JP5319148B2 - Method and array for detecting mutations in target nucleic acid - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for quickly detecting variations in a target nucleic acid. <P>SOLUTION: The method uses (a) a query probe having a capture sequence hybridizing with a capture probe and a query sequence complementary to a base sequence adjacent to a specific site in the target nucleic acid in a manner that a nucleotide species complementary to a nucleotide species adjacent to a specific site of the target nucleic acid is present at the 3' terminal and (b) a labeled nucleotide having a query nucleotide complementing a nucleotide species of a specific site in the target nucleic acid and having a labeled element to each mutation constituting base relating to the variation in the target nucleic acid and possibly detectable in a specific site. Variations can be detected quickly by using these components. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&amp;INPIT

Description

本発明は、標的核酸中の一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphisms）を含む遺伝子上の変異を検出する技術に関する。   The present invention relates to a technique for detecting a mutation on a gene containing single nucleotide polymorphisms in a target nucleic acid.

ヒトなどにおけるＳＮＰを含む遺伝子変異は体質や遺伝病のみならず、特定疾患についての罹患率、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択等にも関連していることがわかっている。ＳＮＰや遺伝子変異は、通常、複数個が関連しているとともに、個別化医療の促進のためには、できるだけ多くのＳＮＰや変異を網羅的に検出又は定量することが求められている。   It has been found that genetic mutations including SNPs in humans and the like are related not only to constitution and genetic diseases, but also to the prevalence of specific diseases, disease diagnosis, prognosis of treatment, selection of drugs and treatments, and the like. A plurality of SNPs and gene mutations are usually related, and in order to promote personalized medicine, it is required to comprehensively detect or quantify as many SNPs and mutations as possible.

そこで、ＳＮＰ等を効率的に検出又は定量する方法として、ＤＮＡコンピュータ技術を利用した方法が提案されている（非特許文献１）。この方法では、図６に示すように、予め、多数の相互に相違する配列のキャプチャープローブを保持する固相担体を準備する。そして、標識用タグ配列とＳＮＰの特定塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列とを有する２種類の５’クエリプローブと、前記特定部分配列に隣接する共通部分配列に相補的なクエリ配列とキャプチャーに相補的な識別用タグ配列とを有する一つの３’クエリプローブと、を用いる。２種類の５’クエリプローブの各標識用タグ配列１、２は、それぞれのクエリ配列を区別可能に、例えば、Ｃｙ３とＣｙ５等の異なる標識物質で標識可能に形成されている。また、識別用配列は、キャプチャープローブと相補的となっている。   Therefore, a method using DNA computer technology has been proposed as a method for efficiently detecting or quantifying SNP or the like (Non-patent Document 1). In this method, as shown in FIG. 6, a solid phase carrier holding a number of capture probes having different sequences is prepared in advance. Two kinds of 5 ′ query probes having a tag sequence for labeling and a query sequence complementary to a specific partial sequence containing a specific base of SNP, and a query sequence complementary to a common partial sequence adjacent to the specific partial sequence And a 3 ′ query probe having an identification tag sequence complementary to the capture. The tag sequences 1 and 2 for labeling of the two kinds of 5 'query probes are formed so that the respective query sequences can be distinguished, for example, capable of labeling with different labeling substances such as Cy3 and Cy5. Further, the identification sequence is complementary to the capture probe.

この方法は、図６に示すように、まず、被験試料中の核酸中の標的核酸をマルチプレックスＰＣＲ等により増幅する（増幅工程）。次いで、ＰＣＲ増幅産物と５’クエリプローブと３’クエリプローブとのハイブリダイゼーション反応及びライゲーション反応によって、５’クエリプローブと３’クエリプローブとを連結させる（連結・コード化工程）。次に、得られた連結分子の標識用タグ配列を利用してＰＣＲでラベリングする（ラベリング工程）。こうした連結及びラベリングにより、ＳＮＰの特定塩基に関連付けた標識物質を備え、かつ一種類の識別用タグ配列を備える連結分子を得る。さらに、ラベリングした連結分子を識別用タグ配列に相補的なキャプチャープローブが固定化されたアレイで検出するというものである（検出工程）。   In this method, as shown in FIG. 6, first, a target nucleic acid in a nucleic acid in a test sample is amplified by multiplex PCR or the like (amplification step). Next, the 5 'query probe and the 3' query probe are ligated by a hybridization reaction and a ligation reaction of the PCR amplification product, the 5 'query probe, and the 3' query probe (ligation / coding step). Next, labeling is performed by PCR using the tag sequence for labeling of the obtained linking molecule (labeling step). By such ligation and labeling, a linking molecule having a labeling substance associated with a specific base of SNP and having one kind of identification tag sequence is obtained. Further, the labeled linking molecule is detected by an array in which capture probes complementary to the identification tag sequence are immobilized (detection step).

この方法では、２種類の異なる標識物質を有する連結分子が識別用タグ配列を介して一つのキャプチャープローブにハイブリダイズしたときの、それぞれの標識物質に基づくシグナル強度のプロットに基づいてＳＮＰのタイプ（２種類のホモと１種類のヘテロ）を検出する。   In this method, when a linking molecule having two different labeling substances is hybridized to one capture probe via an identification tag sequence, the SNP type (based on a plot of signal intensity based on each labeling substance ( 2 types of homo and 1 type of hetero) are detected.

Analytical Biochemistry 364(2007)78-85Analytical Biochemistry 364 (2007) 78-85

上記非特許文献１に記載の方法は、標的核酸中の特定部分配列に応じたキャプチャープローブを固定化した固相担体を準備することなく、特定塩基を含む部分配列とは無関係に設定した塩基配列を有するキャプチャープローブを固定化したユニバーサルな固相担体を利用できるという利点がある。また、ＳＮＰを構成する２種類の塩基置換を２種類の標識物質を用いて一つのキャプチャープローブで検出するため、網羅的に多数のＳＮＰを検出できるという利点もある。   The method described in Non-Patent Document 1 includes a base sequence set independently of a partial sequence containing a specific base without preparing a solid phase carrier on which a capture probe corresponding to the specific partial sequence in a target nucleic acid is immobilized. There is an advantage that a universal solid-phase carrier on which a capture probe having s is immobilized can be used. In addition, since two types of base substitutions constituting the SNP are detected with one capture probe using two types of labeling substances, there is also an advantage that a large number of SNPs can be comprehensively detected.

しかしながら、上記方法では、検出工程に用いる試料を調製するまでに多くのステップを要しており、しかも全体として少なくとも十数時間を要していた。また、連結・エンコード工程及びラベリング工程で用いる酵素が検出結果に及ぼす影響を抑制するため、連結・エンコード工程以後検出工程まで（７時間程度）を同日中に実施する必要があった。このため、日常的な作業時間を考慮すると、増幅工程と連結・コード化工程以後とを異なる日に行わざるを得なかった。   However, in the above method, many steps are required to prepare a sample used in the detection process, and at least a dozen hours are required as a whole. Moreover, in order to suppress the influence which the enzyme used at a connection / encoding process and a labeling process has on a detection result, it was necessary to carry out from the connection / encoding process to the detection process (about 7 hours) on the same day. For this reason, in consideration of daily work time, the amplification process and the concatenation / coding process must be performed on different days.

さらに、上記方法では、ＳＮＰのタイプ判別をシグナル強度のプロットによらなければならないほか、標識物質間の退色性などに差がある場合には、ＳＮＰのタイプ判別の精度を十分に確保できない場合もありえる。   Furthermore, in the above method, SNP type discrimination must be based on signal intensity plots, and if there is a difference in fading between labeled substances, the accuracy of SNP type discrimination may not be sufficiently secured. It can be.

そこで、本発明は、迅速に標的核酸中の変異を検出又は定量する方法及びそのためのプローブセット等を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、さらに精度もよく変異を検出又は定量する方法及びそのためのプローブセット等を提供することを他の一つの目的とする。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for rapidly detecting or quantifying a mutation in a target nucleic acid, a probe set for the method, and the like. Another object of the present invention is to provide a method for detecting or quantifying mutations with higher accuracy and a probe set for the method.

本発明者らは、標的核酸中の１塩基多型等の変異を迅速に検出するのにあたり、連結・コード化工程と標識工程とを同時に実現することが重要であると考え、種々検討した。この結果、予め固相担体上に備えられるキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列と変異部位に隣接する塩基配列と相補的であり、変異部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するクエリ配列とを備えるクエリプローブと、標的核酸中の変異部位のヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を５’末端に有するクエリヌクレオチドと標識要素とを備えるプローブとを用いることで、一挙にエンコードとラベリングを実現できるという知見を得た。本発明によればこうした知見に基づき以下の手段が提供される。   The present inventors considered that it is important to simultaneously realize the ligation / encoding step and the labeling step in order to rapidly detect mutations such as single nucleotide polymorphisms in the target nucleic acid, and conducted various studies. As a result, a nucleotide sequence that is complementary to a capture sequence previously hybridized with a capture probe provided on a solid phase carrier and a base sequence adjacent to the mutation site and complementary to the nucleotide species adjacent to the mutation site is located at the 3 ′ end. Encoding and labeling at once by using a query probe comprising a query sequence having a query nucleotide having a nucleotide species complementary to the nucleotide species of the mutation site in the target nucleic acid at the 5 ′ end and a labeling element The knowledge that can be realized. The present invention provides the following means based on these findings.

