JP5165933B2 - Method and array for detecting specific partial sequence in target nucleic acid - Google Patents

Method and array for detecting specific partial sequence in target nucleic acid Download PDF

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Description

本発明は、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）や遺伝子上の変異などの特定塩基配列を有する標的核酸の検出及び定量技術に関する。   The present invention relates to a technique for detecting and quantifying a target nucleic acid having a specific base sequence such as a single nucleotide polymorphism or a mutation on a gene.

ヒトなどにおけるＳＮＰや遺伝子変異は体質や遺伝病のみならず、特定疾患についての罹患率、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択等にも関連していることがわかっている。ＳＮＰや遺伝子変異は、通常、複数個が関連しているとともに、個別化医療の促進のためには、できるだけ多くのＳＮＰや変異を網羅的に検出又は定量することが求められている。   It has been found that SNPs and gene mutations in humans and the like are related not only to constitution and genetic diseases, but also to the prevalence of specific diseases, disease diagnosis, prognosis of treatment, selection of drugs and treatments, and the like. A plurality of SNPs and gene mutations are usually related, and in order to promote personalized medicine, it is required to comprehensively detect or quantify as many SNPs and mutations as possible.

そこで、ＳＮＰ等を効率的に検出又は定量する方法として、ＤＮＡコンピュータ技術を利用した方法が提案されている（非特許文献１）。この方法では、図５に示すように、標識用タグ配列とＳＮＰの特定塩基を含む部分配列に相補的なクエリ配列とを有する２種類の５’クエリプローブと、前記部分配列に隣接する共通部分配列とキャプチャーに相補的な識別用タグ配列とを有する一つの３’クエリプローブと、を用いる。２種類の５’クエリプローブの各標識用タグ配列１、２は、それぞれのクエリ配列を区別可能に、例えば、Ｃｙ３とＣｙ５等の異なる標識物質で標識可能に形成されている。   Therefore, a method using DNA computer technology has been proposed as a method for efficiently detecting or quantifying SNP or the like (Non-patent Document 1). In this method, as shown in FIG. 5, two types of 5 ′ query probes having a tag sequence for labeling and a query sequence complementary to a partial sequence containing a specific base of SNP, and a common portion adjacent to the partial sequence One 3 ′ query probe having a sequence and an identifying tag sequence complementary to the capture is used. The tag sequences 1 and 2 for labeling of the two kinds of 5 'query probes are formed so that the respective query sequences can be distinguished, for example, capable of labeling with different labeling substances such as Cy3 and Cy5.

この方法は、これらのプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応及びライゲーション反応によって、５’クエリプローブと３’クエリプローブとを連結させる（エンコード）。次いで、得られた連結分子の標識用タグ配列を利用してＰＣＲでラベリングする。こうした連結及びラベリングにより、ＳＮＰの特定塩基に関連付けた標識物質を備え、かつ一種類の識別用タグ配列を備える連結分子を得る。さらに、ラベリングした連結分子を識別用タグ配列に相補的なキャプチャープローブが固定化されたアレイで検出するというものである。   In this method, a 5 'query probe and a 3' query probe are linked (encoded) by a hybridization reaction and a ligation reaction between these probes and a target nucleic acid. Next, labeling is performed by PCR using the tag sequence for labeling of the obtained linking molecule. By such ligation and labeling, a linking molecule having a labeling substance associated with a specific base of SNP and having one kind of identification tag sequence is obtained. Further, the labeled linking molecule is detected with an array in which capture probes complementary to the identification tag sequence are immobilized.

この方法では、２種類の異なる標識物質を有する連結分子が識別用タグ配列を介して一つのキャプチャープローブにハイブリダイズしたときの、それぞれの標識物質に基づくシグナル強度のプロットに基づいてＳＮＰのタイプ（２種類のホモと１種類のヘテロ）を検出する。
Analytical Biochemistry 364(2007)78-85 In this method, when a linking molecule having two different labeling substances is hybridized to one capture probe via an identification tag sequence, the SNP type (based on a plot of signal intensity based on each labeling substance ( 2 types of homo and 1 type of hetero) are detected.
Analytical Biochemistry 364 (2007) 78-85

上記非特許文献１に記載の方法は、標的核酸中の特定部分配列に応じたキャプチャープローブを固定化した固相担体を準備することなく、特定塩基を含む部分配列とは無関係に設定した塩基配列を有するキャプチャープローブを固定化したユニバーサルな固相担体を利用できるという利点がある。また、ＳＮＰを構成する２種類の塩基置換を２種類の標識物質を用いて一つのキャプチャープローブで検出するため、網羅的に多数のＳＮＰを検出できるという利点もある。   The method described in Non-Patent Document 1 includes a base sequence set independently of a partial sequence containing a specific base without preparing a solid phase carrier on which a capture probe corresponding to the specific partial sequence in a target nucleic acid is immobilized. There is an advantage that a universal solid-phase carrier on which a capture probe having s is immobilized can be used. In addition, since two types of base substitutions constituting the SNP are detected with one capture probe using two types of labeling substances, there is also an advantage that a large number of SNPs can be comprehensively detected.

しかしながら、ＳＮＰのタイプ判別をシグナル強度のプロットによる以上、連結分子が十分量ない場合や繰り返し数が少ない場合などには、ＳＮＰのタイプ判別の精度が十分でないことも考えられる。また、標的核酸中の特定部分配列の検出を異なる標識物質（２種類）を利用して行う以上、標識物質間の退色性などの特性の差が現われた場合には、ＳＮＰのタイプ判別において十分な精度を確保できないおそれがある。さらに、こうした事情から、ＳＮＰよりもバリエーションに富む遺伝子変異を検出しその変異率などを定量するのは困難な場合があると考えられる。   However, since the SNP type discrimination is based on the signal intensity plot, the accuracy of the SNP type discrimination may not be sufficient when there are not enough connected molecules or when the number of repeats is small. In addition, since the detection of the specific partial sequence in the target nucleic acid is performed using different labeling substances (two types), if there is a difference in characteristics such as fading between the labeling substances, the SNP type determination is sufficient. May not be able to ensure accurate accuracy. Furthermore, from such circumstances, it may be difficult to detect gene mutations richer in variation than SNP and quantify the mutation rate.

そこで、本発明は、精度良く標的核酸中の多型や変異などの特定部分配列を検出又は定量する方法及びそのためのアレイを提供することを一つの目的とする。また、本発明は、容易に標的核酸中の変異やその変異率を検出又は定量する方法及びそのためのアレイを提供することを他の一つの目的とする。   Therefore, an object of the present invention is to provide a method for detecting or quantifying specific partial sequences such as polymorphisms and mutations in a target nucleic acid with high accuracy, and an array therefor. Another object of the present invention is to provide a method for easily detecting or quantifying a mutation in a target nucleic acid and its mutation rate and an array therefor.

本発明者らは、標的核酸中の特定部分配列を検出するのにあたり、クエリプローブの連結分子を、標的核酸中の検出しようとする多型や変異の種類に応じて複数種類の標識物質を対応させるのではなく、多型等の種類に応じて複数種類の識別用タグ配列を対応させて形成し、これらの識別用タグ配列に基づいて異なるキャプチャープローブに連結分子をハイブリダイズさせることで、ユニバーサルな固相担体を用いつつ、標識物質の特性差等に基づく誤差等を抑制して精度よく多型等を検出できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。   In detecting a specific partial sequence in a target nucleic acid, the present inventors correspond to a query probe linking molecule with multiple types of labeling substances according to the polymorphism or mutation type to be detected in the target nucleic acid. Rather than letting it form, multiple types of identification tag sequences are made to correspond according to the type of polymorphism, etc., and the linking molecules are hybridized to different capture probes based on these identification tag sequences, so that universal The present inventors have found that polymorphs and the like can be detected with high accuracy by using a solid phase carrier while suppressing errors based on the difference in properties of the labeling substance. That is, according to the present invention, the following means are provided.

本発明によれば、試料中の１種又は２種以上の標的核酸中の多型又は変異を検出する方法であって、少なくとも一種の前記標的核酸中の検出しようとする前記多型又は前記変異を構成する少なくとも１個の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを備える２種類以上の第１のクエリプローブからなる第１のクエリプローブセットと、前記標的核酸の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的なクエリ配列と標識を付加するための標識用タグ配列とを備える第２のクエリプローブと、標的核酸と、をハイブリダイズ可能に接触させる第１の接触工程と、前記一つの標的核酸にハイブリダイズした前記第１のクエリプローブと前記第２のクエリプローブとを連結してこれらの連結分子を取得する連結工程と、前記連結分子が備える前記標識用タグ配列を用いて前記連結分子を単一の標識物質で標識して標識済み連結分子を取得する標識工程と、前記識別用タグ配列に相補的又は相同的なキャプチャー配列を有し前記特定部分配列に関連付けられた２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体上でこれらのキャプチャープローブと前記標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる第２の接触工程と、ハイブリダイズ後の前記固相担体上の前記標識物質に基づく前記一つの標的核酸についての２種類以上のシグナル強度情報を取得するシグナル強度情報取得工程と、前記２種類以上のシグナル強度情報に基づいて前記一つの標的核酸中の前記多型又は前記変異を検出する検出工程と、を備える方法が提供される。   According to the present invention, there is provided a method for detecting a polymorphism or mutation in one or more target nucleic acids in a sample, the polymorphism or mutation to be detected in at least one target nucleic acid. A first query consisting of two or more types of first query probes comprising a query sequence complementary to a specific partial sequence comprising at least one base constituting the base and an identification tag sequence capable of identifying the specific partial sequence A target query nucleic acid is hybridized with a probe set, a second query probe comprising a query sequence complementary to a partial sequence adjacent to the specific partial sequence of the target nucleic acid, and a tag sequence for labeling for adding a label. A first contacting step for allowing soy contact, and the first query probe and the second query probe hybridized to the one target nucleic acid to link these linked molecules. Complementary to the linking step to acquire, a labeling step to label the linking molecule with a single labeling substance using the labeling tag sequence provided in the linking molecule to obtain a labeled linking molecule, and the identification tag sequence These capture probes and the labeled linking molecule are brought into contact with each other on a solid phase carrier on which two or more types of capture probes associated with the specific partial sequence having a specific or homologous capture sequence are immobilized. A second contact step, a signal intensity information acquisition step for acquiring two or more types of signal intensity information for the one target nucleic acid based on the labeling substance on the solid phase carrier after hybridization, and the two types And a detection step of detecting the polymorphism or the mutation in the one target nucleic acid based on the signal intensity information described above. It is.

この方法において、前記検出工程は、前記第１のクエリプローブセット中の各第１のクエリプローブの各識別用タグ配列を介して各前記特定部分配列に関連付けられたキャプチャープローブに対応して得られるシグナル強度の比に基づいて、検出しようとする前記多型又は前記変異の有無を検出する工程としてもよい。   In this method, the detection step is obtained corresponding to a capture probe associated with each specific partial sequence via each identification tag sequence of each first query probe in the first query probe set. It may be a step of detecting the presence or absence of the polymorphism or mutation to be detected based on the ratio of signal intensities.

また、この方法において、前記検出工程は、前記第１のクエリプローブセット中の一つの第１のクエリプローブの識別用タグ配列を介して前記特定部分配列に関連付けられたキャプチャープローブに対応して得られるシグナル強度に対する前記第１のクエリプローブセット中の全ての第１のクエリプローブの識別用タグ配列を介して前記特定部分配列に関連付けられた全てのキャプチャープローブに対応して得られるシグナル強度の和の割合に基づいて、検出しようとする前記多型のタイプ判別又は前記変異の比率を求める工程としてもよい。   Further, in this method, the detection step is obtained corresponding to the capture probe associated with the specific partial sequence via the identification tag sequence of one first query probe in the first query probe set. Sum of signal intensities obtained corresponding to all the capture probes associated with the specific partial sequence via the identification tag sequence of all the first query probes in the first query probe set with respect to the obtained signal intensities It is good also as the process of calculating | requiring the type discrimination | determination of the said polymorphism to be detected or the ratio of the said variation | mutation based on the ratio.

また、予め準備した、検出しようとする前記多型のタイプを備える１種又は２種以上の参照用オリゴヌクレオチドにつき、前記第１の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第２の接触工程及び前記シグナル強度情報取得工程を実施して、前記参照用オリゴヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報を利用して前記検出工程を実施することもできる。   In addition, for one or two or more reference oligonucleotides having the polymorphic type to be detected prepared in advance, the first contact step, the linking step, the labeling step, the second contact The detection step can be performed using the reference signal intensity information acquired for the reference oligonucleotide by performing the step and the signal intensity information acquisition step.

さらに、予め準備した、検出しようとする前記変異について所定の比率を備える１種又は２種以上の参照用オリゴヌクレオチドにつき、前記第１の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第２の接触工程及び前記シグナル強度情報取得工程を実施して、前記参照用オリゴヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報を利用して前記検出工程を実施することもできる。   Further, for one or more reference oligonucleotides prepared in advance and having a predetermined ratio for the mutation to be detected, the first contact step, the linking step, the labeling step, the second step The detection step can also be performed using the reference signal intensity information acquired for the reference oligonucleotide by performing the contact step and the signal intensity information acquisition step.

さらに、２種類以上の前記参照用オリヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報に基づく検量線を利用して前記評価工程を実施してもよい。   Furthermore, the evaluation step may be performed using a calibration curve based on reference signal intensity information acquired for two or more types of reference oligonucleotides.

前記第２の接触工程は、前記標識済み連結分子とともに、前記第１のクエリプローブセット中の各前記第１のクエリプローブの各前記識別用タグ配列と前記単一の標識物質とは異なる他の標識物質とを備え、相互に同一濃度で準備した補正用オリゴヌクレオチドとを、前記固相担体上で前記キャプチャープローブとハイブリダイズ可能に接触させる工程であり、前記シグナル強度情報取得工程は、前記一つの標的核酸についてのシグナル強度情報を取得するとともに、前記補正用オリゴヌクレオチドについての前記他の標識物質に基づく補正用シグナル強度情報を取得する工程であり、前記検出工程は、前記補正用シグナル強度情報を利用することを含む工程としてもよい。   In the second contacting step, each of the identification tag sequence of each of the first query probes in the first query probe set and the single labeling substance are different from each other together with the labeled linking molecule. And a correction oligonucleotide prepared at the same concentration with each other so as to be able to hybridize with the capture probe on the solid phase carrier. The signal intensity information for one target nucleic acid is acquired and the signal intensity information for correction based on the other labeling substance for the correction oligonucleotide is acquired, and the detection step includes the signal intensity information for correction It is good also as a process including using.

さらに、前記検出しようとする多型又は変異は一塩基多型であって、前記第１のクエリプローブセットは、一塩基多型の一方の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを有する一方の第１のクエリプローブと、一塩基多型の他方の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列を有する他方の第1のクエリプローブと、を含むこともできるし、前記検出しようとする多型又は変異は変異であって、前記第１のクエリプローブセットは、前記変異に関し正常な１又は２以上の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを有する第１のクエリプローブと、前記変異に関し異常な１又は２以上の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列を有する第1のクエリプローブとの少なくとも２種類の第１のクエリプローブと、を含むこともできる。   Furthermore, the polymorphism or mutation to be detected is a single nucleotide polymorphism, and the first query probe set includes a query sequence complementary to a specific partial sequence containing one base of the single nucleotide polymorphism, and the A first query probe having an identification tag sequence capable of identifying a specific partial sequence, and a query sequence complementary to the specific partial sequence including the other base of the single nucleotide polymorphism can be distinguished from the specific partial sequence A first query probe having another identification tag sequence, and the polymorphism or mutation to be detected is a mutation, and the first query probe set relates to the mutation. A first query probe having a query sequence complementary to a specific partial sequence containing one or more normal bases and an identification tag sequence capable of identifying the specific partial sequence; and 1 or 2 abnormal with respect to the mutation Including at least two types of first query probes, a query sequence complementary to a specific partial sequence including the above bases and a first query probe having an identification tag sequence capable of identifying the specific partial sequence. You can also.

