JP5314667B2 - 膀胱癌の診断および/または予後方法 - Google Patents
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Description
本発明の応用分野は、健康管理分野、主として「腫瘍泌尿器学」および「分子生物学」の分野にある。本発明は、特に膀胱癌の診断および予後方法を目的とするものである。
本発明の目的は、膀胱癌の遺伝子マーカーとして作用するある種の遺伝子および/またはそれらの組合せの遺伝子発現の膀胱液における検出および定量に基づくイン・ビトロの非侵襲的な膀胱癌の診断および予後方法に関する。
本発明の主要な目的は、膀胱癌の遺伝子マーカーとして作用するある種の遺伝子の検出および定量に基づくイン・ビトロの非侵襲的な膀胱癌の診断および/または予後方法を開発することにある。
本発明の別の特定態様によれば、上記診断法はKLF9遺伝子の検出および定量に基づいている。
本発明の制限ではなく例示に有用な幾つかの実施例を、下記に挙げる。
本発明の最終目的を行うには、膀胱液(尿および/または膀胱洗浄液)から得られるRNAの品質が一般的に低い場合には、最初に遺伝子発現プロフィールに対する様々なRNA分解レベルの衝撃を知る必要があった。膀胱液から得られた遺伝子発現プロフィールが対応する腫瘍で得られるものと調和する場合にも、測定しなければならなかった。
高悪性(G3)pT2として診断された1名の同一患者の腫瘍組織(T)および膀胱洗浄液(BW)試料を選択した[Lopez-Beltran A, Sauter G, Gasser T, Hartmann A, Schmitz-Drager BJ, Helpap B, Ayala HG, Tamboni P, Knowles MA, Sidransky D, Cordon-Cardo C, Jones PA, Cairns P, Simon R, Amin MB, Tyczynsky JE. 「泌尿器系の腫瘍(Tumours of the Urinary System)」: Eble JN, Sauter G, Epstein JI, Sesterhenn IA(監修), 「泌尿器系および男性器の腫瘍の病理学および遺伝学(Pathology and Genetics of Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs)」. World Health Organization Classification of Tumours. リヨン: IARC Press; 2004: 89-157; Sobin LH, Wittekind CH. 「悪性腫瘍のTNM分類(TNM Classification of Malignant Tumours)」. International Union Against Cancer., 第6版. ニューヨーク: Jonh Wiley & Sons; 2002]。両試料(T0およびBW0)のRNAを、TRIzol(Invitrogen, カールスバード, カリフォルニア, 米国)を用いて供給業者の指示に従って抽出した。次いで、両RNA(T0およびBW0)の一部を80℃で15(T1およびBW1)、30(T2およびBW2)および60(T3およびBW3)分間インキュベーションすることによって分解し、水を塩基緩衝液の代わりに用いたことを除き、Xiang CC, Chen M, Ma L et al. 「マイクロアレー研究用の小さな組織試料からの分解したRNAを増幅する新規方法(A new strategy to amplify degraded RNA from small tissue samples for microarray studies)」. Nucleic Acids Res 2003; 31:53に記載の方法によって3つの分解レベルを得た。