[１]固相担体上に固定化された複数種類のキャプチャープローブを用いて標的核酸中の変異を検出する方法であって、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を用いて、以下の工程（１）〜（３）：
（１）前記変異構成塩基毎に、前記標的核酸と前記クエリプローブとをハイブリダイズさせるとともに、前記クエリプローブの３’末端に標識ヌクレオチドを連結して連結分子を得る連結工程と、
（２）前記変異構成塩基毎に得られる前記連結分子と前記キャプチャープローブとを前記固相担体上でハイブリダイズ可能に接触させる接触工程と、
（３）前記固相担体上において前記キャプチャープローブ毎に前記標識要素に基づくシグナル情報を取得するシグナル情報取得工程と、
を実施する、検出方法。
[２]前記標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド種として前記クエリクレオチドのみを有し、当該クエリヌクレオチドで連結反応が終結されるように形成されている、[１]に記載の検出方法。
[３]前記変異につき、
前記クエリプローブは、前記変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備え、
前記標識ヌクレオチドは、相互に同一の標識要素を備える、
[１]又は[２]に記載の検出方法。
[４]前記変異の有無又は前記構成変異塩基の比率を、以下の式；
[前記変異構成塩基の一つについて得られた連結分子がハイブリダイズしたキャプチャープローブについて得られるシグナル強度の比]／[前記変異について得られたすべての連結分子がハイブリダイズしたキャプチャープローブについて得られるシグナル強度の和]
に基づいて検出する、[３]に記載の検出方法。
[５] 前記変異につき、
前記クエリプローブは、前記変異構成塩基間に同一のキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備え、
前記標識ヌクレオチドは、前記変異構成塩基毎に異なる標識要素を備える、
[１]又は[２]に記載の検出方法。
[６] 前記接触工程は、前記変異構成塩基毎に実施された連結工程の各連結分子の混合物を一つの前記固相担体上に供給することを含む、[１]〜[５]のいずれかに記載の検出方法。
[７] １種又は２種以上の標的核酸についての複数の変異を検出するのにあたり、複数の変異につき前記（１）〜（３）の各工程をそれぞれ一括して実施する、[１]〜[６]のずれかに記載の検出方法。
[８]前記複数の標的核酸は、検体中の核酸に対してマルチプレックスＰＣＲにて準備する、[７]に載の検出方法。
[９] 固相担体上に固定化された複数種類のキャプチャープローブを用いて標的核酸中の変異を検出するためのキットであって、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を備える、キット。
[１０] 標的核酸中の変異を検出するのに用いるキットであって、
複数のキャプチャープローブを備える固相担体と、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を備える、キット。 [1] A method for detecting a mutation in a target nucleic acid using a plurality of types of capture probes immobilized on a solid support,
The following (a) and (b) for each mutated base that may be detected at a specific site for the mutation in the target nucleic acid:
(A) a capture sequence that hybridizes with the capture probe and a complementary query sequence to a base sequence adjacent to a specific site in the target nucleic acid, and a nucleotide species adjacent to the specific site in the target nucleic acid A query probe comprising at the 3 ′ end a nucleotide species to be
(B) a labeled nucleotide having a query nucleotide that complements the nucleotide species at the specific site in the target nucleic acid and comprising a labeling element;
The following steps (1) to (3):
(1) A linking step for hybridizing the target nucleic acid and the query probe for each of the mutated bases, and linking a labeled nucleotide to the 3 ′ end of the query probe to obtain a linking molecule;
(2) a contact step in which the linking molecule obtained for each of the mutation-constituting bases and the capture probe are brought into contact with each other so as to be hybridizable on the solid phase carrier;
(3) a signal information acquisition step of acquiring signal information based on the labeling element for each capture probe on the solid phase carrier;
A detection method is carried out.
[2] The detection method according to [1], wherein the labeled nucleotide has only the query nucleotide as a nucleotide species, and is formed such that a ligation reaction is terminated by the query nucleotide.
[3]
The query probe comprises a capture sequence that hybridizes with a different capture probe for each of the mutated bases,
The labeled nucleotides comprise mutually identical labeling elements,
The detection method according to [1] or [2].
[4] The presence or absence of the mutation or the ratio of the constituent mutant bases is expressed by the following formula:
[Ratio of signal intensity obtained for a capture probe hybridized with a linking molecule obtained for one of the mutation-constituting bases] / [Signal obtained for a capture probe hybridized with all ligation molecules obtained for the mutation Sum of strength]
The detection method according to [3], wherein detection is performed based on.
[5] Regarding the mutation,
The query probe comprises a capture sequence that hybridizes with the same capture probe between the mutated bases,
The labeled nucleotide comprises a different labeling element for each of the mutated constituent bases,
The detection method according to [1] or [2].
[6] The contact step according to any one of [1] to [5], wherein the contacting step includes supplying a mixture of each linking molecule of the linking step performed for each of the mutated bases onto one solid phase carrier. The detection method according to.
[7] In detecting a plurality of mutations for one or more target nucleic acids, the steps (1) to (3) are collectively performed for each of the plurality of mutations. [1] to The detection method according to any one of [6].
[8] The detection method according to [7], wherein the plurality of target nucleic acids are prepared by multiplex PCR for nucleic acids in a specimen.
[9] A kit for detecting a mutation in a target nucleic acid using a plurality of types of capture probes immobilized on a solid phase carrier,
The following (a) and (b) for each mutated base that may be detected at a specific site for the mutation in the target nucleic acid:
(A) a capture sequence that hybridizes with the capture probe and a complementary query sequence to a base sequence adjacent to a specific site in the target nucleic acid, and a nucleotide species adjacent to the specific site in the target nucleic acid A query probe comprising at the 3 ′ end a nucleotide species to be
(B) a labeled nucleotide having a query nucleotide that complements the nucleotide species at the specific site in the target nucleic acid and comprising a labeling element;
A kit comprising:
[10] A kit for detecting a mutation in a target nucleic acid,
A solid support comprising a plurality of capture probes;
The following (a) and (b) for each mutated base that may be detected at a specific site for the mutation in the target nucleic acid:
(A) a capture sequence that hybridizes with the capture probe and a complementary query sequence to a base sequence adjacent to a specific site in the target nucleic acid, and a nucleotide species adjacent to the specific site in the target nucleic acid A query probe comprising at the 3 ′ end a nucleotide species to be
(B) a labeled nucleotide having a query nucleotide that complements the nucleotide species at the specific site in the target nucleic acid and comprising a labeling element;
A kit comprising:

本発明は、上記のとおりのクエリプローブと標識ヌクレオチドとを用いるため、クエリプローブと標的核酸とをハイブリダイズさせて、クエリローブに標識ヌクレオチドを連結することにより、標的核酸中の変異構成塩基を検出して固相担体上の予め配列が決まったキャプチャープローブにハイブリダイズ可能にコード化し、しかも標識要素を備えた連結分子を一挙に得ることができる。この連結分子を固相担体上に供給するハイブリダイズ試料として用いて、連結分子が備える標識要素に基づいてシグナル強度情報を取得することで、変異構成塩基の有無や比率を検出できる。したがって、従来の連結・コード化工程とラベリング工程とを省略・簡略化して、迅速に検出工程に到達できる。   Since the present invention uses the query probe and the labeled nucleotide as described above, the query probe and the target nucleic acid are hybridized, and the labeled nucleotide is linked to the query lobe, thereby detecting a mutated base in the target nucleic acid. Thus, it is possible to obtain a linking molecule that can be hybridized with a capture probe having a predetermined sequence on a solid phase carrier and that has a labeling element at once. By using this linking molecule as a hybridized sample to be supplied onto the solid phase carrier and acquiring signal intensity information based on the labeling element provided in the linking molecule, the presence or absence and the ratio of the mutated base can be detected. Therefore, the conventional connection / coding process and labeling process can be omitted / simplified, and the detection process can be reached quickly.

さらに、変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を有するクエリプローブと変異構成塩基間で同一での識別要素を用いる標識ヌクレオチドとを用いることで、得られる連結分子は、変異構成塩基の種別に応じて固相担体上の異なるキャプチャープローブで識別できるキャプチャー配列と他の変異構成塩基に応じた連結分子と同一の識別要素とを備えている。このため、標識要素間でのバラツキを抑制するとともに、定性的な検出精度も定量程度も向上させることができる。   Furthermore, by using a query probe having a capture sequence that hybridizes with a different capture probe for each mutated base and a labeled nucleotide that uses the same identification element between the mutated bases, the resulting linking molecule is mutated base Capture sequences that can be identified by different capture probes on the solid phase carrier according to the type of the linking molecule and the same identification element as the linking molecule according to the other mutated base. For this reason, it is possible to suppress the variation between the label elements and improve the qualitative detection accuracy and the quantification degree.

なお、本明細書において「核酸」とは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ-オリゴ核酸などの人工合成核酸を含む。また、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。また、本明細書において「標的核酸」とは、任意の配列を有する任意の核酸であって、実際の検出対象とする変異を有する一本鎖の状態をいうものとする。通常、多くの生物において染色体ＤＮＡは相補鎖からなる二重鎖ＤＮＡであるが、本発明において検出対象となるのはセンス鎖（コード鎖）及びアンチセンス鎖(鋳型鎖)のいずれであってもよい。なお、標的核酸は、典型的には、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒトや非ヒト動物における遺伝子上の指標となる塩基配列を有する可能性のある核酸が挙げられる。指標としては、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の核酸なども標的核酸に含まれる。   In the present specification, “nucleic acid” refers to all DNA and RNA including cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, total RNA, hnRNA and synthetic RNA, peptide nucleic acid, morpholino nucleic acid, methylphosphonate nucleic acid, and Includes artificially synthesized nucleic acids such as S-oligonucleic acid. Moreover, it may be single-stranded or double-stranded. Further, in this specification, the “target nucleic acid” refers to an arbitrary nucleic acid having an arbitrary sequence and a single-stranded state having a mutation to be actually detected. Usually, in many organisms, chromosomal DNA is a double-stranded DNA consisting of complementary strands. In the present invention, either the sense strand (coding strand) or the antisense strand (template strand) can be detected. Good. The target nucleic acid is typically a genetic index in humans and non-human animals such as constitution, genetic disease, onset of specific diseases such as cancer, disease diagnosis, treatment prognosis, drug and treatment selection, etc. Examples include nucleic acids that may have a base sequence. Examples of the index include polymorphisms such as SNP and congenital or acquired mutations. Further, nucleic acids derived from microorganisms such as pathogenic bacteria and viruses are also included in the target nucleic acid.

標的核酸としては、後述する試料又はその核酸画分をそのまま用いることもできるが、好ましくは、ＰＣＲによる増幅反応、より好ましくはマルチプレックスＰＣＲによる増幅反応により、複数の標的核酸の全てが増幅された増幅産物を用いることが好ましい。   As the target nucleic acid, the sample described later or its nucleic acid fraction can be used as it is, but preferably all of the plurality of target nucleic acids were amplified by PCR amplification reaction, more preferably multiplex PCR amplification reaction. It is preferable to use an amplification product.

本明細書において「試料」とは、標的核酸を含む可能性のある試料をいう。試料としては、細胞、組織、血液、尿、唾液等が含まれ、核酸を含む任意の試料を用いることができる。こうした各種の試料からの核酸を含む画分は当業者であれば適宜従来技術を参照して取得することができる。   As used herein, “sample” refers to a sample that may contain a target nucleic acid. Samples include cells, tissues, blood, urine, saliva and the like, and any sample containing nucleic acid can be used. Fractions containing nucleic acids from these various samples can be obtained by those skilled in the art with reference to conventional techniques as appropriate.

本明細書において「変異」とは、遺伝子上の１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入及び付加のいずれか１種以上を含む変化をいう。「変異」には、一塩基多型及びそれ以外の多型を含む広い意味で使用するものとする。「多型」としては、典型的には一塩基多型が挙げられる。本明細書において「変異構成塩基」とは、一つの変異における正常型及び変異型を構成する塩基をいう。また、例えば、ＡがＧに置換される一塩基多型にあっては、「変異構成塩基」は２種類存在することになる。   As used herein, “mutation” refers to a change including any one or more of substitution, deletion, insertion and addition of one or more bases on a gene. “Mutation” is used in a broad sense including single nucleotide polymorphisms and other polymorphisms. “Polymorphism” typically includes a single nucleotide polymorphism. As used herein, “mutant constituent base” refers to a base constituting a normal type and a mutant type in one mutation. For example, in the single nucleotide polymorphism in which A is substituted with G, there are two types of “mutant constituent bases”.

以下、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら説明する。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings as appropriate.

[標的核酸中の変異又は多型を検出する方法]
本発明の検出方法は、クエリプローブと標識ヌクレオチドとを連結する連結工程と、連結分子とキャプチャープローブとを接触させる接触工程と、シグナル強度情報取得工程と、を備えている。本発明の検出方法は、１種又２種以上の標的核酸を適用対象とし、これらの標的核酸中の変異に関する特定部分配列を検出対象とする。以下、一種の標的核酸についての一つの変異を検出する一連の工程を説明するが、以下の工程は、複数又は多数の標的核酸中の複数の変異を同時に検出する場合にも適用される。また、以下の工程は、一つの標的核酸の複数の変異を検出する場合において、個々の変異に適用される。 [Method for detecting mutation or polymorphism in target nucleic acid]
The detection method of the present invention comprises a linking step for linking a query probe and a labeled nucleotide, a contacting step for bringing a linking molecule and a capture probe into contact, and a signal intensity information acquisition step. The detection method of the present invention applies to one or more target nucleic acids, and a specific partial sequence relating to a mutation in these target nucleic acids is to be detected. Hereinafter, a series of steps for detecting one mutation for one kind of target nucleic acid will be described. However, the following steps are also applied to a case where a plurality of mutations in a plurality of target nucleic acids are detected simultaneously. In addition, the following steps are applied to individual mutations when detecting a plurality of mutations in one target nucleic acid.