前記固相担体は、前記少なくとも一種の前記標的核酸についての前記２種類以上のキャプチャープローブが互いに隣接する配置状態を備えるアレイとすることもできるし、前記固相担体は、前記少なくとも一種の前記標的核酸についての前記２種類以上のキャプチャープローブを互いに隣接する配置状態を備え、かつこれらの隣接するキャプチャープローブ間の融解温度の最大温度差(絶対値)が５℃以下、好ましくは０．２℃以下となるように配置されているアレイであってもよい。   The solid phase carrier may be an array having an arrangement state in which the two or more types of capture probes for the at least one type of the target nucleic acid are adjacent to each other, and the solid phase carrier may be the at least one type of the target. The two or more types of capture probes for nucleic acids are arranged adjacent to each other, and the maximum temperature difference (absolute value) of melting temperature between these adjacent capture probes is 5 ° C. or less, preferably 0.2 ° C. or less The array may be arranged so that

本発明によれば、上記いずれかに記載の検出方法に用いられるキャプチャープローブが固定化された固相担体であって、前記少なくとも一種の標的核酸についての前記２種類以上のキャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列されている、固相担体が提供される。   According to the present invention, there is provided a solid phase carrier on which a capture probe used in any of the detection methods described above is immobilized, wherein the two or more types of capture probes for the at least one target nucleic acid have melting temperatures thereof. There is provided a solid support which is arranged in an order based on

本発明によれば、試料中の１種又は２種以上の標的核酸中の多型又は変異を検出するためのキャプチャープローブが固定化された固相担体であって、前記キャプチャープローブは、２個以上であり、前記標的核酸の検出しようとする前記多型又は前記変異の塩基配列とは無関係に設定された同一塩基長のキャプチャー配列を有し、融解温度が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、その融解温度に基づく順序で配列されている、固相担体が提供される。この固相担体において、前記複数のキャプチャープローブは、正規直交化配列、例えば、それぞれ配列番号：１〜配列番号：１００から選択されるキャプチャー塩基配列を有することが好ましい。   According to the present invention, there is provided a solid phase carrier on which a capture probe for detecting a polymorphism or mutation in one or more target nucleic acids in a sample is immobilized, and the two capture probes are It has the capture sequence of the same base length set irrespective of the base sequence of the polymorphism or the mutation to be detected of the target nucleic acid, and has a melting temperature of 40 ° C. or higher and 80 ° C. or lower, preferably There is provided a solid support that is 50 ° C. or higher and 70 ° C. or lower and arranged in an order based on its melting temperature. In this solid phase carrier, the plurality of capture probes preferably have orthonormalized sequences, for example, capture base sequences each selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 100.

本発明によれば、試料中の標的核酸を検出するためのプローブセットであって、標的核酸中の検出しようとする多型又は変異を構成する少なくとも１個の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを備える２種類以上の第１のクエリプローブからなる第１のクエリプローブセットと、前記標的核酸の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的なクエリ配列と標識を付加するための標識用タグ配列とを備える第２のクエリプローブと、を備える、プローブセットが提供される。   According to the present invention, a probe set for detecting a target nucleic acid in a sample is complementary to a specific partial sequence containing at least one base constituting a polymorphism or mutation to be detected in the target nucleic acid. A first query probe set comprising two or more types of first query probes, each of which includes a simple query sequence and an identification tag sequence capable of identifying the specific partial sequence, and a portion adjacent to the specific partial sequence of the target nucleic acid A probe set is provided, comprising: a second query probe comprising a query sequence complementary to the sequence and a tag sequence for labeling for adding a label.

本発明は、標的核酸の検出方法及び標的核酸を検出するためのアレイに関する。本発明の標的核酸の検出方法によれば、上記のとおりの第１のクエリプローブセット中の第１のクエリプローブと第２のクエリプローブとを標的核酸にハイブリダイズさせて連結することで標的核酸中の特定部分配列の種類に応じた識別用タグ配列を有する連結分子を得て、この連結分子を標識して、前記識別用タグ配列に相補的なキャプチャープローブが固定化された固相担体上でハイブリダイズさせることで異なるキャプチャープローブへの異なる連結分子のハイブリダイズ量を検出することで、異なる標識物質のシグナル強度比による識別によらないで特定部分配列の有無やその量を検出することができる。このため、複数の標識物質を利用することに基づく不確実性を排除してそれによる検出精度低下を回避できる。したがって、精度よく多型や変異等を検出できるとともに、変異等の比率を容易にしかも精度よく検出できる。   The present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid and an array for detecting the target nucleic acid. According to the method for detecting a target nucleic acid of the present invention, a target nucleic acid is obtained by hybridizing and linking the first query probe and the second query probe in the first query probe set as described above to the target nucleic acid. On a solid phase carrier on which a linking molecule having an identification tag sequence corresponding to the type of a specific partial sequence is obtained, this linking molecule is labeled, and a capture probe complementary to the identification tag sequence is immobilized By detecting the amount of hybridization of different linking molecules to different capture probes by hybridizing with, it is possible to detect the presence and amount of a specific partial sequence without discrimination by the signal intensity ratio of different labeling substances it can. For this reason, the uncertainty based on using a some labeling substance can be excluded, and the detection accuracy fall by it can be avoided. Therefore, polymorphisms and mutations can be detected with high accuracy, and the ratio of mutations can be easily detected with high accuracy.

また、この方法によれば、標的核酸中に存在する可能性のある特定部分配列毎に一つの第１のクエリプローブを用いることで、第１の接触工程、連結工程及び標識工程により、存在している特定部分配列及びその存在比に応じて標識済み連結分子を得ることができる。得られた連結分子は識別用タグ配列を介して１：１でキャプチャープローブと関連付けられているため、第２の接触工程、シグナル強度情報取得工程及び検出工程により、特定部分配列の存在及びその存在比を特定部分配列毎に関連付けられたキャプチャープローブにおけるシグナル強度情報に基づいて精度よく検出できる。   Further, according to this method, by using one first query probe for each specific partial sequence that may be present in the target nucleic acid, it exists by the first contact step, the linking step, and the labeling step. Depending on the specific partial sequence and the abundance thereof, a labeled linking molecule can be obtained. Since the obtained linking molecule is associated with the capture probe 1: 1 through the identification tag sequence, the presence of the specific partial sequence and its presence are detected by the second contact step, the signal intensity information acquisition step, and the detection step. The ratio can be accurately detected based on signal intensity information in the capture probe associated with each specific partial sequence.

また、前記識別用タグ配列及びキャプチャー配列は、特定部分配列と無関係に設定することができるため、これらの配列はいずれもどのような標的核酸についても適用することができる。したがって、多型等の検出の利便性や適切コストを確保することができる。また、多数の標的核酸の多型又は変異を同時に検出するのに適している。   Moreover, since the identification tag sequence and the capture sequence can be set independently of the specific partial sequence, any of these sequences can be applied to any target nucleic acid. Therefore, it is possible to ensure the convenience of detecting the polymorphism and the appropriate cost. Moreover, it is suitable for simultaneously detecting polymorphisms or mutations of a large number of target nucleic acids.

また、本発明の固相担体によれば、上記のとおり、２個以上の前記キャプチャープローブが標的核酸中の検出しようとする塩基配列とは無関係に設定された同一塩基長のキャプチャー塩基配列を有し、融解温度が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、その融解温度に基づく順序で配列されているため、このキャプチャープローブによって試料中の標的核酸を隣り合う２種類以上のキャプチャープローブによって検出しようとする場合、キャプチャープローブの融解温度によるハイブリダイゼーション時のハイブリダイズ量の誤差を抑制でき、ハイブリダイズ量に基づいて精度よく標的核酸を検出することができる。   Further, according to the solid phase carrier of the present invention, as described above, two or more of the capture probes have capture base sequences having the same base length set independently of the base sequence to be detected in the target nucleic acid. However, the melting temperature is 40 ° C. or higher and 80 ° C. or lower, preferably 50 ° C. or higher and 70 ° C. or lower, and is arranged in the order based on the melting temperature. When detection is performed with more than one type of capture probe, an error in the amount of hybridization during hybridization due to the melting temperature of the capture probe can be suppressed, and the target nucleic acid can be detected with high accuracy based on the amount of hybridization.

また、こうしたキャプチャープローブを、標的核酸中の特定部分配列に関連付けた識別用タグ配列を介して標的核酸を検出するのに用いることで、検出しようとする標的核酸によらないで標的核酸を検出できるユニバーサルな固相担体として利用できる。さらに、こうした固相担体によれば、多数の標的核酸の多型又は変異を同時検出するのに適している。   In addition, by using such a capture probe to detect a target nucleic acid via an identification tag sequence associated with a specific partial sequence in the target nucleic acid, the target nucleic acid can be detected regardless of the target nucleic acid to be detected. It can be used as a universal solid phase carrier. Furthermore, such a solid phase carrier is suitable for simultaneously detecting a large number of polymorphisms or mutations of a target nucleic acid.

以下、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら説明する。図１は、本発明の検出方法の原理を模式的に表す図である。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings as appropriate. FIG. 1 is a diagram schematically showing the principle of the detection method of the present invention.

なお、本明細書において「核酸」とは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ-オリゴ核酸などの人工合成核酸を含む。また、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。また、本明細書において「標的核酸」とは、任意の配列を有する任意の核酸である。典型的には、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒトや非ヒト動物における遺伝子上の指標となる塩基配列を有する可能性のある核酸が挙げられる。指標としては、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の核酸なども標的核酸に含まれる。   In the present specification, “nucleic acid” refers to all DNA and RNA including cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, total RNA, hnRNA and synthetic RNA, peptide nucleic acid, morpholino nucleic acid, methylphosphonate nucleic acid, and Includes artificially synthesized nucleic acids such as S-oligonucleic acid. Moreover, it may be single-stranded or double-stranded. In the present specification, the “target nucleic acid” is an arbitrary nucleic acid having an arbitrary sequence. Typically, it may have a base sequence that serves as a genetic indicator in humans or non-human animals, such as constitution, genetic disease, onset of specific diseases such as cancer, disease diagnosis, treatment prognosis, drug and treatment selection, etc. There may be mentioned nucleic acids with Examples of the index include polymorphisms such as SNP and congenital or acquired mutations. Further, nucleic acids derived from microorganisms such as pathogenic bacteria and viruses are also included in the target nucleic acid.

標的核酸は、後述する試料又はその核酸画分をそのまま用いることもできるが、好ましくは、ＰＣＲによる増幅反応、より好ましくはマルチプレックスＰＣＲによる増幅反応により、検出対象とする複数の標的核酸の全てが増幅された増幅産物を用いることが好ましい。   As the target nucleic acid, a sample described later or a nucleic acid fraction thereof can be used as it is. However, preferably, all of a plurality of target nucleic acids to be detected are detected by an amplification reaction by PCR, more preferably an amplification reaction by multiplex PCR. It is preferable to use an amplified product.

本明細書において「試料」とは、標的核酸を含む可能性のある試料をいう。試料としては、細胞、組織、血液、尿、唾液等が含まれ、核酸を含む任意の試料を用いることができる。こうした各種の試料からの核酸を含む画分は当業者であれば適宜従来技術を参照して取得することができる。   As used herein, “sample” refers to a sample that may contain a target nucleic acid. Samples include cells, tissues, blood, urine, saliva and the like, and any sample containing nucleic acid can be used. Fractions containing nucleic acids from these various samples can be obtained by those skilled in the art with reference to conventional techniques as appropriate.

本明細書において「多型」とは、一塩基多型及びそれ以外の多型を含む広い意味で使用されるが、典型的には一塩基多型が挙げられる。本明細書において「変異」とは、遺伝子上の１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入及び付加のいずれか１種以上を含む変化をいう。本明細書において「特定部分配列」とは、多型や変異を構成する少なくとも１個の塩基を含む配列をいう。したがって、例えばＡがＧに置換された一塩基多型にあっては、特定部分配列は２種類存在することになる。   In the present specification, the “polymorphism” is used in a broad sense including a single nucleotide polymorphism and other polymorphisms, and typically includes a single nucleotide polymorphism. As used herein, “mutation” refers to a change including any one or more of substitution, deletion, insertion and addition of one or more bases on a gene. In the present specification, the “specific partial sequence” refers to a sequence containing at least one base constituting a polymorphism or mutation. Therefore, for example, in the single nucleotide polymorphism in which A is substituted with G, there are two types of specific partial sequences.

[標的核酸中の多型又は変異を検出する方法]
本発明の検出方法は、第１のクエリプローブセットと、第２のクエリプローブと、標的核酸とを接触させる第１の接触工程と、第１のクエリプローブと第２のクエリプローブとの連結工程と、標識工程と、標識済み連結分子とキャプチャープローブとを接触させる第２の接触工程と、シグナル強度情報取得工程と、検出工程と、を備えている。本発明の検出方法は、１種又２種以上の標的核酸を適用対象とし、これらの標的核酸中の多型又は変異に関する特定部分配列を検出対象とする。以下、一種の標的核酸についての一連の工程を説明するが、以下の工程は、複数又は多数の標的核酸を同時に検出する場合にも適用される。 [Method for detecting polymorphism or mutation in target nucleic acid]
The detection method of the present invention includes a first contact step of bringing a first query probe set, a second query probe, and a target nucleic acid into contact with each other, and a step of linking the first query probe and the second query probe. And a labeling step, a second contact step in which the labeled linking molecule and the capture probe are brought into contact with each other, a signal intensity information acquisition step, and a detection step. The detection method of the present invention applies to one or more target nucleic acids, and a specific partial sequence related to polymorphism or mutation in these target nucleic acids is to be detected. Hereinafter, a series of steps for one type of target nucleic acid will be described. However, the following steps are also applied to the case where a plurality of target nucleic acids are detected simultaneously.

図１には、本発明の検出方法の概要を示し、図２には、本発明に用いるプローブセットの一例の概要を示し、図３には、識別用タグ配列及びキャプチャープローブの融解温度についての説明図を示す。なお、図１及び図２は、ＳＮＰの１塩基置換を検出するための検出方法及びプローブセットについての一例である。   FIG. 1 shows an outline of the detection method of the present invention, FIG. 2 shows an outline of an example of the probe set used in the present invention, and FIG. 3 shows the identification tag sequence and the melting temperature of the capture probe. An explanatory diagram is shown. 1 and 2 are examples of a detection method and probe set for detecting SNP single-base substitution.

〈第１の接触工程〉
第１の接触工程は、第１のクエリプローブセットと第２のクエリプローブと標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。まず、本工程で用いる第１のクエリプローブセットと第２のクエリプローブについて説明する。第１のクエリプローブセットを構成する第１のクエリプローブは、図１及び図２に示すように、標的核酸の検出しようとする少なくとも１個の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と、前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを備えている。 <First contact process>
The first contact step is a step of bringing the first query probe set, the second query probe, and the target nucleic acid into contact with each other so as to be capable of hybridizing. First, the first query probe set and the second query probe used in this step will be described. As shown in FIGS. 1 and 2, the first query probe constituting the first query probe set includes a query sequence complementary to a specific partial sequence including at least one base to be detected of the target nucleic acid. And an identification tag sequence capable of identifying the specific partial sequence.