完全なRNA(T0およびBW0)および分解RNA(T1、T2、T3、BW1、BW2およびBW3)5μgを、T3プロモーター配列の3'における付加によって修飾した9ヌクレオチドのランダム配列(T3N9)を有するプライマーを用いて増幅した(Xiang CC, Chen M, Ma L et al. 「マイクロアレー研究のための小さな組織試料由来の分解RNAを増幅する新規方法(A new strategy to amplify degraded RNA from small tissue samples for microarray studies)」. Nucleic Acids Res 2003; 31:e53)。プローブは、直接ラベリング法によって合成した(Richter A, Schwager C, Hentze S, Ansorge W, Hentze MW, Muckenthaler M. 「DNAマイクロアレーによる発現分析に用いた蛍光タグDNAラベリング法の比較(Comparison of fluorescent tag DNA labeling methods used for expression analysis by DNA microarrays)」. Biotechniques 2002; 33:620-8, 630)。
Oncochip-v2グラスヒトcDNAマイクロアレー(http://qrupos.cnio.es/qenomica/arravs/reports/ochip_v2.xls)を用いて、腫瘍および膀胱洗浄液(T0、T1、T2、T3、BW0、BW1、BW2およびBW3)の両方のRNAの4個の次第に分解した部分のそれぞれを健康な膀胱試料由来のRNAのプール(C0)と共に同時ハイブリダイズした。蛍光画像はG2565BA Microarray Scanner System (Agilent, Technologies, バルトブロン, 独国)を用いて得て、TIFF画像はR統計学的環境下(http://www.r-project.org)でSpotプログラム(http://experimental.act.cmis.csiro.au/Spot)を用いて定量した。マイクロアレーのそれぞれの点の最終強度測定は、以前に示唆されている方法(http://www.stat.berkeley.edu/users/terrv/zarrav/Html/imaqe.html)(GEOデーターベースにおける一般にアクセス可能なデーター; GSE3192)により計算した。最後に、総ての品質基準に従う1111個の有効なクローンを得て、それぞれのアレーの100個の最も示差的に発現したクローンを選択してアレー間で比較し、それらの間の共通な遺伝子の割合を計算した。高い割合の共通の示差発現遺伝子が、腫瘍組織アレー間(85-91%)および膀胱洗浄液アレー間(78-93%)で検出され(図2a)、RNAの分解は実質的に遺伝子発現プロフィールに影響しないことを示唆していた。
特定の患者のマイクロアレーで得られた結果が一層長いコホートまで補外することができることを確認するため、文献に準じた膀胱癌過程に関するアレーで示差発現した4個の遺伝子(KRT20、IGF2、GSNおよびCCL2)をqRT-PCRによって分析した。この確認には、36個の追加の膀胱腫瘍洗浄液と14個のコントロール膀胱洗浄液を用いた。
膀胱洗浄液RNAを用いて、cDNAマイクロアレーおよびqRT-PCRの両方による対応する膀胱腫瘍の遺伝子発現プロフィールを推定することが可能である。
膀胱液試料の遺伝子発現プロフィールの測定が可能であることを知れば、次の目的はできるだけ大規模な特定遺伝子発現データーを得ることであった。少数の試料でできる限り多量の遺伝子を分析することによって出発し、連続的工程でさらに大規模なシリーズの試料においてますます小さくかつ一層選択された量の遺伝子を連続的に分析した。
組織試料は低温鉗子(腫瘍試料)または直接鋏(コントロール試料)を用いて手術室で得た。得られた組織の一部を、次にRNA抽出の目的で処理するまで直ちに-80℃で冷凍し、残りの部分はその解剖学的-病理学的分析のために病理解剖部門に送った。RNA抽出のため、組織を機械的にホモジナイズし、RNAをTRIzol (Invitrogen, カールスバード, カリフォルニア, 米国)のプロトコルに従って抽出した。最後に、RNAを分光光度法により260 nmの吸光度を測定することによって定量した。
表在性腫瘍と侵襲性腫瘍が異なる遺伝子プロフィールを有すると思われるときには、最も端的な腫瘍群(低悪性の表在性腫瘍対浸潤性腫瘍)を比較することにした。さらに、不明瞭な臨床挙動を有する種類の腫瘍の分子プロフィールを見出すことも決定したが、それらは表在性であるが高度の細胞収差を有し(高悪性T1, pT1 HGとして分類)、多くの場合に(約50%)浸潤性腫瘍となるからである。このようにして、4つの検討群を定義した。
群1: 膀胱粘膜のみを侵襲する低悪性表在性腫瘍試料(LG)(病理学的にはpTa LGとして分類)。
群2: 上皮下結合組織を侵襲する高悪性表在性腫瘍試料(HG)(病理学的にはpT1 HGとして分類)。
群3: 浸潤性の高悪性腫瘍試料(病理学的にはpT2として分類)。