図１Ａ及び図１Ｂには、本発明の検出方法の概要を示し、図２には、本発明に用いるプローブセットの一例の概要を示し、図３には、本発明に用いるプローブセットの他の一例の概要を示し、図４には、タグ配列及びキャプチャープローブの融解温度についての説明図を示す。なお、図１〜図３は、ＳＮＰを検出するための検出方法及びキットについての一例である。以下、まず、本発明の検出方法に用いるプローブ等について説明し、次いで各工程について説明する。   1A and 1B show an outline of the detection method of the present invention, FIG. 2 shows an outline of an example of the probe set used in the present invention, and FIG. 3 shows another probe set used in the present invention. An outline of an example is shown, and FIG. 4 is an explanatory diagram showing the melting temperature of the tag sequence and the capture probe. In addition, FIGS. 1-3 is an example about the detection method and kit for detecting SNP. Hereinafter, first, a probe and the like used in the detection method of the present invention will be described, and then each step will be described.

（クエリプローブ）
クエリプローブは、クエリ配列を３’側に有しており、キャプチャープローブにハイブリダイズ可能に相補的なタグ配列をその５’側に有することができる。 (Query probe)
The query probe has a query sequence on the 3 ′ side, and can have a complementary tag sequence on the 5 ′ side so as to be hybridizable to the capture probe.

（クエリ配列）
図１〜図３に示すように、クエリプローブは、標的核酸の検出しようとする特定の変異部位に隣接する塩基配列と相補的なクエリ配列を備えている。より具体的には、クエリ配列は、標的核酸中の変異部位の３’側に隣接する塩基配列の少なくとも一部に相補的である。こしたクエリ配列は、標的核酸に存在する可能性のある変異部位を含んでおらず、標的核酸中において保存されている領域に向けられている。したがって、クエリ配列は、検出しようとする一つの変異につき共通である。 (Query array)
As shown in FIGS. 1 to 3, the query probe includes a query sequence complementary to a base sequence adjacent to a specific mutation site to be detected in the target nucleic acid. More specifically, the query sequence is complementary to at least a part of the base sequence adjacent to the 3 ′ side of the mutation site in the target nucleic acid. These query sequences do not contain mutation sites that may be present in the target nucleic acid and are directed to regions conserved in the target nucleic acid. Therefore, the query sequence is common for one mutation to be detected.

また、クエリプローブは、標的核酸中の変異部位に隣接するヌクレオチド種(以下、単に隣接ヌクレオチド種ともいう。)を相補するヌクレオチド種を３’末端となるようにクエリ配列を備えている。クエリプローブの３’末端、すなわち、クエリ配列の３’末端には、後述する連結工程において、標識ヌクレオチドが連結される。   The query probe also includes a query sequence so that the nucleotide species complementary to the nucleotide species adjacent to the mutation site in the target nucleic acid (hereinafter also simply referred to as the adjacent nucleotide species) is the 3 'end. In the 3 'end of the query probe, that is, the 3' end of the query sequence, a labeled nucleotide is linked in the linkage step described later.

クエリ配列は、必要に応じ、例えば、連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。また、クエリ配列の長さは特に限定されないが、たとえば１０塩基長以上であることが好ましい。   The query sequence is designed by calculating, for example, continuous match length, melting temperature prediction by Nearest-Neighbor method, Hamming distance, and secondary structure prediction. The length of the query sequence is not particularly limited, but is preferably 10 bases or longer, for example.

（タグ配列）
図１〜図３に示すように、タグ配列は、固相担体に固定化されているキャプチャープローブとハイブリダイズ可能に相補的な塩基配列からなる。 (Tag array)
As shown in FIGS. 1 to 3, the tag sequence is composed of a complementary base sequence capable of hybridizing with a capture probe immobilized on a solid phase carrier.

タグ配列は、変異構成塩基との関係で２つの形態を有する。一つの形態は、図１Ａ及び図２に示すように、タグ配列が変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブとハイブリダイズするよう準備される形態である。このとき、検出しようとする変異についてのクエリプローブは、同一のクエリ配列と変異構成塩基毎に異なるタグ配列とを有するため、クエリプローブは変異構成塩基の種類に応じた種類が準備されることになる。この結果、検出しようとする変異につき得られる連結分子は、固相担体上の変異構成塩基毎に予め決められたそれぞれ異なるキャプチャープローブとハイブリダイズすることになる。なお、図１Ａでは、２種類の変異構成塩基をそれぞれ検出するための２種類のタグ配列が設定されているが、３種類又は４種類の変異構成塩基である場合であっても、対応するタグ配列を変異構成塩基毎に設定すればよい。   The tag sequence has two forms in relation to the mutated base. One form is a form in which the tag sequence is prepared to hybridize with a different capture probe for each mutated base, as shown in FIGS. 1A and 2. At this time, since the query probe for the mutation to be detected has the same query sequence and a different tag sequence for each mutation constituent base, the query probe is prepared according to the type of the mutation constituent base. Become. As a result, the linking molecule obtained for the mutation to be detected hybridizes with different capture probes determined in advance for each mutation base on the solid phase carrier. In FIG. 1A, two types of tag sequences for detecting each of two types of mutation-constituting bases are set, but even if there are three or four types of mutation-constituting bases, the corresponding tags The sequence may be set for each mutation base.

他の一つの形態は、図１Ｂ及び図３に示すように、タグ配列が変異構成塩基間で同一のキャプチャープローブとハイブリダイズするよう準備される形態である。このとき、検出しようとする変異についてクエリプローブは、同一のクエリ配列と同一のタグ配列とを備えることになり、すべての変異構成塩基について共通の一つのクエリププローブが準備されることになる。この結果、得られる連結分子は、固相担体上の予め決められた一つのキャプチャープローブとハイブリダイズすることになる。なお、この場合、各変異構成塩基は、標識ヌクレオチドの標識要素で識別される。   Another form is a form in which the tag sequence is prepared to hybridize with the same capture probe between the mutated bases, as shown in FIGS. 1B and 3. At this time, the query probe for the mutation to be detected has the same query sequence and the same tag sequence, and one query probe common to all the mutation constituent bases is prepared. As a result, the obtained linking molecule is hybridized with one predetermined capture probe on the solid phase carrier. In this case, each mutated base is identified by the labeling element of the labeled nucleotide.

タグ配列がハイブリダイズするキャプチャープローブのキャプチャー配列は、正規直交化配列ともいい、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。正規直交化配列は、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（intramolecular）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味する。１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。また、正規直交化配列は、ＰＣＲにおいて増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイゼーションのような問題に影響されずに、当該正規直交化配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有している。上記のような正規直交化配列は、H.Yshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vol.54 9-20(2000)および特願2003-108126に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。   The capture sequence of the capture probe to which the tag sequence hybridizes is also called an orthonormalized sequence. For example, continuous match length for a DNA sequence of a predetermined base length obtained from a random number, melting temperature prediction by Nearest-Neighbor method, Hamming distance Designed by performing secondary structure prediction calculations. The orthonormalized sequence is a base sequence of nucleic acid having a uniform melting temperature, that is, a sequence designed so that the melting temperature is within a certain range, and the nucleic acid itself is intramolecular. It means a base sequence that does not form a stable hybrid other than a base sequence that is structured in the above and does not inhibit hybridization with a complementary sequence. A sequence included in one orthonormalized sequence group hardly reacts between sequences other than the desired combination and within a self-sequence, or does not generate a reaction. Further, when the orthonormalized sequence is amplified in PCR, the amount of nucleic acid corresponding to the initial amount of the nucleic acid having the orthonormalized sequence is quantitatively determined without being affected by the problems such as the above-described cross hybridization. Has the property of being amplified. The orthonormalization sequence as described above is described in detail in H. Yshida and A. Suyama, “Solution to 3-SAT by breadth first search”, DIMACS Vol. 54 9-20 (2000) and Japanese Patent Application 2003-108126. Has been. Orthonormalized sequences can be designed using the methods described in these references.

例えば、キャプチャー配列としては、配列番号１〜100で表される塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長であり、融解温度（Ｔｍ）が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、同一条件でのハイブリダイゼーションにおいて均質なハイブリダイゼーション結果が得られることが期待される。   For example, as the capture sequence, the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 100 or a base sequence complementary to the base sequence can be used. These base sequences all have the same base length, and have a melting temperature (Tm) of 40 ° C. or higher and 80 ° C. or lower, preferably 50 ° C. or higher and 70 ° C. or lower. Expected to be obtained.

タグ配列が変異構成塩基毎に準備される場合、各タグ配列とキャプチャープローブとの融解温度は、相互に近接していることが好ましい。同時に網羅的に複数の標的核酸の複数の変異を検出しようとする場合には、一つの標的核酸に対して使用する複数のクエリプローブの複数のタグ配列とキャプチャー配列との融解温度は互いに最も近似するように組み合わされていることが好ましい。例えば、図４に示すように、タグ配列（キャプチャー配列）を融解温度の順に配列したとき、一つの標的核酸に対する２種類以上のクエリプローブにおけるタグ配列を、当該順列において隣り合う２種類以上の塩基配列から選択することができる。また、他の標的核酸に対応するクエリプローブセットのタグ配列及びキャプチャー配列は、図４に示すように、既に選択した塩基配列にすぐ隣の一連の塩基配列から選択してもよいし、離れた一連の塩基配列から選択してもよい。同時に検出しようとする標的核酸に対応する全てのクエリプローブセットで使用されるタグ配列及びキャプチャー配列の融解温度が前記融解温度の順列において一連の塩基配列を用いることが好ましい。なお、融解温度は、ＧＣ％法、Wallace法、Current Protocols in Molecular Biologyに準拠した方法(秀潤社刊バイオ実験イラストレイテッド３本当に増えるＰＣＲｐ２５に記載)等により算出したものを採用できるが、本発明における融解温度の範囲および塩基配列濃度の影響を加味できるNearest-Neighbor法によって算出されることが好ましい。Nearest-Neighbor法による融解温度は、例えば、Visual OMP（トミーデジタルバイオロジー株式会社製）とのソフトウエアや日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp/）が提供するソフトウエア（Oligo Calculator；http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html）により容易に取得できる。配列番号１〜１００で表されるキャプチャー配列は、Visual OMPによって算出される融解温度（０．１Ｍプローブ濃度、５０ｍＭ Ｎａ+イオン及び１．５ｍＭ Ｍｇ+イオン）の高い順に配列されている。 When a tag sequence is prepared for each mutation base, it is preferable that the melting temperature of each tag sequence and the capture probe be close to each other. When exhaustively detecting multiple mutations in multiple target nucleic acids simultaneously, the melting temperatures of multiple tag sequences and capture sequences of multiple query probes used for one target nucleic acid are closest to each other It is preferable that they are combined. For example, as shown in FIG. 4, when tag sequences (capture sequences) are arranged in the order of melting temperature, tag sequences in two or more query probes for one target nucleic acid are converted into two or more types of bases adjacent in the permutation. You can select from the sequence. The tag sequence and capture sequence of the query probe set corresponding to another target nucleic acid may be selected from a series of base sequences immediately adjacent to the already selected base sequence, as shown in FIG. You may select from a series of base sequences. It is preferable to use a series of base sequences in which the melting temperature of the tag sequence and the capture sequence used in all query probe sets corresponding to the target nucleic acid to be detected simultaneously is in the permutation of the melting temperature. The melting temperature calculated by the GC% method, the Wallace method, a method based on Current Protocols in Molecular Biology (described in Shujunsha's Bio-Experiment Illustrated 3 PCRp25, which is really increased), etc. can be adopted. It is preferably calculated by the Nearest-Neighbor method that can take into account the range of melting temperature and base sequence concentration in the invention. The melting temperature by the Nearest-Neighbor method is, for example, software with Visual OMP (manufactured by Tommy Digital Biology Co., Ltd.) or software provided by Japan Genetic Research Institute (http://www.ngrl.co.jp/). (Oligo Calculator; http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html). The capture sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 100 are arranged in descending order of melting temperature (0.1 M probe concentration, 50 mM Na + ion and 1.5 mM Mg + ion) calculated by Visual OMP.