（第１のクエリプローブセット）
第１のクエリプローブセットは、複数の第１のクエリプローブから構成される。第１のクエリプローブは、クエリ配列をその３’側に有することができ、識別用タグ配列をその５’側に有することができる。なお、第１のクエリプローブにおけるクエリ配列及び識別用タグ配列の配置は、第２のクエリプローブとの関係で適宜選択することが可能である。 (First query probe set)
The first query probe set is composed of a plurality of first query probes. The first query probe can have a query sequence on its 3 ′ side and can have an identification tag sequence on its 5 ′ side. The arrangement of the query sequence and the identification tag sequence in the first query probe can be appropriately selected in relation to the second query probe.

第１のクエリプローブは、検出しようとする特定部分配列の種類の数に応じて準備される。第１のクエリプローブは、存在する可能性のある特定部分配列の種類に応じ、特定部分配列毎に一つの特有のクエリ配列を備えるよう設定される。すなわち、第１のクエリプローブは、存在する可能性のある特定部分配列毎にそれぞれ１種類準備される。例えば、上述のようにＡがＧに置換される一塩基多型の場合には２種類の特定部分配列が存在し、２種類のクエリ配列をそれぞれ備える２種類の第１のクエリプローブが準備される。また、変異の場合には、２種類又は３種類以上の特定部分配列が存在し、２種類又は３種類以上のクエリ配列をそれぞれ備える２種類又は３種類以上の第１のクエリプローブが準備される。   The first query probe is prepared according to the number of types of specific partial sequences to be detected. The first query probe is set to have one unique query sequence for each specific partial sequence, depending on the type of the specific partial sequence that may exist. That is, one type of first query probe is prepared for each specific partial sequence that may exist. For example, in the case of a single nucleotide polymorphism in which A is replaced with G as described above, there are two types of specific partial sequences, and two types of first query probes each having two types of query sequences are prepared. The In the case of mutation, two or three or more types of specific partial sequences exist, and two or three or more types of first query probes each having two or three or more types of query sequences are prepared. .

第１のクエリプローブは、こうしたクエリ配列をそれぞれ有することができる。クエリ配列は、検出しようとする特定部分配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的に設定される。特定部分配列は、プローブの端末を構成するように配置されることが好ましく、例えば、図１及び図２に示す例においては、特定部分配列は、そのまま３’末端を形成するように配置されていることが好ましい。   Each first query probe can have such a query sequence. The query sequence is set complementarily to such an extent that it can hybridize with a specific partial sequence to be detected with high selectivity. Preferably, it is set to be completely complementary. The specific partial sequence is preferably arranged so as to constitute the terminal of the probe. For example, in the example shown in FIGS. 1 and 2, the specific partial sequence is arranged so as to form the 3 ′ end as it is. Preferably it is.

クエリ配列は、例えば、連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。また、クエリ配列の長さは特に限定されないが、たとえば３０塩基長以上であることが好ましい。   The query sequence is designed by calculating, for example, continuous match length, melting temperature prediction by Nearest-Neighbor method, Hamming distance, and secondary structure prediction. The length of the query sequence is not particularly limited, but is preferably 30 bases or more, for example.

第１のクエリプローブは、それぞれ特有の一つの識別用タグ配列を有している。識別用タグ配列は、標的核酸中に存在する可能性のある特定部分配列に対応して設定することができる。第１のクエリプローブは、こうした識別用タグ配列と特有のクエリ配列とをそれぞれ備えることで、標的核酸中の特定部分配列を識別用タグ配列で置き換えすることができる。すなわち、予め設定した識別用タグ配列にエンコード若しくはコード変換することができる。   Each of the first query probes has a unique identification tag sequence. The identification tag sequence can be set corresponding to a specific partial sequence that may exist in the target nucleic acid. The first query probe includes the identification tag sequence and the unique query sequence, respectively, so that the specific partial sequence in the target nucleic acid can be replaced with the identification tag sequence. That is, encoding or code conversion can be performed on a preset identification tag array.

識別用タグ配列は、標的核酸の塩基配列、すなわち、特定部分配列と無関係に設定することができる。特定部分配列と無関係に設定することで識別用タグ配列は、検出に都合のよい配列とすることができるほか、所定の識別用タグ配列に対応したキャプチャープローブを用いることでどのような特定部分配列であってもキャプチャープローブと識別用タグ配列との組み合わせによって検出することができる。   The tag sequence for identification can be set regardless of the base sequence of the target nucleic acid, that is, the specific partial sequence. The identification tag sequence can be made convenient for detection by setting it independently of the specific partial sequence, and any specific partial sequence can be obtained by using a capture probe corresponding to the predetermined identification tag sequence. Even so, it can be detected by a combination of a capture probe and an identification tag sequence.

識別用タグ配列と後述する固相担体に固定化されるキャプチャープローブのキャプチャー配列とは相同的又は相補的であり、好ましくは完全に相同な配列又は完全に相補的な配列である。キャプチャー配列に対して相同的とするか相補的とするかは、標識工程におけるプライマーの設計等に応じて適宜決定されればよく、標識工程後にキャプチャー配列に対して選択的にハイブリダイズ可能な相補性を有していればよい。なお、以下の説明において、キャプチャープローブのキャプチャー配列を基準としてこれと相同的な配列を有する識別用タグ配列を（＋）を付加して記載し、これと相補的な配列を有する識別用タグ配列を（−）を付加して記載するものとする。識別用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列としては、例えば、配列番号：１〜配列番号：１００に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長であり、融解温度（Ｔｍ）が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、同一条件でのハイブリダイゼーションにおいて均質なハイブリダイゼーション結果が得られることが期待される。   The tag sequence for identification and the capture sequence of a capture probe immobilized on a solid phase carrier to be described later are homologous or complementary, preferably a completely homologous sequence or a completely complementary sequence. Whether it is homologous or complementary to the capture sequence may be appropriately determined according to the design of the primer in the labeling step, and the complement that can selectively hybridize to the capture sequence after the labeling step. What is necessary is just to have sex. In the following description, an identification tag sequence having a sequence homologous to the capture sequence of the capture probe is described with (+) added, and an identification tag sequence having a complementary sequence thereto. Shall be described with (−) added. As the tag sequence for identification (+) and the capture sequence, for example, the base sequence described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 100 or a base sequence complementary to this base sequence can be used. These base sequences all have the same base length, and have a melting temperature (Tm) of 40 ° C. or higher and 80 ° C. or lower, preferably 50 ° C. or higher and 70 ° C. or lower. Expected to be obtained.

第１のクエリプローブセットを構成する複数の第１のクエリプローブの識別用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列の融解温度は、できるだけ近いことが好ましい。より好ましくは、同時に網羅的に複数の標的核酸の複数の特定部分配列を検出しようとする場合には、一つの標的核酸に対して使用する複数の第１のクエリプローブの複数の識別用タグ配列（＋）とキャプチャー配列との融解温度は互いに最も近似するように組み合わされていることが好ましい。例えば、図３に示すように、識別用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列を融解温度の順に配列したとき、一つの標的核酸に対する２種類以上の第１のクエリプローブにおける識別用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列は、当該順列において隣り合う２種類以上の塩基配列から選択することができる。また、他の標的核酸に対応する第１のクエリプローブセットの識別用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列は、図３に示すように、既に選択した塩基配列にすぐ隣の一連の塩基配列から選択してもよいし、離れた一連の塩基配列から選択してもよい。同時に検出しようとする標的核酸に対応する全ての第１のクエリプローブセットで使用される識別用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列の融解温度が前記融解温度の順列において一連の塩基配列を用いることが好ましい。なお、融解温度は、ＧＣ％法、Ｗａｌｌａｃｅ法、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに準拠した方法(秀潤社刊バイオ実験イラストレイテッド３本当に増えるＰＣＲｐ２５に記載)等により算出したものを採用できるが、本発明における融解温度の範囲および塩基配列濃度の影響を加味できるＮｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法によって算出されることが好ましい。Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法による融解温度は、例えば、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（トミーデジタルバイオロジー株式会社製）とのソフトウエアや日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp/）が提供するソフトウエア（Oligo
Calculator；http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html）により容易に取得できる。なお、配列番号：１〜配列番号：１００は、Ｖｉｓｕａｌ
ＯＭＰによって算出される融解温度（０．１Ｍプローブ濃度、５０ｍＭ Ｎａ+イオン及び１．５ｍＭ
Ｍｇ+イオン）の高い順に配列されている。 The melting temperature of the identification tag sequence (+) and the capture sequence of the plurality of first query probes constituting the first query probe set is preferably as close as possible. More preferably, when comprehensively detecting a plurality of specific partial sequences of a plurality of target nucleic acids simultaneously, a plurality of identification tag sequences of a plurality of first query probes used for one target nucleic acid It is preferable that the melting temperatures of (+) and the capture sequence are combined so as to be closest to each other. For example, as shown in FIG. 3, when the identification tag sequence (+) and the capture sequence are arranged in the order of the melting temperature, the identification tag sequence (+) in two or more first query probes for one target nucleic acid. The capture sequence can be selected from two or more types of base sequences adjacent in the permutation. In addition, the identification tag sequence (+) and the capture sequence of the first query probe set corresponding to other target nucleic acids are selected from a series of base sequences immediately adjacent to the already selected base sequence as shown in FIG. Alternatively, it may be selected from a series of distant base sequences. The identification tag sequence (+) and capture sequence used in all the first query probe sets corresponding to the target nucleic acids to be detected at the same time use a series of base sequences in the permutation of the melting temperature. preferable. In addition, melting temperature is GC% method, Wallace method, Current.
It is possible to adopt a method calculated by a method based on Protocols in Molecular Biology (explained by PCR Jun 25, published by Shujunsha Bio Experiment Illustrated 3), but considering the range of melting temperature and base sequence concentration in the present invention. It is preferable to be calculated by a possible Nearest-Neighbor method. The melting temperature by the Nearest-Neighbor method is, for example, software with Visual OMP (manufactured by Tommy Digital Biology Co., Ltd.) or software provided by Japan Genetic Research Institute (http://www.ngrl.co.jp/). (Oligo
Calculator; http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html). SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 100 are Visual
Melting temperature calculated by OMP (0.1 M probe concentration, 50 mM Na + ion and 1.5 mM
(Mg + ions) are arranged in descending order.

このような識別用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列は、正規直交化配列ともいい、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。正規直交化配列は、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味する。１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。また、正規直交化配列は、ＰＣＲにおいて増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイゼーションのような問題に影響されずに、当該正規直交化配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有している。上記のような正規直交化配列は、Ｈ．Ｙｓｈｉｄａ
ａｎｄ Ａ．Ｓｕｙａｍａ，“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ３−ＳＡＴ ｂｙ ｂｒｅａｄｔｈ ｆｉｒｓｔ ｓｅａｒｃｈ”，ＤＩＭＡＣＳ Ｖｏｌ．５４ ９−２０（２０００）および特願２００３−１０８１２６に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。 Such a tag sequence for identification (+) and a capture sequence are also called orthonormalized sequences. For example, a DNA sequence having a predetermined base length obtained from a random number has a continuous match length, a melting temperature prediction by the Nearest-Neighbor method, It is designed by calculating Hamming distance and secondary structure prediction. An orthonormalized sequence is a nucleotide sequence of a nucleic acid having a uniform melting temperature, that is, a sequence designed so that the melting temperature is within a certain range, and the nucleic acid itself is intramolecular. It means a base sequence that does not form a stable hybrid other than a base sequence that is structured in the above and does not inhibit hybridization with a complementary sequence. A sequence included in one orthonormalized sequence group hardly reacts between sequences other than the desired combination and within a self-sequence, or does not generate a reaction. Further, when the orthonormalized sequence is amplified in PCR, the amount of nucleic acid corresponding to the initial amount of the nucleic acid having the orthonormalized sequence is quantitatively determined without being affected by the problems such as the above-described cross hybridization. Has the property of being amplified. Orthonormalized arrays such as those described above are H.264. Yshida
and A. Suyama, "Solution to 3-SAT by breadth first search", DIMACS Vol. 54 9-20 (2000) and Japanese Patent Application No. 2003-108126. Orthonormalized sequences can be designed using the methods described in these references.

第１のクエリプローブセットを、標的核酸中に存在可能性のある特定部分配列にそれぞれ対応した第１のクエリプローブのセットとすることによって、異なる標識の信号（シグナル強度）の有無によらないで、特定部分配列を検出することができる。すなわち、従来法では、キャプチャープローブを一つのセルとして用いて当該セル内における２種類の標識物質に基づく信号（シグナル強度）の有無又は程度により標的核酸中のＳＮＰを検出していたが、本方法によれば、存在可能性のある特定部分配列に対応した数の識別用タグ配列及びキャプチャープローブを用いることでデジタル的にしか検出できなかった特定部分配列をその数に応じて個別に検出することができしかもその比率も定量することができる。また、使用可能な標識物質の種類にも拘束されないで特定部分配列を検出することできる。さらに、こうした第１のクエリプローブセットを用いることで、第２のクエリプローブとの組み合わせにより、特定塩基配列を備える標的核酸を選択的に抽出することができるため、網羅的に複数の、好ましくは多数の標的核酸を検出するのに寄与している。   By using the first query probe set as the first query probe set corresponding to each specific partial sequence that may exist in the target nucleic acid, it does not depend on the presence or absence of signals (signal intensity) of different labels. , Specific partial sequences can be detected. That is, in the conventional method, the SNP in the target nucleic acid is detected based on the presence or absence of signals (signal intensity) based on two types of labeling substances in the cell using the capture probe as one cell. According to the present invention, it is possible to individually detect specific partial sequences that can only be detected digitally by using a number of identification tag sequences and capture probes corresponding to specific partial sequences that may exist. And the ratio can be quantified. Further, the specific partial sequence can be detected without being restricted by the type of labeling substance that can be used. Furthermore, by using such a first query probe set, a target nucleic acid having a specific base sequence can be selectively extracted by combination with the second query probe. It contributes to the detection of a large number of target nucleic acids.

検出しようとする多型又は変異は一塩基多型であるとき、例えば、第１のクエリプローブセットを以下の第１のクエリプローブから構成することができる。すなわち、一塩基多型の一方の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列とこの特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを有する第１のクエリプローブと、一塩基多型の他方の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列とこの特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列を有するもう一つの第1のクエリプローブとを用いることができる。こうした第１のクエリプローブセットを用いることで、一塩基多型を、精度よく検出することができる。   When the polymorphism or mutation to be detected is a single nucleotide polymorphism, for example, the first query probe set can be composed of the following first query probes. That is, a first query probe having a query sequence complementary to a specific partial sequence containing one base of a single nucleotide polymorphism and an identification tag sequence capable of identifying the specific partial sequence, and the other of the single nucleotide polymorphism A query sequence complementary to a specific partial sequence containing the bases of the above and another first query probe having an identification tag sequence that can identify the specific partial sequence can be used. By using such a first query probe set, a single nucleotide polymorphism can be detected with high accuracy.

