JP5320501B1 - 移植用細胞シートを運搬するためのキャリア - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
細胞非障害性の条件で応答可能な、細胞シート付着性の被覆層と、医療用材料として許容される基材からなる支持層とを備える、移植用細胞シートを運搬するためのキャリアを提供する。キャリアの被覆層に付着している細胞シートを移植場所に適用し、そして細胞非障害性の条件にすることにより細胞シートを移植場所に維持しつつ、剥離除去することができる。
【選択図】なし
Description
[1] 細胞非障害性の条件で応答可能な、細胞シート付着性の被覆層と、
医療用材料として許容される基材からなる支持層と
を備える、移植用細胞シートを運搬するためのキャリアであって:
キャリアの被覆層に付着している細胞シートを移植場所に適用し、そして細胞非障害性の条件にすることにより細胞シートを移植場所に維持しつつ、剥離除去することができる、キャリア。
[2] 支持層が、ポリ乳酸不織布からなる、1に記載のキャリア。
[3] 被覆層が、細胞非障害性の温度で応答可能な多糖類を含む、[1]または[2]に記載のキャリア。
[4] 細胞非障害性の条件が、細胞非障害性の温度の等張液を滴下することである、[1]に記載のキャリア。
[5] 支持層が、厚さ5〜500μm、重量(目付)10〜250g/m2であり;
被覆層が、厚さ5〜500μmであるか、および/または被覆量が0.1〜200g/m2である、
1〜4のいずれか一に記載の、キャリア。
[6] 巻き上がり試験において、カール高さが1.0mm以下である、[1]〜[5]のいずれか一に記載のキャリア。
[7] [1]〜[6]のいずれか一に記載のキャリアと、キャリアの被覆層に付着している細胞シートからなる、移植用片。
[8] (1)培養場所にある細胞シートの上に、[1]〜[6]のいずれか一に記載のキャリアを被覆層が細胞シートに接するように積層し、
(2)キャリアとともに細胞シートを培養場所から移動させる、
工程を含む、細胞シートの製造方法。
[9] (1)培養場所にある細胞シートの上に、[1]〜[6]のいずれか一に記載のキャリアを被覆層が細胞シートに接するように積層し、
(2)キャリアとともに細胞シートを培養場所から移植場所へ移動させ、
(3)細胞シートを移植場所に適用し、そして
(4)細胞非障害性の条件にすることにより細胞シートを移植場所に維持しつつ、キャリアを剥離除去する
工程を含む、細胞シートの移植方法。
[10] 細胞非障害性の条件で応答可能な、細胞シート付着性の被覆層と、
医療用材料として許容される基材からなる支持層と
を備える、細胞シートの運搬において使用する、キャリア。
[11] 細胞非障害性の条件で応答可能な、細胞シート付着性の被覆層と、
医療用材料として許容される基材からなる支持層と
を備える、細胞シートの移植において使用する、キャリア。
本発明のキャリアを用いることにより、眼球等の球面であっても細胞シートをきれいに密着させることができる。
本発明のキャリアは細胞シートの剥離性がよいので細胞シートに与える損傷を抑えることができる。そのため、本発明のキャリアを用いることにより、細胞シートの生着性を高めることが期待できる。
本発明に関連して、範囲を「X〜Y」で表すときは、特に記載した場合を除き、その範囲は両端の値XおよびYを含む。
本発明は、細胞非障害性の条件で応答可能な、細胞シート付着性の被覆層と、医療用材料として許容される基材からなる支持層とを備える、移植用細胞シートを運搬するためのキャリアを提供する。
本発明で「キャリア」というときは、特に記載した場合を除き、細胞シートを密着させて運搬するために使用するものであり、その形状は、膜状またはシート状である。
本発明において、被覆層の性質に関して「細胞シート付着性」というときは、特に記載した場合を除き、培養器表面から剥離させるための処理がされた細胞シートを一緒に持ち上げるのに十分な程度に付着させることができる性質をいう。
