使用される培地成分、抗生物質等とを混合して得られる混合物（以下、「アッセイ用細胞培養混合物」ともいう）を用いて、上記各評価用毛乳頭細胞、上記各参照用毛乳頭細胞、上記評価基準用毛乳頭細胞および上記対照基準用毛乳頭細胞のうち必要なものを調製するための細胞培養を行う（以下、ここでの細胞培養を「アッセイ用細胞培養」ともいう。また、便宜的に、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）、細胞増殖因子評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）および被験物質評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）を評価用毛乳頭細胞と総称し、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤評価対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）、細胞増殖因子評価対照用毛乳頭細胞（Ｙ２）および被験物質評価対照用毛乳頭細胞（Ｚ２）を評価対照用毛乳頭細胞と総称し、被験物質評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ３）および上記被験物質評価対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）を単に評価基準用毛乳頭細胞および上記参照基準用毛乳頭細胞ともいう）。

なお、本発明の生化学的評価方法は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路の活性化を利用する方法であるので、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）以外の毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路の活性化に影響を及ぼす物質は複数種用いないことが、上記生化学的評価をより正確に評価する観点から好ましい。

上記成分は、本発明の目的を損なわない限り、一括で混合しても、適宜の順番で混合してもよい（但し、細胞培養は、通常、必要な成分がすべて存在する条件下で行う）。

上記アッセイ用細胞培養用混合物を調製は、該混合物の調製ミスを削減できる、各主成分をより均一に配合できる、該混合物の調製をより手際よくできるという観点から、以下の手順で行うことが好ましい。

まず、毛乳頭細胞（Ａ）、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）、細胞増殖因子（Ｃ）および被験物質（Ｄ）以外の成分のうち、必要な成分、例えば、血清などの培地成分や抗生物質などを培地と混合して、細胞培養用培地（以下、「アッセイ用細胞培養用培地」ともいう）を調製する。次いで、アッセイ用細胞培養用培地にＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）を溶解または懸濁させた活性化剤溶液（または懸濁液）、アッセイ用細胞培養用培地に細胞増殖因子（Ｃ）を溶解または懸濁させた細胞増殖因子溶液（または懸濁液）、アッセイ用細胞培養用培地に被験物質（Ｄ）を溶解または懸濁させた被験物質溶液（または懸濁液）、アッセイ用細胞培養用培地に毛乳頭細胞（Ａ）を懸濁させると共にその他必要な成分を溶解または懸濁させた細胞懸濁液のうち必要なものを別途調製する。次いで、アッセイ用細胞培養用培地のみ、活性化剤溶液（または懸濁液）、被験物質溶液（または懸濁液）、および細胞懸濁液のうち各生化学的評価方法を実施する際に必要なものを、この順番で細胞培養用容器に添加する。この際の各主成分の配合量は、後に述べる各種成分の配合量の条件を満たすように、適宜調整すればよい。

このような手順でアッセイ用細胞培養用混合物を調製することで、上記第一〜第三の生化学的評価方法による各種評価をより正確におこなうができる。

活性化剤溶液（または懸濁液）および細胞懸濁液は、各種成分を、通常２０〜２５℃で３０〜１２０分程度、例えばピペットマン、電動ピペットマン、８連の電動ピペットなどを用いて混合することで得られる。

ここで、培地は、固形でも液状でもよいが、液体状で用いることが作業性の観点から好ましく、培地が固形である場合は、適宜加熱するなどして液体状にすることが好ましい。

上記アッセイ用細胞培養は、上記のように各種成分を細胞培養用容器に仕込み、次いで、該細胞培養用容器を、通常、常圧付近（通常１気圧）、３３〜３８℃、２〜８％ＣＯ₂雰囲気下で処理すること行われる。

細胞培養時間は、培養する毛乳頭細胞の増殖速度との兼ね合いの観点より、１〜７日であることが好ましい。

上記アッセイ用細胞培養は、例えば、静置条件下で行っても、振盪条件下で行なってもよいが、毛乳頭細胞を細胞培養用容器に接着させるという観点から、静置条件下が好ましい。

上記アッセイ用細胞培養は、細菌、カビ等が増えると細胞に栄養が行き届かなくなることや、異生物の混入により実験結果が乱れることなどの観点から、無菌条件下で行うことが好ましい。無菌化条件は、例えば、抗生物質を添加した培地を用いて細胞培養を行うなどすることで実現できる。

細胞培養用容器としては、例えば、細胞培養用プレート（例えば、コラーゲンタイプＩコートディッシュ（商品名）、ベクトン・ディッキンソン社製）や各種サイズの細胞培養皿（例えば、３５ｍｍディッシュの細胞培養皿）が挙げられる。生化学的変化を行うための毛乳頭細胞（Ａ）の培養では、成分構成の異なる多数の細胞培養用細胞混合物を一度に毛乳頭細胞の培養に供すことができ、また、細胞培養用細胞混合物の使用量が比較的少量で済むという観点から、細胞培養用プレートを用いることが好ましい。

上記のようにして、細胞培養により毛乳頭細胞（Ａ）を維持および増殖させて、細胞培養後に得られる混合物中の評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞および参照基準用毛乳頭細胞を後述の毛乳頭細胞の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」の測定に供する（以下、ここでの細胞培養後に得られる混合物を「アッセイ用細胞培養後の混合物」ともいう）。

［アッセイ用培養に用いる各種成分］
上記のアッセイ用細胞培養に用いる各種成分は、次の通りである。

＜毛乳頭細胞（Ａ）＞
毛乳頭細胞（Ａ）は、動物の毛より得られる毛乳頭を細胞培養に供することで調製する。

本発明において使用される毛乳頭細胞（Ａ）とは、毛の成長器官である毛包の一部分である毛乳頭を構成する細胞である。

毛乳頭細胞（Ａ）の由来とする動物種は、体毛を有し、かつ、その体毛が毛周期で制御されている動物種であれば特に制限されないが、知見の蓄積度、材料の入手しやすさ、および、臨床的応用時の考察の容易さ等の点から、マウス、ラット、ベニガオザル、および、ヒトが好ましく、特にマウス、ヒトが好ましい。

上記動物種の体のどの部位の体毛を用いるかは、目的に応じて適宜選択すればよく、例えば、毛髪、ひげ、背中皮膚の体毛、頬髭、眉毛、腋毛、すね毛などが挙げられるが、毛乳頭細胞が大きいほど単離しやすい観点から、毛髪、頬髭が好ましく、ヒトの毛髪、マウスの頬髭がより好ましい。

毛乳頭細胞（Ａ）の性状に関しては、正常細胞、及び、不老死化細胞を用いることができるが、生体内の挙動を反映しており、継代培養を重ねるとアルカリフォスファターゼの活性を失うという点から正常細胞が好ましい。よって、ヒト由来の正常毛乳頭細胞を使用することが特に好ましく、ヒトの毛髪由来の正常毛乳頭細胞が最も好ましい。

ここで、正常細胞とは、継代数を重ねると***できなくなり、継代数が限られている細胞をいう。毛乳頭細胞（Ａ）の場合は、さらに、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）を添加することでアルカリフォスファターゼが活性化される細胞をいう。不老死化細胞とは、継代数を重ねても増え続ける細胞をいう。毛乳頭細胞（Ａ）の場合は、さらに、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）を添加しても、多くの場合、アルカリフォスファターゼの活性が完全にみられない毛乳頭細胞をいう。

毛乳頭は、通常、上記動物種の毛より分離して採取したものを用いる。通常、毛乳頭は動物の皮膚内に存在する。動物の皮膚内から組織を傷めないように毛を引き抜いた時には、毛乳頭は引き抜かれた毛の先端に存在することが確認できる。毛乳頭を採取する方法としては、（必要に応じてピンセットなどを用いて）毛を引き抜く抜毛法、毛のついた皮膚ごと切り出し、単離する方法などが挙げられるが、動物愛護を実現したり、不要な苦痛や傷などの付与を回避したりするなどの観点から、抜毛法が好ましい。

抜毛法を例に具体的に説明すれば、次の通りである。

毛乳頭細胞を採取するために、必要に応じてピンセットを用いて、毛をつかみ、毛を対象動物から引き抜く。この際、強く引き抜くことによって、通常、毛乳頭付き毛包の付着した毛髪をおおよそ１００本に１本くらいの割合で採取することができる。

次いで、例えばピンセットを用いて毛髪から毛乳頭付の毛包を分離して、生理食塩水等の媒体中に移し、ピンセットやメスなどを用いた顕微鏡下での毛包から毛乳頭のみを単離する処理に供する。

単離した毛乳頭は細胞培養用容器に移動して、培地に後述の培地成分、抗生物質、Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）、ならびに、増殖因子以外の増殖因子（Ｆ）などを必要に応じて添加した細胞培養用培地（以下、ここでの細胞培養用培地を「原料用細胞培養用培地」ともいう）を該細胞培養容器に加え、次いで毛乳頭細胞を培養する（ここでの毛乳頭細胞に原料用細胞培養用培地を混合したものを「原料用細胞培養用混合物」ともいう）。

ここで、毛乳頭細胞（Ａ）を維持および増殖させる効果のあるＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２から選択されるいずれか１種以上を添加することが望ましい。但し、ここで用いたＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）の活性化に対する細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用や該細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用に対する被験物質（Ｄ）の生化学的作用をより正確に評価するという観点から、通常は、後述するように、原料用細胞培養用培地を細胞培養用容器から除去し、次いで生理食塩水で該細胞培養用容器中の毛乳頭細胞（Ａ）を洗浄するなどして、評価用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞、対照用毛乳頭細胞および対照基準用毛乳頭細胞を調製するアッセイ用細胞培養の前に、毛乳頭細胞（Ａ）から除去される。

ここでは、一度に多量の細胞を培養できる観点から、細胞培養皿（例えば、３５ｍｍディッシュの細胞培養皿）を用いることが好ましい。

温度、時間などに関する細胞培養条件は、アッセイ用細胞培養の条件に準じればよい。

また、配合成分についても、使用する物質や配合量は、後述の通りにすればよい（アッセイ用細胞培養と同様にすればよい）。

上記第一の生化学的評価方法実施時に用いる毛乳頭細胞（Ａ）は、初代培養で得られたものでも継代培養で得られたものでもよいが、毎時調製するのが困難であるという観点より継代培養で得られたものが好ましい。

初代培養では、毛乳頭から細胞（毛乳頭細胞）が広がり、毛乳頭細胞（Ａ）が増殖する。初代培養では、通常、毛乳頭細胞（Ａ）が細胞培養用容器の面積の約４割程度まで増加するので、その程度まで細胞が増殖したところで（通常２〜５日程度）、次の操作を行う。

まず、初代培養を行ったディッシュから一度培養液を取り除き、生理性食塩水などを合計０．５〜２ｍＬ程度用いて毛乳頭細胞（Ａ）を１〜２回程度洗浄する。次いで、０．１％トリプシン、コラゲナーゼ、パパインなどの酵素、０．０２％エチレンジアミン四酢酸、クエン酸、ポリ燐酸などのキレート化剤、必要に応じてアンホテリシンなどの抗生物質などを加えて、３５〜３８℃で、３〜５分間程度放置する。これら酵素、キレート化剤、抗生物質などは、それぞれ、一種単独または二種以上混合したものであってもよい。

次いで、細胞培養用容器から解離した毛乳頭細胞（Ａ）を回収して、回収した毛乳頭細胞（Ａ）を新たな細胞培養用容器に播種して、上記初代培養と同様の手順で再度細胞培養を行うことで継代培養を行う（但し、継代培養時は、毛乳頭細胞が細胞培養用容器の面積の約７〜８割程度まで増加するので、その程度まで細胞が増殖したところで（通常２〜５日程度）、次の操作を行う）。このときに、細胞増殖因子（Ｆ）（前述のＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２など）を添加することが望ましい。なお、（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２について述べた際に触れたように）細胞増殖因子（Ｆ）は実験条件の厳密性の観点から、通常、アッセイ用毛乳頭細胞を調製する際の細胞培養の前に上記洗浄などを行って毛乳頭細胞（Ａ）から除去される。