また、検出しようとする多型又は変異が遺伝子上の変異であるとき、例えば、第１のクエリプローブセットを以下の第１のクエリプローブから構成することができる。すなわち、変異に関し正常な１又は２以上の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを有する第１のクエリプローブと、変異に関し異常な１又は２以上の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列とこの特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列を有する第1のクエリプローブとの少なくとももう一つの第１のクエリプローブとを用いることができる。こうした第１のクエリプローブセットを用いることで、遺伝子上の変異をそのバリエーションに応じて検出することができるとともに、各種変異の存在比率も精度よく検出することができる。   When the polymorphism or mutation to be detected is a genetic mutation, for example, the first query probe set can be composed of the following first query probes. That is, a first query probe having a query sequence complementary to a specific partial sequence containing one or more bases normal for mutation and an identification tag sequence that can identify the specific partial sequence, and abnormal for mutation A query sequence complementary to a specific partial sequence containing one or more bases, and at least another first query probe of a first query probe having an identification tag sequence capable of identifying the specific partial sequence Can be used. By using such a first query probe set, mutations on the gene can be detected according to the variation, and the abundance ratios of various mutations can be detected with high accuracy.

（第２のクエリプローブ）
第２のクエリプローブは、標的核酸の特定部分配列に隣接する共通の部分配列に相補的なクエリ配列と標識物質を付加するための標識用タグ配列とを備えることができる。図１及び図２に示すように、第２のクエリプローブは、クエリ配列をその５’側に有することができ、標識物質を付加するための標識用タグ配列をその３’側に有することができる。なお、第１のクエリプローブと同様、第２のクエリプローブにおけるクエリ配列及び識別用タグ配列の配置は、適宜選択可能である。 (Second query probe)
The second query probe can include a query sequence complementary to a common partial sequence adjacent to a specific partial sequence of the target nucleic acid and a labeling tag sequence for adding a labeling substance. As shown in FIGS. 1 and 2, the second query probe can have a query sequence on its 5 ′ side, and can have a labeling tag sequence for adding a labeling substance on its 3 ′ side. it can. Similar to the first query probe, the arrangement of the query sequence and the identification tag sequence in the second query probe can be selected as appropriate.

第２のクエリプローブが有するクエリ配列は、第１のクエリプローブが有するクエリ配列に対応する特定部分配列に隣接する部分配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的な配列とすることができる。好ましくは完全に相補的とすることができる。第２のクエリプローブのクエリ配列は、後述する連結工程において、第１のクエリ配列とリガーゼ反応により連結される。このため、クエリ配列の５’末端側等の連結側末端はリガーゼ反応可能にリン酸エスエル化されていることが好ましい。なお、第２のクエリプローブが有するクエリ配列は、標的核酸に存在する可能性のある多型や変異などの特定塩基部分に対応するものではなく、標的核酸中において保存されている共通の塩基配列に相補的な配列である。第２のクエリプローブにおけるクエリ配列は、第１のクエリプローブにおけるクエリ配列と同様にして設計することができる。   The query sequence that the second query probe has may be a sequence that is complementary to the extent that it can hybridize with high selectivity to the partial sequence adjacent to the specific partial sequence corresponding to the query sequence that the first query probe has. it can. Preferably it can be completely complementary. The query sequence of the second query probe is linked to the first query sequence by a ligase reaction in the linkage step described later. For this reason, it is preferable that the ligation side end such as the 5 'end side of the query sequence is phosphorylated so as to enable ligase reaction. The query sequence possessed by the second query probe does not correspond to a specific base portion such as a polymorphism or mutation that may exist in the target nucleic acid, and is a common base sequence conserved in the target nucleic acid. Is a complementary sequence. The query sequence in the second query probe can be designed in the same manner as the query sequence in the first query probe.

第２のクエリプローブは、標識物質を付加するための標識用タグ配列を備えることができる。それぞれ特有の一つの識別用タグ配列を有している。標識物質は、少なくとも１種類の標的核酸について１種類（共通）とすることが好ましい。標識物質を共通化させることで、標識物質の特性に基づく誤差を排除できるほか、異なる標識物質に基づく信号（シグナル強度）の有無や比に基づいて標的核酸を検出しなくてもすむ。なお、標識物質は、２種以上の標的核酸に対して１種類（共通）とすることもできるし、異なる標的核酸に適宜異なる標識物質を用いることもできる。   The second query probe can include a labeling tag sequence for adding a labeling substance. Each has a unique identification tag sequence. The labeling substance is preferably one type (common) for at least one type of target nucleic acid. By making the labeling substance common, errors based on the characteristics of the labeling substance can be eliminated, and it is not necessary to detect the target nucleic acid based on the presence or absence or ratio of signals (signal intensity) based on different labeling substances. The labeling substance can be one kind (common) for two or more kinds of target nucleic acids, and different labeling substances can be appropriately used for different target nucleic acids.

標識用タグ配列は、特に限定しないで標識物質の付加に都合のよい配列を適宜設定し又は公知の配列から選択して用いればよい。   The tag sequence for labeling is not particularly limited, and a sequence convenient for adding a labeling substance may be appropriately set or selected from known sequences.

第２のクエリプローブは、特定部分配列に隣接する部分配列に相補的なクエリ配列と標識用タグ配列とを有することで、第１の接触工程及び後述する連結工程によって標的核酸中の特定部分配列を選択的に抽出し、かつ標識可能にすることができる。また、こうした第２のクエリプローブは、網羅的に複数の、好ましくは多数の標的核酸を検出するのに寄与している。   The second query probe has a query sequence complementary to a partial sequence adjacent to the specific partial sequence and a tag sequence for labeling, so that the specific partial sequence in the target nucleic acid is obtained by the first contact step and the linking step described later. Can be selectively extracted and labeled. Also, such a second query probe contributes comprehensively to detecting a plurality of, preferably a large number of target nucleic acids.

第１の接触工程では、これらのクエリプローブと標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる。ハイブリダイゼーション条件は、標的核酸やその特定部分配列、さらにはこれらの長さに基づいて適宜設定することができる。好ましくは、これらの全てのクエリプローブを含むハイブリダイゼーション液を予め調製しておき、このハイブリダイゼーション液を標的核酸に対して供給する。   In the first contact step, these query probe and the target nucleic acid are brought into contact with each other so as to be hybridizable. Hybridization conditions can be appropriately set based on the target nucleic acid, a specific partial sequence thereof, and the length thereof. Preferably, a hybridization solution containing all these query probes is prepared in advance, and this hybridization solution is supplied to the target nucleic acid.

第１の接触工程によれば、これらのクエリプローブと標的核酸とを接触させることで、標的核酸中に所定の特定部分配列が存在するときには、その特定部分配列に対応するクエリ配列を有する第１のクエリプローブと第２のクエリプローブとがコンカテマー状（タンデム状）にそれぞれ標的核酸にハイブリダイズすることになる。標的核酸中に所定の特定部分配列が存在しないときには、第１のクエリプローブは標的核酸にハイブリダイズしないが、第２のクエリプローブのみがハイブリダイズすることになる。   According to the first contact step, when a predetermined specific partial sequence is present in the target nucleic acid by contacting these query probes with the target nucleic acid, the first probe having the query sequence corresponding to the specific partial sequence is provided. The query probe and the second query probe each hybridize to the target nucleic acid in a concatamer form (tandem form). When the predetermined specific partial sequence does not exist in the target nucleic acid, the first query probe does not hybridize to the target nucleic acid, but only the second query probe hybridizes.

（連結工程）
連結工程は、標的核酸にハイブリダイズした第１のクエリプローブと第２のクエリプローブとを連結してこれらの連結分子を取得する工程である。第１の接触工程において説明したように標的核酸中に検出しようとする所定の特定部分配列が存在するとき、その特定部分配列に対応するクエリ配列を有する第１のクエリプローブと第２のクエリプローブとが標的核酸にハイブリダイズする。図１及び図２に示すように、この状態で第１のクエリプローブの５’末端と第２のクエリプローブの３’末端とを連結する。 (Linking process)
In the linking step, the first query probe and the second query probe hybridized to the target nucleic acid are linked to obtain these linked molecules. As described in the first contact step, when a predetermined specific partial sequence to be detected exists in the target nucleic acid, the first query probe and the second query probe having a query sequence corresponding to the specific partial sequence And hybridize to the target nucleic acid. As shown in FIGS. 1 and 2, in this state, the 5 ′ end of the first query probe and the 3 ′ end of the second query probe are connected.

これらプローブの連結手法は特に限定しない。ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いる酵素反応を用いることもできるし、化学的な反応を用いることもできる。好ましくは、ＤＮＡリガーゼによりこれらのプローブのライゲーション反応を行う。連結するために使用することができるリガーゼには、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＴａｑＤＮＡリガーゼが含まれるが、これに限定されず、標的核酸やプローブの種類に応じて任意のＤＮＡリガーゼ又はＲＮＡリガーゼを使用し得る。 The connection method of these probes is not particularly limited. An enzymatic reaction using a ligase such as DNA ligase can be used, and a chemical reaction can also be used. Preferably, the ligation reaction of these probes is performed by DNA ligase. Ligases that can be used to link include Thermus Aquaticus (Thermus
aquaticus) Taq DNA ligase, but not limited thereto, any DNA ligase or RNA ligase may be used depending on the type of target nucleic acid or probe.

本連結工程によれば、第１のクエリプローブと第２のクエリプローブとを連結することで、標的核酸中に存在する特定部分配列を選択的に抽出し、かつ、予めこの特定部分配列に関連付けた識別用タグ配列に置き換えるとともに標識可能な連結分子を特定部分配列の存在及び存在比に応じて得ることができる。こうした連結分子は、適当な標識を付与することで予め識別用タグ配列とともに設定済みのキャプチャー配列を有するキャプチャープローブによって検出することができる。すなわち、結果として、特定部分配列に応じたキャプチャープローブにて標的核酸を検出することができる。   According to this linking step, the specific query sequence existing in the target nucleic acid is selectively extracted by linking the first query probe and the second query probe, and associated in advance with the specific query sequence. In addition, a linking molecule that can be replaced with a tag sequence for identification and can be labeled can be obtained according to the presence and abundance of the specific partial sequence. Such a linking molecule can be detected by a capture probe having a capture sequence that has been set in advance together with a tag sequence for identification by applying an appropriate label. That is, as a result, the target nucleic acid can be detected with the capture probe corresponding to the specific partial sequence.

したがって、本連結工程によれば、上記第１のクエリプローブセットと第２のクエリプローブとを用い上記第１の接触工程及び本連結工程を実施することで、効率的に標的核酸中の特定塩基配列をその存在及び存在比に基づいて抽出でき、ユニバーサルなキャプチャープローブによって特定塩基配列を個別に検出可能な連結分子を得ることができる。   Therefore, according to the present linking step, the specific base in the target nucleic acid is efficiently obtained by performing the first contact step and the main linking step using the first query probe set and the second query probe. A sequence can be extracted based on its presence and abundance ratio, and a linking molecule capable of individually detecting a specific base sequence can be obtained by a universal capture probe.

なお、上記第１の接触工程及び本連結工程は、特に連結工程を酵素反応を用いて行う場合など、前記第１の接触工程は、連結工程に先立つハイブリダイゼーション工程として、本連結工程と連続若しくは実質的に一つの工程（エンコード工程ともいう。）として実施することができる。   The first contacting step and the main linking step are continuous with the main linking step as a hybridization step prior to the linking step, particularly when the linking step is performed using an enzyme reaction. It can be carried out substantially as one process (also referred to as an encoding process).

第１のクエリプローブと第２のクエリプローブとを連結した連結分子は、それのみを回収することなく、次工程へと移行することができる。また、標的核酸とともに適当な方法で回収することができ、例えば、カラム等精製器具等によって連結分子を回収してもよい。また、後段の標識工程に先立って、標的核酸から連結分子を解離させる。解離は、例えば、化学的変性及び熱的変性を含む変性処理によって達成することができる。たとえば、化学的変性によって連結されたオリゴヌクレオチドを解離させる場合には、アルカリ変性などの当業者に周知の処理を行えばよい。熱的変性により連結オリゴヌクレオチドを解離させる場合には、生理的条件下では、８５℃以上、好ましくは９０℃以上の温度にすればよいが、当業者であれば、適切な解離方法を選択することができる。   The linked molecule in which the first query probe and the second query probe are linked can be transferred to the next step without collecting only the linked molecule. Further, it can be recovered together with the target nucleic acid by an appropriate method. For example, the linking molecule may be recovered by a purification tool such as a column. Prior to the subsequent labeling step, the linking molecule is dissociated from the target nucleic acid. Dissociation can be achieved, for example, by denaturing processes including chemical denaturation and thermal denaturation. For example, when dissociating oligonucleotides linked by chemical denaturation, a treatment well known to those skilled in the art, such as alkali denaturation, may be performed. When dissociating the ligated oligonucleotide by thermal denaturation, the temperature should be 85 ° C. or higher, preferably 90 ° C. or higher under physiological conditions. Those skilled in the art will select an appropriate dissociation method. be able to.

（標識工程）
標記工程は、連結分子が備える標識用タグ配列を用いて連結分子を単一の標識物質で標識して標識済み連結分子を取得する工程である。標識工程で、連結分子を標識することで、後述する第２の接触工程を経て後述する検出工程で特定塩基配列に対応する個別のキャプチャープローブへのハイブリダイズ量を検出することができる標識済み連結分子を得ることができる。 (Labeling process)
The title step is a step of obtaining a labeled linked molecule by labeling the linked molecule with a single labeling substance using a labeling tag sequence provided in the linked molecule. By labeling the linking molecule in the labeling step, a labeled ligation that can detect the amount of hybridization to an individual capture probe corresponding to the specific base sequence in the detection step described later through the second contact step described later A molecule can be obtained.

標識工程は、標識用タグを用いて標識物質で標識する公知の方法を採用して実施することができる。好ましくは、ＰＣＲ増幅反応を利用する。プライマーは採用するＰＣＲ手法に応じて適宜設計することができる。具体的には、連結分子が保持する識別用タグ配列にハイブリダイズするプライマー及び／又は連結分子が保持する標識用タグ配列にハイブリダイズし標識物質を保持したプライマーでＰＣＲ増幅反応を行う。このとき、通常のＰＣＲによる増幅を行ってもよいし、1本鎖の増幅産物が得られる増幅方法として、アシンメトリックＰＣＲによる増幅を行ってもよい。通常のＰＣＲ増幅反応を用いて標識物質を付与する場合、第１のクエリプローブに由来する識別用タグ配列（＋）は、それ自身に相補的であるとともにキャプチャー配列に相補的な識別用タグ配列（−）に変換される。アシメトリックＰＣＲを用いる場合には、用いるプライマーにより、標識前と同一の識別用タグ配列を維持した標識済み産物を得ることもできるし、標識前の識別用タグ配列に対して相補的な配列に変換した標識済み産物を得ることもできる。いずれにしても、標識後にキャプチャー配列に対して選択的にハイブリダイズ可能に相補的な配列な識別用タグ配列（−）が標識済み産物で得られればよい。   The labeling step can be performed by employing a known method of labeling with a labeling substance using a labeling tag. Preferably, a PCR amplification reaction is used. Primers can be appropriately designed according to the PCR technique employed. Specifically, a PCR amplification reaction is performed with a primer that hybridizes to the identification tag sequence held by the linking molecule and / or a primer that hybridizes to the labeling tag sequence held by the linking molecule and holds the labeling substance. At this time, amplification by normal PCR may be performed, or amplification by asymmetric PCR may be performed as an amplification method for obtaining a single-stranded amplification product. When a labeling substance is applied using a normal PCR amplification reaction, the identification tag sequence (+) derived from the first query probe is complementary to itself and is complementary to the capture sequence. Converted to (-). When asymmetric PCR is used, a labeled product maintaining the same identification tag sequence as before labeling can be obtained by using primers, or a sequence complementary to the identification tag sequence before labeling can be obtained. A converted labeled product can also be obtained. In any case, an identification tag sequence (-) that is a complementary sequence that can be selectively hybridized to the capture sequence after labeling may be obtained as the labeled product.

