JP5334527B2 - 新規微生物、当該新規微生物を用いた廃水処理方法及び廃水処理装置 - Google Patents
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Description
本発明に係る新規微生物は、ウレイバチルス・サーモフィルス(Ureibacillus thermophilus)に属し、高温条件(例えば50〜60℃)においてリン成分を菌体内に蓄積する能力を有している。本発明に係る新規微生物は、5%NaCl条件下で生育せず、ゼラチンを加水分解する点において、ウレイバチルス・サーモフィルス(Ureibacillus thermophilus)に属する微生物として公知のUreibacillus thermophilus HC148 (Accession No. DQ348072)とは異なっている。
なお、本発明に係る新規微生物は、受託番号FERM P-21602で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ菌株に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本発明に係る新規微生物は、上記表1〜3に示す菌学的性質を有し、高温条件(例えば50〜60℃)においてリン成分を菌体内に蓄積する能力を有するウレイバチルス・サーモフィルスを含んでいる。また、本発明に係る新規微生物は、配列番号1に示す塩基配列に対して99.8%を超える相同性を有し、高温条件(例えば50〜60℃)においてリン成分を菌体内に蓄積する能力を有するウレイバチルス・サーモフィルスを含んでいる。
〔実施例1〕新規微生物の単離、同定
(1)環境試料からの微生物単離
活性汚泥サンプルは広島県東広島市廃水処理設備の活性汚泥を用いた。超音波処理を数秒間行って凝集体を分解し、10〜107倍程度の希釈系列を作り2×YT寒天培地に塗布した。2×YT寒天培地の組成は、トリプトン:16g、酵母エキス:10g、NaCl:5g、ゲランガム:15g、蒸留水:1Lとした。
環境試料から得られた高温菌を、12時間60℃で培養した。培養液1mlを、遠心分離(15,000rpm×3min)して菌体を沈殿させた後、1mlの0.8%NaClで洗浄し、1mlの0.8%NaClに再懸濁した。
菌体からのポリリン酸の抽出
菌体培養液1mlを遠心分離(15,000rpm×5min)して菌体を集菌した。沈殿した菌体ペレットに350μlのGITC溶液(4M guanidine isothiocyanate、50mM Tris-HCl、pH7.4)を加えて、90℃、2分間保温した。さらに超音波処理を3分間行って菌体を溶解した。さらに90℃で2分間保温し、30μlの10% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)と300μlの99.5%エタノールを加え、よく混合した後、90℃で2分間保温した。
ポリリン酸の定量はポリリン酸キナーゼ(PPK)を用いてATPに変換し、ATP量として測定した。菌体から調製したポリリン酸溶液4μlに0.5mM ADP溶液2μl、PPK(15μg/ml)1μlおよび3.3×PPK 緩衝液(50 mM HEPES-KOH、40mM(NH4)2SO4、4 mM MgCl2、pH7.2)3μlを加えて、37℃で1時間保温し、ポリリン酸をATPに変換した。
ポリリン酸の蓄積量が多かった株について菌株の同定を行った。菌株の同定は、種間でよく保存されている16S rRNAをコードしている塩基配列をデータベース上で比較する方法をとった。また、形態観察及び生理・生化学試験を行い、当該株の帰属分類群を決定した。
目的とする菌を、12時間、60度で培養し、ペレットにした。567μlのTEを添加し、ピペッティングによってよく懸濁した。30μlの10%SDSと3μlの20mg/mlプロティナーゼKを加え、軽くvortexしてから37度で1時間インキュベートした。5MのNaClを100 ml加え、vortexしてよく混ぜた。CTAB/NaCl溶液を80μl加えてよく混ぜ、65度で10分間インキュベートした。ほぼ等量(700μl程度)のCIを加え、20秒間vortexしてよく混ぜて均一なエマルジョンにし、15,000rpmで5分間、室温で遠心した。遠心後、白い界面が現れた。界面部分をとらないように水層を新しいチューブに移した。ほぼ等量(700μl)のPCIを加え、20秒間vortexしてよく混ぜて均一なエマルジョンにし、再び15,000rpmで5分間、室温で遠心した。上層を新しいチューブに移した。イソプロパノールを0.6容(450μl程度)加え、白いひも状のDNAがはっきり見えるようになるまでチューブをひっくり返して混ぜた。室温で2-10分間静置し、15,000rpmで10-15分間、室温で遠心してDNAを沈殿させた。10μlのTE bufferに溶解させ、10mg/mlのRNase solutionを1μl加え、37度で1時間程度インキュベートした。等量(100μl)のPCIを加え、20秒間vortexして均一なエマルジョンにし、15,000rpmで15秒間、室温で遠心した。上層を新しいチューブに移し、下層に再度100μlのTEを足してvortex、15,000rpmで15秒間遠心し、上層を先にとったものに加えた。この上層200μlに、3M酢酸ナトリウム溶液を20μl、100%エタノールを500μl加えて、よく混ぜた後、室温で2-10分間放置した。15,000rpmで10-15分間遠心し、DNAをペレットにし、上清を除き、70%エタノールを1ml加え、軽く混ぜてDNAを洗浄した。15,000rpmで5分間遠心して再度沈殿させ、上清を取り除き、真空デシケータで、ペレットを乾燥させた。100μlのTEに溶解させ、260nmの吸光度を測定して濃度を決定するとともに、電気泳動によって得られたDNAの分子量をチェックした。