このような継代培養を繰り返すことで、本発明の第一〜第三の生化学的評価や、後述のスクリーニング方法に必要な数の毛乳頭細胞（Ａ）を得ることができる。

毛乳頭細胞（Ａ）は、細胞の数が上記アッセイ用細胞培養用混合物および原料用細胞培養用混合物のいずれにおいても（以下、特に断りがない限り、アッセイ用細胞培養用混合物および原料用細胞培養用混合物を「細胞培養用混合物」と総称する）、１ｍｌあたり、通常、１×１０⁵〜１×１０⁶ｃｅｌｌｓとなる量で用いられる。

＜Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）＞
Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）は、上述の通り、毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ/β−カテニン経路を活性化する目的で使用される。

毛乳頭細胞（Ａ）を活性化する方法はいくつか知られているが、本発明では、評価指標であるＡＬＰ活性を再現性よくかつ高感度で測定するという観点より、Ｗｎｔ／β―カテニン経路を活性化することを特徴とする。Ｗｎｔ／β―カテニン経路の活性化剤（Ｂ）としては、Ｗｎｔタンパクファミリー、Ｗｎｔアゴニスト（例えばＢＭＬ−２８４）、Ｗｎｔの制御に関わるプロテオグリカン類、ＧＳＫ（グリコーゲン合成酵素）−３阻害剤、および、リチウム塩（塩化リチウム、炭酸リチウムなど）が挙げられるが、Ｗｎｔ３ａ、ＧＳＫ３阻害剤、リチウム塩が、細胞当りのＡＬＰ活性の上昇度が大きい点から好ましい。これらＷｎｔ／β―カテニン経路の活性化剤（Ｂ）は、一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。Ｗｎｔ／β―カテニン経路活性化剤（Ｂ）の使用量は、使用するＷｎｔ／β―カテニン経路の活性化剤（Ｂ）の種類によって異なるが、毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β―カテニン経路が活性化するような量に適宜調製すればよい。例えば、Ｗｎｔ３ａは、通常、毛乳頭細胞５×１０³ｃｅｌｌｓ当たり１ｎｇ〜５０ｎｇとなるような量で用いられ、上記細胞培養用混合物中の最終濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌである。ＧＳＫ３阻害剤は、通常、毛乳頭細胞５×１０³ｃｅｌｌｓ当り１０ｎｇ〜１００ｎｇとなるような量で用いられ、上記細胞培養用混合物中の最終濃度は、通常、１００ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌである。リチウム塩は、通常、毛乳頭細胞５×１０³ｃｅｌｌｓ当り４μｇ〜２００μｇとなるような量で用いられ、上記細胞培養用混合物中の最終濃度は、通常、１ｍＭ〜５０ｍＭである。

＜細胞増殖因子（Ｃ）＞
細胞増殖因子（Ｃ）は、特定の受容体に結合させて、特定の生化学的変化を起こさせる目的で使用される。

細胞増殖因子（Ｃ）は、毛乳頭細胞（Ａ）に応答するものであればどのような細胞増殖因子でもよい。ＦＧＦを選択した場合、その分子種としては、毛乳頭細胞表面上のＦＧＦＲに親和性のあるものであればよく、例示的にはＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−９が挙げられる。

ＦＧＦ−１は、運動ニューロン中に多く発現しており、神経保護作用を発揮する。また、ＦＧＦ−１は、神経栄養因子として知られている他、筋芽細胞では筋組織への分化を促す。また、ＦＧＦ−１は、皮膚繊維芽細胞の増殖に関わり、腫瘍細胞の増殖促進にも関与する。よって、この生化学的変化を評価することで、神経成長、筋肉形成、皮膚新生、およびＦＧＦ−１の関与する腫瘍細胞へのＦＧＦ−１の影響を評価できる。またＦＧＦ−１は毛髪の成長にも関与している。

ＦＧＦ−２は、創傷治癒、四肢の発生、血管形成、ニューロンの分化に関与している。ＦＧＦ−２は、繊維芽細胞の増殖、腫瘍細胞の増殖促進にも関与する。よって、この生化学的変化を評価することで、創傷治癒や血管形成、神経成長、四肢形成およびＦＧＦ−２の関与する腫瘍細胞へのＦＧＦ−２の影響を評価できる。またＦＧＦ−２は毛髪の成長にも関与している。

ＦＧＦ−４は、毛乳頭細胞と反応したり、胚発生初期に発現し様々な細胞の分化や増殖、形態形成に関わったりする。ＦＧＦ−４は、大脳海馬領域、小脳プルキニエ細胞、小腸上皮細胞および精巣で発現している。よって、この生化学的変化を評価することで、大脳、小脳および精巣での異状、特に、ＦＧＦ−４の関与する該当部位の腫瘍へのＦＧＦ−４の影響を評価できる。

ＦＧＦ−５は、毛乳頭細胞と反応したり、毛乳頭細胞の毛周期の成長期を退行期に導くという生化学的変化を生じさせたりするものである。よって、ＦＧＦ−５は、この生化学的変化を評価することで、ＦＧＦ−５の毛成長への影響を評価できる。

ＦＧＦ−６は、毛乳頭細胞と反応したり、筋組織、脳内で発現、また交感神経への分化誘導能、軟骨へ分化誘導に関わったりする。よって、この生化学的変化を評価することで、筋肉形成、軟骨形成におけるＦＧＦ−６の影響、および脳神経・交感神経での異状、特に、ＦＧＦ−６の関与する該当部位の腫瘍への影響を評価できる。

ＦＧＦ−９は、毛乳頭細胞と反応したり、軟骨形成、末梢神経系の発達、および、前立腺がんの進展に関与したりする。よって、この生化学的変化を評価することで、軟骨形成時の異状に関するＦＧＦ−９の影響、および、前立腺癌へのＦＧＦ−９の影響を評価できる。

これら細胞増殖因子（Ｃ）の中でも、ＦＧＦ−５が、入手の容易さや医学生化学的知見の蓄積度などの観点より好ましく用いられる。

これら細胞増殖因子（Ｃ）は、本発明の目的を損なわない範囲で、断片化されていたり、遺伝子配列が組み替えられていたり、糖鎖により修飾されていない糖鎖未修飾体であったりしてもよい。

これら細胞増殖因子（Ｃ）は、動物生体または動物細胞から単離したり、あるいは、遺伝子組み換え法により動物・昆虫・微生物等の培養細胞に合成させたものを精製、単離するなどして調製することができる。また、例えば、ペプロテック社、R&Dシステムズ社などから市販品を入手することもできる。

これら細胞増殖因子（Ｃ）は、目的の応じて、一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよいが、評価対象となる細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的評価をより正確に行うという観点から、一種単独で用いることが好ましい。

細胞増殖因子（Ｃ）は、通常、毛乳頭細胞（Ａ）５×１０³ｃｅｌｌｓ当り１ｎｇ〜１０ｎｇとなる量で用いられる。

細胞増殖因子（Ｃ）の細胞培養用混合物中の最終濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌである。

＜被験物質（Ｄ）＞
被験物質（Ｄ）は、上記細胞増殖因子（Ｃ）などに影響を与えるかどうかを評価するために用いる物質である。

被験物質（Ｄ）は、特に限定されるものではないが、産業的かつ実用的見地から植物抽出物もしくは植物抽出液の完全な或いは部分的な精製物であることが好ましい。植物抽出液は市販されているものが利用できるが自家調製してもよい。いずれの場合も、抽出溶媒として細胞毒性が低く、水が主要構成分である培養液と相溶性の良いものを選択すべきである。

ここで「植物抽出物」とは、植物を生のまま、または乾燥して、必要ならさらに粉砕、加熱処理などの必要な加工処理した後に、水または後述の溶媒にて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液、またはその乾燥末を意味する。

これら植物抽出液は、生のまま抽出工程に供してもよいが、抽出効率を考慮すると、細切、乾燥、粉砕などの処理を行った後に抽出を行うことが望ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬して行う。効率を上げるために、連続的または間歇的な攪拌をするか、或いは抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度は、通常５℃から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出減退の性状、抽出溶媒の種類、抽出温度などによっても異なるが、一般に１〜１４日程度とするのが適当である。抽出操作は、ソックスレー抽出器などの抽出器具を使用して連続抽出してもよい。

その抽出方法は、特に限定されず、通常の方法、例えば加熱抽出したものであってもよいし、常温抽出であってもよい。さらに常圧下の他に、加圧下で抽出を行ってもよい。

抽出に使用する溶媒として、水の他に、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの低級アルコール系溶媒、ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール系溶媒、エチルエーテル、プロピルエーテルなどのエーテル系溶媒、アセトン、エチルメチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒などの極性有機溶媒を用いることができる。特に、物質の溶解度に優れ、かつ凝固点および沸点が比較的低い溶媒が好ましく用いられる。特に、水、エタノール、プロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール、ＤＭＳＯ、および、これらの混液が好ましく、水、エタノール、および、これらの混液がさらに好ましい。抽出する植物の種類、部位、性状などに応じて、抽出溶媒を適宜選択すればよい。例えば、皮膚炎を起こすシュウ酸カルシウムなどが多く含まれる植物の場合には、水と上記有機溶媒とを組合せた複数溶剤の交互の使用による抽出により、あらいは混合溶媒を用いる分配による抽出により、不適切な成分を選択的に除去した抽出物を得ることもできる。

或いは、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などを用いることもできる。必要ならば、例えば特開昭６２−１７２０９６号公報に開示されている二酸化炭素の超臨界状態の流体による方法を採用してもよい。

このようにして得られた粗抽出物は、そのままでも本発明の生化学的評価方法に供することが可能であるがさらに減圧濃縮、希釈、ろ過などの処理を適宜行って用いてもよい。或いは、抽出した溶液を、濃縮、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を行なって乾燥物としてもよい。

濃縮、乾燥、または水もしくは極性溶媒への再溶解といった操作、或いはこれからの生理作用を損なわない範囲で、公知の方法により脱色、脱臭、脱塩などの精製処理、カラムクロマトグラフィーなどによる分画処理による精製をさらに行なってもよい。

本発明で使用できる上記植物の抽出物とは、例えば、ピーカンナッツ（学名：Carya illinoinensis）では、葉、茎、樹皮、果実、種子、種子殻、根などの植物体の一部、全草または樹液などから抽出されるものである。好ましくは、種子殻を水または含水溶剤にて抽出されるもの、特に好ましくは、種子殻を熱水抽出して得られるものである。ヒバマタ（英名：bladder wrack、学術名：Fucus vesiculosis）では、海藻と呼ばれる植物体の全藻から抽出されるものである。好ましくは、３０〜６０重量％のエタノールを含む水で抽出されるものである。ワレモコウ（学術名：Sanguisorba officinalis）では、茎、花、実、根茎部などの植物体の一部、または、全草から水、エタノール、または含エタノール水溶剤にて抽出されるもの、好ましくは、根茎部から２０〜５５重量％のエタノールを含む水で抽出されるもの、特に好ましくは、根茎部から３０〜５５重量％のエタノールを含む水で抽出されるものである。ツバキ（学名：Camellia japonica）では、葉、茎、花、果実、種子、雄しべなどの植物体の一部、全草または樹液などから抽出されるものである。好ましくは、葉、花、果実、または種子から１，３−ブチレングリコール水溶液で抽出されるもの、特に好ましくは、種子から４５〜５０重量％の１，３−ブチレングリコールの水溶液で抽出されるものである。

これら被験物質（Ｄ）は、目的の応じて、一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。

被験物質（Ｄ）の培養液中の最終濃度は、通常、０．０２％〜１．５％である。

＜Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）＞
上記細胞培養用混合物には、必要に応じて、Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）が配合されていてもよい。Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）は、上記Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の補助剤として用いられる。Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）によりＷｎｔ/β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）の毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ/β−カテニン経路の活性化作用が増強されて毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性が上昇するため、毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性値の変動が大きくなり、Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）を添加しなかった場合には、ＡＬＰ活性の変動差が小さく、評価が難しい場合にも、Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）を添加することでＡＬＰ活性の変動差が拡大して評価が可能になるなど、測定評価をするにあたって、好ましい影響を与える。

Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸などがあげられる。これらＷｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）の中でも、細胞増殖因子（Ｃ）およびその受容体との結合性に優れる観点から、ヘパリンが好ましい。

これらＷｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）は、目的の応じて、一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。

Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）は、通常、毛乳頭細胞（Ａ）５×１０³ｃｅｌｌｓ当り１００ｎｇ〜１μｇとなる量で用いられる。

Ｗｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｅ）の細胞培養用混合液中の最終濃度は、通常、１μｇ／ｍｌ〜１０μ／ｍｌである。

＜細胞増殖因子（Ｃ）として用いた増殖因子以外の増殖因子（Ｆ）＞
細胞増殖因子（Ｃ）として用いた細胞増殖因子以外の細胞増殖因子（Ｆ）としては、例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、インスリンなどが挙げられ、細胞増殖の維持の観点から、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２が好ましい。なお、念のため補足説明すれば、ＦＧＦ−１やＦＧＦ−２は、細胞増殖因子（Ｃ）にも、細胞増殖因子以外の細胞増殖因子（Ｆ）にも分類されうるが、ＦＧＦ−１やＦＧＦ−２が細胞増殖因子（Ｃ）として用いられた場合は、ＦＧＦ−１やＦＧＦ−２は細胞増殖因子（Ｆ）には分類されない。その逆も然りである。これら細胞増殖因子（Ｆ）は一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよいが、ＦＧＦ−１あるいはＦＧＦ−２を単独で用いることが、試験条件の明確化の観点から好ましい。これら細胞増殖因子（Ｆ）は、毛乳頭細胞５×１０⁵ｃｅｌｌｓあたり１０ｎｇ〜２００ｎｇとなる量で用いられ、細胞培養用混合物中の最終濃度は、通常、１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌである。

ただし、細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用をより正確に評価する観点から、細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用を評価する際の細胞培養時、すなわち、アッセイ用細胞培養用混合物には、細胞増殖因子（Ｆ）は配合しないことが好ましい。

＜培地＞
培地としては、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）、ＰＣＧＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭI１６４０培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１２培地などが挙げられる。

これら培地は、目的の応じて、一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。

従来の知見の蓄積が大きいという観点より、ＤＭＥＭ培地およびＰＣＧＭ培地が好ましく、ＤＭＥＭ培地がより好ましい。

培地は、通常、毛乳頭細胞（Ａ）５×１０³ｃｅｌｌｓ当り２５μｌ〜１００μｌとなる量で用いられる。

＜培地成分＞
上記培地に添加する培地成分としては、血清、ビタミン、各種アミノ酸、タンパクなどが挙げられる。

血清としては、例えば、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヒト血清などが挙げられ、手に入りやすく、安価であり、細菌ウイルス等に対して安全であるなどの観点から、１０％ウシ胎児血清、ウマ血清が好ましく、ウシ胎児血清がより好ましい。これら血清の濃度は、本発明の目的を損なわない限り、特に制限されない。これら血清は一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。これら血清は通常、毛乳頭細胞５×１０³ｃｅｌｌｓ当り５ｍｇ〜１５ｍｇとなる量で用いられる。これら血清の細胞培養用混合物中の最終濃度は、通常、５％〜１５％である。このような条件で血清を用いると、毛乳頭細胞の増殖が促進される観点より好ましい。

ビタミン、各種アミノ酸、タンパクなども、それぞれにおいて、一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。

上記培地成分は、一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。

これら培地成分は、通常、合計で毛乳頭細胞５×１０³ｃｅｌｌｓ当り０．１ｎｇ〜１０μｇとなる量で用いられ、細胞培養用混合物中の最終濃度は、通常、１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。

＜抗生物質＞
上記抗生物質としては、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン溶液、ペニシリン−ストレプトマイシン混合物（混液）、ゲンタマイシン、アンフォテリシンなどが挙げられ、実験に影響が少なく、安価で手に入りやすいという観点から、ペニシリン−ストレプトマイシン混液が好ましい。これら抗生物質は一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。これら抗生物質は通常、毛乳頭細胞５×１０³ｃｅｌｌｓあたり０．０１ｕｎｉｔｓ〜１ｕｎｉｔ／ｍＬとなる量で用いられる。これら抗生物質は細胞培養用混合物中の最終濃度は、通常、０．１ｕｎｉｔｓ／ｍＬ〜１０ｕｎｉｔｓ／ｍＬである。このような量で抗生物質を用いると、培養液を無菌状態に保てる観点より好ましい。

上記各成分は、目的に応じて適宜組合せることができる。

１−４．細胞増殖度およびＡＬＰ活性値の測定と評価
上記の通りアッセイ用細胞培養を行って得られた評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞および参照基準用毛乳頭細胞の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」を測定する。

毛乳頭細胞の基本的な変化指標は細胞増殖度であり、細胞増殖度は測定時の細胞数を反映するものであるが、後述するように、ＡＬＰ活性値による評価の方が信頼度は高い。

第一〜第三の生化学的評価方法においては、細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値に基づいて、下記の通り各種生化学的作用を評価することができる（図５〜７も参照）。

１−４−１．細胞増殖度の測定方法
細胞増殖度の測定方法としては、染色していない細胞、あるいは、色素（例えば、トリパンブルー、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ、スルホローダミンＢ等）で染色した細胞を計測する直接計測法、チミジンの取り込み法によるＤＮＡ合成能評価法、あるいは、ホルマザン生成反応を応用したミトコンドリア活性評価法、前述の染色細胞のバイオマス定量法が挙げられるが、作業効率および試験費用削減などの観点からミトコンドリア活性評価法が好ましい。

以下、ミトコンドリア活性評価法を例に挙げて、より詳しく説明する。

ミトコンドリア活性評価法は、例えば、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ ８（商品名、同仁化学研究所製）を用いて行うことができる。

Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ ８は、高感度水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウム塩WST-8を発色基質として採用しており、WST-8は細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成する。このホルマザンの４５０ｎｍの吸光度を直接測定することにより、生細胞数を計測することができる。

具体的には、まず、上述のように毛乳頭細胞（Ａ）の培養を行うことで、評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞および参照基準用毛乳頭細胞のうち必要なものを、細胞培養用プレートを用いて、それぞれ別途のウェルで調製する。ただし、それぞれの毛乳頭細胞を調製するにあたり、対数増殖期にある毛乳頭細胞（Ａ）を目的の細胞数になるように計数し、例えば細胞培養用プレートのウェルにウェル当たりの細胞数が１×１０³〜１×１０⁴ｃｅｌｌｓとなるように播種することが好ましい。細胞培養用プレートのウェル当たりの毛乳頭細胞（Ａ）の数がこのような範囲であると、上記各種生化学的作用を容易に検出でき、毛乳頭細胞（Ａ）が生着しないという不都合を避けることができる。次いで、各ウェルにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ ８を原液の状態で添加し、通常、１〜４時間呈色反応を行なう（例えば９６穴マイクロプレートを用いた場合は、細胞培養用懸濁液は通常ウェル当たり約１００μＬ、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ ８はウェル当たり通常約１０μｍである）。この呈色反応は、細胞の通常の生育条件で活性を測定することによりデータの信頼性が向上するという観点から、炭酸ガスインキュベータ内で行うことが好ましい。呈色反応は、濃度が０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ、あるいは、濃度が１ ｗ／ｖ％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ ８ １０μＬに対して約１０μＬ添加することで、停止することができる。呈色反応後、マイクロプレートリーダー（例えば、マイクロプレートリーダー−６８０（商品名）、バイオラッド社製）を用いて、ウェル内の混合物の４５０ｎｍの吸光度を測定する。必要に応じて、参照波長である６００ｎｍ（試薬の吸収がない波長）の吸光度を測定して、該６００ｎｍの吸光度の測定値を４５０ｎｍの吸光度の測定値から差し引くことで、試料の濁りの影響を取り除いてもよい。

このようにして、上記評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞および参照基準用毛乳頭細胞を調製する際に得られた各種アッセイ用細胞培養後の混合物の吸光度（４５０ｎｍ）をそれぞれ測定する（以下、吸光度（波長）と記したときは、カッコ内は吸光度の測定波長を示す）。

また、バックグラウンド用混合物の吸光度（４５０ｎｍ）を上記手法に従って測定し、バックグラウンドの吸光度とする。

バックグラウンド用混合物は、アッセイ用細胞培養用混合物から、毛乳頭細胞（Ａ）、Ｗｎｔ／β―カテニン経路の活性化剤（Ｂ）、細胞増殖因子（Ｃ）、被験物質（Ｄ）、およびＷｎｔ／β−カテニン経路活性化補助剤（Ｄ）の純分を除外した以外は同一の組成の混合物とする。

そして、各種アッセイ用細胞培養後の混合物の吸光度からバックグラウンドの吸光度を減じた吸光度を、評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞および参照基準用毛乳頭細胞の吸光度とし、これを評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞および参照基準用毛乳頭細胞の細胞数とする。

１−４−２．ＡＬＰ活性値の測定方法
ＡＬＰ活性値の測定は次の通り行う。

アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）は、脂肪族・芳香族のリン酸エステルに作用して、該リン酸エステルを加水分解し、リン酸を遊離させる酵素であり、酵素活性の至適ｐＨがアルカリ域にある。したがって、ＡＬＰによるリン酸エステルの加水分解反応はアルカリ域で起こる。毛乳頭細胞のＡＬＰ活性は毛乳頭細胞の成長期に特異的にみられることから、培養細胞においてもＡＬＰ活性を上げることで毛乳頭細胞の成長期の細胞状態を反映していると考えられる。ＡＬＰ活性の測定は、上記ＡＬＰによるリン酸エステルの加水分解反応の基質に基いた測定法が確立されており、例えば、ｐ−ニトロフェニルリン酸法、フェニルリン酸法、グリセロリン酸法、ＮＡＤサイクリング法が知られている。これらの中でも、ｐ−ニトロフェニルリン酸法、あるいはＮＡＤサイクリング法が、便宜性および試験コストの観点から好ましい。

なお、アッセイ用細胞培養後の評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞および参照基準用毛乳頭細胞は、上記細胞増殖度の測定と評価およびＡＬＰ活性値の測定と評価のうち、いずれかあるいは両方行ってもよい。

上記細胞増殖度の測定と評価およびＡＬＰ活性値の測定と評価のうちいずれか一方のみ行う場合、あるいは、両方行うがそれぞれ別途の細胞培養後の混合物で行う場合は、細胞培養後の混合物をそのまま測定に供すればよいが、一つの細胞培養後の混合物でまずいずれか一方の測定と評価を行い、次いで、もう一方の測定と評価を行う場合は、一度測定した後の細胞を洗浄処理などすることが好ましい。

ｐ−ニトロフェニルリン酸法で、細胞増殖度の測定と評価を行った後に、同じ細胞培養後の混合物をＡＬＰ活性値の測定と評価に供する場合を例にとれば以下の通りである。

上記細胞増殖度の測定を経た細胞などをＡＬＰ活性測定に供する場合は、細胞を生理食塩水により洗浄し（通常、室温、１回当たり１００μｍ、２〜３回程度）、−７０〜−８０℃の温度で５〜１０分間凍結後、２０〜２５℃で５〜１０分間かけて融解する操作を少なくとも二度行って、細胞を破砕することが好ましい。

必要に応じて上記処理を行った後、ＡＬＰ活性値の測定と評価を行う。

ｐ−ニトロフェニルリン酸法を例にあげて、以下に説明する。

例えば、細胞培養用プレートを用いて、ウェル内のＡＬＰ活性の測定対象となる細胞に、ジエタノールアミン緩衝液、トリス緩衝液などを用いて調製したｐ−ニトロフェニルリン酸（シグマ社製）の溶液を加えて３５〜３８℃で３０〜６０分間反応させる。上記反応終了後に、使用した細胞培養用プレートをマイクロプレートリーダーにてウェル内容物の波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。