標識物質としては従来公知のものを適宜選択して用いることができる。それ自体励起されると蛍光シグナルを発する蛍光物質などの各種色素であってもよいし、さらに酵素反応や抗原抗体反応により第２成分と組み合わせて各種シグナルを発する物質であってもよい。典型的には、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ５５５、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ６４７等の蛍光標識物質を用いることができる。   As the labeling substance, conventionally known substances can be appropriately selected and used. It may be various dyes such as a fluorescent substance that emits a fluorescent signal when excited by itself, or may be a substance that emits various signals in combination with the second component by an enzyme reaction or an antigen-antibody reaction. Typically, a fluorescent labeling substance such as Cy3, Alexa555, Cy5, Alexa647 can be used.

後段の第２の接触工程に先だって、増幅により標識物質を付与した標識済み連結分子分離し、１本鎖としておくことが好ましい。分離は、ビオチンで被覆した磁気ビーズ等の固相担体を用いること等の公知の方法を採用することができ、１本鎖化は、上述した化学的変性又は熱的変性を施す手法等を採用できる。   Prior to the second contact step in the subsequent stage, it is preferable to separate the labeled linked molecule to which a labeling substance has been added by amplification and to make it a single strand. For the separation, a known method such as using a solid phase support such as a magnetic bead coated with biotin can be adopted, and for the single strand formation, the above-described chemical denaturation method or thermal denaturation method is adopted. it can.

（第２の接触工程）
第２の接触工程は、標識済み連結分子中の識別用タグ配列（−）に相補的なキャプチャー配列を有する２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体上でこれらのキャプチャープローブと標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。この工程によれば、標識済み連結分子中の識別用タグ配列（−）がキャプチャープローブ中のキャプチャー配列と一定条件下において選択的にハイブリダイズ部可能な程度に相補的であるとき、これらはハイブリダイズし固相担体上の所定のキャプチャープローブにおいて二重鎖を形成する。標識済み連結分子中にキャプチャープローブと相補的な識別用タグ配列（−）を有していない場合には、固相担体上において二重鎖は形成されない。第１の接触工程後において、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。 (Second contact step)
In the second contact step, these capture probes are labeled on a solid phase carrier on which two or more types of capture probes having a capture sequence complementary to the identification tag sequence (-) in the labeled linking molecule are immobilized. This is a step of bringing a linking molecule into contact with each other so as to be hybridizable. According to this step, when the identification tag sequence (-) in the labeled linking molecule is complementary to the capture sequence in the capture probe to the extent that it can selectively hybridize under certain conditions, these are hybridized. Soybeans form a duplex at a given capture probe on a solid support. When the labeled linking molecule does not have an identification tag sequence (-) complementary to the capture probe, no duplex is formed on the solid phase carrier. After the first contact step, a cleaning step may be further included as appropriate.

（キャプチャープローブが固定化された固相担体）
第２の接触工程では、２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体を用いることができる。こうした固相担体は、例えばビーズであってもよいし平板であってもよく、材質は特に限定されないが、ガラス製又はプラスチック製の固相担体を用いることができる。好ましくは、固相担体は平板状であり、２種類以上のキャプチャープローブが一定の配列で固定されたアレイである。アレイは、多数個のキャプチャープローブを固定でき、同時に網羅的に各種の多型や変異を検出するのに都合がよい。また、アレイは、一つの固相担体上に複数個の区画された個別のアレイ領域を備えていてもよい。これらの個別のアレイ領域は、それぞれ同一のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよいし、それぞれ別のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよい。 (Solid phase carrier with capture probe immobilized)
In the second contact step, a solid phase carrier on which two or more types of capture probes are immobilized can be used. Such a solid support may be, for example, a bead or a flat plate, and the material is not particularly limited, but a solid support made of glass or plastic can be used. Preferably, the solid support is a flat plate, and is an array in which two or more types of capture probes are fixed in a fixed arrangement. An array can fix a large number of capture probes, and is convenient for comprehensively detecting various polymorphisms and mutations at the same time. In addition, the array may include a plurality of partitioned individual array regions on a single solid phase carrier. In each of these individual array regions, the same set of capture probes may be immobilized, or different sets of capture probes may be immobilized.

第２の接触工程で用いる固相担体は、標的核酸において検出しようとする特定部分配列に関連付けた２種類以上のキャプチャープローブが互いに隣接する配置状態を備えるアレイであることが好ましい。これらが隣接していることにより、アレイ上におけるハイブリダイゼーションのキャプチャープローブの固定化位置に由来するバラツキを抑制して、精度よく標的核酸中の特定部分配列を検出することができる。   The solid phase carrier used in the second contact step is preferably an array having an arrangement state in which two or more types of capture probes associated with a specific partial sequence to be detected in the target nucleic acid are adjacent to each other. By being adjacent to each other, it is possible to suppress a variation derived from the position where the hybridization capture probe is immobilized on the array, and to detect a specific partial sequence in the target nucleic acid with high accuracy.

また、好ましい固相担体は、標的核酸において検出しようとする特定部位配列に関連付けた２種類以上のキャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列された配列状態を備えるアレイである。こうしたアレイを用いて、このキャプチャープローブの順序に沿って、各標的核酸に対応する２種類以上のキャプチャープローブ、換言すれば、識別用タグ配列を割り当てることで、キャプチャー配列の融解温度の差に由来するハイブリダイゼーションのバラツキを抑制して、精度よく標的核酸中の特定部分配列を検出することができる。好ましいアレイの一例を図３に示す。   A preferred solid phase carrier is an array having an array state in which two or more types of capture probes associated with a specific site sequence to be detected in the target nucleic acid are arranged in an order based on the melting temperature. Using such an array, two or more types of capture probes corresponding to each target nucleic acid, in other words, identification tag sequences are assigned in the order of the capture probes, resulting in a difference in the melting temperature of the capture sequences. The specific partial sequence in the target nucleic acid can be detected with high accuracy by suppressing the variation in hybridization. An example of a preferred array is shown in FIG.

さらに好ましい固相担体は、標的核酸において検出しようとする特定部分配列に対応する２種類以上のキャプチャープローブを互いに隣接する配置状態を備え、かつこれらの隣接するキャプチャープローブ間の融解温度の最大温度差（絶対値）が５℃以下好ましくは０．２℃以下となるように配置されているアレイである。こうしたアレイを用いることで、アレイ上でキャプチャープローブの固定化位置及びキャプチャープローブの融解温度の差に基づくハイブリダイゼーションのバラツキを抑制できる。典型的には、多数のキャプチャープローブを融解温度に基づく順序で配列したとき連続して配列されているキャプチャープローブを一つの標的核酸の特定部分配列を検出するための２種類以上のキャプチャープローブとして採用すればよい。   A more preferable solid phase carrier has an arrangement state in which two or more types of capture probes corresponding to a specific partial sequence to be detected in the target nucleic acid are adjacent to each other, and the maximum temperature difference in melting temperature between these adjacent capture probes The array is arranged so that (absolute value) is 5 ° C. or less, preferably 0.2 ° C. or less. By using such an array, it is possible to suppress variations in hybridization based on the difference between the capture probe immobilization position and the capture probe melting temperature on the array. Typically, when multiple capture probes are arranged in the order based on the melting temperature, the capture probes arranged in succession are used as two or more types of capture probes for detecting a specific partial sequence of one target nucleic acid. do it.

また、好ましい固相担体は、一つの標的核酸についての複数のキャプチャープローブは、２個以上であり、標的核酸中の検出しようとする塩基配列とは無関係に設定された同一塩基長のキャプチャー配列を有し、融解温度が４０℃以上８０℃以下（好ましくは５０℃以上７０℃以下、より好ましくは５５℃以上６５℃以下）であって、その融解温度に基づく順序で配列されているアレイである。こうしたアレイによれば、標的核酸の特定部分配列を、キャプチャー配列とハイブリダイズ可能な程度に相補的な識別用タグ配列にコード変換しておくことで、どのような特定部分配列にも対応可能なアレイとして用いることができる。しかも、２個以上、好ましくは６４個以上より好ましくは１００個以上の多数個のキャプチャープローブを備えることで、多数個の標的核酸又は標的核酸中の複数の特定部分配列を同時に検出することができる。さらに、これらのキャプチャープローブが全て同一塩基長で融解温度が４０℃以上８０℃以下（好ましくは５０℃以上７０℃以下、さらに好ましくは５５℃以上６５℃以下）であるため、均一なハイブリダイゼーションを実現でき、高い精度で標的核酸中の特定部分配列を検出し定量できる。   In addition, a preferred solid phase carrier has two or more capture probes for one target nucleic acid, and a capture sequence having the same base length set independently of the base sequence to be detected in the target nucleic acid is used. And an array having a melting temperature of 40 ° C. or higher and 80 ° C. or lower (preferably 50 ° C. or higher and 70 ° C. or lower, more preferably 55 ° C. or higher and 65 ° C. or lower) and arranged in the order based on the melting temperature. . According to such an array, the specific partial sequence of the target nucleic acid is converted into a tag sequence for identification that is complementary to the extent that it can hybridize with the capture sequence, so that any specific partial sequence can be supported. It can be used as an array. Moreover, by providing two or more, preferably 64 or more, more preferably 100 or more, multiple capture probes, multiple target nucleic acids or a plurality of specific partial sequences in the target nucleic acid can be detected simultaneously. . Furthermore, since these capture probes all have the same base length and a melting temperature of 40 ° C. to 80 ° C. (preferably 50 ° C. to 70 ° C., more preferably 55 ° C. to 65 ° C.), uniform hybridization can be achieved. This can be realized, and a specific partial sequence in the target nucleic acid can be detected and quantified with high accuracy.

固相担体に固定化される複数のキャプチャープローブは、それぞれ配列番号：１〜配列番号：１００から選択されるキャプチャー配列を有することができる。なお、これらの塩基配列は既に説明したように、一定条件で設計された正規直交化配列である。   The plurality of capture probes immobilized on the solid phase carrier can each have a capture sequence selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 100. These base sequences are orthonormalized sequences designed under certain conditions, as already described.

キャプチャープローブの固定化形態は特に限定されない。共有結合性であってもよいし非共有結合性であってもよい。キャプチャープローブは、従来公知の各種の方法で固相担体表面に固定化することができる。また、固相担体表面に対しては適当なリンカー配列を備えていてもよい。リンカー配列は、好ましくはキャプチャープローブ間において同一塩基長で同一配列とする。   The immobilization form of the capture probe is not particularly limited. It may be covalent or non-covalent. The capture probe can be immobilized on the surface of the solid support by various conventionally known methods. An appropriate linker sequence may be provided on the surface of the solid phase carrier. The linker sequence is preferably the same sequence with the same base length between the capture probes.

（シグナル強度情報取得工程）
シグナル強度情報取得工程は、ハイブリダイズ後の固相担体上の標識物質に基づく標的核酸についてのシグナル強度情報を取得する工程である。本件シグナル強度情報取得程によれば、標識済み連結分子における標的核酸中の特定部分配列に対応した識別用タグ配列（−）がキャプチャープローブとハイブリダイズすることで当該キャプチャープローブに関連付けされた状態で標識物質に基づきシグナル強度情報を得ることができる。こうしたキャプチャープローブに関連付けされたシグナル強度情報は、標的核酸中に存在する特定部分配列の数だけ得ることができる。 (Signal intensity information acquisition process)
The signal intensity information acquisition step is a step of acquiring signal intensity information about the target nucleic acid based on the labeling substance on the solid phase carrier after hybridization. According to the signal intensity information acquisition process in this case, the identification tag sequence (-) corresponding to the specific partial sequence in the target nucleic acid in the labeled linking molecule is hybridized with the capture probe so that it is associated with the capture probe. Signal intensity information can be obtained based on the labeling substance. The signal intensity information associated with such a capture probe can be obtained by the number of specific partial sequences present in the target nucleic acid.

標的核酸中の特定部分配列は識別用タグ配列及びキャプチャー配列と予め関連付けされているので、所定のキャプチャープローブに関連付けされたシグナル強度情報を取得することで、標的核酸中の特定部分配列の有無やその量等を定量することができる。   Since the specific partial sequence in the target nucleic acid is associated with the identification tag sequence and the capture sequence in advance, by acquiring the signal intensity information associated with the predetermined capture probe, the presence or absence of the specific partial sequence in the target nucleic acid The amount or the like can be quantified.

シグナル強度情報取得工程は、用いた固相担体の形態や標識物質の種類に応じて、従来公知の手法を適宜選択して採用すればよい。典型的には、固相担体からハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチド等を洗浄操作等によって除去した後、付加した標識物質の蛍光シグナルをアレイスキャナ等により検出したり、標識物質に対して化学発光反応を実施したりすることができる。固相担体にビーズを用いた場合には、フローサイトメーターによる検出方法が挙げられる。   In the signal intensity information acquisition step, a conventionally known method may be appropriately selected and employed according to the form of the solid phase carrier used and the type of labeling substance. Typically, oligonucleotides that have not been hybridized from the solid phase carrier are removed by a washing operation, etc., and then the fluorescence signal of the added labeling substance is detected by an array scanner or the like, or a chemiluminescent reaction to the labeling substance Can be implemented. When beads are used as the solid phase carrier, a detection method using a flow cytometer can be used.

（検出工程）
検出工程は、第１のクエリプローブセット中の各第１のクエリプローブの各識別用タグ配列を介して各前記特定部分配列に関連付けられたキャプチャープローブに対応して得られるシグナル強度情報に基づいて、一つの標的核酸中の前記多型又は前記変異の有無を検出する工程とすることができる。こうした検出工程によれば、同一キャプチャープローブについての異なる標識物質に基づく信号の有無や強度によらないで、異なるキャプチャープローブについての同一標識物質に基づくシグナル強度情報に基づいて、標的核酸中の特定部分配列を検出できる。このため、個々の特定部分配列について精度よく検出でき、この結果、多型又は変異の有無若しくは比率を精度よく検出し定量することができる。 (Detection process)
The detection step is based on signal intensity information obtained corresponding to each capture probe associated with each specific partial sequence via each identification tag sequence of each first query probe in the first query probe set. , A step of detecting the presence or absence of the polymorphism or the mutation in one target nucleic acid. According to such a detection process, a specific portion in the target nucleic acid is determined based on the signal intensity information based on the same labeling substance for different capture probes, regardless of the presence or intensity of signals based on different labeling substances for the same capture probe. The sequence can be detected. For this reason, it is possible to accurately detect each specific partial sequence, and as a result, it is possible to accurately detect and quantify the presence or absence or ratio of a polymorphism or mutation.