本発明のキャリアは、医療用具または細胞培養用器材の製造のための従来技術を利用して製造することができる。支持層表面への被覆は、通常、溶解液を調製する工程、溶解液で支持層基材をコートする工程、ゲル化およびまたは乾燥等により、被覆層を形成させる工程を含む。
本発明のキャリアは、下記のステップにより、使用することができる:
(1)培養場所にある細胞シートの上に、キャリアを被覆層が細胞シートに接するように積層してキャリアと細胞シートを密着させ、キャリアに細胞シートが密着した状態で、細胞シートを培養器表面から剥離・回収する。
(2)キャリアとともに細胞シートを培養場所から移動させる。
(3)キャリアの被覆層に付着している細胞シートを移植場所に適用し、そして細胞非障害性の条件にすることにより細胞シートを移植場所に維持しつつ、剥離除去する。
下記の方法で、キャリアを調製した。
基材・・・ポリ乳酸不織布(目付30 g/m2; 厚み0.17 mm; 引張強度 タテ49.0 N、ヨコ24.5 N; 伸び率 タテ15.0%、ヨコ15.0 %; 引裂強度 タテ3.9 N、ヨコ3.9 N)。
被覆材・・・多糖類混合物(澱粉、寒天、ペクチン、グリセリン、乳化剤)
(1)バットに、多糖類混合物(8.3g)およびPBS(300ml)を入れて、室温で溶解し、多糖類溶解液を得る。
(2)ポリ乳酸不織布を多糖類溶解液にディッピングする。
(3)ディッピングしたポリ乳酸不織布を、PPフィルムの上に置き、60℃で乾燥する。
模擬培養細胞として湯葉を用い、細胞シートキャリア用材料のスクリーニングを行った。
結果を下表に示した。
密着性:細胞シートキャリアを模擬細胞シートと一緒に持ち上げることができるか
◎:キャリアに模擬シート全体が密着しており、一緒に持ち上げることができる。
○:キャリアに模擬シートのほぼ全体が密着しており、一緒に持ち上げることができる。
△:キャリアと模擬シートとが密着していない部分が半分以上みられるが、一緒に持ち上げることはできる。
×:キャリアと模擬シートとがほとんど密着しておらず、一緒に持ち上げることができない。
◎:簡単に除去することができる。
○:模擬シートへの張り付きがややみられるが、模擬シートはゲルに密着したままで、キャリアのみを除去することができる。
△:キャリアが模擬シートへ張り付いており、キャリアをはがす際に、模擬シートの一部が一緒に持ち上がる
×:キャリアが模擬シートへ張り付いており、キャリアのみを持ち上げることができない。
1.方法
1.1. 細胞シートキャリアサンプル
下記のサンプルを準備した。なお、ポリ乳酸不織布としては、評価1で用いたものと同じ素材のものを用い、多糖類混合物による被覆は、実施例1と同様に行った。
本発明品A ;50g/m2(ポリ乳酸不織布目付)+20μm(多糖類混合物コート厚)
本発明品B ;30g/m2(ポリ乳酸不織布目付)+20μm(多糖類混合物コート厚)
本発明品C ;20g/m2(ポリ乳酸不織布目付)+20μm(多糖類混合物コート厚)
また、比較のため、製品Aを用いた。
細胞種:犬脂肪由来間葉系幹細胞Canine adipose derived mesenchymal stem cell; cADSCs
培養容器:直径3.5 cmシャーレー(UpCell(登録商標)、株式会社セルシード)
播種時細胞数:1.5×106 cells/dish
培養日数:3日間(オーバーコンフルエントになるように)
培地:α-MEM with lO % FBS,1 % PS
1. 健常犬(メス4才)の背部皮下から約1グラムの脂肪組織を採取した。
2. 0.1%コラゲナーゼ液中で、37℃、60分間処理し組織を分解した。
3. 血清入りの培地を入れて酵素反応を中止させた。
4. 室温で1200 rpm、5分間遠心分離後、上清を取り除いた。
5. 遠心された細胞塊を培地に懸濁し、75cm2フラスコで培養した。