このようにして、測定・評価用の細胞培養後の混合物の吸光度を測定する。

上記測定・評価用の細胞培養後の混合物の吸光度とは別に、対照（ブランク）として、Ｗｎｔ／β―カテニン経路の活性化剤（Ｂ）を配合しない以外は、アッセイ用細胞培養用混合物と同じように調製した細胞培養用混合液を、アッセイ用細胞培養用混合物と同様に細胞培養して得られた混合物の吸光度（４９０ｎｍ）を上記手法に従って測定する。

また、バックグラウンド用混合物の吸光度（４９０ｎｍ）を上記手法に従って測定し、バックグラウンドの吸光度とする。

バックグラウンド用混合物は、アッセイ用細胞培養用混合物から、毛乳頭細胞（Ａ）、Ｗｎｔ／β―カテニン経路の活性化剤（Ｂ）、細胞増殖因子（Ｃ）、被験物質（Ｄ）、およびＷｎｔ/β−カテニン経路活性化補助剤（Ｄ）の純分を除外した以外は同一の組成の混合物とする。

そして、アッセイ用細胞培養後の混合物の吸光度からバックグラウンドの吸光度を減じた吸光度を評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞および参照基準用毛乳頭細胞の吸光度とし、これを評価用毛乳頭細胞、参照用毛乳頭細胞、評価基準用毛乳頭細胞および参照基準用毛乳頭細胞のＡＬＰ活性値とする。

１−４−３．第一の生化学的評価方法における評価基準
第一の生化学的評価方法では、上記のように求めた評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と参照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」を比較して、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化を評価する。

上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記参照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」よりも大きければ、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）により毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路は活性化されると評価される。数値が大きいほど、上記活性化の度合いは大きいと評価する。

上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記参照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と同じであれば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）により毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路は活性化されないと評価される。

上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記参照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」より小さい場合は、活性化剤の添加濃度等の原因により、細胞毒性あるいは細胞活性の抑制が生じたと判断される。

上記評価を行うに当たり、上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と上記参照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」との比較は、絶対値評価（減法）で行っても相対評価（除法）で行ってもよい。

また、毛乳頭細胞のＡＬＰ活性は測定数値自体での評価も可能であるが、細胞培養後の増殖細胞数を考慮して、細胞当りのＡＬＰ活性値に換算することが好ましい。

細胞当りのＡＬＰ活性値は、ＡＬＰ活性値を細胞増殖度で除することで求められる。

これら、絶対比較、相対比較、細胞当りのＡＬＰ活性値に関する議論は、第二、第三の生化学的評価でも同様である。

１−４−４．第二の生化学的評価方法
第一の生化学的評価方法では、上記のように求めた評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と参照用毛乳頭細胞（Ｙ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」を比較して、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化に対する細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用を評価する。

上記評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記参照用毛乳頭細胞（Ｙ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」よりも大きければ、細胞増殖因子（Ｃ）は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路の活性化を促進すると評価する。また、数値が大きいほど、上記活性化の促進度は大きいと評価する。

上記評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記参照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と同じであれば、細胞増殖因子（Ｃ）は、上記活性化に影響しないと評価する。

上記評価用毛乳頭細胞（Ｙ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記参照用毛乳頭細胞（Ｙ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」よりも小さければ、細胞増殖因子（Ｃ）は、上記活性化を抑制すると評価する。また、数値が小さいほど、上記活性化の抑制度は大きいと評価する。

１−４−５．第三の生化学的評価方法
第三の生化学的評価方法では、上記のように求めた評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と、対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」とを比較して、上記細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用に対する被験物質（Ｄ）の生化学的作用を下記評価基準に従って評価する。

細胞増殖因子（Ｃ）がＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路の活性化を促進する場合は、次の通りである。

上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」より大きい場合は、被験物質（Ｄ）は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路の活性化を促進する細胞増殖因子（Ｃ）の作用を促進すると評価する。また、数値が大きいほど、被験物質（Ｄ）による上記活性化を促進する細胞増殖因子（Ｃ）の作用を促進する度合いは大きいと評価する。

上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と同じ場合は、被験物質（Ｄ）は、前記活性化を促進する細胞増殖因子（Ｃ）の作用に影響しないと評価する。

上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」より小さい場合は、被験物質（Ｄ）は、前記活性化を促進する細胞増殖因子（Ｃ）の作用を抑制すると評価する。また、数値が小さいほど、被験物質（Ｄ）による上記活性化を促進する細胞増殖因子（Ｃ）の作用を抑制する度合いは大きいと評価する。

細胞増殖因子（Ｃ）がＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路の活性化を抑制する場合は次の通りである。

上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」より大きい場合は、被験物質（Ｄ）は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）による毛乳頭細胞（Ａ）内のＷｎｔ／β活性化経路の活性化を抑制する細胞増殖因子（Ｃ）の作用を抑制すると評価する。また、数値が大きいほど、被験物質（Ｄ）による上記活性化を促進する細胞増殖因子（Ｃ）の作用を抑制する度合いは大きいと評価する。

上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」と同じ場合は、被験物質（Ｄ）は、前記活性化を抑制する細胞増殖因子（Ｃ）の作用に影響しないと評価する。

上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」より小さい場合は、被験物質（Ｄ）は、前記活性化を抑制する細胞増殖因子（Ｃ）の作用を促進すると評価する。また、数値が大きいほど、被験物質（Ｄ）による上記活性化を抑制する細胞増殖因子（Ｃ）の作用を促進する度合いは大きいと評価する。

なお、被験物質（Ｄ）の使用量により評価が変わることもあるので、次のように、被験物質（Ｄ）の量の変化に依存した「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」を評価することが好ましい。
・上記被験物質（Ｄ）の量を変えて、上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）および対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）をそれぞれ少なくとも２種調製する。
・各上記評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）、各上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）のそれぞれについて、「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」を測定する。但し、上記２種以上の評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」はいずれも同じ評価指標を用い、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」、上記２種以上の対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」、ならびに、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」は、いずれも、上記各評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）の細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値に対応する（同じ）評価指標を用いる。
・被験物質（Ｄ）の量の変化に依存した、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」の変化と、被験物質（Ｄ）の量の変化に依存した、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」の変化とを比較する。

後述の実施例３、４には、細胞増殖因子（Ｃ）が前記活性化を抑制する場合の、該細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用に対する被験物質（Ｄ）の生化学的作用を評価する態様における、上記評価方法の具体例が示されている。後述の実施例３、４で述べる議論は、図７の関係を考慮すれば、細胞増殖因子（Ｃ）が前記活性化を促進する場合の、該細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用に対する被験物質（Ｄ）の生化学的作用を評価する態様についても、同様に適用できる。

このように、上記評価方法により、細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用に対する被験物質（Ｄ）の生化学的作用を被験物質（Ｄ）の量による影響も含めて総合的かつ詳細に評価することができる。被験物質（Ｄ）の量は、上記被験物質（Ｄ）の項目で述べた量の範囲内で変化させればよいが、上記評価をより正確に行うという観点より、被験物質（Ｄ）の量の変化は、変化幅（一番薄い濃度から一番濃い濃度までの濃度幅）が５０倍以上となるように、少なくとも３点以上の複数の量を設定して行うことが好ましい。

１−４−６．各種評価について
上記第一〜第二の評価方法においては、評価対照ＡＬＰ活性値と評価対照ＡＬＰ活性値の相違が、「評価対照ＡＬＰ活性値／評価対照ＡＬＰ活性値」で表した時に±０．１以内であるときは、通常誤差範囲であるとして、評価対照ＡＬＰ活性値と評価対照ＡＬＰ活性値とが同じ場合に準じて扱う。上記第三の評価方法においては、評価基準ＡＬＰ活性値に対する評価対照ＡＬＰ活性値と、評価対照基準ＡＬＰ活性値に対する評価対照ＡＬＰ活性値との相違が、「｛（評価対照ＡＬＰ活性値／評価対照ＡＬＰ活性値）／（評価対照ＡＬＰ活性値／評価基準ＡＬＰ活性値）｝×１００（％）」で表した時に±１０％以内であるときは、通常誤差範囲であるとして、評価基準ＡＬＰ活性値に対する評価対照ＡＬＰ活性値と、評価対照基準ＡＬＰ活性値に対する評価対照ＡＬＰ活性値とが同じ場合に準じて扱う。また、上記第一〜第三の評価方法のいずれにおいても、統計学的手法により例えば、ｔ検定によって、有意差を求めることが好ましい。

なお、例えば、ＦＧＦ−５を用いた場合に、上記毛乳頭細胞（Ａ）の細胞増殖度の評価では、毛乳頭細胞（Ａ）へのＦＧＦ−５の影響は、細胞増殖を促し活性化していると評価できるように推察されても、ＡＬＰ活性値の評価によると、逆に、毛乳頭細胞（Ａ）へのＦＧＦ−５の影響は、ＡＬＰ活性を下げ、毛髪成長能力を低下させ、成長期を終了させるものと評価できるように判断できる場合がある。

これは、細胞増殖度による評価とＡＬＰ活性値による評価とでは着目する細胞内シグナル経路が異なるものと考えられる。生物学の世界では、異なるシグナル経路が異なる事象を誘導することは一般的なことであり、また、ＦＧＦおよびその受容体からのシグナルには２つの異なる経路を有することが知られている。本発明では、細胞増殖度が毛成長の司令塔である毛乳頭細胞(自分は毛にならない)の「増殖」する事象を、ＡＬＰ活性値は、毛乳頭細胞が何らかの指令を毛母細胞（毛になるために増殖、成長する）出して、毛母細胞の成長を調整する事象を観察しているために、一見、評価に差が生じるものと考えられる。

このような場合は、通常、ＡＬＰ活性の評価の方が、毛髪の成長に関してより直接的に関与する指標であるので、信頼度が高いという点で好ましい。

さらに、前述のように、細胞培養後の増殖細胞数を考慮して、細胞当りのＡＬＰ活性に換算することが好ましいことを鑑みると、上記評価の信頼度は、いずれの生化学的評価方法においても、細胞当りのＡＬＰ活性値＞ＡＬＰ活性値＞細胞増殖度である。

２．スクリーニング方法
上記第二の生化学的評価方法は、細胞増殖因子（Ｃ）の関与する生化学反応に対して、被験物質（Ｄ）がどのようなに作用するかあるいはしないかを評価できるため、当該評価方法の結果を利用して、細胞増殖因子の関与する生化学反応に対して活性である物質をスクリーニングすることが可能である。

すなわち、本発明の一態様によれば、細胞増殖因子（Ｃ）の関与する生化学反応に効果を及ぼす活性を有する物質のスクリーニング方法が提供される。

なお、細胞増殖因子に関与する一連の生化学的反応は、細胞増殖因子の標的となる細胞に存在する特異的な受容体と該細胞増殖因子が結合することにより開始され、その後の該細胞増殖因子と該受容体によるシグナル伝達が進んでいく。したがって、上記第二の生化学的評価方法を利用したスクリーニング方法によって見出されることが想定される物質は、上述のあらゆる事象における特定の反応に作用を及ぼす物質であることが想定されており、細胞増殖因子単独、受容体単独あるいは双方の複合体へ作用するいずれの物質も包含される。そして、本発明における「物質」とは、単に単一化合物を指すのではなく、生体抽出物、特に植物抽出物、あるいは、該抽出物を部分的に精製して得られる物等、スクリーニング評価が可能な被験物を幅広く包含するものである。

当該スクリーニング方法は、上記第三の生化学的評価方法を実施して、毛乳頭細胞の細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性変化に対する被験物質（Ｄ）の作用を評価し、細胞増殖因子の関与する生化学的反応に作用する物質を見出すことを目的としている。本スクリーニング方法で用いられる被験物質（Ｄ）は、上記生化学的評価方法の項目で説明した被験物質（Ｄ）に準ずる。