標的核酸中の多型又は変異を検出するには、例えば、２種以上のキャプチャープローブについて得られるシグナル強度の比に基づいて、検出しようとする多型又は変異の有無を検出する工程としてもよい。上記のように、本検出方法によれば、多型や変異を構成する特定部分配列毎にキャプチャープローブが準備され、これらのキャプチャープローブに関してシグナル強度情報を取得できるため、一つの多型や変異に対応する各キャプチャープローブ間の単なるシグナル強度の比に基づいても多型の有無（タイプ）や変異の有無を精度よく検出することができる。   In order to detect a polymorphism or mutation in the target nucleic acid, for example, it may be a step of detecting the presence or absence of the polymorphism or mutation to be detected based on the ratio of signal intensities obtained for two or more types of capture probes. . As described above, according to this detection method, a capture probe is prepared for each specific partial sequence that constitutes a polymorphism or mutation, and signal intensity information can be obtained for these capture probes. Presence / absence of polymorphism (type) and presence / absence of mutation can be accurately detected based on a simple signal intensity ratio between corresponding capture probes.

また、図１に示すように、２種以上のキャプチャープローブに対応して得られる一つのシグナル強度に対する２種以上のキャプチャープローブに対応して得られる全てのシグナル強度の和の割合に基づいて、前記一つの標的核酸中の前記多型のタイプ判別又は前記変異の比率を求めるようにしてもよい。すなわち、式：一つの特定部分配列に対応するキャプチャープローブに関して得られるシグナル強度／（標的核酸に存在する可能性のある特定部分配列にそれぞれ対応する２種類以上のキャプチャープローブに関して得られるシグナル強度の和）を用いることで、標的核酸中の前記一つの特定部分配列の存在比率を求めることができる。この存在比率により、多型の有無及びタイプ並びに変異の有無及び変異率を得ることができる。こうした検出工程によれば、精度よく変異のタイプや変異率を求めることができる。しかも、一つの標的核酸中の存在可能性のある特定部分配列が３種類以上であっても、その数に応じて識別用タグ配列を備える第１のクエリプローブを設定すれば、容易に同時にこれらの特定部分配列を検出しその比率を定量できる。   Moreover, as shown in FIG. 1, based on the ratio of the sum of all signal intensities obtained corresponding to two or more capture probes to one signal intensity obtained corresponding to two or more types of capture probes, The polymorphism type discrimination or the mutation ratio in the one target nucleic acid may be obtained. That is, the formula: signal intensity obtained for a capture probe corresponding to one specific partial sequence / (sum of signal intensity obtained for two or more types of capture probes each corresponding to a specific partial sequence that may exist in the target nucleic acid ) Can be used to determine the abundance ratio of the one specific partial sequence in the target nucleic acid. The presence / absence and type of the polymorphism, the presence / absence of the mutation, and the mutation rate can be obtained by this abundance ratio. According to such a detection process, the type of mutation and the mutation rate can be obtained with high accuracy. In addition, even if there are three or more types of specific partial sequences that may exist in one target nucleic acid, if the first query probe having a tag sequence for identification is set according to the number, these can be easily and simultaneously The specific partial sequence can be detected and the ratio thereof can be quantified.

本検出方法が一塩基多型を検出するものである場合、例えば、予め準備した、検出しようとする前記多型のタイプを備える１種又は２種以上の参照用オリゴヌクレオチドにつき、前記第１の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第２の接触工程及び前記シグナル強度情報取得工程を実施して、前記参照用オリゴヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報を利用して前記検出工程を実施することができる。こうすることで、連結工程において特定部分配列間、すなわち、異なる第１のクエリプローブ間で連結効率に生じる可能性のあるバイアスを補正することができる。   When the present detection method is to detect a single nucleotide polymorphism, for example, for one or more reference oligonucleotides prepared in advance and having the type of the polymorph to be detected, the first Performing the contact step, the linking step, the labeling step, the second contact step, and the signal intensity information acquisition step, and using the reference signal intensity information acquired for the reference oligonucleotide, the detection step Can be implemented. By doing so, it is possible to correct a bias that may occur in the linking efficiency between specific partial sequences in the linking step, that is, between different first query probes.

また、本検出方法が、遺伝子変異を検出するものである場合、例えば、予め準備した、検出しようとする前記変異について所定の比率を備える１種又は２種以上の参照用オリゴヌクレオチドにつき、前記第１の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第２の接触工程及び前記シグナル強度情報取得工程を実施して、前記参照用オリゴヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報を利用して前記検出工程を実施することができる。こうすることで、上記のように、異なる第１のクエリプローブ間で連結効率に生じる可能性のあるバイアスを補正することができる。   In addition, when the present detection method is for detecting a gene mutation, for example, for one or more reference oligonucleotides prepared in advance and having a predetermined ratio for the mutation to be detected, the first Performing the first contact step, the linking step, the labeling step, the second contact step, and the signal intensity information acquisition step, and using the reference signal intensity information acquired for the reference oligonucleotide, the detection A process can be performed. By doing so, as described above, it is possible to correct a bias that may occur in the coupling efficiency between different first query probes.

こうしたバイアス補正に関し、好ましくは、２種類以上の前記参照用オリヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報に基づいて検量線を作製し、この検量線を利用して試料中の標的核酸中の多型や変異などを検出し定量することができる。検量線を用いることで一層効果的に前述のバイアスを補正して精度の高い検出及び定量が可能となる。なお、参照用シグナル強度情報の取得及び検量線の作製は予め行っておいてもよいし、標的核酸の検出時に同時に行ってもよい。   Regarding such bias correction, preferably, a calibration curve is prepared based on reference signal intensity information acquired for two or more kinds of reference oligonucleotides, and a polymorphism in a target nucleic acid in a sample is obtained using the calibration curve. And mutations can be detected and quantified. By using the calibration curve, the above-described bias can be corrected more effectively, and highly accurate detection and quantification are possible. Note that acquisition of reference signal intensity information and preparation of a calibration curve may be performed in advance, or may be performed simultaneously with detection of the target nucleic acid.

キャプチャープローブは融解温度が近いものを採用しているが、融解温度及びその他の事情によりキャプチャープローブ間におけるハイブリダイズ量にバイアスが生じる可能性があるが、以下のように各工程を実施することでこれを抑制又は回避することができる。   A capture probe with a similar melting temperature is used, but there may be a bias in the amount of hybridization between capture probes due to the melting temperature and other circumstances, but by performing each step as follows: This can be suppressed or avoided.

さらに、例えば、第２の接触工程で、標識済み連結分子とともに、前記第１のクエリプローブセット中の各第１のクエリプローブの各識別用タグ配列（−）と前記単一の標識物質とは異なる他の標識物質とを備え、相互に同一濃度で準備した２種類以上の補正用オリゴヌクレオチドとを、固相担体上で前記キャプチャープローブとハイブリダイズ可能に接触させるようにし、シグナル強度情報取得工程で標的核酸についてのシグナル強度情報を取得するとともに、前記補正用オリゴヌクレオチドについての前記他の標識物質に基づく補正用シグナル強度情報を取得し、検出工程で、前記補正用シグナル強度情報を利用するようにしてもよい。こうした補正は、例えば、他の標識物質を同一濃度で用いたとき、キャプチャープローブ間で得られたシグナル強度に差が生じた場合には、そのようなシグナル強度の差が連結分子にも存在するとして補正する。こうした補正用シグナル強度情報を利用した補正は、多型の有無（タイプ）並びに変異の有無及び変異率のいずれを得る場合にも適用できるとともに、既に説明した参照用シグナル強度情報に基づく補正と併用することができる。   Further, for example, in the second contact step, together with the labeled linking molecule, each identification tag sequence (−) of each first query probe in the first query probe set and the single labeling substance are Signal intensity information acquisition step, wherein two or more kinds of correction oligonucleotides, which are provided with different different labeling substances and are prepared at the same concentration, are brought into contact with the capture probe so as to be hybridizable on a solid phase carrier. To acquire the signal intensity information about the target nucleic acid, acquire the correction signal intensity information based on the other labeling substance about the correction oligonucleotide, and use the correction signal intensity information in the detection step It may be. For example, when other labeling substances are used at the same concentration and there is a difference in the signal intensity obtained between the capture probes, such a difference in signal intensity is also present in the linking molecule. As a correction. Such correction using the signal intensity information for correction can be applied to obtain both the presence / absence of polymorphism (type), the presence / absence of mutation, and the mutation rate, as well as the correction based on the signal intensity information for reference already described. can do.

なお、補正に関して用いる参照用オリゴヌクレオチド及び補正用オリゴヌクレオチドは、必ずしも1本鎖で準備される必要はなく、２本鎖であってもよい。   Note that the reference oligonucleotide and the correction oligonucleotide used for correction do not necessarily have to be prepared in a single strand, and may be in a double strand.

（試料中の標的核酸を検出するためのプローブセット）
本発明のプローブセットは、標的核酸中の検出しようとする多型又は変異における少なくとも１個の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを備える２種類以上の第１のクエリプローブからなる第１のクエリプローブセットと、前記標的核酸の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的なクエリ配列と標識を付加するための標識用タグ配列とを備える第２のクエリプローブと、を備えることができる。 (Probe set for detecting the target nucleic acid in the sample)
The probe set of the present invention comprises a query sequence complementary to a specific partial sequence containing at least one base in a polymorphism or mutation to be detected in a target nucleic acid, and an identification tag sequence capable of identifying the specific partial sequence A first query probe set comprising two or more types of first query probes, and a tag for labeling for adding a query sequence complementary to a partial sequence adjacent to the specific partial sequence of the target nucleic acid and a label A second query probe comprising an array.

本発明のプローブセットにおける第１のクエリプローブ及び第２のクエリプローブ等については既に説明した範囲の各種実施形態をそのまま適用することができる。   For the first query probe, the second query probe, and the like in the probe set of the present invention, various embodiments in the range described above can be applied as they are.

以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。   EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the following examples illustrate the present invention and do not limit the scope of the present invention.

本発明の検出方法による遺伝子変異（ＳＮＰ）の検出を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。
（１）変異遺伝子検出用ＤＮＡマイクロアレイの作製
（２）サンプル遺伝子の増幅
（３）ハイブリダイズ及び連結（エンコード反応）
（４）ラベル化反応
（５）ＤＮＡマイクロアレイを用いた検出
（６）データ解析 Detection of gene mutation (SNP) by the detection method of the present invention was performed by the following procedure. Hereinafter, it demonstrates according to these order.
(1) Preparation of DNA microarray for detecting mutant genes (2) Amplification of sample genes (3) Hybridization and ligation (encoding reaction)
(4) Labeling reaction (5) Detection using DNA microarray (6) Data analysis

（１）遺伝子変異（ＳＮＰ）検出用ＤＮＡマイクロアレイの作製
東洋鋼鈑社製ｇｅｎｅ ｓｌｉｄｅガラス基板に、５’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴＤＮＡ（株式会社日本遺伝子研究所製）を溶かした水溶液をキャプチャープローブとして、日本ガイシ株式会社にてＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標である）スポッターを用いてスポットした。表１に示すように、使用した合成オリゴＤＮＡ配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary
Table1記載のD1_1からD1_100のうちＴｍが高い順に、D1_52, D1_71, D1_93, D1_74, D1_41, D1_92, D1_79, D1_78, D1_65の9種とした。スポットの後、８０℃、１時間のベークを行った。なお、これらのＴｍは、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰによって算出される融解温度（０．１Ｍプローブ濃度、５０ｍＭ
Ｎａ+イオン及び１．５ｍＭ Ｍｇ+イオン）の高い順に配列されている。
(1) Preparation of DNA microarray for detecting gene mutation (SNP) Aqueous solution in which synthetic oligo DNA (manufactured by Nippon Genetic Laboratory Co., Ltd.) in which 5 ′ end is modified with amino group is dissolved in gene slide glass substrate manufactured by Toyo Kohan As a capture probe at NGK Corporation using a GENESHOT (registered trademark) spotter. As shown in Table 1, the synthetic oligo DNA sequences used are supplementary in the literature (Analytical Biochemistry 364 (2007) 78-85).
N1 types D1_52, D1_71, D1_93, D1_74, D1_41, D1_92, D1_79, D1_78, and D1_65 are listed in descending order of Tm from D1_1 to D1_100 shown in Table 1. After the spot, baking was performed at 80 ° C. for 1 hour. In addition, these Tm is the melting temperature (0.1M probe concentration, 50 mM) calculated by Visual OMP.
Na + ions and 1.5 mM Mg + ions) are arranged in descending order.

さらに、以下に記載した手順で、合成オリゴDNAの固定化を行った。すなわち、2×SSC/0.2％SDSで１５分洗浄後、95℃ 2×SSC/0.2％SDSで５分洗浄し、その後、滅菌水で洗浄（10回上下振とう）を３回繰り返した。その後、遠心（1000rpm×3分)により脱水した。   Furthermore, the synthetic oligo DNA was immobilized by the procedure described below. That is, after washing with 2 × SSC / 0.2% SDS for 15 minutes, washing with 95 ° C. 2 × SSC / 0.2% SDS for 5 minutes, and then washing with sterilized water (shaking up and down 10 times) was repeated three times. Thereafter, it was dehydrated by centrifugation (1000 rpm × 3 minutes).

（２）遺伝子変異を有する標的核酸の調製と増幅
検出対象とする遺伝子変異を含む塩基配列は、以下の表２に示す変異の周辺配列である１５０ｂｐ程度とし、これらの塩基配列からなる人工遺伝子を標的核酸とした。合計４組の標的核酸を合成した。
(2) Preparation and amplification of target nucleic acid having gene mutation The base sequence containing the gene mutation to be detected is about 150 bp which is the peripheral sequence of the mutation shown in Table 2 below, and an artificial gene consisting of these base sequences is selected. The target nucleic acid was used. A total of 4 sets of target nucleic acids were synthesized.

次に、これらのサンプルを以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社のＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（カタログ＃ＲＲ００１Ｂ）を使用した。サーマルサイクラーとして、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００を使用した。なお、用いたＰＣＲプライマーについてはＴｍ＝５８．９０±０．７５℃の範囲となるよう設計を行った。各プライマー配列を表３に示す。なお、Ｔｍは、日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp/）が提供するソフトウエア（Oligo
Calculator；http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html）を利用して以下の式に基づいて算出した。
Ｔｍ＝（（ΔＨ＊１０００／（ΔＳ＋４１．３））−２７３．１５−２１．５９７１）（ただし、塩濃度：０．０５Ｍ、プライマー濃度：２５０ｐｍｏｌであり、ΔＳはハイブリッドにおける所定の最近接エントロピー変化の合計(cal/mol・K)を表し、ΔＨはハイブリッドにおける所定の最近接エントロピー変化の合計(kcal/mol)を表す。）
These samples were then amplified as follows. Note that TaKaRa Ex Taq (catalog # RR001B) manufactured by TaKaRa Bio was used as a sample amplification reagent. Applied as a thermal cycler
A Biosystems GeneAmp PCR System 9700 was used. The PCR primer used was designed to have a range of Tm = 58.90 ± 0.75 ° C. Each primer sequence is shown in Table 3. Tm is a software (Oligo) provided by Japan Genetic Research Institute (http://www.ngrl.co.jp/).
Calculator: http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html) was used to calculate based on the following formula.
Tm = ((ΔH * 1000 / (ΔS + 41.3))-273.15-21.5971) (wherein the salt concentration is 0.05M, the primer concentration is 250 pmol, and ΔS is the predetermined nearest-entropy change in the hybrid) (A / H represents the sum (kcal / mol) of the predetermined closest entropy change in the hybrid.)