群4: 健康な膀胱粘膜試料(コントロール)。
cDNAに基づくマイクロアレーのプラットフォームは以前に検討されてきたが、さらに多数の遺伝子発現結果を得ることができるオリゴヌクレオチドに基づく他の市販プラットフォームがあることが文献から知られていた。最後に、このプラットフォームについての公的データーベースで利用可能な多量のデーターがあり、実質的に総ての文献がその結果の高品質を記載し、ほとんどのヒト遺伝子の遺伝子発現を測定できる新規マイクロアレー(U133 plus 2.0)が市販されたときには、Affymetrixプラットフォーム(http://www.affymetrix.com/index.affx)を用いることにした。
それぞれのクローンについての標準化した発現データーを得たならば、選択した様々な試料が未管理クラスターを行うことによって互いにクラスター形成する方法を研究することにした(図4)。後者では、総てのコントロールが互いにクラスター形成し、腫瘍から明らかに識別されることを観察することができ、これは腫瘍とコントロールとの間に多数の示差発現遺伝子(診断遺伝子)があることを示していた。さらに、浸潤性腫瘍(pT2_1、pT2_2およびpT2_3)および高悪性の表在性腫瘍(pT1 HG_1、pT1 HG_2およびpT1 HG_3)の3つのプールは互いにクラスター形成し、低悪性の表在性腫瘍の3つのプール(pT1 LG_1、pT1 LG_2、pT1 LG 3)から識別されることも観察され、これによりいずれの経路のマーカー遺伝子(予後遺伝子)を配置することもできる。
遺伝子を多少示差発現するものから配列したならば、完全に独立し文献によれば遙かに正確な手法である定量的リアル・タイムPCR(qRT-PCR)を用いて得られた結果を実証することにした。特に示差的に発現した遺伝子10個をこの手法を実証するために選択し、それらの遺伝子発現を(両方の手法の結果を比較できるようにするために)マイクロアレーでハイブリダイズした正確に同じプールを用いて、および(実際のqRT-PCR法の再製可能性を検討できるようにするために)それぞれのプールの個々の試料を用いてqRT-PCRによって定量した(図5)。回帰係数0.978がマイクロアレーとqRT-PCRとの比較で得られ、これは2つの手法の間の極めて良好な再製可能性を示していた。qRT-PCRによって得られた個々の試料の算術平均と同じ手法によるプールでのそれらの発現を比較したところ、回帰係数は0.995となり、これによりqRT-PCRによる定量が優れた技術的品質を有するという事実の文献データーが確認された。
小さな遺伝子群で2種類の完全に独立した手法を用いる遺伝子発現の定量によって観察された結果を考慮すれば、マイクロアレーによって観察された発現は比較的大きな候補遺伝子の群を次にさらに大規模かつ特異的分析について定義する目的で使用するのに十分な信頼性があると思われると推定することができる。
この研究の最終目的は、膀胱TCCに関係しかつその発現時に診断および予後腫瘍情報が得られる小さな遺伝子の群を選択することであった。その目的のため、DNAマイクロアレーおよび定量的リアル・タイムPCRの2つの手法を用いることができることが実証された。マイクロアレー法によれば、数千の遺伝子がそれぞれの実験で試験され、qRT-PCR法によるよりも一層良好な品質を有する一層多量のRNAが実験を行う上で必要とされる。さらに、後者は一層正確な手法であり、目的とする遺伝子の正確な数を定量することができる。従って、この研究の次の工程ではqRT-PCRに基づくTaqMan Low Density Arrays(TLDA)法を用いることにした。
TLDAは、最大384の遺伝子に対する凍結乾燥プライマーおよびTaqManプローブを含むマイクロ流体カードである(1枚の同じカードで384の遺伝子から1つの同じ試料で48の遺伝子および8試料までを分析することができる様々なTLDA配置がある)。従って、組織RNAとハイブリダイズしたAffymetrixマイクロアレーにより上記で行った実験から、384遺伝子のサブグループを選択しなければならない。腫瘍とコントロールの間で最も示差的に発現した遺伝子(診断遺伝子)および3つの腫瘍群pTa LG、pT1 HGおよびpT2 HGの間で示差発現した遺伝子(予後遺伝子)も選択した。