なおクエリプローブのタグ配列とクエリ配列との間に適当なスペーサー配列を備えていてもよい。スペーサーを備えることで、キャプチャープローブとのハイブリダイズ時における立体障害を回避又は抑制できる。スペーサーとしては、特に限定されないが、例えば、天然型または非天然型のポリヌクレオチド鎖、炭化水素鎖、ペプチド鎖、ペプチド核酸糖鎖などが挙げられる。スペーサーとしてヌクレオチド又はその誘導体等を用いるときヌクレオチド残基数は、標的核酸に相補的な塩基配列とタグ配列に応じて適宜決定すればよいが、好ましくは３〜１０残基である。   An appropriate spacer sequence may be provided between the tag sequence of the query probe and the query sequence. By providing the spacer, steric hindrance during hybridization with the capture probe can be avoided or suppressed. The spacer is not particularly limited, and examples thereof include a natural or non-natural polynucleotide chain, a hydrocarbon chain, a peptide chain, and a peptide nucleic acid sugar chain. When nucleotides or derivatives thereof are used as the spacer, the number of nucleotide residues may be appropriately determined according to the base sequence complementary to the target nucleic acid and the tag sequence, but is preferably 3 to 10 residues.

（標識ヌクレオチド）
標識ヌクレオチドは、標的核酸中の変異構成塩基に相補的な塩基を有するクエリヌクレオチドを有するとともに標識要素を備えることができる。 (Labeled nucleotide)
The labeled nucleotide can have a query nucleotide having a base complementary to the mutated base in the target nucleic acid and can include a labeling element.

標識ヌクレオチドは、連結反応の種類に応じて適宜選択される。例えば、連結反応をＤＮＡポリメラーゼ反応を用いて行う場合には、標識ヌクレオチドは、５’末端に、クエリヌクレオチドとして、変異構成塩基に対応するクエリヌクレオチド（三リン酸）を備えている。この場合、クエリヌクレオチドは、追加的にヌクレオチドが連結されないで当該ヌクレオチドで連結反応が終結されるよう、デオキシリボース等の３’ＯＨが水素基となっていることが好ましい。こうした標識ヌクレオチドを用いることにより、一塩基伸長反応によって最も短い連結分子でエンコード及び標識できる。このようなクエリヌクレオチドとしては、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）、すなわち、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ若しくはｄｄＵＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰが挙げられる。   The labeled nucleotide is appropriately selected depending on the type of ligation reaction. For example, when the ligation reaction is performed using a DNA polymerase reaction, the labeled nucleotide is provided with a query nucleotide (triphosphate) corresponding to the mutated base as the query nucleotide at the 5 'end. In this case, the query nucleotide preferably has 3′OH such as deoxyribose as a hydrogen group so that the ligation reaction is terminated without the nucleotide being additionally linked. By using such a labeled nucleotide, it can be encoded and labeled with the shortest linking molecule by a single base extension reaction. Examples of such query nucleotide include dideoxynucleotide (ddNTP), that is, ddATP, ddTTP or ddUTP, ddGTP, ddCTP.

また、連結反応をＤＮＡリガーゼを用いて行う場合には、標識ヌクレオチドは、５’末端に変異構成塩基に対応するクエリヌクレオチド（一リン酸）を備えている。ＤＮＡリガーゼを用いる場合には、標識ヌクレオチドは、クエリヌクレオチド以外にその３’末端側に数個から２０個程度までの標的核酸の対応する領域に相補的な塩基配列（標的核酸の変異構成塩基の５’側に隣接する領域に対するクエリ配列である。）を備えるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。   When the ligation reaction is performed using DNA ligase, the labeled nucleotide has a query nucleotide (monophosphate) corresponding to the mutated base at the 5 'end. When DNA ligase is used, the labeled nucleotide is composed of a base sequence complementary to the corresponding region of the target nucleic acid from several to about 20 on the 3 ′ end side in addition to the query nucleotide (of the nucleotide constituting the target nucleic acid mutation). It is preferably an oligonucleotide comprising a query sequence for a region adjacent to the 5 ′ side.

標識ヌクレオチドは、図１〜図３に示すように、変異構成塩基毎に準備される。例えば、これらの図に例示するのは、ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合の標識ヌクレオチドであるとして説明すると、図１Ａに示すように、ＳＮＰにおいて変異構成塩基がＡ及びＧのときには、ｄｄＴＴＰ及びｄｄＣＴＰをそれぞれクエリヌクレオチドとする２種類の標識ヌクレオチド（Ａクエリ標識ヌクレオチド及びＧクエリ標識ヌクレオチド）が準備される。   A labeled nucleotide is prepared for each mutation base as shown in FIGS. For example, these figures are illustrated as labeled nucleotides when DNA polymerase is used. As shown in FIG. 1A, when the mutation bases are A and G in SNP, ddTTP and ddCTP are respectively queried. Two types of labeled nucleotides (A query labeled nucleotide and G query labeled nucleotide) are prepared.

標識ヌクレオチドは、適当な標識要素を備えている。ｄｄＮＴＰに付加できる標識要素としては、公知の標識物から適宜選択される。例えば、酵素、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質又は発光団などの標識物質が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５などのシアニン系蛍光色素のほか、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッド等の蛍光物質が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、32Ｐ、35Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。 The labeled nucleotide is provided with a suitable labeling element. The labeling element that can be added to ddNTP is appropriately selected from known labeling substances. For example, labeling substances such as enzymes, fluorescent substances, haptens, antigens, antibodies, radioactive substances, or luminophores can be mentioned. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase and peroxidase. Examples of the fluorescent material include fluorescent materials such as FITC, 6-FAM, HEX, R6G, ROX, R110, TET, TAMRA, and Texas Red, in addition to cyanine-based fluorescent dyes such as Cy2, Cy3, and Cy5. Examples of haptens include biotin and digoxigenin. Examples of radioactive substances include 32 P and 35 S. Examples of the luminophore include ruthenium.

標識ヌクレオチドにおける標識要素は、変異構成塩基との関係に関して２種の形態を採ることができる。すなわち、一つの形態は、図１Ａ及び図２に示すように、標識ヌクレオチドの標識要素を、変異構成塩基間で同一、すなわち、検出しようとする変異につき同一とする形態である。この形態は、クエリプローブのタグ配列が変異構成塩基毎に準備されている場合に組み合わされる。このようなクエリプローブから得られる連結分子は、標識要素が変異構成塩基間で同一であっても、変異構成塩基の有無や比率を、変異構成塩基毎に準備されるキャプチャープローブにおけるシグナル強度情報により検出できる。   The labeling element in the labeled nucleotide can take two forms with respect to the relationship with the mutated constituent base. That is, as shown in FIG. 1A and FIG. 2, one form is a form in which the labeling elements of the labeled nucleotide are the same among the mutation bases, that is, the same for the mutation to be detected. This form is combined when the tag sequence of the query probe is prepared for each mutation base. The linking molecule obtained from such a query probe has the presence and ratio of the mutated base based on the signal intensity information in the capture probe prepared for each mutated base even if the labeling element is the same between the mutated bases. It can be detected.

標識要素の他の一つの形態は、図１Ｂ及び図３に示すように、標識ヌクレオチドの標識要素が、変異構成塩基毎に相違する形態である。すなわち、標識要素を、検出しようとする変異の変異構成塩基の種類に応じて異なる種類の識別標識とする形態である。この形態は、クエリプローブのタグ配列が変異構成塩基間で同一に準備されている場合に組み合わされる。このようなクエリプローブから得られる連結分子は、検出した変異構成塩基が異なっていても同一のキャプチャープローブとハイブリダイズするため、各変異構成塩基を異なる標識要素に基づくシグナル強度情報により検出しなければならないからである。   Another form of the labeling element is a form in which the labeling element of the labeled nucleotide is different for each mutated base as shown in FIGS. 1B and 3. That is, the labeling element has a different type of identification label depending on the type of the mutation constituent base of the mutation to be detected. This form is combined when the tag sequence of the query probe is prepared identically among the mutated bases. Linked molecules obtained from such query probes will hybridize to the same capture probe even if the detected mutant bases are different, so each mutant base must be detected by signal intensity information based on different label elements. Because it will not be.

多型や変異比率の検出精度の観点からは、一つの変異についての異なる変異構成塩基間で同一の標識要素を用いることが好ましい。同一の標識要素を用いることで標識間におけるシグナル強度の相違や品質等によるバラツキを抑制できるからである。一方、キャプチャープローブ数を低減するためには、一つの変異についての異なる変異構成塩基間で同一のキャプチャープローブを用い、変異構成塩基毎に異なる標識要素を用いることが好ましい。   From the viewpoint of detection accuracy of polymorphism and mutation ratio, it is preferable to use the same labeling element between different mutation bases for one mutation. This is because the use of the same labeling element can suppress variations in signal intensity between the labels and variations due to quality and the like. On the other hand, in order to reduce the number of capture probes, it is preferable to use the same capture probe between different mutated bases for one mutation and to use a different label element for each mutated base.

（連結工程）
連結工程は、変異構成塩基毎に、標的核酸とクエリプローブとをハイブリダイズさせるとともに、クエリプローブの３’末端に標識ヌクレオチドを付加して連結分子を得る工程である。連結工程は、変異構成塩基毎に行われる。すなわち、図２に示すプローブセットを用いる場合には、図１Ａに示すように、変異構成塩基がＴであるときには、変異構成塩基としてＴを検出するためのクエリプローブと、アデニンを塩基として有するヌクレオチド種を有する標識ヌクレオチドと、標的核酸と、を用いる。すなわち、Ｔを検出するために構成された組み合わせを用いる。また、図３に示すプローブセットを用いる場合には、変異構成塩基がＣであるときには、図１Ｂに示すように、変異構成塩基としてＣを検出するためのクエリプローブ（変異構成塩基としてＴを検出する場合と同一のクエリプローブではある。）と、グアニンを塩基として有するヌクレオチド種を有する標識ヌクレオチドと、標的核酸と、を用いる。 (Linking process)
In the linking step, the target nucleic acid and the query probe are hybridized for each mutation base, and a labeled nucleotide is added to the 3 ′ end of the query probe to obtain a linking molecule. The linking step is performed for each mutation base. That is, when the probe set shown in FIG. 2 is used, as shown in FIG. 1A, when the mutation base is T, a query probe for detecting T as a mutation base and a nucleotide having adenine as a base A labeled nucleotide having a species and a target nucleic acid are used. That is, a combination configured to detect T is used. When the probe set shown in FIG. 3 is used, when the mutation base is C, as shown in FIG. 1B, a query probe for detecting C as the mutation base (T is detected as the mutation base). The same query probe as in the above case), a labeled nucleotide having a nucleotide species having guanine as a base, and a target nucleic acid.

