JP2012139216A - 新規微生物、当該新規微生物を用いた廃水処理方法及び廃水処理装置 - Google Patents
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Abstract
【解決課題】クレブシエラ・バリコラ(Klebsiella variicola)に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する新規微生物、又はクレブシエラ(Klebsiella)属若しくはセラチア(Serratia)属に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する新規微生物。
【選択図】なし
Description
(1)微生物単離
土壌サンプルとしては、日本各地の土壌を用いた。土壌サンプルのなかから、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物を含むものを選抜し、その土壌サンプルから生産菌(細菌)の分離を行い、その性質について検討するとともに、新たな有用菌株のスクリーニングを行った。
上記(1)で同定した2株(TB-83及びTB-84)について菌株の同定を行った。菌株の同定は、種間でよく保存されている16S rRNAをコードしている塩基配列をデータベース上で比較する方法をとった。また、形態観察及び生理・生化学試験を行い、当該株の帰属分類群を決定した。
目的とする菌を、12時間、60度で培養し、ペレットにした。567μlのTEを添加し、ピペッティングによってよく懸濁した。30μlの10%SDSと3μlの20mg/mlプロティナーゼKを加え、軽く旋回混合してから37度で1時間インキュベートした。5MのNaClを100ml加え、よく旋回混合した。CTAB/NaCl溶液を80μl加えてよく混ぜ、65度で10分間インキュベートした。ほぼ等量(700μl程度)のCIを加え、20秒間よく旋回混合して均一なエマルジョンにし、15,000rpmで5分間、室温で遠心した。遠心後、白い界面が現れた。界面部分をとらないように水層を新しいチューブに移した。ほぼ等量(700μl)のPCIを加え、20秒間よく旋回混合して均一なエマルジョンにし、再び15,000rpmで5分間、室温で遠心した。上層を新しいチューブに移した。イソプロパノールを0.6容(450μl程度)加え、白いひも状のDNAがはっきり見えるようになるまでチューブをひっくり返して混ぜた。室温で2-10分間静置し、15,000rpmで10-15分間、室温で遠心してDNAを沈殿させた。10μlのTE bufferに溶解させ、10mg/mlのRNase solutionを1μl加え、37度で1時間程度インキュベートした。等量(100μl)のPCIを加え、20秒間よく旋回混合して均一なエマルジョンにし、15,000rpmで15秒間、室温で遠心した。上層を新しいチューブに移し、下層に再度100μlのTEを足してよく旋回混合し、15,000rpmで15秒間遠心し、上層を先にとったものに加えた。この上層200μlに、3M酢酸ナトリウム溶液を20μl、100%エタノールを500μl加えて、よく混ぜた後、室温で2-10分間放置した。15,000rpmで10-15分間遠心し、DNAをペレットにし、上清を除き、70%エタノールを1ml加え、軽く混ぜてDNAを洗浄した。15,000rpmで5分間遠心して再度沈殿させ、上清を取り除き、真空デシケータで、ペレットを乾燥させた。100μlのTEに溶解させ、260nmの吸光度を測定して濃度を決定するとともに、電気泳動によって得られたDNAの分子量をチェックした。
目的とする菌をNutrient agar培地(Oxoid社製)を用いて45℃で24時間培養し、培養した菌体からDNAを抽出し、16s rDNA領域をPCRにより増幅し、その後、配列決定を行った。具体的に、DNA抽出にはInstaGene Matrix(Bio Rad社製)を添付のプロトコールに従って使用した。PCRは、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を添付のプロトコールに従って使用した。サイクルシークエンスには、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムス社製)を添付のプロトコールに従って使用した。使用したプライマーは、「遺伝子解析法 16s rRNA遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編、放線菌の分類と同定88-117pp、日本学会事務センター(2001)」に開示された9F、339F、785F、1099F、536R、802R、1242R及び1510Rを使用した。シークエンスはABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System(アプライドバイオシステムス社製)を添付のプロトコールに従って使用した。配列決定はChromasPro 1.4(Technelysium Pty社製)を添付のプロトコールに従って使用した。
光学顕微鏡による形態観察及びBARROW et al., "Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria" 3rd edition. 1993. Canibridge University Pressに記載された方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸/ガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵(O/F)について試験を行った。生理・生化学試験にはAPI50CHB(BioMerieux社製)を使用した。
本実施例では、実施例1で単離・同定したTB-83及びTB-84のアルコール耐性を、他の微生物と比較した。本実施例では、1リットルあたり、Glycerol:40g、カザミノ酸:1g、Yeast Exteract:0.5g、KH2PO4:10g及びNH4Cl:1gを含む培地を使用した。また、培地のpHは10とした。本実施例の培養条件としては培養温度を21℃とし、静置培養とした。また、供試微生物は、培地への接種後、OD580が0.3となるように調整した。
本実施例では、実施例1で単離・同定したTB-83株に対して変異原処理を施し、ストレプトマイシン耐性を有する変異株を作製した。
実施例1で単離・同定したTB-83株を約1.0×108cells/mlとなるように調整し、シャーレに広げ、約30cmの距離からUVライトを照射した。照射20秒ごとにサンプリングを行い、サンプル100μlをNB液体培地2mlに添加し、30℃で一晩振盪培養行った。その後、集菌し0.85%生理食塩水100μlに懸濁・希釈したものを、ストレプトマイシン(Sm)を添加したNB平板培地に塗布し30℃で培養を行い、Sm耐性を有する変異株の取得を試みた。
本実施例では、実施例3で取得したTB-83D株を用いて実際のBDF廃液(バイディーゼル燃料廃液)からの連続培養によるエタノール生産を試みた。
表15に示したBDF廃液を用いた場合、9日後に最大で約360mMのエタノール濃度で、エタノール生産ができることを確認した。BDF廃液においてもそのエタノール生産量は、純グリセロールを基質とした場合よりも高く、BDF廃液によるエタノール生産が問題なく行われていることがわかった。また、長期にわたり100%程度の高いエタノール収率で生産を行うことができた。
Claims (13)
- クレブシエラ・バリコラ(Klebsiella variicola)に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物。
- 配列番号1に記載された塩基配列を有する16s rDNA又は配列番号1に記載された塩基配列に対して99.7%以上の相同性を有する16s rDNAを有することを特徴とする請求項1記載の微生物。
- 受託番号FERM P-22039又は受託番号FERM P-22203であることを特徴とする請求項1記載の微生物。
- クレブシエラ(Klebsiella)属又はセラチア(Serratia)属に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物。
- 配列番号2に記載された塩基配列を有する16s rDNA又は配列番号2に記載された塩基配列に対して99.3%以上の相同性を有する16s rDNAを有することを特徴とする請求項5記載の微生物。
- 受託番号FERM P-22040であることを特徴とする請求項5記載の微生物。
- グリセロールを含む廃水に請求項1〜8いずれか1項記載の微生物を接触させる工程と、
上記微生物を接触させた後、生成されたエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。 - 上記微生物を接触させた後、生成された水素を回収する工程を更に含むことを特徴する請求項9記載のエタノールの製造方法。
- 上記廃水は、バイオディーゼル燃料を生産した後の残査を含有する廃水であることを特徴とする請求項9記載のエタノールの製造方法。
- グリセロールを含む廃水に請求項1〜8いずれか1項記載の微生物を接触させる発酵槽を備える廃水処理装置。
- 上記発酵槽において生成された水素を回収する水素回収装置を備えることを特徴とする請求項12記載の廃水処理装置。
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