6. 48時間後にPBSで洗浄し、浮遊細胞を取り除いた後に、新しい培養液を加えて培養を続けた。
7. 実験に使える細胞畳になるまで3回継代培養した。
8. 1.5×lO6 細胞を2 mlの培地に懸濁して、3.5 cmシャーレにて3日間培養した。
9. インキュベータから出して、培養液を取り除いた。
10. ニューメチレンブルー染色液で細胞を超生体染色した。(細胞シートを見やすくするための処置)
11. 4種類のキャリアを細胞シートにのせた。
12. 20℃で5〜10分間放置することで細胞シートがシャーレから剥がれ、キャリアに付着するようにした。
13. ピンセットでキャリアを持ち上げ、細胞シートが付着していることを確認した。
14. 細胞シートを下側にしたまま、白い紙の上に置き、キャリアを静かに剥がした。
結果を図1に示した。
製品Aは、3.5cmシャーレに合うような大きさに作られているため、シャーレ一杯に培養された細胞を付着させることができた。しかしながら、滑りやすい素材であるため、細胞シートのずれや巻上がりが生じた。一方で、本発明品 A〜Cでは、大きさがシャーレに合っていないものの、細胞シートのずれや巻上がりはなく、細胞シートをきれいに付着させることができた。また、使用感においてもCが最も優れており、ピンセットでの持ち運びが容易であった。
本発明品 Cは細胞の付着性に優れ、柔軟性が高く、取り扱いが容易であることから、細胞シートのイヌ角膜への移植にも適切に対応できると考えられる。
下表の本発明品 B‘、C’およびDを準備した。多糖類混合物による被覆は、本発明品B',C'は実施例1と同様に行った。本発明品Dについては多糖類混合物中の増粘剤であるペクチン単体(100%)のみの溶液を用い、実施例1と同様の方法でサンプルを作製した。
本発明品B' ;30g/m2(ポリ乳酸不織布目付)+20μm(多糖類混合物コート厚)
本発明品C' ;20g/m2(ポリ乳酸不織布目付)+20μm(多糖類混合物コート厚)
本発明品D ;20g/m2(ポリ乳酸不織布目付)+20μm(ペクチンコート厚)
B'、 C'、およびDを検討した結果、3枚とも、評価2のBおよびCと同様、密着性、剥離性が良好であった。細胞の密着性に優れ、柔軟性が高く、取り扱いが容易であった。今回試験を実施した3枚の中では、B'が操作性や細胞シートの状態などの点で最も優れていた。
犬の角膜損傷部に細胞シートキャリアを用いて細胞移植を試みた。
13. 全身麻酔下で角膜表層切除を行った移植対象症例犬の角膜の上に、細胞シートを下側にしたまま、キャリアごと乗せた。
14. 5〜10分の後、42℃の生理的食塩水をキャリアの上から滴下し、キャリアの細胞シートからの剥離を促した。
15. 細胞シートからキャリアをゆっくり取り除いた。
市販の細胞シート回収用支持体は滑りやすく、比較的硬い素材であるため、細胞シートから剥離することが困難な場合がある。しかしながら、今回使用したキャリアは、細胞の密着性に優れ、また柔軟性が高く、取り扱いが容易であることから、細胞シートのイヌ角膜への移植に際し、適切に対応できた。特に 40℃程度の生理的食塩水を用いた加温により、移植先(角膜)において容易に細胞シートがリリースされ、従前より容易に移植が完了した。また細胞シートを移植した際に、キャリアに柔軟性があることから細胞シートにシワが生じることなく曲面である角膜に付着させることができた。
水分に接触した際の巻き上がり(反り)の有無および程度について試験した。
・本発明品B'(上記で製造したもの。直径30mmの円形にカットしたもの。)
・厚さ50μm、直径30mmの、市販の細胞シート回収用支持体(CellShifter、株式会社セルシード。以下「製品A」という。)の
・PBS(リン酸緩衝生理食塩水)
・デジマチックハイトゲージ;HDS-20C(Mitutoyo製)
ガラス板の上にPBSを0.05ml滴下する。その上にキャリア材をのせ、10秒間静置し、カールした高さhをハイトゲージで測定する(下図参照)。測定は、室温で行う。