上記のように変異構成塩基毎に準備されたクエリプローブと標識ヌクレオチドの存在下で連結工程を実施することで、意図しないで連結された連結分子の生成を排除できるとともに、他のクエリヌクレオチド種が並存することによって意図した連結分子の生成率がバラツキを抑制できる。特に、変異構成塩基毎にクエリプローブが準備されるときには、意図しない連結分子が生成されてしまって、変異等の検出ができなくなる。   By carrying out the ligation step in the presence of the query probe prepared for each mutation base and the labeled nucleotide as described above, it is possible to eliminate the generation of unintentionally linked molecules, and other query nucleotide species By coexisting, variation in the production rate of the intended linking molecule can be suppressed. In particular, when a query probe is prepared for each mutation-constituting base, an unintended linking molecule is generated, making it impossible to detect mutations and the like.

クエリプローブの３’末端に標識ヌクレオチドを付加するには、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼが用いられる。ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の耐熱性のＤＮＡポリメラーゼである。耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、温度サイクルで変性、アニール、塩基伸長の工程を複数回繰り返すことによって、連結分子の生成量を増加させることができる。ＤＮＡリガーゼは、確実性及び効率の観点から好ましくは耐熱性のＤＮＡリガーゼである。   DNA polymerase or DNA ligase is used to add a labeled nucleotide to the 3 'end of the query probe. The DNA polymerase is preferably a heat-resistant DNA polymerase such as Taq DNA polymerase. By using a heat-resistant DNA polymerase, it is possible to increase the amount of linked molecules generated by repeating the steps of denaturation, annealing, and base extension a plurality of times in a temperature cycle. The DNA ligase is preferably a heat-resistant DNA ligase from the viewpoint of certainty and efficiency.

連結工程の実施により、連結分子が得られる。標識ヌクレオチドは、追加の塩基伸長工程がされないように修飾されているため、連結工程の実施により、クエリ配列の３’末端の隣接ヌクレオチド種に変異構成塩基を相補するヌクレオチド種が連結されて、伸長反応が停止される。この結果、標的核酸中の変異構成塩基を検出可能にキャプチャープローブと関連付けられかつ標識要素が備えられた連結分子が得られる。   By performing the linking step, a linking molecule is obtained. Since the labeled nucleotide is modified so as not to undergo an additional base extension step, by performing the ligation step, the nucleotide species complementary to the mutated base is ligated to the adjacent nucleotide species at the 3 ′ end of the query sequence, thereby extending the labeled nucleotide. The reaction is stopped. As a result, a linking molecule that is associated with the capture probe so as to detect a mutated base in the target nucleic acid and is provided with a labeling element is obtained.

連結分子の一つの形態は、図１Ａ及び図３に示すように、変異構成塩基毎にキャプチャープローブに関連付けられたタグ配列（ＣＰ１（−）及びＣＰ２（−）をそれぞれ有し、変異構成塩基Ａに相補するチミジン（Ｔ）ヌクレオチドが付加された連結分子及び変異構成塩基Ｇに相補するシトシン（Ｃ）ヌクレオチドが付加された連結分子が得られる。これらの連結分子は同一の標識要素を有している。また、他の一つの形態は、図１Ｂ及び図２に示すように、変異構成塩基間で同一のキャプチャープローブに関連付けられたタグ配列（ＣＰ３（−）をそれぞれ有し、変異構成塩基Ｃに相補するグアニン（Ｇ）ヌクレオチドが付加された連結分子及び変異構成塩基Ａに相補するチミン（Ｔ）ヌクレオチドが付加された連結分子が得られる。これらの連結分子は相互に異なる標識要素を有している。   As shown in FIG. 1A and FIG. 3, one form of the linking molecule has tag sequences (CP1 (−) and CP2 (−) associated with the capture probe for each mutation constituent base, respectively. And a linking molecule to which a cytosine (C) nucleotide complementary to the mutant base G is added, and these linking molecules have the same labeling element. 1B and 2, each of the other forms has a tag sequence (CP3 (−)) associated with the same capture probe among the mutated bases, and the mutated base C And a linking molecule to which a thymine (T) nucleotide complementary to the mutant base A is added. Linking molecule has a different label elements mutually.

同時に複数の標的核酸について複数の変異を検出することを考慮すると、図１Ａ及び図３に示す検出形態を好ましく採用できる。標識要素を変異に応じて準備する必要がなく、また、異なるキャプチャープローブで異なる塩基種の変異を検出するため、検出精度もより高いからである。なお、同時に複数の標的核酸について複数の変異を検出するときでも、複数の標的核酸について準備されるクエリヌクレオチドと標的核酸とを一括して変異構成塩基毎に準備した標的ヌクレオチドと反応させればよい。   In consideration of simultaneously detecting a plurality of mutations for a plurality of target nucleic acids, the detection forms shown in FIGS. 1A and 3 can be preferably employed. This is because there is no need to prepare a labeling element according to the mutation, and since the mutation of different base species is detected with different capture probes, the detection accuracy is higher. Even when a plurality of mutations are detected for a plurality of target nucleic acids at the same time, the query nucleotides prepared for the plurality of target nucleic acids and the target nucleic acids may be reacted together with the target nucleotides prepared for each mutation base. .

（接触工程）
接触工程は、連結分子中のタグ配列と相補的なキャプチャー配列を有する２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体上でこれらのキャプチャープローブと連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。この工程によれば、連結分子中のタグ配列がキャプチャープローブ中のキャプチャー配列と一定条件下において選択的にハイブリダイズ部可能な程度に相補的であるとき、これらはハイブリダイズし二重鎖を形成する。この接触工程後において、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション条件は、用いられるキャプチャープローブ等に応じて適宜設定される。 (Contact process)
The contact step is a step of bringing these capture probes and the linking molecule into contact with each other on a solid phase carrier on which two or more types of capture probes having a capture sequence complementary to the tag sequence in the linking molecule are immobilized. is there. According to this step, when the tag sequence in the linking molecule is complementary to the capture sequence in the capture probe so that it can selectively hybridize under certain conditions, they hybridize to form a duplex. To do. After this contact step, a cleaning step may be further included as appropriate. Hybridization conditions are appropriately set according to the capture probe used.

（キャプチャープローブが固定化された固相担体）
接触工程では、２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体を用いることができる。こうした固相担体は、例えばビーズであってもよいし平板であってもよく、材質は特に限定されないが、ガラス製又はプラスチック製の固相担体を用いることができる。好ましくは、固相担体は平板状であり、２種類以上のキャプチャープローブが一定の配列で固定されたアレイである。アレイは、多数個のキャプチャープローブを固定でき、同時に網羅的に各種の多型や変異を検出するのに都合がよい。また、アレイは、一つの固相担体上に複数個の区画された個別のアレイ領域を備えていてもよい。これらの個別のアレイ領域は、それぞれ同一のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよいし、それぞれ別のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよい。 (Solid phase carrier with capture probe immobilized)
In the contact step, a solid phase carrier on which two or more kinds of capture probes are immobilized can be used. Such a solid support may be, for example, a bead or a flat plate, and the material is not particularly limited, but a solid support made of glass or plastic can be used. Preferably, the solid support is a flat plate, and is an array in which two or more types of capture probes are fixed in a fixed arrangement. An array can fix a large number of capture probes, and is convenient for comprehensively detecting various polymorphisms and mutations at the same time. In addition, the array may include a plurality of partitioned individual array regions on a single solid phase carrier. In each of these individual array regions, the same set of capture probes may be immobilized, or different sets of capture probes may be immobilized.

また、好ましい固相担体は、２種類以上のキャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列された配列状態を備えるアレイである。例えば、こうしたアレイを用いて、このキャプチャープローブの順序に沿って、各標的核酸に対応する２種類以上のキャプチャープローブを割り当てることで、キャプチャー配列の融解温度の差に由来するハイブリダイゼーションのバラツキを抑制して、精度よく標的核酸中の変異構成塩基を含む特定部分配列を検出することができる。好ましいアレイの一例を図４に示す。   A preferred solid phase carrier is an array having an arrangement state in which two or more types of capture probes are arranged in an order based on the melting temperature thereof. For example, using such an array, two or more types of capture probes corresponding to each target nucleic acid are assigned in the order of the capture probes, thereby suppressing variations in hybridization resulting from differences in the melting temperatures of the capture sequences. Thus, the specific partial sequence containing the mutated base in the target nucleic acid can be detected with high accuracy. An example of a preferred array is shown in FIG.

接触工程で用いる固相担体は、一つの標的核酸に用いるキャプチャーが互いに隣接する配置状態を備えるアレイであることが好ましい。これらが隣接していることにより、アレイ上におけるハイブリダイゼーションのキャプチャープローブの固定化位置に由来するバラツキを抑制して、精度よく変異構成塩基を含む標的核酸中の特定部分配列を検出することができる。   The solid phase carrier used in the contacting step is preferably an array having an arrangement state in which captures used for one target nucleic acid are adjacent to each other. By being adjacent to each other, it is possible to accurately detect a specific partial sequence in a target nucleic acid containing a mutated base by suppressing variation resulting from the position of the hybridization capture probe immobilized on the array. .

さらに好ましい固相担体は、一つの標的核酸に用いるキャプチャープローブが互いに隣接する配置状態を備え、かつこれらの隣接するキャプチャープローブ間の融解温度の最大温度差（絶対値）が５℃以下好ましくは０．２℃以下となるように配置されているアレイである。こうしたアレイを用いることで、アレイ上でキャプチャープローブの固定化位置及びキャプチャープローブの融解温度の差に基づくハイブリダイゼーションのバラツキを抑制できる。典型的には、多数のキャプチャープローブを融解温度に基づく順序で配列したとき連続して配列されているキャプチャープローブを一つの標的核酸の特定部分配列を検出するための２種類以上のキャプチャープローブとして採用すればよい。   A more preferable solid phase carrier has an arrangement state in which capture probes used for one target nucleic acid are adjacent to each other, and the maximum temperature difference (absolute value) of the melting temperature between these adjacent capture probes is 5 ° C. or less, preferably 0 An array arranged to be 2 ° C. or lower. By using such an array, it is possible to suppress variations in hybridization based on the difference between the capture probe immobilization position and the capture probe melting temperature on the array. Typically, when multiple capture probes are arranged in the order based on the melting temperature, the capture probes arranged in succession are used as two or more types of capture probes for detecting a specific partial sequence of one target nucleic acid. do it.

固相担体に固定化される複数のキャプチャープローブは、それぞれ配列番号１〜１００から選択されるキャプチャー配列を有することができる。なお、これらの塩基配列は既に説明したように、一定条件で設計された正規直交化配列である。   The plurality of capture probes immobilized on the solid phase carrier can each have a capture sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 100. These base sequences are orthonormalized sequences designed under certain conditions, as already described.