本発明のスクリーニング方法は、上記第三の生化学的評価方法を応用したものであるので、細胞増殖因子（Ｃ）の阻害薬及び作動薬のいずれも検出できる。即ち、上記第三の生化学的評価方法を実施し、毛乳頭細胞（Ａ）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」の測定値に基いた上述の各種評価を行うことで、細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用（毛周期における成長期から退行期への誘導）に対する被験物質（Ｄ）の抑制効果および促進効果を評価し、この評価結果に基づいて、上記阻害薬（上記抑制効果を有する物質）および作動薬（上記促進効果を有する物質）を見出すことができる。

被験物質（Ｄ）の細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用に対する作用の評価は、毛乳頭細胞（Ａ）の細胞増殖度のみ、あるいはＡＬＰ活性のみの評価結果に基いて評価することもできるが、細胞増殖度およびＡＬＰ活性の双方の評価結果を複合的に評価することで、被験物質（Ｄ）の細胞増殖因子（Ｃ）の生化学的作用に対する作用をより詳細に評価できる。すなわち上述したように細胞増殖因子がその受容体と結合して、その後の細胞内シグナル伝達経路が複数存在する。ＦＧＦとその受容体の場合、現在までに２経路のシグナル経路が知られており、一方は細胞の「増殖」に関連し、もう一方は細胞の「運動性(遊走化)」に関連する。一方、毛乳頭培養細胞は、細胞培養条件によって三次元的な細胞のかたまり(集塊あるいはsphere)を形成することが知られているが、集塊形成時にＡＬＰ活性が出現し、二次元的にバラバラで集塊していない状態（細胞が遊走化している時）にＡＬＰ活性が消失することが知られている。細胞の遊走化は悪性新生物の転移を引き起こし症状の重篤化をもたらす。従って、「増殖」を抑制するだけでなく、「遊走化」を抑制する物質を評価できる方法は有用である。特に「増殖」を抑制する効果は、時として正常細胞の増殖も抑制しかねないので、さまざまなタイプの治療薬が選抜できることは重要である。

本発明のスクリーニング方法は、上記第三の生化学的評価方法と一種または二種以上の公知の生化学的評価方法試験と組み合わせて行うこともできる。

本発明のスクリーニング方法では、被験物質（Ｄ）として、生化学的作用が公知のものを用いてもよいし未知のものを用いてもよい。

被験物質（Ｄ）として生化学的作用が公知のものを用いる場合は、例えば、従来報告されている該生化学的作用をより詳細に評価したり、その評価結果に基づいて、より優れた生化学的作用を奏する物質を検索したりすることができる。

被験物質（Ｄ）として生化学的作用が未知のものを用いる場合は、例えば、目的に応じた生化学的作用を奏する物質を検索することができたり、そのようにして見出された物質を適宜の用途に供したりすることができる。

本発明のスクリーニング方法では、例えば、次のような細胞増殖因子促進剤や細胞増殖因子阻害剤を見出すことができる。

上記第三の生化学的評価方法により、次のように評価される細胞増殖因子阻害剤。
・細胞増殖因子（Ｃ）が活性化されたＷｎｔ／β−カテニン経路に抑制的に作用し、かつ、被験物質（Ｄ）が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）によりＷｎｔ／β−カテニン経路を活性化された毛乳頭細胞（Ａ）における細胞増殖因子（Ｃ）の作用を阻害する場合は、前記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」が、対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」よりも大きいと評価される。

このような細胞増殖剤阻害剤は、誤差範囲の結果を除くことや、細胞への毒性の考慮等の観点から、前記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」が、前記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対して、約１．２倍以上であることが好ましく、約１．４倍以上であることがさらに好ましい。
・細胞増殖因子（Ｃ）が活性化されたＷｎｔ／β−カテニン経路に促進的に作用し、かつ、被験物質（Ｄ）が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）によりＷｎｔ／β−カテニン経路を活性化された毛乳頭細胞（Ａ）における細胞増殖因子（Ｃ）の作用を阻害する場合は、前記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」が、前記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」よりも小さいと評価される。

このような細胞増殖剤阻害剤は、誤差範囲の結果を除くことや、細胞への毒性の考慮等の観点から、前記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」が、前記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対して、約０．８５倍以下であることが好ましく、約０．７５倍以下であることがさらに好ましい。

上記第三の生化学的評価方法により、次のように評価される細胞増殖因子作動薬。
・細胞増殖因子（Ｃ）が活性化されたＷｎｔ／β−カテニン経路に促進的に作用し、かつ、被験物質（Ｄ）が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）によりＷｎｔ／β−カテニン経路を活性化された毛乳頭細胞（Ａ）における細胞増殖因子（Ｃ）の作用を促進する場合は、前記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する前記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、前記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する前記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」よりも大きいと評価される。

このような細胞増殖剤作動薬は、誤差範囲の結果を除くことや、細胞への毒性の考慮等の観点から、前記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」が、前記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対して、約１．２倍以上であることが好ましく、約１．４倍以上であることがさらに好ましい。
・細胞増殖因子（Ｃ）が活性化されたＷｎｔ／β−カテニン経路に抑制的に作用し、かつ、被験物質（Ｄ）が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）によりＷｎｔ／β−カテニン経路を活性化された毛乳頭細胞（Ａ）における細胞増殖因子（Ｃ）の作用を促進する場合は、前記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する前記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、前記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する前記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」よりも小さいと評価されることを特徴とする細胞増殖因子作動薬。

このような細胞増殖因子作動薬は、誤差範囲の結果を除くことや、細胞への毒性の考慮等の観点から、上記評価方法において、前記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する前記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、前記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する前記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対して、約０．８５倍以下であることが好ましく、約０．７５倍以下であることがさらに好ましい。

以下、本発明のスクリーニング方法の具体例を説明する。

［治療薬のスクリーニング］
ＦＧＦのうち、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−５は、毛乳頭細胞の細胞増殖度を上昇させるように作用する。

そして、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−５の毛乳頭細胞の細胞増殖度を上昇させる作用を抑制する物質は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−５に対するＦＧＦ阻害剤として機能する。従って、本発明のスクリーニング方法において、細胞増殖因子（Ｃ）としてのＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−５を用い、細胞増殖度を評価して、該細胞増殖度を低下させる作用を有する被験物質（Ｄ）をスクリーニングすれば、例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−５を原因として発生する悪性新生物の治療薬を好適にスクリーニングできる。また、上述したように、細胞増殖度とＡＬＰ活性を組み合わせることにより、他に、「増殖」と「転移」の両方を抑制する物質、あるいは、「増殖」は抑えないが「転移」は抑えるタイプの治療薬が好適にスクリーニングできる。それとは反対に、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−５の毛乳頭細胞の細胞増殖度を上昇させる作用を促進させる作用する物質を同様にスクリーニングすれば、例えば、細胞増殖を促進させることで創傷の治癒効果を高めるなどの効能を有する創傷治癒薬を好適にスクリーニングでき、本発明のスクリーニング方法は、治療薬などの医薬品などの開発に好適である。

［育毛剤・養毛剤のスクリーニング］
本発明のスクリーニング方法によれば、毛包の毛周期における成長期の延長（換言すれば退行期への移行遅延）する効果を奏する育毛活性物質を、公知のものの中からより効率的に絞り込んだり、新規のものを見出したりすることができる。

上述のＦＧＦのうち、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、上述の通り、毛乳頭細胞の細胞増殖度を上昇させるように作用する上、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、皮膚あるいは毛包を構成する皮膚線維芽細胞および上皮系細胞を増殖、活性化させるように作用するのでＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の毛乳頭細胞（Ａ）の細胞増殖度を上昇させる作用を促進させる作用する物質をスクリーニングすれば、育毛作用、養毛作用あるいは発毛促進作用を奏する物質を好適にスクリーニングでき、本発明のスクリーニング方法は、育毛剤、養毛剤あるいは発毛促進剤などの開発に好適である。

また、ＦＧＦ−５については、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は同様、毛乳頭細胞（Ａ）の細胞増殖度を評価の指標としてスクリーニングすることができる。その一方で、上述の通り、本発明者らにより、ＦＧＦ−５を活性化毛乳頭細胞（Ａ）に添加することで、ＦＧＦ−５を活性化毛乳頭細胞（Ａ）に添加しない場合に比較して、明らかに毛乳頭細胞のＡＬＰ活性を低下させることができるという、活性化毛乳頭細胞（Ａ）へのＦＧＦ−５添加による新たな効果が見出されている。さらには、本発明者らにより、ＡＬＰ活性は毛乳頭細胞（Ａ）における成長期のマーカー酵素であることから、ＦＧＦ−５が毛乳頭細胞（Ａ）に作用してＡＬＰ活性を低下させ、毛包の成長期を終了させる（退行期へ導く）ことが裏付けられている。よって、本発明者らによって発見されたこの新規事象を応用することで発毛・育毛効果を評価できる。即ち、本発明の第二の生化学的評価方法を利用した本スクリーニング方法を実施するにあたり、ＦＧＦ−５により低下した活性化毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性の回復度に注目して、活性化毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性を回復する作用を奏する物質を探索することでも、育毛活性物質をスクリーニングできる。

例えば、ＦＧＦ−５により低下した活性化毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性が回復（上記第二の生化学的評価方法において、活性化毛乳頭細胞（Ａ）の細胞当たりのＡＬＰ活性値が上昇したり、被験物質（Ｄ）の濃度の上昇に対する細胞当たりのＡＬＰ活性率の低下度が低い）場合には、その被験物質（Ｄ）は、ＦＧＦ−５の毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性を低下させるという作用を抑制あるいは阻害していると考えられ、育毛活性物質として有用であると評価できる。

本発明のスクリーニング方法では、例えば、次のような育毛活性物質を見出すことができる。

上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」が、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性値」よりも大きいと評価される育毛活性剤。

このような育毛活性剤は、誤差範囲の結果を除くことや、細胞への毒性の考慮等の観点から、上記評価方法において、前記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」が、前記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対する前記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）の「細胞増殖度および／またはＡＬＰ活性」に対して、約１．２倍以上であることが好ましく、約１．４倍以上で倍であることがさらに好ましい。

［スクリーニングにより見出される物質とその用途］
上記細胞増殖因子促進剤や細胞増殖因子阻害剤の具体例として、ＦＧＦ阻害剤および育毛活性物質を以下に説明する。

［活性物質の用途］
ＦＧＦ阻害剤としては、フィチン酸、ピーカンナッツ抽出液、ヒバマタ抽出液、及び、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの共重合体が見出された。

これら物質は、本発明のスクリーニング方法により、ＦＧＦ阻害作用が認められた物質であるので、これら物質をＦＧＦ阻害剤の用途に供することに応用することが考えられ、具体的にはＦＧＦまたはＦＧＦＲの機能異常を原因とする癌に対する抗癌剤の用途に供することが考えられる。

さらに、これら物質は、後述の実施例に示すように、ＦＧＦ−５による毛乳頭細胞（Ａ）のＡＬＰ活性の低下を抑制することが本発明のスクリーニング方法を行う過程で確認されたものである。これら物質が細胞増殖因子に対して阻害剤として働くことや細胞増殖因子阻害剤として用いることができることは従来知られていない（ただし、フィチン酸のみを有効成分とするＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２阻害剤を除く）。この例は、本発明のスクリーニング方法により、新規細胞増殖因子阻害剤が見出された一例である。

また、当該４物質は、ＦＧＦ−５阻害作用が見出されていることから、育毛活性物質としても有効であるので、これら４物質は、有効成分として育毛剤或いは化粧料組成物の用途に供することができる。これら４物質のうち、少なくとも、ピーカンナッツ抽出液、ヒバマタ抽出液、及び、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの共重合体については、従来育毛剤の用途に供することができることは知られていない。

育毛剤の剤形としては、例示的にクリーム、ローション（アルコールベース）、ローション（水系ベース）、エマルジョン、オイル、ドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）製剤、注射用製剤、経皮吸収用製剤等が挙げられる。また、化粧料組成物はシャンプー、リンス、コンディショナー、頭皮ケア用エッセンス、ヘアカラー、ヘアマニキュア、ヘアカラートリートメント、ヘアミスト、ヘアオイル等が挙げられる。