膀胱洗浄液試料は、膀胱腫瘍の切除前または膀胱切開の前に手術中にバルボタージによって採取した。尿試料は、患者が手術に入る前の自発的排尿によって収集した。膀胱洗浄液試料および尿試料はいずれも、採取直後に氷中に入れて実験室に輸送した。試料を1/25容量の0.5M EDTA, pH8.0と混合して、1000 x gで10分間遠心分離した。細胞ペレットをTRIzol(Invitrogen, カールスバード, カリフォルニア, 米国)1mlに再懸濁し、RNA抽出まで-80℃で冷凍した。
RNAをTRIzol(Invitrogen, カールスバード, カリフォルニア, 米国)のプロトコルに従って抽出し、分光光度法により260 nmの吸光度を測定することによって定量した。
目的の遺伝子が知られている場合には、プライマーおよび蛍光プローブ(TaqMan Assays-on-Demand(商品名)Gene Expression Products)を選択し、Applied Biosystemsウェブ(http://www.appliedbiosystems.com/)でqRT-PCRによって遺伝子発現を定量した。
− 39個の膀胱腫瘍洗浄液試料
− 15個のコントロール膀胱洗浄液試料
− 3個の腫瘍尿試料
3個の末梢血試料; これは、Affymetrixマイクロアレーに基づく上記分析において、筋肉組織混入物が純粋と思われる膀胱粘膜試料で観察されかつ免疫系による膀胱液試料に混入物があることを伺わせる徴候があるときに行った。従って、3個のリンパ球試料を分析して、血中で高発現する遺伝子を比較によって除去できるようにすることにした(血液が膀胱腫瘍の患者からの膀胱液試料における一定の混入物であるとき)。
総てのPCRを行ったならば、それぞれの遺伝子に最も適する閾値レベルおよびベースラインレベルを確立し、Ct(サイクル閾値)または生発現データーをSDS 2.1プログラム(Applied Biosystems)によって計算した。
この工程の検討において、目的は腫瘍とコントロール試料との識別力を増加することであった。その目的のため、一層多数の膀胱液試料を分析し、可能ならばこの診断および予後システムの初期プロトタイプが基づいている遺伝子の数の少なくとも半数だけ減少させることを目的とした。
96アッセイを含むマイクロ流体カード(TaqMan Low Density Arrays)(図9)を、このTLDA配置によりカード当たり4試料を分析できることを除き、384個の遺伝子のものと同様に配置して処理した。
− 42個の腫瘍膀胱洗浄液試料
− 8個のコントロール膀胱洗浄液試料
− 15個の腫瘍尿試料
− 15個のコントロール尿試料。
前の実験工程で用いた手法(実施例3)がこの実施例のものと同じであり、この工程で分析される遺伝子が前に分析した384個の遺伝子TLDAに既に含まれている場合には、実施例3の60個の試料を新たな80個の試料と共に抽出して加えた(総試料数= 140)。
本研究のこの工程での目的は、腫瘍予測モデルを試験して改良すること、並びに予測を行うのに用いた遺伝子の数を最小値まで減少させることであった。
とくに重要な関心は腫瘍予測(診断予測)であったが、様々な種類の腫瘍の分類(予後予測)にも興味があり、この項の主要な目的である。この分類により、それぞれの症例における治療をさらに個人化することができた。
Claims (5)
- 膀胱癌細胞の検出方法であって、
a. 被験者由来の膀胱液試料におけるANXA10、C14orf78、CTSE、CRH、IGF2、KLF9、KRT20、MAGEA3、POSTN、PPP1R14D、SLC1A6、TERT、ASAMおよびMCM10遺伝子の組合せの発現パターンを検出して定量し、
b. 工程a)で得た結果と、膀胱液における前記遺伝子についての標準参照値とを比較すること
を含んでなる、方法。 - 前記膀胱液試料が尿である、請求項1に記載の方法。
- a)における遺伝子の発現を定量的リアル・タイムPCRによって定量する、請求項1または2に記載の方法。
- 膀胱癌細胞検出のための、ANXA10、C14orf78、CTSE、CRH、IGF2、KLF9、KRT20、MAGEA3、POSTN、PPP1R14D、SLC1A6、TERT、ASAMおよびMCM10遺伝子の組合せのイン・ビトロでの使用。
- ANXA10、C14orf78、CTSE、CRH、IGF2、KLF9、KRT20、MAGEA3、POSTN、PPP1R14D、SLC1A6、TERT、ASAMおよびMCM10遺伝子の組合せの発現パターンの検出および定量に適するプローブの組を含んでなる、請求項1に記載の方法を行うための膀胱癌の診断および/または予後予測キット。
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