キャプチャープローブの固定化形態は特に限定されない。共有結合性であってもよいし非共有結合性であってもよい。キャプチャープローブは、従来公知の各種の方法で固相担体表面に固定化することができる。また、固相担体表面に対しては適当なリンカー配列を備えていてもよい。リンカー配列は、好ましくはキャプチャープローブ間において同一塩基長で同一配列とする。   The immobilization form of the capture probe is not particularly limited. It may be covalent or non-covalent. The capture probe can be immobilized on the surface of the solid support by various conventionally known methods. An appropriate linker sequence may be provided on the surface of the solid phase carrier. The linker sequence is preferably the same sequence with the same base length between the capture probes.

（シグナル強度情報取得工程）
シグナル強度情報取得工程は、ハイブリダイズ後の固相担体上の標識要素に基づくシグナル強度情報を取得する工程である。標的核酸中の変異構成塩基は、所定の標識要素及び所定のキャプチャープローブに予め関連付けされている。このため、所定のキャプチャープローブの位置で所定の標識要素に基づくシグナル強度情報を取得することで、標的核酸中の特定部分配列の有無やその量等を定量することができる。 (Signal intensity information acquisition process)
The signal intensity information acquisition step is a step of acquiring signal intensity information based on the label element on the solid phase carrier after hybridization. Mutant constituent bases in the target nucleic acid are associated in advance with a predetermined labeling element and a predetermined capture probe. Therefore, by acquiring signal intensity information based on a predetermined labeling element at a predetermined capture probe position, the presence or absence of a specific partial sequence in the target nucleic acid, the amount thereof, and the like can be quantified.

こうしたキャプチャープローブに関連付けされたシグナル強度情報は、標的核酸中に存在する変異構成塩基の数だけ得ることができる。すなわち、変異要素塩基毎に異なる標識要素で標識されていても、変異構成塩基舞に異なるキャプチャープローブで識別され同じ標識要素で検出されていても同様である。   The signal intensity information associated with such a capture probe can be obtained by the number of mutated bases present in the target nucleic acid. That is, even if it is labeled with a different labeling element for each mutation element base, it is the same even if it is identified with a different capture probe and detected with the same labeling element.

シグナル強度情報取得工程は、用いた固相担体の形態や標識物質の種類に応じて、従来公知の手法を適宜選択して採用すればよい。典型的には、固相担体からハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチド等を洗浄操作等によって除去した後、付加した標識物質の蛍光シグナルをアレイスキャナ等により検出したり、標識物質に対して化学発光反応を実施したりすることができる。固相担体にビーズを用いた場合には、フローサイトメーターによる検出方法が挙げられる。   In the signal intensity information acquisition step, a conventionally known method may be appropriately selected and employed according to the form of the solid phase carrier used and the type of labeling substance. Typically, oligonucleotides that have not been hybridized from the solid phase carrier are removed by a washing operation, etc., and then the fluorescence signal of the added labeling substance is detected by an array scanner or the like, or a chemiluminescent reaction to the labeling substance Can be implemented. When beads are used as the solid phase carrier, a detection method using a flow cytometer can be used.

（検出工程）
検出工程は、所定の標識要素及び所定のキャプチャープローブに関連付けられた変異構成塩基についてのシグナル強度情報に基づいて、変異構成塩基の有無や比率等を検出する工程である。すなわち、検出工程により、変異の有無、多型のタイプ及び変異率を検出することができる。本発明方法によれば、単時間で標的核酸中の変異を検出するためにキャプチャープローブに関連付けられて所定の標識要素で標識された連結分子を得ることができるため、迅速に変異検出が可能である。特に、複数の（多数の）標的核酸中の複数の（多数の）変異を検出する場合にも、変異構成塩基毎に複数の標的核酸につき一括して実施できる。このため、複数の標的核酸につき複数の変異を検出するにあたっても、一種類の核酸中の一つの変異を検出するのと同じ時間で連結分子を作製できる。したがって、本発明方法は、特に網羅的に遺伝子の変異を検出するのに好ましい。また、本発明方法は、ＳＮＰや変異を効率的にハイスループットで検出するのに特に適している。 (Detection process)
The detection step is a step of detecting the presence / absence, ratio, etc. of the mutated base based on the signal intensity information about the mutated base associated with the predetermined labeling element and the predetermined capture probe. That is, the presence or absence of mutation, the type of polymorphism, and the mutation rate can be detected by the detection step. According to the method of the present invention, in order to detect a mutation in a target nucleic acid in a single time, a linked molecule labeled with a predetermined labeling element associated with a capture probe can be obtained, so that a mutation can be detected quickly. is there. In particular, even when a plurality of (many) mutations in a plurality of (many) target nucleic acids are detected, a plurality of target nucleic acids can be collectively performed for each mutation base. Therefore, when detecting a plurality of mutations for a plurality of target nucleic acids, a linking molecule can be prepared in the same time as detecting one mutation in one kind of nucleic acid. Therefore, the method of the present invention is particularly preferable for comprehensively detecting gene mutations. The method of the present invention is particularly suitable for efficiently detecting SNPs and mutations with high throughput.

標的核酸中の多型又は変異を検出するには、二つの形態がある。一つは、図１Ａ及び図２に示す検出形態である。この形態では、変異構成塩基毎に関連付けられたキャプチャープローブＣＰ１、ＣＰ２について同一の標識要素に基づくシグナル強度情報から変異を検出する。キャプチャープローブＣＰ１及びＣＰ２について得られたシグナル強度情報の比から、多型のタイプ、たとえば、ＡＡホモ、ＧＧホモ及びＡＧヘテロなどの多型のタイプを検出できる。また、Ａが正常型でありＧが変異型である変異であると仮定したとき、[キャプチャープローブＣＰ２について得られたシグナル強度情報／キャプチャープローブＣＰ１、ＣＰ２について得られるシグナル強度情報]を算出することで、変異比率（変異構成塩基がＧである比率）を得ることができる。こうした検出形態では、同一標識要素に基づくシグナル強度情報を利用しているため、標識要素自体の特性や品質に基づくバラツキを抑制して精度よい検出が可能となる。特に、変異比率の取得には、変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブを用いることが好ましい。   There are two forms of detecting polymorphisms or mutations in the target nucleic acid. One is the detection mode shown in FIGS. 1A and 2. In this form, a mutation is detected from signal intensity information based on the same labeling element for the capture probes CP1 and CP2 associated with each mutation base. From the ratio of the signal intensity information obtained for the capture probes CP1 and CP2, polymorphic types, for example, polymorphic types such as AA homo, GG homo and AG hetero can be detected. Further, when it is assumed that A is a normal type and G is a mutant type, [signal intensity information obtained for capture probe CP2 / signal intensity information obtained for capture probes CP1 and CP2] is calculated. Thus, the mutation ratio (ratio in which the mutation base is G) can be obtained. In such a detection form, since signal intensity information based on the same labeling element is used, it is possible to perform accurate detection while suppressing variations based on characteristics and quality of the labeling element itself. In particular, for obtaining the mutation ratio, it is preferable to use a different capture probe for each mutation base.

他の一つの形態は、図１Ｂ及び図３に示す検出形態である。この形態では、同一のキャプチャーＣＰ３についての、変異構成塩基毎に関連付けられた異なる標識要素に基づくシグナル強度情報から変異を検出する。キャプチャープローブＣＰ３について得られた２種類の標識要素についてのシグナル強度情報の比（それぞれのシグナル情報をＸＹ軸にプロットすること）から、多型のタイプ（ＣＣホモ、ＴＴホモ及びＣＴヘテロ）を検出できる。また、図１Ａ等の検出形態と同様に変異比率を得ることができる。   Another form is the detection form shown in FIGS. 1B and 3. In this form, a mutation is detected from signal intensity information based on different labeling elements associated with each mutation constituent base for the same capture CP3. Polymorphic types (CC homo, TT homo and CT hetero) are detected from the ratio of signal intensity information for two types of labeling elements obtained for the capture probe CP3 (plotting each signal information on the XY axes) it can. Further, the mutation ratio can be obtained in the same manner as in the detection mode of FIG.

標的核酸中の変異構成塩基を異なるキャプチャープローブで検出する場合、キャプチャープローブは融解温度が近いものを採用しているものの融解温度及びその他の事情によりキャプチャープローブ間におけるハイブリダイズ量にバイアスが生じる可能性があるが、以下のように各工程を実施することでこれを抑制又は回避することができる。   When detecting the bases of mutations in target nucleic acids with different capture probes, the capture probes may be close in melting temperature, but there may be a bias in the amount of hybridization between the capture probes depending on the melting temperature and other circumstances. However, this can be suppressed or avoided by performing each step as follows.

例えば、連結分子とともに、ターゲットとするキャプチャープローブ毎に、所定のタグ配列と標的核酸について用いたのとは異なる標識物質とを備え相互に同一濃度で準備した補正用オリゴヌクレオチドを、固相担体上で前記キャプチャープローブとハイブリダイズ可能に接触させるようにし、シグナル強度情報取得工程で標的核酸及び補正用オリゴヌクレオチドについてのシグナル強度情報を取得する。キャプチャープローブ間での補正用シグナル強度情報の大小を比較することで、キャプチャープローブ間のハイブリダイゼーション効率（量）の差の有無を検出できる。キャプチャープローブ間で得られたシグナル強度に差が生じた場合には、そのようなシグナル強度の差が連結分子にも存在するとして補正する。こうした補正用シグナル強度情報を利用した補正は、多型の有無（タイプ）並びに変異の有無及び変異率のいずれを得る場合にも適用できるとともに、後述する参照用シグナル強度情報に基づく補正と併用することができる。   For example, for each target capture probe, together with a linking molecule, a correction oligonucleotide prepared with a predetermined tag sequence and a labeling substance different from that used for the target nucleic acid and prepared at the same concentration is placed on the solid phase carrier. The signal intensity information about the target nucleic acid and the correction oligonucleotide is acquired in the signal intensity information acquisition step. By comparing the magnitude of the correction signal intensity information between the capture probes, it is possible to detect the presence or absence of a difference in hybridization efficiency (amount) between the capture probes. If a difference occurs in the signal intensity obtained between the capture probes, it is corrected that such a difference in signal intensity is also present in the linking molecule. Such correction using the correction signal intensity information can be applied to obtain the presence or absence of polymorphism (type), the presence or absence of mutation, and the mutation rate, and is used in combination with correction based on reference signal intensity information described later. be able to.

遺伝子変異を検出及び変異率を定量するときには、例えば、標的核酸に替えて準備した、検出しようとする前記変異について所定の比率で変異構成塩基を備える参照用オリゴヌクレオチドにつき、接触工程、連結工程、接触工程及び前記シグナル強度情報取得工程を実施して、前記参照用オリゴヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報を利用して前記検出工程を実施することができる。好ましくは、２種類以上の変異比率で準備した参照用オリヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報に基づいて検量線を作製し、この検量線を利用して試料中の標的核酸中の多型や変異などを検出し変異率を定量することができる。検量線を用いることで精度の高い検出及び定量が可能となる。なお、参照用シグナル強度情報の取得及び検量線の作製は予め行っておいてもよいし、標的核酸についての変異検出時に同時に行ってもよい。   When detecting a gene mutation and quantifying the mutation rate, for example, for a reference oligonucleotide prepared in place of a target nucleic acid and having a mutation-constituting base at a predetermined ratio for the mutation to be detected, a contact step, a linking step, The detection step can be performed using the reference signal intensity information acquired for the reference oligonucleotide by performing the contact step and the signal intensity information acquisition step. Preferably, a calibration curve is prepared based on the reference signal intensity information acquired for the reference oligonucleotide prepared at two or more mutation ratios, and the polymorphism in the target nucleic acid in the sample is obtained using this calibration curve. Mutation rates can be detected and the mutation rate can be quantified. By using a calibration curve, highly accurate detection and quantification are possible. Note that acquisition of reference signal intensity information and preparation of a calibration curve may be performed in advance, or may be performed at the same time as detecting a mutation in the target nucleic acid.