なお、上記４物質の詳細については、次の通りである。

フィチン酸は、イノシトール（ｍｙｏ−イノシトール）の６個の水酸基が全てリン酸エステル化した構造を有するのでイノシトール（ｍｙｏ−イノシトールでも良い）−１，２，３，４，５，６−六リン酸、イノシトール六リン酸、ＩｎｓＰ６またはＩＰ６ともいう。フィチン酸は築野食品工業株式会社から市販されている他、金属塩のものが知られており、ナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩がシグマ社から市販されている。このうち、水あるいは溶剤に溶解するものが好ましく、即ち、フィチン酸、フィチンナトリウム塩およびフィチンカリウム塩が好ましい。

ピーカンナッツ抽出液は、クルミ科ペカン（学術名：Carya illinoinensis）の種子殻から水または含水溶剤で抽出することで製造され、商品としてはピーカンナッツエキスＢＧ（日油株式会社製）がある。また、ピーカンナッツエキスＰＷ（日油株式会社）のような抽出粉末を水または含水溶剤に溶解して調製してもよい。

ヒバマタ抽出液は、褐藻類ヒバマタ科ブラダーラック（英名：bladder wrack、学術名：Fucus vesiculosis）の全藻から水または含水溶剤で抽出することで製造され、商品としてはカイソウ抽出液、カイソウ抽出液ＢＧ―Ｊおよびカイソウ抽出液ＬＡ―Ｊ（丸善製薬株式会社製）等がある。

２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの共重合体は、カチオン性の強い両イオン性ポリマーであり、その水溶液品としてリピジュア―Ｃ（日油株式会社製）がある。

また、育毛剤、化粧料組成物について具体的に説明すれば次の通りである。

本発明の育毛剤は、上記４物質のうちの少なくとも１種を有効成分として含有する。同様に、本発明の化粧料は、上記４物質のうちの少なくとも１種を有効成分として含有する。本発明の育毛剤および化粧料組成物は、上記有効成分と共に、下記成分を所定量、常法に従って混合などの操作を施すことにより製造することができる。

本発明の育毛剤および化粧料には、上記必須成分の他に上記抽出物の作用を損なわない範囲で、油性成分、ヒアルロン酸、セラミドなどの保湿剤、α−トコフェロール、アスコルビン酸誘導体などの抗酸化剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、局所刺激剤、毛包賦活剤、香料、色素、防菌防黴剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、賦形剤、清涼剤などの一般的な育毛剤用添加物を任意に組合せて適宜、含有させることができる。さらにキレート化剤などの安定化剤、経皮吸収促進剤なども加えてよい。

本発明の育毛剤における、育毛剤全量に対する上記有効成分の添加量は、用いる有効成分の種類、形状、抽出処理の有無、抽出溶媒および抽出条件、抽出後の処理などにより異なるが、上記商品を特に処理せずにそのまま有効成分として用いる場合は、育毛剤全量に対して有効成分の最終濃度が通常０. １〜１０％となる量で配合する。

また、頭皮状態の正常化に有効とされる他の育毛促進成分を併用することにより、育毛・養毛効果の相乗作用を図ることもできる。この目的には、常用の血行促進剤、抗脂漏剤、角質溶解剤などがある。

本発明の育毛剤は、症状や体質に関わらず育毛を促進し、著しい抜毛の改善、治療、種々の脱毛症にも顕効を発揮する。また適用の主な対象は、ヒトの頭髪であるが、イヌ、ネコ、カナリヤ、インコといった愛玩動物の毛並み改善などにも使用できる。さらに毛を採取するか、毛皮を利用するメンヨウ、カシミヤ山羊、アルパカ、アンゴラウサギ、ミンク、キツネなどの動物にも適用して発育毛を促進し毛の色つやを良くすることで、毛または毛皮製品の品質を高める一助となる。

本発明の化粧料組成物における、化粧料全量に対する上記有効成分の添加量は、用いる有効成分の種類、形状、抽出処理の有無、抽出溶媒および抽出条件、抽出後の処理などにより異なるが、上記商品を特に処理せずにそのまま有効成分として用いる場合は、育毛剤全量に対して有効成分の最終濃度が通常０．００１〜５％となる量で配合する。

本発明の化粧料組成物は、特に、頭髪および体毛の維持・伸長を目的とする化粧料に適する。

以下、本発明について実施例を挙げてさらに説明するが、本発明はこのような実施例にのみに限定されるものではない。

なお、特に断りがない限り、圧力条件は常圧（約０．１０２４MPa）とする。また、常温とは約２５℃とする。

以下において、細胞培養用プレートのウェル内に添加した成分の構成に応じて、各ウェルを評価区ウェル、対照区ウェル、評価基準区ウェル、対照基準区ウェル、参考評価区ウェル、参考対照区ウェルおよびバックグラウンド測定区ウェルという用語を用いて表す。評価区ウェルとは、上記評価用毛乳頭細胞を得る細胞培養を行うウェルである。対照区ウェルとは、上記対照用毛乳頭細胞を得る細胞培養を行うウェルである。評価基準区ウェルとは、上記評価基準用毛乳頭細胞を得る細胞培養を行うウェルである。対照基準区ウェルとは、上記対照基準用毛乳頭細胞を得る細胞培養を行うウェルである。参考評価区ウェル、参考対照区ウェルは参考用のウェルである。バックグラウンド測定区ウェルとは、評価区ウェル、対照区ウェル、評価基準区ウェル、対照基準区ウェル、参考評価区ウェル、参考対照区ウェル内のアッセイ用細胞培養後の毛乳頭細胞の吸光度を求めるために、それらウェルの吸光度からバックグラウンドを差し引くために使用するウェルである。

また、下記実施例で用いた成分の詳細は、下記の通りである。
・ＤＭＥＭ培地：商品名 D-MEM High Glucose。和光純薬工業株式会社製。
・１０％ウシ胎児血清：商品名 Certified Foetal Bovine Serum。Biological Industries社製。
・抗生物質：ペニシリン−ストレプトマイシン混液。和光純薬工業株式会社製。
・Ｗｎｔ３ａ：商品名 Wnt3a murine recombinant。ペプロテック社製。
・ＧＳＫ−３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸ：カルビオケム社製。
・塩化リチウム：シグマ社製。
・Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ ８（商品名）：株式会社同仁化学研究所製。
・ジエタノールアミン緩衝液：商品名 DEA Buffer Concentrate (10X)。和光純薬工業株式会社製。原液を精製水で10倍に希釈して使用した。
・ｐ−ニトロフェニルリン酸：シグマ社製。
・ワレモコウエキス：ジユ抽出液-R。Sanguisorba officinalisの根茎部の50%エタノール水溶液抽出物。丸善製薬株式会社製。後述の表３に記載の最終濃度となるように、原液を後述のアッセイ用細胞培養用培地で適宜希釈して使用した。
・ツバキ種子エキスＢＧ（商品名）：Camellia japonica種子の50% 1,3-ブチレングリコール水溶液抽出物。日油株式会社製。後述の表３に記載の最終濃度となるように、原液を後述のアッセイ用細胞培養用培地で適宜希釈して使用した。
・β−グリチルレチン酸：丸善製薬株式会社製。１００％エタノールを用いて濃度１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作製し、後述の表３に記載の最終濃度となるように、ストック溶液を後述のアッセイ用細胞培養用培地で適宜希釈して使用した。
・ピーカンナッツエキスＢＧ（商品名）：Carya illinoensis種子殻の熱水成分固形分（熱水抽出して得られた抽出物中の固形分）を30% 1,3-ブチレングリコール水溶液に溶解したもの。日油株式会社製。後述の表４に記載の最終濃度となるように、原液を後述のアッセイ用細胞培養用培地で適宜希釈して使用した。
・ヒバマタ抽出液：商品名 カイソウ抽出液。Fucus vesiculosus全藻の50%エタノール水溶液抽出物。丸善製薬株式会社製。後述の表４に記載の最終濃度となるように、原液を後述のアッセイ用細胞培養用培地で適宜希釈して使用した。
・フィチン酸ナトリウム：シグマ社製。精製水を用いて濃度１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作製し、後述の表４に記載の最終濃度となるように、ストック溶液を後述のアッセイ用細胞培養用培地で適宜希釈して使用した。
・２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの共重合体：商品名 リピジュア−Ｃ。日油株式会社製。後述の表４に記載の最終濃度となるように、原液を後述のアッセイ用細胞培養用培地で適宜希釈して使用した。
・エタノール：小堺製薬株式会社製。濃度99.5％。
・オリーブスクワラン（商品名）：スクワラン、高級アルコール工業株式会社製。
・オレイン酸オクチルドデシル：進栄化学株式会社製。
・トリオレイン酸ソルビタン：日油株式会社製。
・ベヘニルアルコール：東邦化学工業株式会社製。
・パラフィンワックス：日興リカ株式会社製。
・１,３−ブタンジオール：ダイセル化学工業株式会社製。
・防腐剤：メチルパラベン、みどり化学株式会社製。
・ポリオキシエチレンラウリル硫酸トリエタノールアミン塩：日油株式会社製。
・ラウリン酸ジエタノールアミド：日油株式会社製。
・ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン：日油株式会社製。
・エチレングリコールジステアレート：日油株式会社製。
・ヒバマタ抽出液：商品名 カイソウ抽出液。丸善製薬株式会社製。
・カチオン化セルロース：商品名 カチナールHC-100。東邦化学工業株式会社製。
・安息香酸ナトリウム：ＤＳＰ五協フード＆ケミカル株式会社製。
・０．１％トリプシン：製造元：和光純薬工業株式会社。
・０．２％エチレンジアミン四酢酸：製造元：和光純薬工業株式会社。

［実施例１］毛乳頭細胞に対するWnt系活性化物質の反応
毛乳頭を採取するために、脱毛症ではない通常の毛髪成長を示す健常人(男性、３２歳)の毛髪をピンセットを用いてつかみ、頭皮から引き抜いた。これにより、おおよそ１００本に１本の割合で毛乳頭付の毛包が付着した毛髪を得ることができた。ピンセットを用いて毛乳頭付の毛包を該毛髪から分離して生理食塩水内に移し、顕微鏡下に移動した。顕微鏡下で、ピンセットとメスを用いて、毛包から毛乳頭のみを単離した。さらに、単離した毛乳頭２０００ｃｅｌｌｓ／ウェルを３５ｍｍディッシュ（細胞培養皿）へ移動し、培地成分などを添加した原料用細胞培養用培地１〜２ｍｌを加えて、細胞培養を開始した。該原料細胞培養用培地は、ＤＭＥＭ培地（該原料細胞培養用培地の約９０％）、１０％ウシ胎児血清（最終濃度：１０％）、ＦＧＦ２（最終濃度：１０ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（最終濃度：１μｇ／ｍｌ）から構成されるものであり、ウェル内の合計容量は２ｍｌであった。細胞培養は、３７℃で１４日間以上行った。初代培養では、毛乳頭からヒト毛乳頭細胞が広がり、該ヒト毛乳頭細胞が増殖した。ヒト毛乳頭細胞が３５ｍｍディッシュの面積の４割を占めるまで増殖したところで、次の継代培養を行った。継代培養は、一度細胞培養用培地を３５ｍｍディッシュから取り除き、３５ｍｍディッシュ内のヒト毛乳頭細胞を生理食塩水（室温保管時の温度）２ｍｌで一度洗浄してから、該３５ｍｍディッシュ内に０．１％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ混合溶液１ｍｌを加えて３７℃で４分間放置し、該３５ｍｍディッシュから解離したヒト毛乳頭細胞を回収し、新たな１００ｍｍディッシュへ回収したヒト毛乳頭細胞を播種して、上記初代培養と同様の細胞培養条件で毛乳頭細胞の培養を繰り返し行った（但し、ヒト毛乳頭細胞が１００ｍｍディッシュの面積の７〜８割を占めるまで増殖したところで、次の継代培養を行った）。継代培養を繰り返すことでスクリーニングに対応できる細胞数のヒト毛乳頭細胞を得ることができた。以降の操作には、最後の継代培養後、上記のように生理食塩水で洗浄して１００ｍｍディッシュから解離して得たヒト毛乳頭細胞を使用した。