細胞シート移植後を想定し、細胞シートからのキャリア剥離のためにどの程度の力が必要であるかを確認した。
・本発明品B’(上記で製造したもの。直径30mmの円形にカットしたもの。)
・製品A
・デジタルフォースゲージメータ(FG-5000A,扶桑理化製品株式会社)
・両面テープ 日東電工製 両面粘着テープ N0.500 (幅15mm)
(1)ガラス板に両面テープ(幅15mm)を張り付け、その上にキャリア材(直径30mm)を置き、キャリア材の中央15mm部分を張付けた状態にする。
(2)キャリア材の端をデジタルフォースゲージメータに取り付け、10 mm/minの速度で鉛直方向に上昇させ、計測器の最大値を読み取る(下図参照)。
製品Aおよびポリ乳酸不織布について、赤外吸収スペクトルを得た(図4)。製品Aの素材は、ポリ乳酸ではなく、セルロース系であると考えられた。
使用機器:日本分光(株)製 FT/IR-420 赤外分光計
Claims (10)
- 細胞非障害性の温度で溶解、軟化、融解、粘度の低下または分解可能な多糖類を含む、細胞シート付着性の被覆層と、
被覆層をその表面に有し、医療用材料として許容される基材の不織布からなる支持層と
を備える、移植用細胞シートを運搬するためのキャリアであって:
キャリアの被覆層に付着している細胞シートを移植場所に適用し、そして細胞非障害性の温度にすることにより細胞シートを移植場所に維持しつつ、剥離除去することができる、キャリア。 - 支持層が、ポリ乳酸不織布からなる、請求項1に記載のキャリア。
- 細胞非障害性の温度にすることが、細胞非障害性の温度の等張液を滴下することである、請求項1または2に記載のキャリア。
- 支持層が、厚さ5〜500μmであるか、および/または重量10〜250g/m2であり;
被覆層が、厚さ5〜500μmであるか、および/または被覆量が0.1〜200g/m2である、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の、キャリア。 - 巻き上がり試験において、カール高さが1.0mm以下である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のキャリア。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のキャリアと、キャリアの被覆層に付着している細胞シートからなる、移植用片。
- (1)培養場所にある細胞シートの上に、請求項1〜5のいずれか1項に記載のキャリアを被覆層が細胞シートに接するように積層し、
(2)キャリアとともに細胞シートを培養場所から移動させる、
工程を含む、細胞シートの製造方法。 - (1)培養場所にある細胞シートの上に、請求項1〜5のいずれか1項に記載のキャリアを被覆層が細胞シートに接するように積層し、
(2)キャリアとともに細胞シートを培養場所から移植場所へ移動させ、
(3)細胞シートを移植場所に適用し、そして
(4)細胞非障害性の温度にすることにより細胞シートを移植場所に維持しつつ、キャリアを剥離除去する
工程を含む、細胞シートの移植方法(ヒト個体での実施を除く。)。 - 細胞非障害性の温度で溶解、軟化、融解、粘度の低下または分解可能な多糖類を含む、細胞シート付着性の被覆層と、
被覆層をその表面に有し、医療用材料として許容される基材の不織布からなる支持層と
を備える、細胞シートの運搬において使用する、キャリア。 - 細胞非障害性の温度で溶解、軟化、融解、粘度の低下または分解可能な多糖類を含む、細胞シート付着性の被覆層と、
被覆層をその表面に有し、医療用材料として許容される基材の不織布からなる支持層と
を備える、細胞シートの移植において使用する、キャリア。
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