なお、補正に関して用いる参照用オリゴヌクレオチド及び補正用オリゴヌクレオチドは、必ずしも1本鎖で準備される必要はなく、２本鎖であってもよい。   Note that the reference oligonucleotide and the correction oligonucleotide used for correction do not necessarily have to be prepared in a single strand, and may be in a double strand.

（プローブセット）
本発明のプローブセットは、固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出するのに用いるプローブセットである。本発明のプローブセットは、標的核酸中の特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎にキャプチャープローブと標識ヌクレオチドとを備えている。キャプチャープローブと標識ヌクレオチドについては既に説明したとおりである。
既に説明したキャプチャープローブと標識ヌクレオチドを用いることで、標的核酸中の変異を迅速に検出できる。本発明のプローブセットは、このようなキャプチャープローブが固定化されたアレイなどの固相担体とキット化されていてもよい。 (Probe set)
The probe set of the present invention is a probe set used for detecting at least one mutation in a target nucleic acid using a capture probe immobilized on a solid phase carrier. The probe set of the present invention includes a capture probe and a labeled nucleotide for each mutation base that may be detected at a specific site in a target nucleic acid. The capture probe and the labeled nucleotide are as described above.
By using the capture probe and the labeled nucleotide already described, mutations in the target nucleic acid can be rapidly detected. The probe set of the present invention may be kitted with a solid phase carrier such as an array on which such capture probes are immobilized.

以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。以下の実施例では、本発明の検出方法による遺伝子変異（ＳＮＰ）の検出を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。
（1）変異遺伝子検出用DNAマイクロアレイの作製
（2）サンプル遺伝子の増幅
（3）連結（ラベル化含む）反応
（4）DNAマイクロアレイを用いた検出
（5）データ解析 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, a following example does not limit this invention. In the following examples, gene mutation (SNP) was detected by the following procedure using the detection method of the present invention. Hereinafter, it demonstrates according to these order.
(1) Preparation of DNA microarray for detecting mutant genes (2) Amplification of sample genes (3) Ligation (including labeling) reaction (4) Detection using DNA microarray (5) Data analysis

(1)変異遺伝子（SNP遺伝子）検出用DNAマイクロアレイの作製
商業的に入手したプラスチック基板に、3’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴDNA（株式会社日本遺伝子研究所製）を溶かした水溶液をキャプチャープローブとし、日本ガイシ株式会社にてGENESHOTスポッターを用いてスポットした。使用した合成オリゴDNA配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table1記載のD1_1からD1_100のうちTmが高い順に、D1_52, D1_71, D1_93, D1_74, D1_41, D1_92, D1_79, D1_78, D1_65の9種とした(表1)。 スポットの後、80℃、1時間のベークを行った。さらに、以下に記載した手順で、合成オリゴDNAの固定化を行った。 (1) Preparation of DNA microarray for detecting mutant genes (SNP genes) An aqueous solution in which a synthetic oligo DNA (manufactured by Nippon Genetic Laboratory Co., Ltd.) with a 3 'end modified with an amino group was dissolved in a commercially available plastic substrate As a capture probe, spotting was performed at NGK Corporation using a GENESHOT spotter. The synthetic oligo DNA sequences used were D1_52, D1_71, D1_93, D1_74, D1_41, D1_92, D1_79, D1_78 in descending order of Tm among D1_1 to D1_100 described in Supplementary Table 1 of the literature (Analytical Biochemistry 364 (2007) 78-85). , D1_65 (Table 1). After the spot, baking was performed at 80 ° C. for 1 hour. Furthermore, the synthetic oligo DNA was immobilized by the procedure described below.

合成オリゴＤＮＡは以下の手順で固定化した。上記ベーク後、2×SSC/0.2％SDSによる洗浄を15分間実施し、 95℃ 2×SSC/0.2％SDSによる洗浄を5分間実施し、さらに、滅菌水洗浄（10回上下振とう） 3回を行った後、 遠心（1000rpm×3分)により液切りした。   The synthetic oligo DNA was immobilized by the following procedure. After baking, wash with 2 × SSC / 0.2% SDS for 15 minutes, wash with 95 ° C 2 × SSC / 0.2% SDS for 5 minutes, and then wash with sterilized water (10 shaking up and down) 3 times Then, the solution was removed by centrifugation (1000 rpm × 3 minutes).

（２）変異遺伝子サンプルの調製と増幅
検出対象とする変異遺伝子の塩基配列は、以下の表に示す変異遺伝子周辺配列を持っている。いずれも150bp程度の人工合成遺伝子である。４種類の変異遺伝子サンプルは、以下の変異１〜４の野生型及び変異型のそれぞれ合成オリゴＤＮＡを５とおりの比率（野生型：変異型の比を100：0、95：5、90：10、75：25、50：50の5通り）で含んだものとして調製した。 (2) Preparation and amplification of mutant gene sample The base sequence of the mutant gene to be detected has the sequence around the mutant gene shown in the following table. Both are artificially synthesized genes of about 150 bp. The four types of mutant gene samples were composed of five types of the following synthetic oligo DNAs of wild type and mutant type 1 to 4 (ratio of wild type: mutant type: 100: 0, 95: 5, 90:10). , 75:25, 50:50).

サンプル増幅手順は以下の通りであった。サンプル増幅用試薬として、TaKaRa Bio社のTaKaRa Ex Taq(R)（Catalog# RR001B）を使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用した。なお、PCRプライマーについてはTm=58.90±0.75℃の範囲となるよう設計を行った。各プライマー配列を表3に示す。 The sample amplification procedure was as follows. As a sample amplification reagent, TaKaRa Ex Taq (R) (Catalog # RR001B) manufactured by TaKaRa Bio was used. As a thermal cycler, Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 was used. The PCR primer was designed to be in the range of Tm = 58.90 ± 0.75 ° C. Each primer sequence is shown in Table 3.

変異遺伝子サンプル増幅は以下のようにして行った。なお、本実施例では、各変異遺伝子サンプルにつき個々に増幅した。まず、以下の試薬を個々の変異遺伝子サンプルごとに調製した。   Mutant gene sample amplification was performed as follows. In this example, each mutant gene sample was amplified individually. First, the following reagents were prepared for each mutant gene sample.

次いで、サーマルサイクル反応を行った。具体的には、94℃で30秒後、94℃で40秒、66℃で40秒及び72℃で2分を40サイクル行い、その後4℃に下げた。個々に増幅した産物（計4変異種）を変異遺伝子割合ごとにチューブに混ぜ、PCR productsとし、野生遺伝子：変異遺伝子比が100：0、95：5、90：10、75：25、50：50の5チューブを調製した。以上により、標的変異遺伝子を含むPCR産物５種を得た。   Next, a thermal cycle reaction was performed. Specifically, 40 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 94 ° C. for 40 seconds, 66 ° C. for 40 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes were performed, and then the temperature was lowered to 4 ° C. Individually amplified products (total 4 variants) are mixed in tubes for each mutant gene ratio to make PCR products, and the wild gene: mutant gene ratio is 100: 0, 95: 5, 90:10, 75:25, 50: Fifty 5 tubes were prepared. As described above, 5 kinds of PCR products containing the target mutant gene were obtained.

（３）連結(ラベル化込み)反応
増幅済みサンプルのライゲーション（ラベル化込み）反応手順は以下の通りに行った。反応にはTaKaRa Bio社のTaKaRa Ex Taq(R)(RR001A)を使用した。加熱にはサーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用した。なお、クエリプローブ配列及び試薬を以下の表に示す。 (3) Ligation (labeling) reaction The ligation (labeling) reaction procedure of the amplified sample was performed as follows. TaKaRa Bio TaKaRa Ex Taq (R) (RR001A) was used for the reaction. GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used as a thermal cycler for heating. The query probe sequences and reagents are shown in the following table.

まず、上記試薬を調製した。なお、試薬は、変異遺伝子サンプルの異なる変異遺伝子割合毎に調製した。Cy3標識ddNTPおよびクエリプローブの組合せについては、以下の表に示す通りとした。なお、以下の表においてYはクエリプローブ数を表す。   First, the reagent was prepared. Reagents were prepared for each different mutant gene ratio in the mutant gene sample. The combinations of Cy3-labeled ddNTP and query probe were as shown in the following table. In the table below, Y represents the number of query probes.

連結反応（一塩基伸長反応）は、以下のとおりに行った。すなわち、９２℃で1分の後、３０℃で１５分、７５℃で１０分、その後、１０℃に冷却した。次に、５通りの変異遺伝子割合ごとに得られた産物各４種類を混合したものを各変異遺伝子割合に対する産物（５種）とした。   The ligation reaction (single base extension reaction) was performed as follows. That is, after 1 minute at 92 ° C, 15 minutes at 30 ° C, 10 minutes at 75 ° C, and then cooled to 10 ° C. Next, a mixture of 4 types of products obtained for each of the 5 mutant gene ratios was used as a product (5 types) for each mutant gene ratio.

（４）DNAマイクロアレイを用いた検出
ラベル化済みサンプルを用いたDNAマイクロアレイへの反応及びその検出手順は以下の通りとした。ハイブリダイズ用の標識サンプル溶液の組成を以下の表に示す。
(4) Detection using DNA microarray The reaction to the DNA microarray using the labeled sample and the detection procedure were as follows. The composition of the labeled sample solution for hybridization is shown in the following table.

（ハイブリダイズ）
調製した標識サンプル溶液を、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用し、90℃で1分加熱した後、ヒートブロック(TAITEC社DTU-N）を使用し80℃で1分加熱した。次いで、上記サンプル溶液を各9μｌずつ、DNAマイクロアレイのスポットエリアにかけ、乾燥防止のためコンフォート／プラス用サーモブロックＳｌｉｄｅ（eppendorf社）を使用し、37℃で60分間静置することによりハイブリダイズ反応を行った。 (Hybridization)
The prepared labeled sample solution was heated at 90 ° C. for 1 minute using GeneAmp PCR System 9700 from Applied Biosystems, and then heated at 80 ° C. for 1 minute using a heat block (TATUC DTU-N). Next, 9 μl each of the above sample solution was applied to the spot area of the DNA microarray, and the hybridization reaction was carried out by allowing it to stand at 37 ° C. for 60 minutes using a comfort / plus thermoblock Slide (eppendorf) to prevent drying. went.

（洗浄）
洗浄は以下のように行った。すなわち、以下に示す組成の洗浄液をガラス染色バットに移した後、ハイブリダイズ反応終了後のガラス基板を浸漬し、5分間上下振とうして行った。その後、滅菌水を入れたガラス染色バットにガラス基板を移し、1分間上下振とうし、さらに、2000rpmで1分間遠心乾燥し、ガラス基板表面に残った水分を除去した。 (Washing)
Washing was performed as follows. That is, the cleaning liquid having the composition shown below was transferred to a glass dyeing vat, and then the glass substrate after completion of the hybridization reaction was immersed and shaken up and down for 5 minutes. Thereafter, the glass substrate was transferred to a glass staining vat containing sterilized water, shaken up and down for 1 minute, and further centrifuged and dried at 2000 rpm for 1 minute to remove moisture remaining on the glass substrate surface.