次いで、ＤＭＥＭ培地４４５ｍｌに１０％ウシ胎児血清５０ｍｌおよび抗生物質５ｍｌを添加して得られたアッセイ用細胞培養用培地５００ｍｌに、上記の通り調製したヒト毛乳頭細胞５×１０⁵ｃｅｌｌｓを懸濁して、細胞懸濁液を得た。

次いで、９６穴（ウェル）の細胞培養用プレート（ベクトン・ディッキンソン社製。以下同じ。）を用意し、ウェル内の成分構成が下記表1に示した成分構成となるように、各ウェルに細胞懸濁液およびＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤を添加し、評価区ウェルＸ１−１〜１−３および対照区ウェルＸ２を作成した。但し、評価区ウェルＸ１−１〜１−３への各成分の添加は、上記細胞培養用培地、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤を上記細胞培養用培地に溶かした活性化剤溶液、上記細胞懸濁液を、この順番で加えることで行った。対照区ウェルＸ２の場合は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤の添加を省略した以外は試験区と同様に行った。また、ＤＭＥＭ培地０．１ｍＬのみを添加したバックグラウンド測定区ウェルも別途作成した。

このような細胞培養用プレートを用いて、３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で３日間、細胞培養を行った。

細胞培養終了後、各ウェルにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ ８を１０μｌ添加して、１時間発色反応を行なった。発色反応終了後の細胞培養用プレートを、マイクロプレートリーダー（商品名 マイクロプレートリーダー−６８０。バイオラッド社製。以下同じ。）に供して、評価区ウェルＸ１−１〜１−３、対照区ウェルＸ２およびバックグラウンド測定区ウェルの波長４５０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定した。次いで、試験区ウェルの吸光度からバックグラウンド測定区の吸光度を減じた値を求めて評価区ウェルＸ１−１〜１−３のヒト毛乳頭細胞の吸光度（評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）の細胞数）とし、対照区ウェルの吸光度からバックグラウンド測定区の吸光度を減じた値を求めて対照区ウェルＸ２のヒト毛乳頭細胞の吸光度（対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）の細胞数）とした。そして、評価区ウェルＸ１−１〜１−３のヒト毛乳頭細胞の吸光度を、対照区ウェルＸ２のヒト毛乳頭細胞の吸光度を１とした時の相対値でそれぞれ表して、評価区ウェルＸ１−１〜１−３の細胞増殖度を評価した。

式で表せば、次の通りである．
細胞増殖度（ａ．ｕ．）＝（評価区ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）−バックグラウンド測定区の吸光度（４５０ｎｍ））／（対照区ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）−バックグラウンド測定区の吸光度（４５０ｎｍ））
次いで、９６穴の細胞培養用プレート内の評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）および対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）を、生理食塩水（室温保管時の温度）１００ｍＬを用いて２回に分けて洗浄した後、洗浄後の評価用毛乳頭細胞（Ｘ１）および対照用毛乳頭細胞（Ｘ２）を−８０℃で５分間凍結後、常温で約５分間かけて自然融解する操作を各ウェル内で３度繰り返した。次いで、各ウェル内に、１Ｍジエタノールアミン緩衝液を用いて調製したｐ−ニトロフェニルリン酸の溶液（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ加えて、３７℃で３０分間反応を行った。反応終了後の細胞培養用プレートをマイクロプレートリーダーに供して、波長４９０ｎｍにおける吸光度をウェル毎に測定した。細胞の含まれていない点のみ異なる成分構成のバックグラウンド測定区ウェルについても同様に、洗浄、融解、反応を行って、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。次いで、評価区ウェルＸ１−１〜１−３の吸光度からバックグラウンド測定区の吸光度を減じた値を求めて評価区ウェルＸ１−１〜１−３のヒト毛乳頭細胞の吸光度とし、対照区ウェルＸ２の吸光度からバックグラウンド測定区の吸光度を減じた値を求めて対照区ウェルＸ２のヒト毛乳頭細胞の吸光度とした。そして、評価区ウェルＸ１−１〜１−３のヒト毛乳頭細胞の吸光度を、対照区ウェルＸ２のヒト毛乳頭細胞の吸光度を１とした時の相対値でそれぞれ表して、評価区ウェルＸ１−１〜１−３のＡＬＰ活性を評価した。

式で表せば、次の通りである。

ＡＬＰ活性値（ａ．ｕ．）＝（評価区ウェルの吸光度（４９０ｎｍ）−バックグラウンド測定区の吸光度（４９０ｎｍ））／（対照区ウェルの吸光度（４９０ｎｍ）−バックグラウンド測定区の吸光度（４９０ｎｍ））
また、上記評価区ウェルＸ１−１〜１−３および対照区ウェルＸ２のそれぞれについて、ＡＬＰ活性値を上記細胞増殖度で除することで得られた細胞当りのＡＬＰ活性値を求め、細胞当りのＡＬＰ活性値を求めた。そして、評価区ウェルＸ１−１〜１−３の細胞当りのＡＬＰ活性値を、上記対照区ウェルＸ２の細胞当りのＡＬＰ活性値を１とした場合の相対値で表した値を用いて、ヒト毛乳頭細胞のＡＬＰ活性に対するＷｎｔ／β−カテニン経路活性化剤の作用を評価した。

式で表せば、次の通りである。

細胞当たりのＡＬＰ活性値（ａ．ｕ．／ａ．ｕ．）＝（評価区ウェルのＡＬＰ活性値／評価区ウェルの細胞増殖度）／（対照区ウェルのＡＬＰ活性値／対照区ウェルの細胞増殖度）
結果を下記表１および図１（ａ）〜（ｃ）に示す。

図８（ａ）〜（ｃ）に示すように、Ｗｎｔ系活性化物質であるＷｎｔ３ａ、ＧＳＫ−３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸ、あるいは、塩化リチウムを添加した評価区ウェルＸ１−１〜１−３では、細胞当りのＡＬＰ活性が、対照区ウェルＸ２の細胞当りのＡＬＰ活性に比べて、２倍〜５倍高かった。

［実施例２］活性型毛乳頭細胞に対するＦＧＦ−５の反応
実施例１において、細胞懸濁液、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤に加えて、ＦＧＦ−５、へパリンを用い、下記表２−１〜２−３に記載の通りにウェルの構成と各ウェル内の成分構成を変更した以外は、実施例1と同様の方法で細胞培養用プレートを作成し、評価区ウェルＹ１−１〜１−５、対照区ウェルＹ２−１〜２−３、参考評価区ウェル１、参考対照区ウェル１、およびバックグラウンド測定区ウェルが作成された細胞培養用プレートを得た。但し、評価区ウェルへの各成分の添加は、上記細胞培養用培地、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤を上記細胞培養用培地に溶かした活性化剤溶液、ＦＧＦ−５・へパリン剤を上記細胞培養用培地に溶かした溶液、上記細胞懸濁液を、この順番で加えることで行った。参考評価区ウェル１の場合は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤の添加を省略した以外は評価区と同様に行い、参考対照区ウェル１の場合は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤およびヘパリンの添加を省略した以外は評価区と同様に行った。また、上記各評価区Ｙ１−１〜１−５、対照ウェルＹ２−１〜２−３、参考試験区１および参考対照区ウェル１の比較対照関係は、表２−１〜２−３の注釈に示した通りである。

次いで、得られた細胞培養用プレートを用いて、実施例１と同様の方法で、細胞培養、発色反応を行い、波長４５０ｎｍにおける吸光度を上記ウェル毎に測定し、細胞増殖度を求め、評価区ウェルＹ１−１〜１−５、対照区ウェルＹ２−１〜２−３、参考評価区ウェル１、参考対照区ウェル１の細胞増殖度を評価した。

次いで、細胞増殖度を求めた後の細胞培養用プレートを用いて、実施例１と同様の方法で、ウェル内の細胞の洗浄、凍結、融解および反応を行った後、波長４９０ｎｍにおける吸光度をウェル毎に測定し、評価区ウェルＹ１−１〜１−５、対照区ウェルＹ２−１〜２−３、参考評価区ウェル１、参考対照区ウェル１のＡＬＰ活性値および細胞当りのＡＬＰ活性値を求め、評価区ウェルＹ１−１〜１−５、対照区ウェルＹ２−１〜２−３、参考評価区ウェル１、参考対照区ウェル１のＡＬＰ活性を評価した。

なお、参考評価区ウェル１および参考対照区ウェル１の細胞増殖度、ＡＬＰ活性値および細胞当りのＡＬＰ活性値は、実施例１の評価試験区ウェルの細胞増殖度、ＡＬＰ活性値および細胞当りのＡＬＰ活性値を求め方において、評価区ウェルを参考評価区ウェル１あるいは参考対照区ウェルに読み替えて行った。

結果を下記表２−１〜２−３および図９（ａ）〜（ｅ）に示す。

図９（ａ）〜（ｅ）に示すように、ＦＧＦ−５による細胞当りのＡＬＰ活性の低下が全評価区で確認された。その中でも、Ｗｎｔ系活性化物質である、Ｗｎｔ３ａ、ＧＳＫ−３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸ、または、塩化リチウムが添加された評価区Ｙ１−１〜１−５では、ＦＧＦ−５による細胞当りのＡＬＰ活性がより顕著に低下していた。さらに、ＦＧＦ−５と同時にへパリンを加えた評価区では、ＦＧＦ−５による細胞当りのＡＬＰ活性が大幅に低下していた（評価区Ｙ１−４v.s.評価区Ｙ１−５）。

［実施例３］活性型毛乳頭細胞およびＦＧＦ−５を併用したＡＬＰ活性評価法のスクリーニング有効性の評価
実施例１において、細胞懸濁液、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤に加えて、ＦＧＦ−５、へパリン、被験物質を用い、ウェルの構成と各ウェル内の成分構成を変更した以外は、ウェルの構成と各ウェル内の成分構成を下記表３に記載の通り変更した以外は、実施例1と同様の方法で、評価区ウェルＺ１−１〜１−２５、評価基準区ウェルＺ２−１〜２−５、対照区ウェルＺ３−１〜３−２５および対照基準区ウェルＺ４−１〜４−５が作成された細胞培養用プレートを得た。但し、評価区ウェルへの各成分の添加は、被験物質を上記細胞培養用培地に溶かした溶液、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤を上記細胞培養用培地に溶かした活性化剤溶液、ＦＧＦ−５・へパリン剤を上記細胞培養用培地に溶かした溶液、上記細胞懸濁液を、この順番で加えることで行った（被懸物質を用いない場合は被懸物質を省略した）。対照区ウェルの場合は、ＦＧＦ−５の添加を省略した以外は評価区と同様に行った。

次いで、得られた細胞培養用プレートを用いて、実施例１と同様の方法で、細胞培養、発色反応を行い、波長４５０ｎｍにおける吸光度をウェル毎に測定し、細胞増殖度を求め、試験区ウェルの細胞増殖度を評価した。

次いで、細胞増殖度を求めた後の細胞培養用プレートを用いて、実施例１と同様の方法で、ウェル内の細胞の洗浄、凍結、融解および反応を行った後、波長４９０ｎｍにおける吸光度をウェル毎に測定し、各評価区ウェル、評価基準区ウェル、対照区ウェルおよび対照基準区のＡＬＰ活性値および細胞当りのＡＬＰ活性値を求めた。

さらに、試験区ウェル及び対照区ウェルにおいて、被験物質を添加した態様の細胞当りのＡＬＰ活性値を、被験物質を添加していないウェル（評価基準区ウェルおよび対照基準区）の細胞当りのＡＬＰ活性値を１００％とした場合の相対値を求めた（便宜上百分率で表すが、細胞当りのＡＬＰ活性値を１とした場合の相対値で表しても同じ評価結果である）。