まず、以下に示す試薬を個々のサンプル（検出変異種）ごとに調製した。なお、サンプルＤＮＡは、検出変異種ごとに、野生遺伝子：変異遺伝子比を１００：０、９５：５、９０：１０、７５：２５、５０：５０の５通りとし、合計２０サンプルを準備した（５通り×４変異種＝計２０サンプル）。
（試薬調製）
プライマーミックス：F,R混合(20 μM, each) ０．５μｌ
Ex Taq バッファ (10×) 1.0μｌ
Ex Taq ポリメラーゼ(5 Unit/μｌ) 0.1μｌ
dNTP mix （2.5 nM） 0.8μｌ
dH 2 O 7.1μｌ
小計 9.5μｌ
サンプルDNA(10ng/μｌ) 0.5μｌ
合計 10.0μｌ First, the following reagents were prepared for each sample (detection mutant). In addition, sample DNA made the wild gene: mutant gene ratio into five kinds, 100: 0, 95: 5, 90:10, 75:25, 50:50 for every detection variant, and prepared a total of 20 samples ( 5 types x 4 variants = 20 samples in total).
(Reagent preparation)
Primer mix: F, R mix (20 μM, each) 0.5 μl
Ex Taq buffer (10 ×) 1.0μl
Ex Taq polymerase (5 Unit / μl) 0.1μl
dNTP mix (2.5 nM) 0.8 μl
dH 2 O 7.1μl
Subtotal 9.5μl
Sample DNA (10ng / μl) 0.5μl
Total 10.0μl

次に、サーマルサイクル反応（９４℃で３０秒後；９４℃で４０秒、６６℃で４０秒、７２℃で２分を４０サイクル；その後４℃に下げる）を行った。そして、個々に増幅した産物を各３．０μｌずつ（計４変異種）を変異遺伝子割合ごとにチューブに混ぜ、ＰＣＲ産物とした。結果として、各変異種につき、野生遺伝子：変異遺伝子比が１００：０、９５：５、９０：１０、７５：２５、５０：５０の５種類（５チューブ）のＰＣＲ産物を調製した。   Next, a thermal cycle reaction (after 94 seconds at 94 ° C .; 40 seconds at 94 ° C., 40 seconds at 66 ° C., 40 cycles of 2 minutes at 72 ° C .; then lowered to 4 ° C.) was performed. Each of the individually amplified products (total 4 mutants) was mixed in a tube for each mutant gene ratio to obtain a PCR product. As a result, for each mutant species, five types (5 tubes) of PCR products having wild gene: mutant gene ratios of 100: 0, 95: 5, 90:10, 75:25, and 50:50 were prepared.

（３）エンコード反応
実施例２で得たサンプルＤＮＡのＰＣＲ産物についてのエンコード反応を以下のようにして行った。エンコード反応にはNew England Biolabs社のTaq DNA Ligase(Catalog
# M0208S)を使用した。加熱にはサーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用した。なお、サンプルＤＮＡの５’側に相補的なクエリ配列（検出塩基を含む）と識別用タグ配列とを備える５’クエリプローブ（本発明方法における第１のクエリプローブ）の配列を表４に示す。５’クエリプローブは、その５’側に表１に示すキャプチャープローブ配列と相同である識別用タグ配列を備えており、その３’側にクエリ配列を備えている。また、サンプルＤＮＡの３’側に相補的なクエリ配列（検出塩基を含まない）と標識用タグ配列とを備える３’クエリプローブ（本発明方法における第２のクエリプローブ）の配列を表５に示す。３’クエリプローブは、その５'側に５’クエリプローブのクエリ配列に隣接するクエリ配列を有し、３’側に標識用タグ配列を有している。なお、３’クエリプローブの５’末端はリン酸化されている。
(3) Encoding Reaction The encoding reaction for the PCR product of the sample DNA obtained in Example 2 was performed as follows. For the encoding reaction, Taq DNA Ligase from New England Biolabs (Catalog
# M0208S) was used. GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used as a thermal cycler for heating. Table 4 shows the sequence of a 5 ′ query probe (first query probe in the method of the present invention) having a complementary query sequence (including a detection base) and an identification tag sequence on the 5 ′ side of the sample DNA. . The 5 ′ query probe has an identification tag sequence that is homologous to the capture probe sequence shown in Table 1 on the 5 ′ side, and a query sequence on the 3 ′ side. Table 5 shows the sequence of a 3 ′ query probe (second query probe in the method of the present invention) comprising a complementary query sequence (not containing a detection base) and a labeling tag sequence on the 3 ′ side of the sample DNA. Show. The 3 ′ query probe has a query sequence adjacent to the query sequence of the 5 ′ query probe on the 5 ′ side, and a tag sequence for labeling on the 3 ′ side. The 5 ′ end of the 3 ′ query probe is phosphorylated.

エンコード反応は、まず、以下の試薬を調製した。試薬は、実施例２で調製した各変異種につき５種類の野生遺伝子：変異遺伝子比のＰＣＲ産物毎に調製した。次に、加熱を行うことでエンコード反応を行った。エンコード反応では、９５℃で５分、５０℃で１分及び５８℃で６０分加熱し、その後１０℃に下げた。各変異種につき５種類のライゲーション産物を得た。
（試薬調製）
５’クエリプローブ２種/３’クエリプローブＭｉｘ（２．５μＭ，ｅａｃｈ）
0.300μｌ
Taq DNA リガーゼバッファ (10×) 1.500μｌ
dH2O 1.075μｌ
Taq DNA リガーゼ(40 Units/μｌ) 0.125μｌ
小計 3.000μｌ
ＰＣＲ産物(変異遺伝子割合ごとに調製) 12.000μｌ
合計 15.000μｌ In the encoding reaction, first, the following reagents were prepared. Reagents were prepared for each PCR product in the ratio of five wild genes: mutant genes for each mutant prepared in Example 2. Next, the encoding reaction was performed by heating. In the encoding reaction, heating was performed at 95 ° C. for 5 minutes, 50 ° C. for 1 minute, and 58 ° C. for 60 minutes, and then lowered to 10 ° C. Five ligation products were obtained for each variant.
(Reagent preparation)
2 types of 5 ′ query probes / 3 ′ query probes Mix (2.5 μM, each)
0.300μl
Taq DNA ligase buffer (10x) 1.500μl
dH 2 O 1.075μl
Taq DNA ligase (40 Units / μl) 0.125 μl
Subtotal 3.000μl
PCR product (prepared for each mutant gene ratio) 12.000 μl
Total 15.000μl

（４）ラベル化反応
実施例３で得たライゲーション産物のラベル化反応を以下のとおり行った。ラベル化反応には、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社のＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｃａｔａｌｏｇ＃
ＲＲ００１Ｂ）を使用した。サーマルサイクラーとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を使用した。ラベル化にはアシメトリーＰＣＲを用い、表１に示す配列と同一配列の各種Ｄ１プライマーと、標識用タグ配列に相補的であり、５’側がＡｌｅｘａ５５５で標識されたプライマーとを用いた（表６）。
(4) Labeling reaction The labeling reaction of the ligation product obtained in Example 3 was performed as follows. For the labeling reaction, TaKaRa Bio's TaKaRa Ex Taq (Catalog #
RR001B) was used. A GeneAmp PCR System 9700 from Applied Biosystems was used as the thermal cycler. Asymmetry PCR was used for labeling, and various D1 primers having the same sequence as shown in Table 1 and primers complementary to the labeling tag sequence and labeled with Alexa 555 on the 5 ′ side (Table 6) were used. .

ラベル化反応は、まず、以下の試薬を４種の変異種あたり５種類のライゲーション産物につき調製した。次いで、調製した試薬につきサーマルサイクル反応を行った。すなわち、９５℃で１分後；９５℃で３０秒、５５℃で６分、７２℃で３０秒を３０サイクル行い；その後１０℃に下げた。４つの変異種あたり５種類のラベル化済み産物を得た。   In the labeling reaction, first, the following reagents were prepared for 5 types of ligation products per 4 types of variants. Subsequently, thermal cycling reaction was performed about the prepared reagent. That is, after 1 minute at 95 ° C .; 30 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 6 minutes and 72 ° C. for 30 seconds; Five labeled products were obtained per four variants.

（試薬調製）
D1_プライマーMix (50 μM, each) 0.12μｌ
Alexa555-ED-1(200 μM) 0.24μｌ
Ex Taq バッファ (10×) 1.20μｌ
dNTP mix (2.5 nM) 0.96μｌ
Ex Taq ポリメラーゼ(5 Unit/μｌ) 0.12μｌ
ミリQ水 8.36μｌ
小計 11.00μｌ
ライゲーション産物 1.00μｌ
合計 12.00μｌ (Reagent preparation)
D1_Primer Mix (50 μM, each) 0.12 μl
Alexa555-ED-1 (200 μM) 0.24 μl
Ex Taq buffer (10 ×) 1.20μl
dNTP mix (2.5 nM) 0.96μl
Ex Taq polymerase (5 Unit / μl) 0.12μl
Milli-Q water 8.36μl
Subtotal 11.00μl
Ligation product 1.00μl
Total 12.00μl

（5）DNAマイクロアレイを用いた検出
ラベル化済み産物を用いたＤＮＡマイクロアレイへの反応及びその検出手順は以下の通りとした。 (5) Detection using DNA microarray The reaction to the DNA microarray using the labeled product and the detection procedure were as follows.

（ハイブリダイズ用標識サンプル溶液の調製）
まず、ハイブリダイズ補正用液及びハイブリダイズ用液を以下の組成で調製した。 (Preparation of labeled sample solution for hybridization)
First, a hybridization correction solution and a hybridization solution were prepared with the following compositions.

（ハイブリダイズ用標識サンプル溶液の組成）
ハイブリダイズ補正用液 1.5μｌ
ハイブリダイズ用液 9.0μｌ
小計 10.5μｌ
ラベル化済み産物 7.5μｌ
合計 18.0μｌ (Composition of labeled sample solution for hybridization)
Hybridization correction solution 1.5μl
Hybridization solution 9.0μl
Subtotal 10.5μl
7.5 μl of labeled product
18.0μl in total

（ハイブリダイズ補正用液組成（2.5nM, each））
Alexa647-rD1_52(100nM) 10μｌ
Alexa647-rD1_71(100nM) 10μｌ
Alexa647-rD1_93(100nM) 10μｌ
Alexa647-rD1_74(100nM) 10μｌ
Alexa647-rD1_41(100nM) 10μｌ
Alexa647-rD1_92(100nM) 10μｌ
Alexa647-rD1_79(100nM) 10μｌ
Alexa647-rD1_78(100nM) 10μｌ
Alexa647-rD1_65(100nM) 10μｌ
Alexa555-rD1_65（100nM） 10μｌ
TE(ｐH8.0) 300μｌ
400μｌ (Hybridization correction liquid composition (2.5nM, each))
Alexa647-rD1_52 (100nM) 10μl
Alexa647-rD1_71 (100nM) 10μl
Alexa647-rD1_93 (100nM) 10μl
Alexa647-rD1_74 (100nM) 10μl
Alexa647-rD1_41 (100nM) 10μl
Alexa647-rD1_92 (100nM) 10μl
Alexa647-rD1_79 (100nM) 10μl
Alexa647-rD1_78 (100nM) 10μl
Alexa647-rD1_65 (100nM) 10μl
Alexa555-rD1_65 (100nM) 10μl
TE (pH 8.0) 300μl
400μl

なお、ハイブリダイズ補正用液に使用したAlexa555または647標識オリゴDNAは、表1のキャプチャープローブ配列に相補な配列の5’末端をAlexa555または647で標識した。   The Alexa555 or 647-labeled oligo DNA used in the hybridization correction solution was labeled with Alexa555 or 647 at the 5 'end of the sequence complementary to the capture probe sequence shown in Table 1.

（ハイブリダイズ用液組成（×２））
20×SSC 2.0mｌ
10％SDS 0.8ml
100％ Formamide 12.0ml
100 mM EDTA 0.8ml
ミリQ水 24.4mｌ
合計 40.0mｌ (Liquid composition for hybridization (× 2))
20 x SSC 2.0ml
10% SDS 0.8ml
100% Formamide 12.0ml
100 mM EDTA 0.8ml
Milli-Q water 24.4ml
Total 40.0ml

（ハイブリダイズ）
次いで、調製した標識サンプル溶液を、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用し、90℃で1分加熱した後、ヒートブロック(TAITEC社DTU-N）を使用し80℃で1分加熱した。上記サンプル溶液を各９μｌずつ、DNAマイクロアレイのスポットエリアにかけ、乾燥防止のためコンフォート／プラス用サーモブロックスライド（エッペンドルフ社製）を使用し、３７℃で６０分間静置することによりハイブリダイズ反応を行った。 (Hybridization)
Next, the prepared labeled sample solution was heated at 90 ° C. for 1 minute using Gene Bio PCR System 9700 from Applied Biosystems, and then heated at 80 ° C. for 1 minute using a heat block (TAITEC DTU-N). Apply 9 μl each of the sample solution to the spot area of the DNA microarray, and use a comfort / plus thermoblock slide (manufactured by Eppendorf) to prevent drying, and leave it at 37 ° C. for 60 minutes to carry out a hybridization reaction. It was.

（洗浄）
ハイブリダイズ後、以下の組成の洗浄液を満たしたガラス染色バットに、ハイブリダイズ反応終了後のガラス基板を浸漬し、５分間上下振とうし、滅菌水を入れたガラス染色バットにガラス基板を移し、１分間上下振とうし、２０００ｒｐｍで１分間遠心乾燥し、ガラス基板表面に残った水分を除去した。
（洗浄液の組成）
ミリ Q水 188.0mｌ
20×SSC 10.0ml
10％SDS 2.0mｌ
合計 200.0mｌ (Washing)
After hybridization, the glass substrate after completion of the hybridization reaction is immersed in a glass staining vat filled with a cleaning solution having the following composition, shaken up and down for 5 minutes, and transferred to a glass staining vat containing sterilized water. It was shaken up and down for 1 minute, and then dried by centrifugation at 2000 rpm for 1 minute to remove moisture remaining on the glass substrate surface.
(Composition of cleaning solution)
Milli-Q water 188.0ml
20 x SSC 10.0ml
10% SDS 2.0ml
Total 200.0ml

（スキャナーによる蛍光検出）
Appleied Precision社ArrayWoRxを使用して適宜、露光時間を調節し、蛍光画像を取得した。さらにGenePix Proを使用し、得られた画像の蛍光シグナルの数値化を行った。 (Fluorescence detection by scanner)
Using an Appleied Precision ArrayWoRx, the exposure time was appropriately adjusted to obtain a fluorescence image. Furthermore, using GenePix Pro, the fluorescence signal of the obtained image was digitized.

（６）データ解析
キャプチャー間のハイブリダイズ効率(量)の差の有無を確認するため、同時にハイブリダイズしたハイブリダイズ補正用液の蛍光シグナルを測定した。変異1遺伝子検出用スポット（D1_52およびD1_71）それぞれの測定結果（Alexa647）を表７に示す。
(6) Data analysis In order to confirm the presence or absence of the difference in hybridization efficiency (amount) between captures, the fluorescence signal of the hybridization correction solution hybridized simultaneously was measured. Table 7 shows the measurement results (Alexa647) of the spots for detecting mutation 1 gene (D1_52 and D1_71).

表７に示すように、変異1遺伝子検出用の２スポット間の蛍光シグナル比はほぼ1であり、これら２スポット間のハイブリダイズ吸着量に大きな差はないと考えられる。よって、変異1遺伝子検出用スポットの補正は不要と判断した。   As shown in Table 7, the fluorescence signal ratio between the two spots for detecting the mutation 1 gene is almost 1, and it is considered that there is no great difference in the amount of hybridized adsorption between these two spots. Therefore, it was determined that correction of the spot for detecting mutation 1 gene was unnecessary.