（スキャナーによる蛍光検出）
Appleied Precision社ArrayWoRxを使用して適宜、露光時間を調節し、蛍光画像を取得した。さらにGenePix Proを使用し、得られた画像の蛍光シグナルの数値化を行った。 (Fluorescence detection by scanner)
Using an Appleied Precision ArrayWoRx, the exposure time was appropriately adjusted to obtain a fluorescence image. Furthermore, using GenePix Pro, the fluorescence signal of the obtained image was digitized.

（５）データ解析
キャプチャー間のハイブリダイズ効率(量)の差の有無を確認するため、同時にハイブリダイズしたHybri Controlの蛍光シグナルを測定した。変異1遺伝子検出用スポット（D1_52およびD1_71）それぞれの測定結果を以下の表に示す。 (5) Data analysis In order to confirm the presence or absence of the difference in hybridization efficiency (amount) between captures, the fluorescence signal of hybrid control hybridized simultaneously was measured. The following table shows the measurement results of the spot for detecting mutation 1 gene (D1_52 and D1_71).

表１０の結果より、変異1遺伝子検出用の２スポット間の蛍光シグナル比はほぼ1であり、２スポット間のハイブリダイズ吸着量に大きな差はないと考えられる。よって、変異1遺伝子検出用スポットの補正は不要と判断した。   From the results of Table 10, the fluorescence signal ratio between the two spots for detecting the mutation 1 gene is almost 1, and it is considered that there is no significant difference in the amount of hybridized adsorption between the two spots. Therefore, it was determined that correction of the spot for detecting mutation 1 gene was unnecessary.

次に、変異1遺伝子についてスキャナーによる蛍光シグナル検出（D1_52およびD1_71）を行った。結果を以下の表に示す。   Next, fluorescence signal detection (D1_52 and D1_71) was performed for the mutation 1 gene using a scanner. The results are shown in the table below.

表１１の結果をもとに、横軸に変異遺伝子割合、縦軸にＢ／（Ａ＋Ｂ）をプロットし、検量線を作成した。結果を図５に示す。   Based on the results in Table 11, a calibration curve was prepared by plotting the mutant gene ratio on the horizontal axis and B / (A + B) on the vertical axis. The results are shown in FIG.

これらの結果によれば、変異遺伝子における変異型の存在を容易に検出することができ、低い変異率であっても容易に検出することができることが分かった。また、野生型：変異型の比率も容易に検出できることが分かった。   According to these results, it was found that the presence of the mutant type in the mutant gene can be easily detected, and can be easily detected even at a low mutation rate. It was also found that the wild type: mutant type ratio could be easily detected.

以上説明したように、本発明により、従来の連結・コード化工程及び標識工程を同時に行うことが可能となった。その結果、連結と標識とを実施するのに必要な時間は１．５時間となり、工程を実施するのに必要な時間を、従来の５時間の１／３以下の時間に短縮することが可能となった。なお、こうした工程時間の短縮にも関わらず、低い変異率の場合でも精度よく検出できたことから、本発明によれば、検出精度を落とすことなく工程時間を短縮できることがわかった。   As described above, according to the present invention, it has become possible to simultaneously perform the conventional linking / coding process and labeling process. As a result, the time required for carrying out the linking and labeling is 1.5 hours, and the time required for carrying out the process can be shortened to 1/3 or less of the conventional 5 hours. It became. In spite of such shortening of the process time, it was found that the process time could be shortened without degrading the detection accuracy because the detection was possible with high accuracy even in the case of a low mutation rate.

本発明の検出形態の一例の概要を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the outline | summary of an example of the detection form of this invention. 本発明の検出形態の他の一例の概要を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the outline | summary of another example of the detection form of this invention. 本発明に用いるクエリプローブと標識ヌクレオチドとの組み合わせの一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the combination of the query probe and labeled nucleotide which are used for this invention. 本発明に用いるクエリプローブと標識ヌクレオチドとの組み合わせの他の一例を示す図である。It is a figure which shows another example of the combination of the query probe used for this invention, and a labeled nucleotide. 本発明に用いるタグ配列とキャプチャー配列の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the tag arrangement | sequence and capture arrangement | sequence used for this invention. 実施例で作成した検量線を示す図である。It is a figure which shows the calibration curve created in the Example. 従来技術によるＳＮＰ検出形態を示す図である。It is a figure which shows the SNP detection form by a prior art.

配列番号１〜１０９：キャプチャープローブ、配列番号１１０〜１１７：人工合成遺伝子、配列番号１１８〜１２５：プライマー、配列番号１２６〜１３３：合成プローブ SEQ ID NOs: 1 to 109: capture probes, SEQ ID NOs: 110 to 117: artificially synthesized genes, SEQ ID NOs: 118 to 125: primers, SEQ ID NOs: 126 to 133: synthetic probes

Claims (10)

固相担体上に固定化された複数種類のキャプチャープローブを用いて標的核酸中の変異を検出する方法であって、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を用いて、以下の工程（１）〜（３）：
（１）前記変異構成塩基毎に、前記標的核酸と前記クエリプローブとをハイブリダイズさせるとともに、前記クエリプローブの３’末端に標識ヌクレオチドを連結して連結分子を得る連結工程と、
（２）前記変異構成塩基毎に得られる前記連結分子と前記キャプチャープローブとを前記固相担体上でハイブリダイズ可能に接触させる接触工程と、
（３）前記固相担体上において前記キャプチャープローブ毎に前記標識要素に基づくシグナル情報を取得するシグナル情報取得工程と、
を実施する、検出方法。 A method for detecting a mutation in a target nucleic acid using a plurality of types of capture probes immobilized on a solid phase carrier,
The following (a) and (b) for each mutated base that may be detected at a specific site for the mutation in the target nucleic acid:
(A) a capture sequence that hybridizes with the capture probe and a complementary query sequence to a base sequence adjacent to a specific site in the target nucleic acid, and a nucleotide species adjacent to the specific site in the target nucleic acid A query probe comprising at the 3 ′ end a nucleotide species to be
(B) a labeled nucleotide having a query nucleotide that complements the nucleotide species at the specific site in the target nucleic acid and comprising a labeling element;
The following steps (1) to (3):
(1) A linking step for hybridizing the target nucleic acid and the query probe for each of the mutated bases, and linking a labeled nucleotide to the 3 ′ end of the query probe to obtain a linking molecule;
(2) a contact step in which the linking molecule obtained for each of the mutation-constituting bases and the capture probe are brought into contact with each other so as to be hybridizable on the solid phase carrier;
(3) a signal information acquisition step of acquiring signal information based on the labeling element for each capture probe on the solid phase carrier;
A detection method is carried out. 前記標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド種として前記クエリクレオチドのみを有し、当該クエリヌクレオチドで連結反応が終結されるように形成されている、請求項１に記載の検出方法。   The detection method according to claim 1, wherein the labeled nucleotide has only the query nucleotide as a nucleotide species, and is formed so that a ligation reaction is terminated by the query nucleotide. 前記変異につき、
前記クエリプローブは、前記変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備え、
前記標識ヌクレオチドは、相互に同一の標識要素を備える、
請求項１又は２に記載の検出方法。 For the mutation,
The query probe comprises a capture sequence that hybridizes with a different capture probe for each of the mutated bases,
The labeled nucleotides comprise mutually identical labeling elements,
The detection method according to claim 1 or 2. 前記変異の有無又は前記構成変異塩基の比率を、以下の式；
[前記変異構成塩基の一つについて得られた連結分子がハイブリダイズしたキャプチャープローブについて得られるシグナル強度の比]／[前記変異について得られたすべての連結分子がハイブリダイズしたキャプチャープローブについて得られるシグナル強度の和]
に基づいて検出する、請求項３に記載の検出方法。 The presence or absence of the mutation or the ratio of the constitutive mutant base is expressed by the following formula:
[Ratio of signal intensity obtained for a capture probe hybridized with a linking molecule obtained for one of the mutation-constituting bases] / [Signal obtained for a capture probe hybridized with all ligation molecules obtained for the mutation Sum of strength]
The detection method according to claim 3, wherein the detection is performed based on. 前記変異につき、
前記クエリプローブは、前記変異構成塩基間に同一のキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備え、
前記標識ヌクレオチドは、前記変異構成塩基毎に異なる標識要素を備える、
請求項１又は２に記載の検出方法。 For the mutation,
The query probe comprises a capture sequence that hybridizes with the same capture probe between the mutated bases,
The labeled nucleotide comprises a different labeling element for each of the mutated constituent bases,
The detection method according to claim 1 or 2. 前記接触工程は、前記変異構成塩基毎に実施された連結工程の各連結分子の混合物を一つの前記固相担体上に供給することを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法。   The detection method according to claim 1, wherein the contacting step includes supplying a mixture of each linking molecule in the linking step performed for each of the mutated bases onto one solid phase carrier. . １種又は２種以上の標的核酸についての複数の変異を検出するのにあたり、複数の変異につき前記（１）〜（３）の各工程をそれぞれ一括して実施する、請求項１〜６のずれかに記載の検出方法。   The shift according to claim 1, wherein each of the steps (1) to (3) is collectively performed for detecting a plurality of mutations for one or more types of target nucleic acids. The detection method of crab. 前記複数の標的核酸は、検体中の核酸に対してマルチプレックスＰＣＲにて準備する、請求項７に載の検出方法。   The detection method according to claim 7, wherein the plurality of target nucleic acids are prepared by multiplex PCR with respect to nucleic acids in a specimen. 固相担体上に固定化された複数種類のキャプチャープローブを用いて標的核酸中の変異を検出するためのキットであって、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を備える、キット。 A kit for detecting a mutation in a target nucleic acid using a plurality of types of capture probes immobilized on a solid phase carrier,
The following (a) and (b) for each mutated base that may be detected at a specific site for the mutation in the target nucleic acid:
(A) a capture sequence that hybridizes with the capture probe and a complementary query sequence to a base sequence adjacent to a specific site in the target nucleic acid, and a nucleotide species adjacent to the specific site in the target nucleic acid A query probe comprising at the 3 ′ end a nucleotide species to be
(B) a labeled nucleotide having a query nucleotide that complements the nucleotide species at the specific site in the target nucleic acid and comprising a labeling element;
A kit comprising: 標的核酸中の変異を検出するのに用いるキットであって、
複数のキャプチャープローブを備える固相担体と、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を備える、キット。 A kit used to detect a mutation in a target nucleic acid,
A solid support comprising a plurality of capture probes;
The following (a) and (b) for each mutated base that may be detected at a specific site for the mutation in the target nucleic acid:
(A) a capture sequence that hybridizes with the capture probe and a complementary query sequence to a base sequence adjacent to a specific site in the target nucleic acid, and a nucleotide species adjacent to the specific site in the target nucleic acid A query probe comprising at the 3 ′ end a nucleotide species to be
(B) a labeled nucleotide having a query nucleotide that complements the nucleotide species at the specific site in the target nucleic acid and comprising a labeling element;
A kit comprising:
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