式で表せば、次の通りである。

細胞当りのＡＬＰ活性率（％）＝（被験物質を添加した態様の細胞当りのＡＬＰ活性値）／（被験物質を添加していない態様の細胞当りのＡＬＰ活性値）
そして、試験区ウェルの被験物質の添加量に対する細胞当たりのＡＬＰ活性率の変化と対照区ウェルの被験物質の添加量に対する細胞当たりのＡＬＰ活性率の変化とを比較することにより、被験物質のＦＧＦ−５に対する作用（阻害効果や促進効果）を評価した。結果を下記表３−１〜３−４および図１０（ａ）〜（ｄ）に示す。

上記評価の結果、評価区ウェル（ＦＧＦ−５添加）の細胞当たりのＡＬＰ活性率と対照区ウェル（ＦＧＦ−５不添加）の細胞当たりのＡＬＰ活性率とが同様に変化している場合は、細胞当たりのＡＬＰ活性率の変化にＦＧＦ−５の有無は関与せず、ＡＬＰ活性率は被験物質の添加量に応じて変化していると考えられる。

評価区ウェル（ＦＧＦ−５添加）の細胞当たりのＡＬＰ活性率が対照区ウェル（ＦＧＦ−５不添加）の細胞当たりのＡＬＰ活性率を下回る場合は、被験物質の添加量以外にも、細胞当たりのＡＬＰ活性率を低下させる因子が存在することを示していると考えられる。評価区ウェルと対照区ウェルの相違はＦＧＦ−５の有無であるので、評価区ウェルの細胞当たりのＡＬＰ活性率が対照区ウェルの細胞当たりのＡＬＰ活性率に比べて低下するのは、被験物質がＦＧＦ−５の細胞当たりのＡＬＰ活性を低下させる作用を促進しているためと考えられる。

評価区ウェル（ＦＧＦ−５添加）の細胞当たりのＡＬＰ活性率が対照区ウェル（ＦＧＦ−５不添加）の細胞当たりのＡＬＰ活性率を上回る場合は、被験物質の添加量以外にも、細胞当たりのＡＬＰ活性率の低下を抑制する因子が存在することを示していると考えられる。評価区ウェルと対照区ウェルの相違はＦＧＦ−５の有無であるので、評価区ウェルの細胞当たりのＡＬＰ活性率の低下が対照区ウェルの細胞当たりのＡＬＰ活性率の低下に比べて抑制されるのは、被験物質が細胞当たりのＦＧＦ−５のＡＬＰ活性率の低下を抑制しているためと考えられる。

図３に示すように、一般に育毛剤成分の溶剤として用いられるエタノールでは、ＦＧＦ−５を添加した評価区ウェルの細胞当たりのＡＬＰ活性率は、ＦＧＦ−５を添加していない対照区ウェルの細胞当たりのＡＬＰ活性率に対して、有意な変化はみられなかった。即ち、エタノールはＦＧＦ−５による毛乳頭細胞のＡＬＰ活性の低下に対して影響を与えていない（ＦＧＦ−５を阻害していない）ことが示された。

また、発毛・育毛効果が従来認められていないツバキ種子エキスでは、ＦＧＦ−５を添加した評価区ウェルの細胞当たりのＡＬＰ活性値は、ＦＧＦ−５を添加していない対照区ウェルの細胞当たりのＡＬＰ活性率に対して、ほとんど差が無いか、または、ＦＧＦ−５を添加していない評価区ウェルの細胞当たりのＡＬＰ活性率よりも低下する傾向があった。即ち、ツバキ種子エキスは、ＦＧＦ−５による毛乳頭細胞のＡＬＰ活性の低下に対して影響を与えていない（ＦＧＦ−５を阻害しない）か、または、ＦＧＦ−５による毛乳頭細胞のＡＬＰ活性の低下を促進する（ＦＧＦ−５の補助剤として作用する）という傾向にあることが示された。

さらに、育毛剤にはよく配合されるが育毛や発毛効果のない抗炎症剤であるβ−グリチルレチン酸についても、ＦＧＦ−５を添加した評価区ウェルのＡＬＰ活性値は、ＦＧＦ−５を添加していない対照区ウェルのＡＬＰ活性率に対して、変化に差がなかった。即ち、β−グリチルレチン酸では、ＦＧＦ−５によるＡＬＰ活性の低下に対する育毛や発毛効果（ＦＧＦ−５阻害効果）は見出されなかった。

これに対して、育毛効果を有する成分として知られるワレモコウエキスでは、ＦＧＦ−５を添加した評価区ウェルのＡＬＰ活性値は、ＦＧＦ−５を添加していない陰性対照区ウェルのＡＬＰ活性率に対して、明らかに高かった。即ち、ＦＧＦ−５によるＡＬＰ活性の低下を緩和する（ＦＧＦ−５の阻害剤として働く）ことが示された。

以上より、本発明の第三の生化学的評価法を利用したスクリーニング方法により、細胞増殖因子の生化学的作用に影響を及ぼす物質をスクリーニングできることが実証された。

［実施例４］活性型毛乳頭細胞およびＦＧＦ−５を併用したＡＬＰ活性評価法のスクリーニング有効性の評価
実施例３において、被験物質を下記表４に記載の通り変更した以外は、実施例３と同様の方法で、各種評価を行った。結果を下記表４−１〜４−４および図１１（ａ）〜（ｄ）に示す。

図１１に示すように、ピーカンナッツエキスＢＧ、カイソウ抽出液、フィチン酸ナトリウム、及び、リピジュア―Ｃは、いずれも、ＦＧＦ−５を添加した評価区ウェルのＡＬＰ活性率が、ＦＧＦ−５を添加していない対照区ウェルのＡＬＰ活性率に対して明らかに高かった。即ち、これら４被験物質はＦＧＦ−５によるＡＬＰ活性の低下を緩和する（ＦＧＦ−５の阻害剤として働く）ことが示された。

上記４被験物質は、ＦＧＦ−５の生化学的作用に対する影響が知られていない物質であるが、本発明の第三の生化学的評価法を利用したスクリーニング方法により、ＦＧＦ−５の生化学的作用に影響を及ぼす物質として確認・検出することができた。

［実施例５］育毛料
まず、下記に示したＡ相とＢ相の各配合成分を、Ａ相、Ｂ相毎に別々の撹拌槽に仕込んで、Ａ相は６５℃で２０分間、Ｂ相は４０℃で１０分間の条件でそれぞれ攪拌して、各配合成分を溶解し、Ａ相とＢ相を調製した。

得られたＡ相、Ｂ相を４５℃に温度調節し、Ａ相全量、Ｂ相全量をホモディスパーを用いて４５℃で３０分間撹拌しながら混合して乳化させた。続いて、室温で３０分間上記混合物を攪拌後、Ｃ相を添加してさらに５分間撹拌してクリーム状の養毛料を得た。
（Ａ相）：
配合成分と配合量（重量％。但し、最終的に得られるクリーム状の養毛料の量を１００重量％とする。）：
オリーブスクワラン １０.０、オレイン酸オクチルドデシル ７.０、トリオレイン酸ソルビタン ３.０、ベヘニルアルコール ３.０、パラフィンワックス ３.０。
（Ｂ相）：
配合成分と配合量（重量％。但し、最終的に得られるクリーム状の養毛料の量を１００重量％とする。）：
１,３−ブタンジオール ５.０、フィチン酸ナトリウム １.０、防腐剤 ０.５、精製水６７。
（Ｃ相）：
配合成分と配合量（重量％。但し、最終的に得られるクリーム状の養毛料の量を１００重量％とする。）：
香料 ０．５。

［実施例６］育毛シャンプー
配合成分 配合量（重量％。但し、最終的に得られる育毛シャンプーを１００重量％とする。）：
ポリオキシエチレンラウリル硫酸トリエタノールアミン塩 １０．０、ラウリン酸ジエタノールアミド ５．０、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン ５．０、エチレングリコールジステアレート ３．０、１,３−ブタンジオール ２．０、ヒバマタ抽出液 １．０、ピーカンナッツ抽出液 １．０、カチオン化セルロース ０．５、安息香酸ナトリウム ０．５、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドの共重合体 ０．３、香料０．５、精製水 残量。

上記配合成分を撹拌槽に仕込み、６５℃で３０分間混合し、その後、さらに３０分間室温で撹拌しながら放冷し、パール感のある育毛シャンプーを得た。

本発明によれば、医薬・化粧料等の用途で幅広く利用されている細胞増殖因子の作動薬あるいは阻害剤の開発が円滑になる。特に、発毛促進剤、育毛剤、あるいは各細胞増殖因子が原因として発生する悪性新生物の治療薬や創傷治癒薬の開発に好適である。さらに本発明で見出された活性物質を有効成分とするＦＧＦ阻害薬、あるいは、髪の成長期を延長させる育毛剤を効率的に製造することが可能となる。

Claims (5)

1. （Ｚ１）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）、細胞増殖因子（Ｃ）、被験物質（Ｄ）およびヘパリンの存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる被験物質評価用毛乳頭細胞と、
   （Ｚ２）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）、細胞増殖因子（Ｃ）およびヘパリンの存在下かつ被験物質（Ｄ）の非存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる被験物質評価基準用毛乳頭細胞と、
   （Ｚ３）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）、被験物質（Ｄ）およびヘパリンの存在下かつ細胞増殖因子（Ｃ）の非存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる被験物質評価対照用毛乳頭細胞と、
   （Ｚ４）Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）およびヘパリンの存在下かつ細胞増殖因子（Ｃ）および被験物質（Ｄ）の非存在下で毛乳頭細胞（Ａ）を細胞培養して得られる被験物質評価対照基準用毛乳頭細胞とを調製し、
   被験物質評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）、被験物質評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）、被験物質評価対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）および対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）のそれぞれについて、ＡＬＰ活性値を測定し、
   上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）のＡＬＰ活性値に対する評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）のＡＬＰ活性値と、
   上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）のＡＬＰ活性値に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）のＡＬＰ活性値とを比較することで、
   被験物質（Ｄ）が、細胞増殖因子（Ｃ）の作用に対して与える影響を評価する生化学的評価方法であって、
   上記Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化剤（Ｂ）は、ＧＳＫ３ ＩｎｈｉｂｉｔｏｒおよびＷｎｔ３ａからなる群より選択される少なくとも１種であり、
   上記細胞増殖因子（Ｃ）はＦＧＦ−５であることを特徴とする生化学的評価方法。
2. 上記被験物質（Ｄ）の量を変えて、上記評価用毛乳頭細胞（Ｚ１）および対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）をそれぞれ少なくとも２種調製し、
   各上記評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）、各上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）のそれぞれについて、ＡＬＰ活性値を測定し、
   被験物質（Ｄ）の量の変化に依存した、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）のＡＬＰ活性値に対する上記評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）のＡＬＰ活性値の変化と、
   被験物質（Ｄ）の量の変化に依存した、上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）のＡＬＰ活性値に対する上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）のＡＬＰ活性値の変化とを
   比較することを特徴とする請求項１に記載の生化学的評価方法。
3. 上記評価用活性化毛乳頭細胞（Ｚ１）、上記評価基準用毛乳頭細胞（Ｚ２）、上記対照用毛乳頭細胞（Ｚ３）および上記対照基準用毛乳頭細胞（Ｚ４）のそれぞれについて、ＡＬＰ活性値とともに細胞増殖度を測定し、上記比較におけるＡＬＰ活性値を、ＡＬＰ活性値を細胞増殖度で除することにより求められる細胞当たりのＡＬＰ活性値に換算することを特徴とする請求項１または２に記載の生化学的評価方法。
4. ヒト由来の正常毛乳頭細胞を使用することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生化学的評価方法。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の生化学的評価方法による試験を実施し、毛乳頭細胞（Ａ）の成長期の延長または退行期への移行遅延の効果を有する育毛活性物質を見出すことを特徴とするスクリーニング方法。

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