次に、変異1遺伝子についてスキャナーによる蛍光シグナル検出（D1_52およびD1_71）を行った。測定結果（Alexa555）を表８に示す。また、表８の結果に基づいて横軸を変異遺伝子割合とし、縦軸にＢ／（Ａ＋Ｂ）をプロットし、検量線を作成した。検量線を図４に示す。
Next, fluorescence signal detection (D1_52 and D1_71) was performed for the mutation 1 gene using a scanner. The measurement results (Alexa555) are shown in Table 8. Further, based on the results in Table 8, the horizontal axis is the mutant gene ratio, and the vertical axis is plotted as B / (A + B) to create a calibration curve. A calibration curve is shown in FIG.

表８及び図４に示すように、変異遺伝子における変異型の存在を容易に検出することができ、低い変異率であっても容易に精度よく検出することができることが分かった。また、野生型：変異型の比率も容易に精度よく検出できることが分かった。さらに、こうした検量線を利用することで、さらに精度よく変異を検出しその比率を定量できることがわかった。また、本発明によれば、標的核酸中の検出しようとする存在可能性のある特定部分配列の種類毎に１種類の第１のクエリプローブを準備するとともに、これらの第１のクエリプローブ毎にキャプチャープローブを準備することで、精度よく特定部分配列の存在及びその存在比率を検出することができることがわかった。   As shown in Table 8 and FIG. 4, it was found that the presence of the mutant type in the mutant gene can be easily detected, and it can be easily detected with high accuracy even at a low mutation rate. It was also found that the ratio of wild type: mutant type could be detected easily and accurately. Furthermore, it was found that by using such a calibration curve, mutations can be detected more accurately and the ratios can be quantified. Moreover, according to the present invention, one type of first query probe is prepared for each type of specific partial sequence that may be present in the target nucleic acid, and for each of these first query probes. It was found that the presence of the specific partial sequence and the existence ratio thereof can be detected with high accuracy by preparing the capture probe.

本発明の検出方法の概要を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the outline | summary of the detection method of this invention. 本発明に用いる第１のクエリプローブセット及び第２のクエリプローブを説明する図である。It is a figure explaining the 1st query probe set and 2nd query probe used for this invention. 本発明において用いる識別用タグ配列及びキャプチャー配列の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the tag sequence for identification used in this invention, and a capture arrangement | sequence. 実施例６で作成した検量線を示すグラフ図である。10 is a graph showing a calibration curve created in Example 6. FIG. 従来の変異検出方法の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the conventional mutation detection method.

配列番号１〜１０９：キャプチャープローブ、配列番号１１０〜１１７:人工合成遺伝子、配列番号１１８〜１２５：プライマー、配列番号１２６〜１３３：５’クエリプローブ、配列番号１３４〜１３７：３’クエリプローブ、配列番号１３８：プライマー SEQ ID NOs: 1 to 109: capture probes, SEQ ID NOs: 110 to 117: artificially synthesized genes, SEQ ID NOs: 118 to 125: primers, SEQ ID NOs: 126 to 133: 5 ′ query probes, SEQ ID NOs: 134 to 137: 3 ′ query probes, sequences Number 138: Primer

Claims (13)

試料中の１種又は２種以上の標的核酸中の多型又は変異を検出する方法であって、
少なくとも一種の前記標的核酸中の検出しようとする前記多型又は前記変異を構成する少なくとも１個の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを備える２種類以上の第１のクエリプローブからなる第１のクエリプローブセットと、前記標的核酸の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的なクエリ配列と標識を付加するための標識用タグ配列とを備える第２のクエリプローブと、標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる第１の接触工程と、
前記一種の標的核酸にハイブリダイズした前記第１のクエリプローブと前記第２のクエリプローブとを連結してこれらの連結分子を取得する連結工程と、
前記連結分子が備える前記標識用タグ配列を用いて前記連結分子を単一の標識物質で標識して標識済み連結分子を取得する標識工程と、
前記識別用タグ配列に相補的又は相同的なキャプチャー配列を有し前記特定部分配列に関連付けられた２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体上でこれらのキャプチャープローブと前記標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる第２の接触工程と、
ハイブリダイズ後の前記固相担体上の前記標識物質に基づく前記一つの標的核酸についての２種類以上のシグナル強度情報を取得するシグナル強度情報取得工程と、
前記２種類以上のシグナル強度情報に基づいて前記一種の標的核酸中の前記多型又は前記変異を検出する検出工程と、
を備え、
前記第２の接触工程は、前記標識済み連結分子とともに、前記第１のクエリプローブセット中の各前記第１のクエリプローブの各前記識別用タグ配列と前記単一の標識物質とは異なる他の標識物質とを備え、相互に同一濃度で準備した補正用オリゴヌクレオチドとを、前記固相担体上で前記キャプチャープローブとハイブリダイズ可能に接触させる工程であり、
前記シグナル強度情報取得工程は、前記一つの標的核酸についてのシグナル強度情報を取得するとともに、前記補正用オリゴヌクレオチドについての前記他の標識物質に基づく補正用シグナル強度情報を取得する工程であり、
前記検出工程は、前記第１のクエリプローブセット中の一つの第１のクエリプローブの識別用タグ配列を介して前記特定部分配列に関連付けられたキャプチャープローブに対応して得られるシグナル強度に対する前記第１のクエリプローブセット中の全ての第１のクエリプローブの識別用タグ配列を介して前記特定部分配列に関連付けられた全てキャプチャープローブに対応して得られるシグナル強度の和の割合に基づくとともに、前記補正用シグナル強度情報を利用して、前記一つの標的核酸中の前記多型のタイプ判別又は前記変異の比率を求める工程であり、
前記固相担体は、前記キャプチャープローブが２個以上であり、前記標的核酸の前記多型又は前記変異の塩基配列とは無関係に設定された同一塩基長のキャプチャー配列を有し、融解温度が５０℃以上７０℃以下であり、
前記キャプチャー配列は、それぞれ配列番号：１〜配列番号：１００から選択される塩基配列を有する、方法。 A method for detecting a polymorphism or mutation in one or more target nucleic acids in a sample, comprising:
A tag sequence for identification capable of discriminating the specific partial sequence from a query sequence complementary to the specific partial sequence containing at least one base constituting the polymorphism or the mutation to be detected in at least one target nucleic acid A first query probe set comprising two or more types of first query probes, and a label for adding a query sequence complementary to a partial sequence adjacent to the specific partial sequence of the target nucleic acid and a label A first contact step in which a second query probe comprising a tag sequence and a target nucleic acid are brought into contact in a hybridizable manner;
A linking step of linking the first query probe and the second query probe hybridized to the one type of target nucleic acid to obtain these linking molecules;
A labeling step of obtaining a labeled linked molecule by labeling the linked molecule with a single labeling substance using the labeling tag sequence provided in the linked molecule;
These capture probes and the labeled linking molecule are immobilized on a solid phase carrier having a capture sequence complementary or homologous to the identification tag sequence and having two or more types of capture probes associated with the specific partial sequence immobilized thereon. A second contacting step in which the contact is made in a hybridizable manner,
A signal intensity information acquisition step of acquiring two or more types of signal intensity information for the one target nucleic acid based on the labeling substance on the solid phase carrier after hybridization;
A detection step of detecting the polymorphism or the mutation in the one type of target nucleic acid based on the two or more types of signal intensity information;
With
In the second contacting step, each of the identification tag sequence of each of the first query probes in the first query probe set and the single labeling substance are different from each other together with the labeled linking molecule. A correction oligonucleotide comprising a labeling substance and prepared at the same concentration with each other, and a step of contacting the capture probe on the solid phase carrier so as to be capable of hybridizing,
The signal intensity information acquisition step is a step of acquiring signal intensity information for the one target nucleic acid and acquiring correction signal intensity information based on the other labeling substance for the correction oligonucleotide,
In the detection step, the first signal with respect to the signal intensity obtained corresponding to the capture probe associated with the specific partial sequence via the identification tag sequence of one first query probe in the first query probe set. Based on the ratio of the sum of the signal intensities obtained corresponding to all the capture probes associated with the specific partial sequence via the identification tag sequences of all the first query probes in one query probe set, and Using the correction signal intensity information, the step of determining the type of the polymorphism in the one target nucleic acid or the ratio of the mutation,
The solid phase carrier has two or more capture probes, has a capture sequence of the same base length set independently of the base sequence of the polymorphism or the mutation of the target nucleic acid, and has a melting temperature of 50 ℃ ≧ 70 ℃,
The capture sequence has a base sequence selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 100, respectively . 予め準備した、検出しようとする前記多型のタイプを備える１種又は２種以上の参照用オリゴヌクレオチドにつき、前記第１の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第２の接触工程及び前記シグナル強度情報取得工程を実施して、前記参照用オリゴヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報を利用して前記検出工程を実施する、請求項１に記載の方法。   For one or more reference oligonucleotides that are prepared in advance and have the polymorphic type to be detected, the first contact step, the linking step, the labeling step, the second contact step, and The method according to claim 1, wherein the signal intensity information acquisition step is performed, and the detection step is performed using reference signal intensity information acquired for the reference oligonucleotide. 予め準備した、検出しようとする前記変異について所定の比率を備える１種又は２種以上の参照用オリゴヌクレオチドにつき、前記第１の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第２の接触工程及び前記シグナル強度情報取得工程を実施して、前記参照用オリゴヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報を利用して前記検出工程を実施する、請求項２に記載の方法。   The first contact step, the linking step, the labeling step, and the second contact step for one or more reference oligonucleotides prepared in advance and having a predetermined ratio for the mutation to be detected 3. The method according to claim 2, wherein the signal intensity information acquisition step is performed, and the detection step is performed using the reference signal intensity information acquired for the reference oligonucleotide. ２種類以上の前記参照用オリヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報に基づく検量線を利用して前記検出工程を実施する、請求項２又は３に記載の方法。   The method according to claim 2 or 3, wherein the detection step is carried out using a calibration curve based on reference signal intensity information acquired for two or more types of reference oligonucleotides. 前記検出しようとする多型又は変異は一塩基多型であって、前記第１のクエリプローブセットは、一塩基多型の一方の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを有する一方の第１のクエリプローブと、一塩基多型の他方の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列を有する他方の第1のクエリプローブと、を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。   The polymorphism or mutation to be detected is a single nucleotide polymorphism, and the first query probe set includes a query sequence complementary to a specific partial sequence containing one base of the single nucleotide polymorphism and the specific portion. A first query probe having an identification tag sequence capable of identifying a sequence, a query sequence complementary to a specific partial sequence including the other base of a single nucleotide polymorphism, and an identification capable of identifying the specific partial sequence The other 1st query probe which has a tag sequence for use, The method in any one of Claims 1-4. 前記検出しようとする多型又は変異は変異であって、前記第１のクエリプローブセットは、前記変異に関し正常な１又は２以上の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを有する第１のクエリプローブと、前記変異に関し異常な１又は２以上の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列を有する第1のクエリプローブとの少なくとも２種類の第１のクエリプローブと、を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。   The polymorphism or mutation to be detected is a mutation, and the first query probe set includes a query sequence complementary to a specific partial sequence containing one or more bases normal to the mutation and the specific portion. A first query probe having an identification tag sequence that can identify a sequence, a query sequence complementary to a specific partial sequence containing one or more bases abnormal for the mutation, and the specific partial sequence can be identified The method according to claim 1, comprising at least two types of first query probes and a first query probe having an identification tag sequence. 前記固相担体は、前記少なくとも一種の前記標的核酸についての前記２種類以上のキャプチャープローブが互いに隣接する配置状態を備えるアレイである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the solid phase carrier is an array having an arrangement state in which the two or more types of capture probes for the at least one type of the target nucleic acid are adjacent to each other. 前記固相担体は、前記少なくとも一種の前記標的核酸についての前記２種類以上のキャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列された配列状態を備えるアレイである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。   The solid phase carrier is an array having an arrangement state in which the two or more types of capture probes for the at least one target nucleic acid are arranged in an order based on the melting temperature thereof. The method described. 前記固相担体は、前記標的核酸において検出しようとする特定部分配列に対応する２種類以上のキャプチャープローブを互いに隣接する配置状態を備え、かつこれらの隣接するキャプチャープローブ間の融解温度の最大温度差（絶対値）が５度以下となるように配置されている、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。   The solid phase carrier has an arrangement state in which two or more types of capture probes corresponding to a specific partial sequence to be detected in the target nucleic acid are adjacent to each other, and a maximum temperature difference in melting temperature between these adjacent capture probes The method according to claim 1, wherein (absolute value) is arranged to be 5 degrees or less. 請求項１〜９のいずれかに記載の検出方法に用いられる、キャプチャープローブが固定化された固相担体であって、
前記固相担体は、前記少なくとも一種の標的核酸についての前記２種類以上のキャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列されている、固相担体。 A solid phase carrier to which a capture probe is immobilized, which is used in the detection method according to claim 1,
The solid phase carrier is a solid phase carrier in which the two or more types of capture probes for the at least one target nucleic acid are arranged in an order based on the melting temperature thereof. 前記固相担体は、前記キャプチャープローブが２個以上であり、それぞれ前記標的核酸の前記多型又は前記変異の塩基配列とは無関係に設定された同一塩基長のキャプチャー配列を有し、融解温度が５０℃以上７０℃以下である、請求項１０に記載の固相担体。 The solid phase carrier has two or more capture probes, each having a capture sequence of the same base length set independently of the base sequence of the polymorphism or the mutation of the target nucleic acid, and having a melting temperature The solid phase carrier according to claim 10, which is 50 ° C or higher and 70 ° C or lower . 前記キャプチャープローブは、それぞれ配列番号：１〜配列番号：１００から選択されるキャプチャー塩基配列を有する、請求項１０又は１１に記載の固相担体。   The solid-phase carrier according to claim 10 or 11, wherein each of the capture probes has a capture base sequence selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 100. 請求項１〜９のいずれかに記載の試料中の標的核酸の検出方法に用いるプローブ等のセットであって、
標的核酸中の検出しようとする多型又は変異を構成する少なくとも１個の塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列と前記特定部分配列を識別可能な識別用タグ配列とを備える２種類以上の第１のクエリプローブからなる第１のクエリプローブセットと、
前記標的核酸の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的なクエリ配列と標識を付加するための標識用タグ配列とを備える第２のクエリプローブと、
前記第１のクエリプローブセット中の各前記第１のクエリプローブの各前記識別用タグ配列と前記単一の標識物質とは異なる他の標識物質とを備え、相互に同一濃度で準備した補正用オリゴヌクレオチドと、
を備える、プローブセット。
 A set of probes and the like used in the method for detecting a target nucleic acid in a sample according to any one of claims 1 to 9 ,
Two or more types comprising a query sequence complementary to a specific partial sequence containing at least one base constituting a polymorphism or mutation to be detected in the target nucleic acid, and an identification tag sequence capable of identifying the specific partial sequence A first query probe set comprising:
A second query probe comprising a query sequence complementary to a partial sequence adjacent to the specific partial sequence of the target nucleic acid and a tag sequence for labeling for adding a label;
For correction using the identification tag sequence of each of the first query probes in the first query probe set and another labeling substance different from the single labeling substance and prepared at the same concentration. An oligonucleotide;
A probe set comprising:
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