目的とする菌をNutrient agar培地(Oxoid社製)を用いて45℃で24時間培養し、培養した菌体からDNAを抽出し、16s rDNA領域をPCRにより増幅し、その後、配列決定を行った。具体的に、DNA抽出にはInstaGene Matrix(Bio Rad社製)を添付のプロトコールに従って使用した。PCRは、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を添付のプロトコールに従って使用した。サイクルシークエンスには、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムス社製)を添付のプロトコールに従って使用した。使用したプライマーは、「遺伝子解析法 16s rRNA遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編、放線菌の分類と同定88-117pp、日本学会事務センター(2001)」に開示された9F、339F、785F、1099F、536R、802R、1242R及び1510Rを使用した。シークエンスはABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System(アプライドバイオシステムス社製)を添付のプロトコールに従って使用した。配列決定はChromasPro 1.4(Technelysium Pty社製)をを添付のプロトコールに従って使用した。
光学顕微鏡による形態観察及びBARROW et al., "Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria" 3rd edition. 1993. Canibridge University Pressに記載された方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸/ガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵(O/F)について試験を行った。
生理・生化学試験にはAPI50CHB(BioMerieux社製)を使用した。
環境試料中からのポリリン酸蓄積高温菌のスクリーニング
環境試料の懸濁液を2xYTプレートにプレーティングし、60度で培養したところ、活性汚泥サンプルでは102-104倍希釈、土壌試料では10-103倍希釈低度で高温菌のシングルコロニーを得ることが出来た。得られた高温菌を2xYTに植菌し、60℃で培養し、DAPI染色したものを蛍光顕微鏡で観察し、黄色の蛍光を示標にポリリン酸蓄積菌の単離を行った。活性汚泥、土壌から得られた高温菌204コロニーについて試験を行った。その結果、試験した204サンプルのうち黄色の蛍光が観察されたのは22サンプルであった。このうち2株が非常に強い黄色蛍光を示し、5株が比較的強い黄色蛍光を示し、他15株が弱い黄色蛍光を示した。再現性試験をこれらについて行ったところ、試験毎に蛍光強度が変化するものが多く見られ再現性が得られないものがあった。これは、ポリリン酸蓄積が培養条件の違いや細胞の増殖ステージによって変化していることを示している可能性があり、安定的なリン酸の回収システムに使用するには不向きであると考えた。そこで、毎回安定して黄色の蛍光が観察される菌株をポリリン酸高蓄積株の候補株として選択した。
安定してポリリン酸を蓄積して黄色の蛍光を発する株が、どれくらいの量のポリリン酸を蓄積しているかを、ポリリン酸測定を行って調べた。供試株を60℃で培養し、継時的にサンプリングを行い、OD600の値とポリリン酸量を測定した。その結果を図3に示す。図3から判るように、供試株は対数増殖期中期あたりからポリリン酸蓄積量が増加し始め、定常期に一定になった。その値は約100nmol/mg proteinに達した。この蓄積量は、遺伝子操作をしていないバクテリアでは非常に高い値である。供試株は生育と共にポリリン酸を蓄積した。これは大腸菌がアミノ酸飢餓時にポリリン酸を蓄積するのとは、異なる挙動であり興味深い。また、リン酸回収の観点からは、特別な培養条件にする必要がないという点で、利点があると考えられた。
供試株の16s rDNA領域の塩基配列を決定した結果を配列番号1に示した。また、生理・生化学試験の結果を表9〜11に示した。
Claims (8)
- ウレイバチルス・サーモフィルス(Ureibacillus thermophilus)に属し、50〜60℃の条件下でポリリン酸を菌体内に蓄積する能力を有し、受託番号FERM P-21602である微生物。
- リン成分を含む廃水に請求項1記載の微生物を接触させる工程を含む廃水処理方法。
- 上記廃水を50〜60℃とすることを特徴とする請求項2記載の廃水処理方法。
- 上記微生物を接触させた後、廃液中に含まれるリン成分を蓄積した微生物を分離し、分離後の微生物からリン成分を回収する工程を更に含む、請求項2記載の廃水処理方法。
- 硝酸イオンを含む廃水に請求項1記載の微生物を接触させる脱リン槽を備える廃水処理装置。
- 上記廃水の温度を所望の温度に制御する温度制御手段を更に備える、請求項5記載の廃水処理装置。
- 上記温度制御手段は、脱リン槽における廃水の温度を50〜60℃に制御することを特徴とする請求項6記載の廃水処理装置。
- 上記脱リン槽に接続され、廃液中に含まれるリン成分を蓄積した微生物を分離、回収する装置を更に備えることを特徴とする請求項5記載の廃水処理装置。
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